炎症・再生　Vol.23 No.1 2003578 Mini Review　皮膚の炎症性疾患におけるmatrix metalloproteinase-9の役割―Leptomycin B投与による治療の可能性について―

Mini Review

皮膚の炎症性疾患におけるmatrix metalloproteinase-9の役割－Leptomycin B 投与による治療の可能性について－

小林孝志千葉大学医学部附属病院皮膚科

Role of matrix metalloproteinase-9 expression on cutaneous inflammation: Possible treatment by leptomycin B appli-

cation

Matrix metalloproteinase-9 has been suggested to play many roles in the inflammation including bullous

disease, tumor invasion and metastasis, ultraviolet (UV) B-irradiated dermatosis, and dyskeratosis. We previ-

ously showed the upregulation of MMP-9 transcripts due to KRE-M9 element in the MMP-9 promoter in the

differentiation of keratinocytes.

Recently, much attention has been paid to leptomycin B (LMB), a modulator for trafficking a variety of

transcription-related proteins from nucleus to cytoplasm.

By the addition of LMB for kertinocytes in culture, MMP-9 secretions were reduced in comparison with MMP-2,

even in the up-regulations of MMP-9 expression in high calcium or in the addition of transforming growth factor-β,

both of which cause the differentiation of keratinocytes, and in the additions of tumor necrosis factor-α or

interleukin-1α, inflammatory and apoptotic cytokines. In addition, KRE-M9 as well as other elements including

12-o-tetradecanoyl-o-phorbol-13-acetate responsive element was shown to be responsible for the reduced

MMP-9 transcription by LMB.

Topical applications of LMB on the murine skin after UVB irradiation prevented the skin from the dyskeratosis

and from the infiltrates of inflammatory cells.

These results indicate that the applications of LMB and of its derivatives could be a useful remedy for many

pathological conditions in which MMP-9 are involved.

Rec.4/1/2004, Acc.5/31/2004, pp578-583

Takashi Kobayashi

Department of Dermatology/Clinical Biology of Extracellular Matrix (F7),

Chiba University School of Medicine

KKKKKey wey wey wey wey wooooordsrdsrdsrdsrds matrix metalloptoteinase-9, leptomycin B, inflammation, keratinocyte, skin

はじめに　細胞外マトリックス成分に対する生体内分解酵素とし

て様々な分子が報告されてきた1)．それらの中でmatrix

metalloproteinase(MMP)群は，Ⅰ型コラーゲンを律速段階

で分解する酵素として1960年代に発見されたコラゲナー

ゼに始まり，現在まで少なくとも28種類が報告されてい

る．これまでの諸家による検討から，MMPsの組織代謝に

果たす役割が多臓器において広範囲にわたることが示さ

れている．皮膚科領域も例外ではなく，最近ではMMP-9

の炎症時での役割が注目されている．筆者もMMP-9に関

して性状検討を重ねてきた一人で ある．本稿では，これ

まで報告されてきたMMP-9の皮膚での役割について ，ま

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た筆者が見い出したMMP-9 の新たな産生阻害物質，

leptomycin B (LMB)の皮膚での抗炎症効果の可能性につい

て概説，報告する．

皮膚病態におけるMMP-9の役割　MMP-9はMMP-2とともにジェラティネイス (gelatinase)

として知られ，元来，変性コラーゲン (gelatin) を分解す

る酵素として発見，命名されたが，1980年代に本2酵素

が基底膜に特異的に存在するⅣ型コラーゲンを分解する

ことが報告され，悪性腫瘍の浸潤，転移に関わる重要な酵

素としてにわかに注目された2)．また，1）紫外線による

皮膚の炎症，老化に関わること3)，2）血管新生に関わる

こと4)，3）潰瘍などの創傷治癒に関わること5)，が従来よ

り示されてきた．さらに最近の遺伝子ターゲティング法

による検討から，1）MMP-9欠失マウスでは類天疱瘡の水

疱形成モデルで水疱を生じないこと6)，2）癌の浸潤転移

に際して腫瘍細胞よりも周囲の炎症細胞由来のMMP-9が

より重要な役割を果たすであろうこと7)，が明らかにされ

た．　　

　筆者らは，皮膚病理組織切片上での抗MMP-9単クロー

ン抗体を用いた免疫組織学的検討やin situジェラティンザ

イモグラフ法による検討から，MMP-9が，1）炎症を伴う

癌の浸潤部位8,9)，2）悪性あるいは良性の異常角化組織8-10)，

に局在することを確認した． その後，培養ヒト表皮角化細

胞(keratinocyte, 以下KC)の系を用いてMMP-9が，高カル

シウムやtransforming growth factor(TGF)-β添加刺激など，

分化誘導時にMMP-2と比較して選択的に発現誘導される

ことを確認した11,12)． 　　　

　また，MMP-9プロモーター上に存在するKRE-M9と命

名したelementが，近接する12-o-tetradecanoyl-phorbol-13-

acetate(TPA)responsive elementとともにMMP-9発現に重

要であること13)，KCを未分化に保つためにKRE-M9に結

合する蛋白が存在することを見出し，本蛋白をdifferentia-

tion repressingfactor (DRF)-1 と命名，報告した14)．

　MMP-9分泌細胞は多岐にわたり，KCの他ランゲルハ

ンス細胞，マクロファージや多形核白血球に加え，

HT1080など種々の培養腫瘍細胞系が知られ5,15)，他に線維

芽細胞でもサイトカインの刺激により分泌する16)． MMP-9

の基質は，上述した変性コラーゲンやIV型コラーゲンの

他，V，VII，XVII型コラーゲン，エラスティン，ファイ

ブロネクティンなど様々な細胞外マトリックス成分，ま

たα1-antitrypsin などの酵素阻害物質が報告され，他に

TGF-β，tumor necrosis factor(TNF)-α，interleukin(IL)-1α

などのサイトカインの 前駆体を基質として分解，活性化

することも示されている5)．

　このように皮膚を含めた多臓器でのMMP-9 発現が炎症

病態に関わることが想定され，今後はMMP-9の酵素活性

を制御し，種々の炎症病態を治療することを目的とした

研究が盛んに行われるであろうと考えられる．

　実際，すでにMMP-9活性の阻害物質については悪性腫

瘍の増殖に関わる血管新生を抑制する報告がある4)．

新たなMMP-9産生阻害物質　近年，細胞内で核と細胞質とを交通する蛋白質につい

ての研究が進み，次々と新たな知見が得られてきた．これ

らの中で，nuclear export signal(NES)を持つ蛋白質がCRM1

と結合して核外に輸送されること，LMBがこの輸送を阻

害する物質であることが明らかとなった17)．LMBは，も

ともと放線菌由来の抗真菌作用を持つ抗生物質として発

見された脂肪酸の一種である18). NES を持つ蛋白質には

種々の遺伝子発現に関わる転写因子関連分子群が挙げら

れる．これらのことから，LMBの生物学的活性が重要で

あることは推測されるが，以前から主に細胞増殖の抑制

活性には注目されていたものの18)，具体的な組織代謝に

果たす役割についてはこれまで報告されていない．

　さて，MMP-9はMMP-2と異なりプロモーター領域に

様々な調節領域が存在し，多くの転写因子が遺伝子発現

に関わることが報告されてきた13-15)．最近筆者は，LMBが

MMP-9発現に関わる作用を担う可能性があると推測，検

討し報告した19)．以下に概要を述べさせていただきたい．

培養ヒトケラチノサイト由来MMP-9発現のLMBによる制御　MMP-2とMMP-9の基質，ジェラティンをあらかじめ

ゲル中に含ませておき，電気泳動後ゲルごと酵素反応さ

せ，染色，脱色することで酵素活性が透見されるジェラ

ティンザイモグラフ法をKCの培養上清について検討する

と，MMP-2 とMMP-9の分泌が証明される（図1）．MMP-2

とMMP-9はいずれも他のMMPsと同様に潜在型として分

泌され，プロテオライシスを受けて活性化されるが，本

法では潜在型のMMP-2とMMP-9，部分活性化型のMMP-9

が確認される（図1）11)．また，本法は定量性があり12, 16, 20)，

上述したように高カルシウムやTGF-β添加による培養

KCへの分化刺激，またTNF-α，IL-1α添加による炎症惹

起刺激によりいずれも，MMP-2と比較して潜在型および

部分活性化型どちらのMMP-9の分泌量も選択的に増加す

ることが確認された（図1A）． しかしながら，LMBの添

加により上述のいずれの刺激下あるいは非刺激下におい

て，潜在型および部分活性化型MMP-9の選択的な分泌量

の減少が認められた（図 1B-F）．また筆者らは，これらの

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図1 ヒト表皮角化細胞の培養上清を用いたジェラティンザイモグラフ法の結果

表皮角化細胞はMMP-9 およびMMP-2を分泌し，高カルシウム(1.5 mM, lane Ca)，およびTGF-β (1 ng/ml, lane TGF)，TNF-α(10 ng/ml, lane TNF)，IL-1α (10-10

M, lane IL1)添加刺激後24時間の培養上清中，MMP-2 と比較してMMP-9の選択的分泌誘導を認めた (A)．しかし , 非刺激 (B)，高カルシウム(1.5 mM, C)およびTGF-β (1 ng/ml, D)，TNF-α (10ng/ml, E)，IL-1α (10-10 M, F)添加刺激において，LMB を添加(0.4 nM (lanes 0.4), 2 nM (lanes2)，10 nM (lanes 10))すると，LMB非添加 (lanes 0)に比べて，濃度依存的にMMP-9 の選択的分泌抑制を認めた．矢尻は 部分活性化型MMP-9を示す11)．

図2 MMP-9プロモ－タ－領域の模式図（A）と 塩基配列（B）およびルシフェレイスアッセイの結果（C）

KRE-M9はTATA boxの近傍，TREとも近接して存在し（A,B），培養表皮角化細胞にKRE-M9を含むコンストラクトで transfect 後 12時間でプロモーター活性を測定した結果，LMB（5nM）添加によるMMP-9転写活性の抑制にKRE-M9が関与することが示された（C）．(columnの長さ：trip-licated dataの平均値，error-barの長さ：標準偏差)

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図3　UVB照射後マウス皮膚の炎症におけるLMB局所投与の効果8週齢のヘアレスマウス（Hos: HR-1）を1週間予備飼育した後，背部に約3 minimal erythemadose (300 mJ/cm2)のUVBを照射（A,C），照射直後および24時間後の2回，エタノールで希釈したLMB（20 nM）を局所塗布（C,D），エタノールのみを局所塗布した皮膚（A,B）間の比較で，UVB照射により，表皮の極性の乱れと異常角化，真皮および脂肪組織の炎症性細胞浸潤を認めた（A）．UVB照射皮膚へのLMBの局所投与により，表皮は極性の異常を認めず，真皮および脂肪組織の細胞浸潤の抑制を認めた（C）．非照射皮膚へのLMB塗布で明らかな変化は認めなかった（D）．ヘマトキシリン・エオジン染色標本 （barの長さ: 100 μm）

いずれの条件でもKC中のMMP-9 mRNA量が分泌量と同

様の変化をすることを確認した19)．

LMBによるMMP-9プロモーター活性についての効果　ヒトMMP-9プロモーターには，NF-κB，少なくとも3

つのTPA responsive element (TRE) の他，多くの調節領域

があることが報告されている13-15)．筆者らが見出した

KRE-M9は，転写開始部位に最も近いTREのさらに下流

で，TATAボックスとの間に存在する（図2A,B）13-15)．培

養KCを用いたルシフェレイスアッセイによる検討から，

LMBのMMP-9転写活性に対する抑制効果にもKRE-M9

が重要であることが証明され， 本調節にもDRF-1が関わる

ことが示唆された（図2C）．また，KRE-M9に変異を起こ

しKRE-M9 近傍のTREのみを含む-80からのコンストラ

クト，およびKRE-M9と近傍のTREのどちらにも変異を

起こし，-714からの上流配列を含むコンストラクトでも

同様なLMBによる抑制効果を認め，LMBによるMMP-9

転写抑制には多領域が関わり，協調的に生じることを確

認した19)．

LMB投与による抗炎症作用についての効果　上述したように，MMP-9は紫外線，特にultraviolet (UV)

B照射による炎症反応に関わることが報告されている3)．

筆者らも培養KCに直接UVBを照射した系で，高カルシ

ウムやTGF-β，TNF-α，IL-1αのサイトカイン添加刺激

時と同様に，MMP-2と比較してMMP-9の選択的分泌誘

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導を確認している21)．

　そこでin vivoでのLMBの抗炎症効果について，実際に

マウスへのUVB 照射皮膚をモデルとして検討した．1

minimal erytema dose(MED)は，照射後24時間で皮膚に紅

斑を生じる最小エネルギー量を表わし，一般にこれ以上

の照射量で炎症反応を生じる．約3 MED (300 mJ/cm2)の

UVB照射により，48時間後の皮膚では病理組織学的に非

照射皮膚と比較して，表皮では極性が乱れ異常角化，真皮

および脂肪組織では炎症性細胞浸潤を認めた（図3A, B）．

しかしながら，20 μMのLMBを照射直後と24時間後に

2回塗布することによって，UVB照射後でも表皮は極性

を保った角化を呈し，真皮，脂肪組織の細胞浸潤も抑制さ

れた（図3C）．なお，非照射皮膚へのLMB塗布では明ら

かな変化を認めなかった （図3D）．

　このUVB照射皮膚へのLMBの効果は2 μMでもほぼ

同程度であったが，濃度を薄めると弱くなり，20 nMでは

表皮に極性の乱れ，表皮下に若干の細胞浸潤を認めた19)．

さらに，マウス皮膚のホモジェネイト検体を用いてジェ

ラティンザイモグラフ法を行った結果，非照射皮膚と比

較してUVB照射皮膚ではMMP-9 発現が誘導されるが，

LMB投与でのUVB照射皮膚ではこの誘導が抑制される

ことを確認した19)．

おわりに　このように，皮膚の炎症性疾患に際してMMP-9が重要

な役割を果たすことが報告されており，今後MMP-9活性

を制御する検討が様々な疾患に対する治療法の開発とし

て期待される．今回はLMB投与による治療の可能性につ

いて述べたが，本剤の局所投与は少なくとも UVB照射に

よる炎症には有用であることが示された．

謝　辞

　稿を終えるにあたり，寄稿の機会をお与えいただいた聖マリアン

ナ医科大学内科教授，中川武正先生，ならびに研究に際し技術援助

いただいた尾之上聡様，及川綾子様に深謝致します．

文　　献1) 小林孝志：真皮結合組織代謝異常－線維成分異常．最

新皮膚科学大系第10巻，中山書店，東京，2003, pp2-

13.

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