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微生物の力だけ： 担子菌を用いた木質資源からのエタノール生成
宮崎大学農学部 森林緑地環境科学科 准教授 亀井一郎
従来技術とその問題点
前処理 （脱リグニン） 糖化
酸触媒，高温，高圧
アルカリ処理 酵素処理
発酵
発酵（酵母）
課題
前処理への投入エネルギー、薬品の環境負荷 糖化用酵素のコスト 発酵効率（おもにヘキソースの発酵性）
新技術の特徴・従来技術との比較
木材 セルロース グルコース エタノール
嫌気条件 好気条件
Phlebia sp. MKFC40001株単独で，前処理から発酵までを完結する 利点： すべて生物反応，薬品，熱処理がいらない。糖化酵素がいらない。
薬品 熱
酵素 酵母
コスト↑ コスト↑
バイオエタノール生産既存技術
本発明の骨子
脱リグニン前処理 セルロースの 糖化・発酵
植物細胞壁の主要成分のひとつであるリグニンを分解することが出来る微生物。
リグニン（モデル構造）
低分子化、無機化可能
Lignin peroxidase, Manganese peroxidase, Laccase
カワラタケ
白色腐朽担子菌 White-rot fungi
ワンポットエタノール発酵
必要条件： リグニン分解能 セルロース糖化能 エタノール発酵能
白色腐朽菌
結論：エタノール発酵能を持った白色腐朽菌
脱リグニン セルロース糖化 発酵
白色腐朽菌 Phlebia sp. MKFC40001について
沖縄マングローブ林で採取された高塩濃度条件下で生育可能でかつ高塩濃度条件下で高いリグニン分解活性を持つ白色腐朽菌 （Xin et al. 2002）
熱帯、亜熱帯沿岸に茂るマングローブ林 満潮になると海水に浸る環境 陸上の森林と大きく異なる環境
塩添加に応答してリグニン分解酵素遺伝子の発現が誘導される特殊な性質を持つ． （Kamei et al. 2008）
Labo
rato
ry o
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nce
スクリーニングにより，本菌がセルロースからエタノールを直接生成できることが明らかになった。
0
5
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0 24 48 72 96 1200
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5
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0 24 48 72 96 120
Con
cent
ratio
n (g
/l)
Con
cent
ratio
n (g
/l)
Con
cent
ratio
n (g
/l)
Con
cent
ratio
n (g
/l)
time (h) time (h)
time (h) time (h)
A B
C D
Phlebia sp. MKFC40001によるヘキソースの発酵
glucose
mannose
galactose
fructose
sugar ethanol
収量 0.40 g/g sugar
収量 0.41 g/g sugar
収量 0.44 g/g sugar
収量 0.41 g/g sugar
変換率 86.9%
変換率 79.0%
変換率 79.5%
変換率 78.2%
すべての六炭糖を効率よくエタノールに変換することが出来る． Labo
rato
ry o
f For
est B
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0 24 48 72 96 120
Con
cent
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n (g
/l)
Con
cent
ratio
n (g
/l)
time (h) time (h)
A B xylose arabinose
0
5
10
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0 24 48 72 96 120
Phlebia sp. MKFC40001によるペントースの発酵 sugar ethanol
収量 0.33 g/g sugar 変換率 65.0%
エタノール生産は観察されず
六炭糖よりも時間はかかるものの，Phlebia sp. MKFC40001は120時間の培養でxyloseをすべて消費し，エタノールを生産できる．
初期濃度に対して理論収率の65.0%のエタノールが生産された．
xylitol
Labo
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20
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0 120 240 3600
5
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0 120 240 360
Con
cent
ratio
n (g
/l)
Con
cent
ratio
n (g
/l)
time (h) time (h)
A B maltose cellobiose
Phlebia sp. MKFC40001による二糖類の発酵 sugar ethanol
培養の初期にグルコースの産生が観察され，その後エタノールの生産が見られる．
加水分解→エタノール発酵が起こっていることが示された．
マルトースよりもセロビオースの消費およびエタノール生産が早く，β-グルコシダーゼ活性が高いことが考えられる．
glucose
Labo
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1
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0 100 200 300
Con
cent
ratio
n (g
/l)
Con
cent
ratio
n (g
/l)
time (h) time (h)
A B
Phlebia sp. MKFC40001による広葉樹未晒クラフトパルプの発酵
半好気条件（シリコン栓） 好気条件（シリコ栓）
使用した広葉樹未晒クラフトパルプ1 gから硫酸加水分解で得られる糖 Glucose: 803 mg, xylose: 174 mg, galactose 2 mg
最大エタノール収量理論値：499.8 mg/ g 広葉樹KP
収量 0.36 g/g KP
理論収率の71.8%がエタノールに変換された．
glucose ethanol
cellobiose
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Phlebia sp. MKFC40001による新聞紙の発酵（菌の接種方法による違い）
菌糸体プラグ 菌糸体の破砕物
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Con
cent
ratio
n (g
/l)
time (h) Table 1 Chemical composition of UHKP and waste news paper (w/w %)
Substrate
Glucan* Xylan* Mannan* Arabinan* Garactan* Lignin Recovery
UHKP 82.0 17.0 0.2 ND ND 2.5 101.7
Newspaper 58.5 7.8 4.8 ND ND 15.2 85.8
ND: Not detected *Each value was calculated from the composition of sulfuric acids hydrolysate of each substrate.
理論収率の51.1%がエタノールに変換された．
菌体の接種法を変えるだけで生成速度も上昇した。
新聞紙はリグニンやインクを多く含む。
不純物を含むセルロース材料でも発酵が可能
先行研究との比較（グルコース，キシロース）
Fungus Ethanol (g/g glucose) Ethanol (g/g xylose)
Rhizopus oryzae 0.41 0.28
Mucor corticolous 0.43 0.15
Mucor indicus 0.39 0.22
Saccharomyces cerevisiae 0.42
Peniophora cinerea
Trametes suaveolens
Phlebia sp. MKFC40001
0.41 0.09
0.39 0.06
0.44 0.33
グルコースからのエタノール収量は酵母並みに高い．キシロースについても既報に比べて各段に高い収量を示す．
白色腐朽菌
酵母
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Phlebia sp. MKFC40001を用いた広葉樹木粉の脱リグニンとエタノール発酵
Phlebia sp. MG-60は白色腐朽菌なので，好気的な脱リグニン処理とその後の糖化，エタノール発酵が単一菌で可能ではないかと考えた．
約80%の含水率に調製したコナラ木粉 （乾燥重量：400 mg）
14日間28℃ 暗所で培養 （脱リグニン）
実験
PDA培地で培養した菌糸片を接種
シリコ栓
20 mlの発酵用液体培
地を加え，シリコン栓で通気を遮断
所定期間28℃ 暗所で培養 （糖化，発酵）
分析
シリコン栓
シリコン栓
14日間28℃ 暗所で培養
Ａ
Ｂ
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Phlebia sp. MKFC40001の菌糸体（PDA培地上）
未処理の木粉
MKFC40001によるリグニンの分解（８週後）
白くなる
発酵中
菌糸 前処理
発酵
エタノール
嫌気条件 好気条件
0
100
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400
500
600
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900
0 14 28 42 56
Am
ount
of c
ompo
nent
s (m
g)
Incubation time (day)
リグニン
グルカン
菌処理木粉重量
好気条件下で生物的脱リグニン前処理 嫌気条件に切替えてエタノール発酵
木材 エタノール
図 好気条件下での前処理期間中の主成分の変動
コントロール木粉重量
キシラン
白色腐朽菌Phlebia sp. MKFC40001を用いた脱リグニン同時糖化発酵
好気条件での生物的脱リグニン処理でリグニン含有量が大きく減少し、一方でグルカン（グルコースポリマー）含有量は大きな変化がない。
選択的なリグニンの分解
嫌気条件 好気条件
好気条件下で生物的脱リグニン前処理
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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20Incubation time (day)
Eth
anol
con
vers
ion
rate
(%)
嫌気条件に切替えてエタノール発酵
木材 エタノール
図２ 前処理期間とエタノール変換率の関係
●前処理56日 ○前処理42日 ■前処理28日 □前処理14日 ◇前処理0日
白色腐朽菌Phlebia sp. MKFC40001を用いた脱リグニン同時糖化発酵
好気条件下での前処理期間が長くなるにつれ、エタノール変換率も高くなる。
注目点 本実験で，木材からエタノールを生成するのに要したのは，菌と水と発酵用培地のみであること。
嫌気条件 好気条件
好気条件下で生物的脱リグニン前処理 嫌気条件に切替えてエタノール発酵
木材 エタノール
白色腐朽菌Phlebia sp. MKFC40001を用いた脱リグニン同時糖化発酵
嫌気条件 好気条件 木材 エタノール
白色腐朽菌Phlebia sp. MKFC40001を用いた統合バイオリファイナリー
乳酸 酢酸 その他有価物
期間の短縮化
生産可能製品の多様化
検討課題
想定される用途
①木質系廃材，林地残材からのエタノール生産 ②紙パルプ系廃棄物からのエタノール生産 ③きのこ廃菌床等食品廃棄物からのエタノール生産
また，遺伝子組換えによる分子育種で最終製品の多様化が期待できる。
実用化に向けた課題
・ 全プロセス完結に要する時間の短縮化
現在最も厳しい条件で培養しているため，培養条件を改善することで，期間短縮が可能
・ エタノール耐性の向上
変異株の取得および分子育種による改善を検討中
・ 様々なバイオマス種に対する特異性と効果
バイオマス種に対応した微生物種の適用により解決可能
企業への期待
・ 様々な形態のセルロース系廃棄物を供給可能な企業との共同研究を希望する。
・ 木質系廃材からのバイオエタノール生産を考えている企業には，本技術の導入が有効であると思われる。
・ 処理に必要な時間については，各種バイオマス材料に対応して処理条件を最適化したり，分子育種を進めることで大幅に短縮することが可能である。
本技術に関する知的財産権
• 発明の名称：担子菌を用いるエタノールの製造方法 • 出願番号 ：PCT/JP2012/055444 • 出願人 ：宮崎大学，九州大学，静岡大学 • 発明者 ：亀井一郎、目黒貞利、近藤隆一郎、 森智夫、平井浩文
