美丽的海洋微藻

海洋国重种质中心高越

2014/09/29

海洋微藻在海洋生态系统中的位置

•海洋植物的主要组成，生活在200m以内的水层中•光合作用产生的能量，启动了海洋生态系统•自身的生理活动、新陈代谢和与环境之间的物质交换，对其周围环境产生重大影响•胞内两种氨基酸N15含量数字化定位海洋生物食物链：海洋藻类1.0，食物链底层

1.0

2.5

3

3.3

4.8

1.9

微藻分类

不同藻类所含的不同色素及色素相关的光合作用产物象征着藻累进化的不同方向

主要内容

如何获得一株纯种海洋微藻？ 范例1 厦门白城-鼓浪屿东海原甲藻赤潮 [2014/05/06-2014/05/10] 范例2 2014年福建海域米氏凯伦藻赤潮 [2012/06-2012/07]

微藻的培养 纯化培养（小体积） 普通培养（几升-数十升） 批量培养（百升以上） 批量半连续培养（千升以上） 粗放型大批量培养（3000L及以上，挖坑即可培养） 藻类如何收集？

藻种室常用藻类 藻种室概况 使用频率最高的藻类及图谱 精美图片

一. 如何获得一株纯种藻株？

藻种分离技术

形态鉴定

分子鉴定

细胞培养

批量培养

普通培养

纯化培养

浓缩/筛选 单细胞分离 藻种纯化 藻株鉴定 藻类保藏新鲜水样

样品采集

批量半连续培养

粗放大批量培养

富营养孵化

沉积物 孢囊挑取淘洗/浓缩

藻类培养技术

1. 前期准备• 近岸采集：矿泉水瓶（水样）、密实袋（泥样）• 海上采集：打水桶/采水器、筛绢、培养基、96孔板、琼脂平板、采泥器、

光照培养箱

2. 样品采集• 水样：海湾、码头等；滩涂、养殖场、盐场的小水洼；赤潮现场；• 水样体积：200-2000毫升。（须保留原位海水）• 现场参数：测定水样的温度和盐度，供分离、培养时参考。

大亚湾养殖区 深圳湾 南通紫菜筏架区 退潮水洼 白城硅藻赤潮2011-04 2012-04 2012-05 2012-06 2014-07-06

东海原甲藻 三角褐指藻

3. 样品初步处理：浓缩、筛选

Sargassum

5μm ~ 200μm

NoctilucaSamples

Φ200μm

Φ5μm

Φ20μm

Φ10μm

√√ ×

DIY Tools

•近岸样品：48H内尽快处理•海上样品：水样：梯度分级浓缩、平板涂布、96孔板梯度稀释、甲醛固定、单细胞分离泥样：4 ℃避光保存

微吸管分离法

玻璃管在酒精灯上拉成直径0.08-0.16毫米的微管

平板分离法（海上分离硅藻、蓝藻等）

合适的培养液，加入1-1.5%的琼脂 ，倒平板，划线培养。

水滴分离法

藻液稀释 ，分成若干小水滴，显微镜筛选单细胞水滴

稀释分离法（海上鞭毛藻初步分离）

用过滤后原位海水稀释，细胞分布均匀，直接用10μL移液枪挑取到单细胞，水滴清洗。

4. 单细胞分离

微吸管 平板 0.22微米注射器滤头

难点

1.海上样品只能初步处理，不能尽善尽美。

2.细胞个体小，脆弱易损伤，很难挑取完全洁净、健康的细胞。

3.大细胞上吸附的杂藻。

4.有些藻株不可实验室培养或者非常难培养。如鳍藻/夜光藻

5. …

5、藻株鉴定

A. 形态学鉴定

•扫描电镜：细胞较小，个性不明显的细胞

• 普通生物显微镜：适合细胞个体相对较大，特征较明显的藻类

SEM by 高越、罗肇河

B. 分子鉴定

现代分子技术能够快速，便捷的判断种类的范围，是传统形态学分类的重要补充。

目前主要用于藻类分类的有: 核糖体 SSU rDNA, LSU rDNA,ITS1+5.8s+ITS2.

对于特定的种类某些基因有其特别的分类意义。如mitochondrial cytochrome b, 和chloroplast 23S 在共生藻属B系群种类区分上的重要意义。

近年ITS2二级结构在藻类分类上的运用成为一个新的热点

SSU具有很好的保守性，通常用于属和属的分类单元。

LSU各个区间的保守性不同，有些区间保守性好（如D1区）有些区间变异性高（如D2区），通常用于属间和种间区分。

ITS变异性高，通常用于种间和种内分类单元的区分。

ITS2二级结构保守性很好，可用于大范围的分类单元。

范例1 厦门白城-鼓浪屿东海原甲藻赤潮 [2014/05/06-2014/05/10]

•水样搅动有荧光，里面有少量夜光藻。•细胞密度：东海原甲藻约7000 cells/mL，夜光藻约80 cells/mL。•光镜和电镜分析，细胞分离，尝试分离出纯种藻株（赤潮藻和夜光藻）

Prorocentrum donghaiense

Noctiluca

鼓浪屿 白城

形态分析

•东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）赤潮，单细胞或连接成链状，细胞宽长椭圆形，尾部呈锥状。•细胞长16-23μm宽9-13μm。壳面几乎被中空阔棘覆盖，细胞顶部鞭毛孔伸出2条鞭毛

（flagellates）可见。

单细胞 链状细胞

电镜分析

SEM by 高越、罗肇河

范例2 2012年福建海域米氏凯伦藻赤潮 [2012/06-2012/07]

赤潮监测海域地理位置

• 采样位置：黄岐半岛鲍鱼养殖区

• 水样：渔排附近海水

• 水样体积：2 L 。

• 原位海水 10L（培养用）

• 现场参数：温度26-28℃，盐度28‰

• 实验室分析

• 群落构成及密度(cells/m L)：米氏凯伦藻/东海原甲藻/红色裸甲藻/叉角藻

形态分析

叉角藻属 Ceratium furca

米氏凯伦藻 Karenia mikimotoi

血红哈卡藻 Akashiwo sanguinea

SEM by 高越、罗肇河

发现中国近海甲藻环沟藻属2个新记录种：纺锤环沟藻和莫氏环沟藻

三、微藻培养

A. 纯化培养

指数期细胞 挑取单克隆

真菌培养基

纯化培养

细菌培养基荧光镜检法

平板培养法

培养基检测

无菌 检验

抗生素除菌两次 二次鉴定

藻细胞检测

B. 普通培养

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Time(Day)

Cell

den

sity

(Cel

ls/m

L)

Alexandrium sp. 不同生长期 同步化后一个细胞周期

起始期

指数期

平稳期消散期

C. 批量培养

Large scale culturing using carboy

Prorocentrum limaDunaliella Salinā

D. 批量半连续培养

E：粗放型大批量培养

2014-08--2014-09海洋三所生态场

难点：藻类如何收集？

A.抽滤

B.筛绢浓缩

C.自然沉降

D.离心收集 连续流离心机

E.生物吸附剂

A B C D

普通离心机收集

四、藻种室常用藻类

藻种室概况

• 海洋藻类保种中心（Center for Collections of Marine Algae，CCMA）创建于2005年，藻种

库现保存有蓝、绿、硅、甲、裸、隐、金、黄等藻类，主要以蓝、甲、硅、绿赤潮藻为主，共计410株系（60株硅藻未定种）。• 每年从台湾海峡、南海、东海及厦门港、极地分离新的株系，并运用分子生物学及扫描电镜等技术进行鉴定。

特殊种保藏室

藻种培养室

无菌保种室 藻类筛选系统

藻株海区分布

国重藻类主要用途

1.甲藻基因组学2.光生物学3.海洋酸化4.蛋白质组学5.生态毒理6.生物毒素7.生物饵料…生物吸附/高分子材料/能源微藻/压舱水处理/保健品…

甲藻：Alexandrium (亚历山大属), Prorocentrum (原甲藻属), Karenia (凯伦藻属), Gymnodinium (裸甲藻属),哈卡藻属（Akashiwo）,前沟藻属（Amphidinium）

硅藻:Thalassiosira (海链藻属), Nitzschia (菱形藻属), Skeletonema (骨条藻属), Phaeodactylum (褐指藻属), Coscinodiscus (圆筛藻属)，角毛藻属（Chaetoceros）

绿藻：微绿球藻 (Nannochloropsis oceanica), Platymonas sp.(扁藻), Chlorella sp.(小球藻), Dunaliella Salinā (盐藻)

蓝藻:Trichodesmium (束毛藻), Synechococcus (聚球藻)

金藻:Prymnesium parvum (小定鞭金藻), Isochrysis galbana (球等鞭金藻 ), Dierateria zhanjiangensis (湛江叉鞭金藻), Chrysophyta.sp (金藻sp.).

其他海洋卡盾藻(Chattonella marina)，球形棕囊藻(Phaeocystis globosa),赤潮异弯藻 (Heterosigma akashiwo)

使用频率最高的藻类：

甲藻

甲藻

硅藻

硅藻

蓝藻/绿藻/其他

网络收集的图片

网络收集的图片-手绘

长耳齿状藻

海洋微藻BBS： http://www.icmpb.com

MEL种质中心http://mel.xmu.edu.cn/gomap/ccma

谢 谢 大 家 ！

千人群：145506174，欢迎加入！

生命微观上的随机无序与宏观个体表现出来有序

未完全定种