Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. EFECTO

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

Posgrado en Materiales Poliméricos

EFECTO DE LA MODIFICACIÓN QUÍMICA Y TÉRMICA EN LAS PROPIEDADES DE

ANDAMIOS DE QUITOSANO PARA REGENERACIÓN ÓSEA

Tesis que presenta

M. I.S MARTHA GABRIELA CHUC GAMBOA

En opción al título de

DOCTOR EN CIENCIAS

(MATERIALES POLIMÉRICOS)

Mérida, Yucatán, México. Mayo de 2020

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CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA DE YUCATÁN, A. C. POSGRADO EN CIENCIAS MATERIALES POLIMÉRICOS

RECONOCIMIENTO

Por medio de la presente, hago constar que el trabajo de tesis de Martha Gabriela

Chuc Gamboa titulado “Efecto de la modificación química y térmica en las

propiedades de andamios de quitosano para regeneración ósea” fue realizado en la

Unidad de Materiales del Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C., bajo

la dirección del Dr. Juan Valerio Cauich Rodríguez, y pertenece al Programa de

Posgrado en Materiales Poliméricos de este Centro.

Esta tesis tiene orientación al desarrollo socioeconómico de la región en el área de

Biomateriales.

Atentamente.

Mérida, Yucatán, México, a 23 de mayo de 2020.

Dra. Cecilia Hernández Zepeda

Directora de Docencia

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DECLARACIÓN DE PROPIEDAD

Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, le pertenece patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C., y en el mismo tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o desarrollos tecnológicos, en lo especial, estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo expuesto en la presente Declaración.

Firma:

Nombre: M.I.S Martha Gabriela Chuc Gamboa

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DEDICATORIA

A mis padres y hermanos.

Porque de él, y por él, y para él, son todas las cosas. A él sea la gloria por los siglos Romanos 11:36

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AGRADECIMIENTOS

A mi director de tesis, Dr. Juan Valerio Cauich Rodríguez por las enseñanzas, paciencia y guía durante la realización de este proyecto. A mi comité tutorial, Dr. José Manuel Cervantes Uc, Dr. Amaury Pozos Guillén, Dr. Fernando Hernández Sánchez, Dr. Julio San Román por sus excelentes sugerencias y aportaciones. Al Dra. Diana María Escobar García de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí por su apoyo en los ensayos de biocompatibilidad. A la I.Q.I. Rossana Faride Vargas Coronado, por el valioso apoyo técnico logístico. Al Dr. Alejandro May Pat y el Proyecto 268595 por su colaboración con el análisis de AFM A la Dra. Patricia Quintana Owen, al Mtro. Daniel Aguilar, y al Ing. Wilian Cauich del CINVESTAV-Mérida del Instituto Politécnico Nacional. A mis maestros y al Coordinador del Posgrado en Materiales Poliméricos Dr. Francis Avilés Cetina. A mis compañeros de laboratorio: José Tec, Omar Castillo, Fernando Aguilar, David Aguilar, Marcos Bonilla, Guido Zapata, Beatriz Maldonado, Carlos Díaz. Al Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. Al Laboratorio Nacional de Nano y Biomateriales (LANBIO), Cinvestav-IPN, Unidad Mérida. Proyecto FOMIX-Yucatán 2008-108160 and CONACYT LAB-2009-01 No. 12391, CONACYT 1360 (Fronteras de las Ciencia) y 248378 (Atención a Problemas Nacionales). Al Laboratorio de Ciencias Básicas de la Facultad de Estomatología de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí. En especial a mis compañeros Abraham Muñoz, Vicente Esparza, Josué Bermeo, Noé Carreón, Claudia Castorena, Alba García, Magdalena Hernández, Areli Limón. A los directivos de la Facultad de Odontología de la Universidad Autónoma de Yucatán, Dr. Fernando Aguilar Ayala, MIE. Celia Godoy Montañez, MOI. Marina E. Rejón Peraza, Dr. Mauricio Escoffie Ramírez. Así como a mis alumnas Paola Azueta y Carolina Cámara. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca otorgada número 339277, y por los apoyos otorgados a través de los proyectos que hicieron posible esta tesis.

i

ÍNDICE DEDICATORIA ....................................................................................................................... iii

LISTA DE FIGURAS............................................................................................................... iii

LISTA DE TABLAS ................................................................................................................. vi

I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1

II. HIPÓTESIS ........................................................................................................................ 5

III. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 5

Objetivo general .................................................................................................................. 5

Objetivos particulares ......................................................................................................... 5

CAPITULO 1. ANTECEDENTES ............................................................................................ 6

1.1 Ingeniería Tisular .......................................................................................................... 6

1.2 Soportes o andamios .................................................................................................... 8

1.3 Quitosano ................................................................................................................... 11

1.4 Polietilenglicol Diglicidil Éter ........................................................................................ 17

1.5 Ácido hialurónico ......................................................................................................... 18

CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................... 24

2.1 Materiales ................................................................................................................... 24

2.2 Métodos ...................................................................................................................... 24

2.2.1 Preparación de películas de quitosano sin agente entrecruzante, entrecruzadas con GA (glutaraldehído) y polietilenglicol diglicidil éter (PEGDE) secas 25°C y 150°C .. 24

2.2.2 Preparación de espumas de quitosano sin agente entrecruzante, entrecruzadas con GA y PEGDE .......................................................................................................... 25

2.2.3 Preparación de películas de quitosano y hialuronato de sodio, quitosano-ácido hialuronato de sodio entrecruzado con glutaraldehído y quitosano-hialuronato de sodio entrecruzados con polietilenglicol diglicil éter ................................................................ 25

2.2.4 Caracterización fisicoquímica de las películas de quitosano, quitosano-GA, quitosano-PEGDE, quitosano-HNa, quitosano-HNa-GA, quitosano-HNa-PEGDE ......... 26

Determinación de grupos de amino libres ...................................................................... 26

2.2.7 Estudios de viabilidad y proliferación celular ......................................................... 31

CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN....................................................................... 35

3.1 Andamios de quitosano, quitosano entrecruzado con glutaraldehído o polietilenglicol diglicil éter en forma de película ........................................................................................ 35

ii

3.1.1 Caracterización fisicoquímica de las películas de quitosano sin agente entrecruzante, entrecruzadas con GA (glutaraldehído) y polietilenglicol diglicidil éter (PEGDE) secas 25°C y 150°C....................................................................................... 35

3.2 Andamios de quitosano-hialuronato de sodio, quitosano- hialuronato de sodio entrecruzado con glutaraldehído y quitosano- hialuronato de sodio entrecruzados con polietilenglicol diglicil éter .................................................................................................. 76

3.2.1 Caracterización fisicoquímica de las películas de quitosano- hialuronato de sodio, quitosano- hialuronato de sodio entrecruzado con GA y quitosano- hialuronato de sodio entrecruzados PEGDE .................................................................................................. 76

3.2.2 Estudios de viabilidad celular y proliferación de los andamios de quitosano/AH, quitosano/AH entrecruzado con glutaraldehído y quitosano/AH entrecruzado con PEGDE ......................................................................................................................... 91

4. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 98

REFERENCIAS .................................................................................................................. 100

ANEXOS ............................................................................................................................ 117

Anexo 1 .......................................................................................................................... 117

Anexo 2 .......................................................................................................................... 118

Anexo 3 .......................................................................................................................... 119

Anexo 4 .......................................................................................................................... 120

Anexo 5 .......................................................................................................................... 121

Anexo 6 .......................................................................................................................... 122

iii

LISTA DE FIGURAS

Figura. 1.1. Estructura molecular de la quitina y el quitosano .............................................. 12

Figura. 1.2. Estructura molecular del ácido hialurónico ........................................................ 19

Figura. 2.1. Caja de 24 pozos con películas y lisozima para degradación enzimática ......... 31

Figura 3.1. Espectros de FTIR del quitosano en polvo de peso molecular medio, película de quitosano ácida y película de quitosano neutra. ................................................................... 36

Figura 3.2. a) Espectros de FTIR de las películas de quitosano secas a 25°C y b) secas a 150°C. CHT: películas de quitosano, CHT-GA: quitosano entrecruzado con glutaraldehído, CHT-PEGDE, quitosano entrecruzado con PEGDE 1,2,3. ................................................... 38

Figura 3.3. Espectro de FTIR del Polietilenglicol diglicidil éter (PEGDE). ............................. 39

Figura. 3.4. a) Película de quitosano seco a 25ºC en solución de HCl, b) Película de quitosano seco a 150ºC en solución de HCl ......................................................................... 41

Figura 3.5. Termograma DSC de la primera (a) y de la segunda (b) corrida de las películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA), quitosano entrecruzado con PEGDE 1, 2, 3 (CHT-PEGDE) secas a 25°C. .......................................... 43

Figura 3.6. Termograma DSC (a) y de la segunda (b) corrida de las películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA), quitosano entrecruzado con PEGDE 1, 2, 3 (CHT-PEGDE) secas a 150°C ...................................................................... 43

Figura 3.7. Análisis termogravimétrico (TGA) (a, b) y DTGA (c, d) de termogramas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA) y entrecruzado con PEGDE 1,2,3 (CHT-PEGDE) ................................................................................................ 45

Figura 3.8. Difractograma del polvo de quitosano ................................................................ 49

Figura 3.9. Difractograma de (a) películas de CHT, CHT entrecruzado con GA (CHT-GA), CHT entrecruzado con PEDGE 1,2,3 (CHT-PEDGE) secas a 25°C y (b) a 150°C. .............. 50

Figura 3.10. Espectros de inspección (survey) por XPS del quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA), y quitosano entrecruzado con PEGDE 1, 2, 3 (CHT-PEGDE) secas a 25°C (a) y a 150°C (b) ..................................................................... 54

Figura 3.11. Morfología de la superficie por MEB de las películas de CHT secas a 25°C (a) y 150°C (b) .............................................................................................................................. 57

Figura 3.12. Topografía 2D y Ra (nm) de las películas de quitosano secas a 25°C (superior, a - e) y con secado adicional a 150°C (inferior, f – j); a: CHT, b: CHT/PEDGE1, c: CHT/PEDGE2, d: CHT/PEDGE3, e: CHT/GA, f: CHT, g: CHT/PEDGE1, h: CHT/PEDGE2, i: CHT//PEDGE3, j: CHT/GA ................................................................................................. 58

Figura 3.13. Imágenes de los ángulos de contacto en H2O (a) y DMEM (b) de las películas de quitosano secas a 25°C y con secado adicional a 150°C ................................................ 60

Figura 3.14. Curvas esfuerzo-deformación típicas de películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA), y quitosano entrecruzado con PEGDE 1, 2, 3 (CHT-PEGDE) secas a 25°C. .................................................................................... 62

iv

Figura 3.15 Degradación enzimática con lisozima de películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con GA (CHT/GA) y quitosano entrecruzado con PEGDE 1,2,3, (CHT/PEGDE) secas a 25°C (TA) y 150°C (S), en (a) PBS y (b) BES. ................................. 65

Figura. 3.16 (a) Viabilidad de osteoblastos en contacto directo (D) e indirecto (I) en películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA) y quitosano entrecruzado con PEDGE 1,2,3 (CHT-PEDGE) secas a 25°C y (b) 150°C. .......................... 69

Figura 3.17. Gráfica de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de proliferación celular por MTS a) Secado 25°C contacto directo, b) Secado 25°C contacto directo, c) Secado 150°C contacto directo, d) Secado 150°C contacto indirecto .................. 70

Figura 3.18. Imágenes por MEB de osteoblastos cultivados en andamios de CHT en contacto directo e indirecto, secados a 25°C y a 150°C. ...................................................... 71

Figura 3.19. (A-J) Imágenes de fluorescencia de osteoblastos cultivados en andamios de CHT marcados con vinculina (7F9): sc-73614, durante 48 h. (K-T) Imágenes de fluorescencia de osteoblastos cultivados en andamios de CHT marcados con intregrina 1β (A-4) durante 48 ............................................................................................................................................. 73

Figura 3.20 (a) Viabilidad de osteoblastos en contacto directo (D) e indirecto (I) en espumas quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA) y quitosano entrecruzado con PEDGE 1, 2, 3 (CHT-PEDGE) ................................................................. 74

Figura 3.21. Gráfica de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de proliferación celular por MTS de espumas de quitosano en a) contacto directo, b) contacto indirecto................................................................................................................................ 75

Figura 3.22. Espectro FTIR del hialuronato de sodio en polvo (HA-p) y de las películas de hialuronato de sodio con ácido acético (HA-f)....................................................................... 76

Figura 3.23. Espectros de FTIR de las películas de a) CHT/HA15%, CHT/HA15% entrecruzadas con glutaraldehído (CHT- HA15%-GA) y entrecruzadas con PEDGE (CHT-HA15%-PEDGE1, 2, 3) y b) de las películas de CHT/ HA30%, CHT/ AH30% entrecruzadas con glutaraldehído (CHT- HA30%-GA) y entrecruzadas con PEDGE (CHT-HA30%-PEDGE1, 2, 3) ...................................................................................................................................... 77

Figura 3.24. Espectro Raman de películas hialuronato de sodio en polvo ........................... 80

Figura 3.25. Espectros Raman de películas de quitosano a) CHT/HNa15% y entrecruzadas con PEDGE (CHT-HA15%-PEDGE 1, 2, 3) y b) de las películas de CHT/ HNa 30%, CHT/ HNa 30% entrecruzadas con PEGDE (CHT-PEGDE 1,2,3) .................................................. 81

Figura 3.26. Análisis termogravimétrico (a, c) y DTGA (b, d) de termogramas (superior) quitosano/HNa 15% (CHT-HA15%), (inferior) quitosano/ HNa 30% (CHT-HA30%), quitosano / HNa 15% y 30% entrecruzado glutaraldehído (CHT-HA 15% y 30%-GA) y quitosano HNa 15% y 30% entrecruzado con polietilenglicol diglicidil éter (CHT-HA 15% y 30%-PEGDE)... 82

Figura 3.27. Difractograma del ácido hialurónico ................................................................. 84

Figura 3.28. Difractogramas de las películas de (a) quitosano-HNa 15%, (CHT-HA15%), CHT-AH15% entrecruzado con glutaraldehído (CHT-HA15%GA), CHT/HNa entrecruzado con PEDGE (CHT-HA15%PEDGE 1,2,3) (b) quitosano-HNa 30% (CHT-HA30%), CHT-

v

HNa15% entrecruzado con glutaraldehído (CHT-HA30%GA), CHT/HNa entrecruzado con PEDGE (CHT-HA30%PEDGE 1,2,3) .................................................................................... 85

Figura 3.29. Espectros de inspección (survey) de XPS de (a) quitosano- NHa 15%, (CHT-HA15%), CHT- NHa 15% entrecruzado con glutaraldehído (CHT-HA15%GA), CHT- NHa entrecruzado con PEDGE (CHT-HA15%PEDGE 1,2,3) (b) quitosano-AH 30% (CHT-HA30%), CHT- NHa 15% entrecruzado con glutaraldehído (CHT-HA30%GA), CHT- NHa entrecruzado con PEDGE (CHT-HA30%PEDGE 1,2,3) ....................................................... 87

Figura 3.30. Imágenes y valores obtenidos de las películas de quitosano modificadas con HNa al 15% y 30%, y de las películas de quitosano modificadas con HNa entrecruzadas con PEGDE 1, 2 y 3 y con GA..................................................................................................... 88

Figura 3.31. Topografía 2D de las películas de quitosano con HNa al 15% (superior, a - e) y al 30% (inferior, f – j); a: CHT, b: CHT/PEDGE1, c: CHT/PEDGE2, d: CHT/PEDGE3, e: CHT/GA, f: CHT, g: CHT/PEDGE1, h: CHT/PEDGE2, i: CHT/PEDGE3, j: CHT/GA. .......... 90

Figura 3.32. (a) Viabilidad de osteoblastos en contacto directo en películas de quitosano (CHT) con ácido hialurónico (AH) al 15% y 30%, y de quitosano- ácido hialurónico entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA) y quitosano-ácido hialurónico entrecruzado con PEDGE (CHT-PEDGE) a 0.114 mM (1), 0.228 mM (2) y 0.342 mM (3) ................................ 92

Figura 3.33. Gráfica de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de proliferación celular por MTS de los andamios de quitosano con HNa al 15% y 30%. .......... 93

Figura 3.34. Gráfica de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de proliferación celular por MTS de andamios de quitosano con HNa a) 15% b) 30% .............. 95

Figura. 3.35. Imágenes por MEB de osteoblastos cultivados en andamios de CHT/AH en contacto directo e indirecto. .................................................................................................. 97

vi

LISTA DE TABLAS

Tabla 1.1 Ejemplos de andamios a base de quitosano, ácido hialurónico y quitosano/ácido hialurónico para ingeniería tisular ósea reportados en la literatura ....................................... 23

Tabla 3.1. Porcentaje de grupos amino en películas de quitosano y películas de quitosano entrecruzado, secadas a 25ºC y a 150ºC ............................................................................. 41

Tabla 3.2 Entalpía de evaporación de la primera corrida de películas de quitosano y películas de quitosano entrecruzado, secas a 25ºC y a 150ºC ............................................................ 44

Tabla 3.3 Temperaturas máximas y pérdida de peso de las películas CHT .......................... 47

secas a 25°C y 150°C. ......................................................................................................... 47

Tabla 3.4. Porcentaje de cristalinidad de películas CHT secas a 25°C y 150°C. .................. 52

Tabla 3.5 Resultados de la distancia intermolecular (d) de las películas de quitosano secadas a 25°C obtenidos mediante la Ley de Bragg ......................................................................... 53

Tabla 3.6. Porcentaje atómico por EDX de C, O, N de películas de quitosano entrecruzadas con GA y PEGDE secas a 25 ° C y 150 ° C. ......................................................................... 53

Tabla 3.7. Porcentaje atómico por XPS de C, O, N de películas de quitosano entrecruzadas con GA y PEGDE secas a 25°C y 150°C.............................................................................. 55

Tabla 3.8. Propiedades mecánicas de películas de quitosano sin entrecruzante, quitosano entrecruzado con glutaraldehído, quitosano entrecruzado con PEGDE ............................... 62

Tabla 3.9. Masa perdida después de la degradación química de películas de quitosano entrecruzado secado a 25℃. ................................................................................................ 63

Tabla 3.10. Porcentajes de pérdida de masa obtenidos de la degradación enzimática de las películas de quitosano .......................................................................................................... 65

Tabla 3.11 Valor de p (ANOVA-Tukey) de las medias de películas de quitosano con secado a 25°C vs secado adicional a 150°C en contacto directo (C.D) y contacto indirecto (C.I) ........ 70

Tabla 3.12 Temperaturas máximas y pérdida de peso de las películas de quitosano/AH 15%/PEGDE entrecruzadas con glutaraldehído y con PEGDE. ........................................... 84

Tabla 3.13 Porcentaje de cristalinidad de películas CHT-HNa al 15% y 30% ....................... 86

Tabla 3.14 Porcentaje atómico por XPS de C, O, N de películas de quitosano/AH 15% entrecruzadas con GA y PEGDE .......................................................................................... 87

Tabla 3.15 Rugosidad de las superficies de las películas de quitosano y ácido hialurónico entrecruzado con PEGDE y GA ........................................................................................... 89

vii

RESUMEN

El quitosano (CHT) es un polisacárido catiónico natural con múltiples propiedades antimicrobianas, antimicóticas, etc. y excelente biocompatibilidad que ha sido ampliamente usado como biomaterial en numerosas aplicaciones biomédicas. Estas propiedades son generalmente atribuidas a la presencia de grupos amino protonables que, sin embargo, pueden ser afectados durante sus distintas modificaciones. Por lo tanto, el efecto de la temperatura (25℃ o 150℃), el agente de entrecruzante (PEGDE o GA) y la adición de hialuronato de sodio (HNa) al quitosano fue estudiado para determinar su impacto en varias propiedades fisicoquímica y su biocompatibilidad. El CHT entrecruzado con PEGDE mostró una reducción en los grupos amino libres y la relación amida I / II, la cual se redujo aún más con el secado adicional a 150°C. En el análisis de difracción de rayos X (DRX), el CHT entrecruzado con PEGDE mostró múltiples picos, mientras que el porcentaje de cristalinidad se redujo con un aumento en la concentración de PEGDE y tratamientos térmicos a 150°C. En los ensayos celulares por contacto directo se observó una alta viabilidad de osteoblastos a concentraciones bajas y medias de PEDGE, la cual aumentó cuando los andamios entrecruzados se trataron térmicamente a 150°C. Esto se atribuyó a su hidrofilia parcial, baja cristalinidad y rugosidad de la superficie a pesar de la pequeña reducción en la cantidad de grupos amino libres, inducida durante el secado a 150°C. Además, los andamios de CHT entrecruzados con PEGDE mostraron una fuerte expresión de vinculina e integrina 1β, lo que los hace adecuados para aplicaciones óseas. Los andamios de quitosano modificados con HNa mostraron una disminución de la banda 1650 cm-1 (amida I) y un desplazamiento de la banda 1561 cm-1 (N-H2) a 1550 cm-1 la cual se observó más intensa cuando la concentración de HNa fue mayor. En las películas de CHT/HNa/PEGDE al 15% y 30% de HNa, la banda ubicada a1640 cm-1 aumentó de intensidad conforme incrementó la concentración de PEGDE. En el análisis por DRX se observa una disminución del pico ubicado a 2θ = 9.5° conforme aumenta la cantidad de PEGDE. Mediante TGA se observó un aumento de la Td2 para PEGDE1 registrando valores de 298°C (CHT puro) a 344°C (HNa15%) y 285°C (HNa 30%), observando que a concentraciones mayores de HNa cuando se entrecruza con PEGDE, disminuye la estabilidad térmica de las películas. La modificación de quitosano/HNa con PEGDE permitió la obtención de andamios con propiedades biocompatibles para el crecimiento de osteoblastos. En los ensayos de biocompatibilidad, las películas de CHT-HNa que mostraron una mejor adhesión y viabilidad celular fueron las entrecruzadas con PEGDE. Sin embargo, un exceso de HNa (30%) no mejora su viabilidad celular. En contraste, muestras entrecruzadas con glutaraldehído si son beneficiadas con la adición del hialuronato de sodio.

viii

ABSTRACT

Chitosan (CHT) is a natural cationic polysaccharide with excellent biocompatibility and multiple properties, such as antimicrobial and antifungal agents, among others. Thus, it has been widely used as a biomaterial for numerous biomedical applications. Chitosan’s properties are generally attributed to the presence of protonable amino groups, which, nonetheless, can be affected during their various modifications. Therefore, this study assessed the effect that the change of temperature (25℃ or 150℃), the crosslinking agent (PEGDE or GA), and the addition of sodium hyaluronate (HNa) on chitosan to determine the impact on its various physicochemical properties and its biocompatibility. CHT crosslinked with PEGDE showed a reduction in free amino groups and the amide I / II ratio, which was further reduced with exhaustive drying at 150°C. Additionally, X-ray diffraction (DRX), showed multiple peaks and crystallinity reduction with an increase in the concentration of PEGDE and thermal treatment at 150°C. In the cytotoxicity test by direct contact, high viability of osteoblasts was observed at low and medium concentrations of PEDGE, which also improved when cross-linked scaffolds were heat treated at 150°C. This outcome was attributed to its partial hydrophilicity, low crystallinity and low surface roughness, even though a small reduction in the amount of free amino groups was induced during the drying at 150°C. Furthermore, CHT scaffolds crosslinked with PEGDE showed a strong expression of vinculin and integrin 1β, which made them suitable for bone applications. Chitosan scaffolds modified with HNa showed a reduction of the band 1650 cm-1 (amide I), a shift of the band from1561 cm-1 (N-H2) to 1550 cm-1 which was more intense when the concentration of HNa was higher. In CHT/HNa/PEGDE films with 15% and 30% HNa, the band located at 1640 cm-1 increased in intensity as the concentration of PEGDE increased, as well. The DRX analysis showed a peak intensity reduction at 2θ = 9.5° as the amount of PEGDE increased. An increase in Td2 for PEGDE1 was observed by TGA recording values from 298°C (pure CHT) to 344°C (HNa15%) and 285°C (HNa 30%). It was also observed that when high concentrations of HNa were used in the presence of PEGDE, the thermal stability of the films decreased. Chitosan/HNa crosslinked with PEGDE also rendered osteoblasts compatible scaffolds exhibiting good adhesion and increased viability; yet, an excess of HNa (30%) did not improve the cell viability. In contrast, glutaraldehyde crosslinked chitosan showed improved cytotoxicity by adding sodium hyaluronate.

1

I. INTRODUCCIÓN

La incidencia mundial de trastornos y afecciones óseas ha aumentado considerablemente

y se espera que se duplique para el presente año, especialmente en poblaciones donde el

envejecimiento se combina con obesidad y una deficiente actividad física [1].

En la cavidad bucal se presentan diversas situaciones y/o enfermedades las cuales

ocasionan un daño permanente a los tejidos óseos como son: la enfermedad periodontal

[2], cirugías de terceros molares retenidos, tratamientos de ortodoncia, trastornos de la

articulación mandibular, así como labio y paladar hendido.

Con respecto a la práctica clínica, la reparación de defectos del tejido óseo se considera un

desafío importante [1]. Este problema se puede tratar mediante trasplantes, sin embargo,

el principal inconveniente asociado a dicha terapéutica es la escasez de donadores. Esta

circunstancia demanda la necesidad de un soporte (andamio) adecuado, en el cual las

células autólogas puedan cultivarse en condiciones óptimas in vitro y posteriormente

trasplantarse nuevamente al cuerpo humano; esto obviará la necesidad de esperar a un

donante [3].

Los injertos óseos se utilizan en una amplia gama de entornos clínicos para mejorar la

reparación y regeneración ósea [4]. La reparación de defectos óseos mediante ingeniería

de tejidos se presenta como una mejor alternativa a esto, debido a que el proceso de

reparación puede continuar con el propio tejido del paciente para cuando se complete la

regeneración. Sin embargo, las prácticas de ingeniería del tejido óseo no se han llevado a

la práctica clínica a causa de varias limitaciones o desafíos. La ingeniería de los tejidos

óseos apunta a inducir una nueva regeneración ósea funcional a través de la combinación

sinérgica de biomateriales, células y factores de crecimiento [3].

Los elementos clave de la ingeniería tisular son: las células, la presencia de moléculas de

señalización que induzcan la morfogénesis, la matriz extracelular o los soportes/andamios

(scaffolds) [5]–[7].

El andamio, por definición, es una estructura de soporte temporal para el crecimiento de

células y tejidos. También se llama matriz extracelular sintética y desempeña un papel

crítico en el apoyo de las células. Luego, estas células experimentan proliferación,

migración y diferenciación en tres dimensiones, lo que conduce a la formación de un tejido

específico con las funciones apropiadas que se encontrarían en el cuerpo humano. Así

mismo, el andamio debe ser capaz de degradarse a una velocidad controlable cercana a la

2

tasa de regeneración del tejido de interés con una inflamación mínima [8]–[11]. También

deben interactuar con las células circundantes y mantener el fenotipo del tejido regenerado,

así como ser biocompatible, biodegradable, promover la adhesión celular, la proliferación y

mantener la actividad metabólica de las células [12].

Los materiales que se emplean en la elaboración de andamios pueden ser polímeros

naturales, polímeros sintéticos o cerámicos. Los polímeros naturales han llamado la

atención de varios investigadores debido a sus excelentes propiedades de

biocompatibilidad [13].

Los polímeros naturales como el quitosano, el alginato y el ácido hialurónico contienen

grupos funcionales ionizables que pueden ser fácilmente utilizados con el fin de

proporcionar factores bioactivos tales como proteínas, fármacos y ácidos nucleicos [14]. En

las últimas dos décadas se ha publicado aceleradamente artículos acerca de las

aplicaciones de la quitina y quitosano en la liberación de medicamentos, la ingeniería de

tejidos, la piel e injertos óseos [15].

El principal derivado de la quitina: el quitosano, ha adquirido atención como andamio para

regeneración de tejidos debido a la posibilidad de producción a gran escala y bajo costo;

sus grupos funcionales reactivos y cargados positivamente le permiten formar complejos

con polímeros aniónicos, incluidas proteínas que ayudan a regular la actividad celular;

adicionalmente, este policatión natural exhibe propiedades antibacterianas. La presencia

de grupos amino en la estructura de quitosano diferencia a éste de la quitina, y le da a este

polímero muchas propiedades peculiares [16].

Algunas de las propiedades funcionales del quitosano son: biocompatibilidad,

mucoadhesión, capacidad filmogénica, hemostático, promotor de absorción, actividad

antimicrobiana, anticolesterolémica y antioxidante; se degrada en oligosacáridos no tóxicos

dentro del cuerpo debido a la acción de las lisozimas [17]. Se ha reportado que los

biomateriales basados en quitosano no desencadenan reacciones inflamatorias o alérgicas

después de su implantación, inyección, aplicación tópica, o ingestión en el cuerpo humano

[13]. Las propiedades de adherencia celular, proliferación y diferenciación del quitosano se

atribuyen a su naturaleza hidrófila, y sus cadenas poliméricas agregadas compactas, las

cuales son útiles para proporcionar estabilidad a los andamios, en términos de tamaño y

morfología, durante el cultivo celular [18]. Sin embargo, una de sus desventajas es que

carece de la resistencia a la tensión necesaria para que coincida con la de algunos tejidos

del cuerpo humano [19], [20].

3

El ácido hialurónico (AH), otro polímero natural, es un glucosaminoglicano que consiste en

unidades repetitivas de ácido D-glucurónico y N-acetil D-glucosamina [21], [22]. Se

encuentra en la MEC de todos los tejidos vivos, en diferentes concentraciones y pesos

moleculares, estando presente de forma más abundante en los tejidos sometidos a cargas

mecánicas, como cartílagos, dermis y cuerdas vocales [23]. El AH realiza un papel clave en

la división y migración celular, la angiogénesis, la cicatrización de heridas y la regeneración

de tejidos. Debido a su biocompatibilidad, biodegradabilidad y susceptibilidad para

modificarse químicamente, es de gran interés por su potencial en el campo de la ingeniería

de tejidos [23].

El AH posee la capacidad de interactuar con los receptores en la superficie de células

troncales, induciendo la transducción de señales intracelulares y afectando actividades

como proliferación, supervivencia, movimiento y diferenciación celular [24]. Los materiales

basados en ácido hialurónico se han utilizado como andamios para ingeniería de tejidos y

se ha demostrado por medio de pruebas in vitro e in vivo que favorecen la regeneración de

tejidos [23]. En la presente investigación se propone el empleo de andamios a base de

quitosano, modificados con hialuronato de sodio con la finalidad de mejorar sus

propiedades de biocompatibilidad.

Cuando las células se cultivan en andamios elaborados a partir de polímeros naturales,

éstos proporcionan una gran cantidad de señales biológicas, pero a menudo sus

propiedades fisicomecánicas se ven afectadas [25]. Como alternativa, los andamios

formados a partir de macromoléculas de origen biológico se emplean en conjunto con

polímeros sintéticos para poder modificar algunas de sus propiedades, tales como la

mecánica y la degradación, pero por lo general dichos polímeros no son biocompatibles con

las células. Por lo tanto, existe un interés creciente para desarrollar estrategias en la

preparación de andamios que integren los beneficios de ambos materiales (naturales y

sintéticos). El quitosano es un candidato para soporte celular con un gran potencial ya que

posee propiedades biológicas únicas, las cuales posibilitan el desarrollo de materiales en

una gran variedad de formas.

La novedad de esta investigación radica en el hecho de poder desarrollar un material de

soporte celular a base de quitosano y quitosano/ácido hialurónico, entrecruzado con

polietilenglicol diglicidil éter (PEGDE), el cual posea las características requeridas para ser

empleado en ingeniería tisular ósea. Adicionalmente, se estudió el efecto de la temperatura

de secado (25 ℃ o 150 ℃) en las propiedades del quitosano puro.

4

En el capítulo 1 de este trabajo se mencionan los conceptos de ingeniería tisular ósea, así

una revisión bibliográfica de los materiales con los que se elaboran los andamios, en

específico el quitosano, hialuronato de sodio, y el PEGDE. En el capítulo 2 se presentan los

materiales y la metodología utilizada para la elaboración y caracterización de los andamios.

En el capítulo 3 se presentan los resultados y discusión de la caracterización fisicoquímica

y biológica de los andamios fabricados. Para finalizar se presentan las conclusiones

obtenidas con base en el análisis de los resultados.

5

II. HIPÓTESIS

La modificación del quitosano y quitosano/AH con PEGDE permitirá obtener andamios con

las propiedades fisicoquímicas adecuadas para permitir la proliferación de osteoblastos.

III. OBJETIVOS

Objetivo general

Determinar las propiedades de andamios de quitosano entrecruzados con PEGDE,

sometidos a diferentes tratamientos térmicos, y andamios de quitosano y hialuronato de

sodio entrecruzados con PEGDE.

Objetivos particulares

1. Obtener películas de quitosano entrecruzado con PEGDE a distintas

concentraciones.

2. Modificar el quitosano con hialuronato de sodio y entrecruzarlo con PEGDE a

distintas concentraciones.

3. Caracterizar los andamios obtenidos a partir de la determinación de sus propiedades

fisicoquímicas (FTIR, DSC, TGA, DSC, DRX, MEB, XPS, EDX, MEB, AFM) ángulo

de contacto y propiedades mecánicas de tensión en películas de quitosano secas a

25℃ y a 150ºC

4. Realizar estudios de degradación acelerada y enzimática

5. Determinar la adhesión y proliferación de osteoblastos sobre el andamio de

quitosano entrecruzado con PEGDE seco a 25°C y a 150°C (películas y espumas),

y sobre andamios de quitosano/hialuronato de sodio.

6

CAPITULO 1. ANTECEDENTES

1.1 Ingeniería Tisular

En los últimos años se han logrado avances significativos para tratar la pérdida o falla de

tejidos óseos mediante estrategias basadas en la ingeniería de tejidos [26].

La ingeniería de tejidos óseos (ITO) posee la habilidad de suministrar materiales

osteoinductivos y osteoconductivos. Los primeros estimulan a las células osteoprogenitoras

para diferenciarse en osteoblastos los cuales inician la formación de tejido óseo. Mientras

que los segundos sirven como andamios para el crecimiento de nuevo tejido óseo

proveniente de tejido óseo original [27]. Por lo tanto, la ITO se basa en la comprensión de

la estructura ósea, la mecánica ósea y la formación de tejido, ya que su objetivo es inducir

nuevos tejidos óseos funcionales. En otras palabras, para regenerar o reparar con éxito el

hueso, es esencial el conocimiento de la biología ósea y su desarrollo [1].

El hueso posee la capacidad de realizar una amplia gama de funciones, y responde a una

variedad de estímulos metabólicos, físicos y endocrinos. Los huesos representan la base

de nuestra locomoción corporal, proporcionan capacidad de carga a nuestro esqueleto y

protección a nuestros órganos internos; albergan los elementos biológicos necesarios para

la hematopoyesis, atrapan metales peligrosos (por ejemplo, plomo), y mantienen la

homeostasis de electrolitos clave a través del almacenamiento de iones de calcio y fosfato,

e incluso se ha sugerido que participa en la regulación del azúcar. Además, el hueso

participa en un ciclo constante de reabsorción y renovación, experimentando un intercambio

químico continuo y remodelación estructural debido a mediadores internos y demandas

mecánicas externas. La ingeniería funcional del tejido óseo requiere que el hueso

recientemente restaurado se integre completamente con el hueso huésped vecino y, lo que

es más importante, realice las funciones mencionadas anteriormente [1].

El hueso es un tejido altamente vascularizado, consiste en 60% de minerales, 30% de

matriz extracelular y 10% de agua. El tejido óseo puede clasificarse en dos formas: (a)

hueso cortical, que proporciona una función mecánica y protectora, y (b) hueso trabecular,

que es más metabólicamente activo y facilita el movimiento de las articulaciones y las

extremidades. En el proceso de osificación, se produce la formación de hueso nuevo por

7

células llamadas osteoblastos. Estos osteoblastos, y la matriz ósea, son los dos elementos

esenciales involucrados en la formación de hueso [28].

Actualmente, es reconocido el hecho de las considerables deficiencias, limitaciones y

complicaciones de los tratamientos clínicos convencionales para la reparación y

regeneración ósea; éstas incluyen trasplantes autólogos y alogénicos utilizando autoinjertos

y aloinjertos. En el presente, los autoinjertos se emplean como el estándar de oro para los

injertos óseos porque son histocompatibles, no inmunogénicos, y ofrecen las propiedades

requeridas de un material para ser utilizado como injerto óseo. Específicamente, los

autoinjertos poseen los componentes esenciales para lograr la osteoinducción (es decir,

proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y otros factores de crecimiento), la osteogénesis (es

decir, células osteoprogenitoras) y la osteoconducción (es decir, matriz tridimensional y

porosa). Sin embargo, los autoinjertos implican la extracción de hueso de la cresta ilíaca

del paciente y, por lo tanto, requieren una segunda operación en el sitio de extracción del

tejido. Adicionalmente, los trasplantes óseos autólogos son procedimientos muy costosos

y pueden provocar lesiones y morbilidad significativa en el sitio de donación, deformidad,

cicatrización y también están asociados con riesgos quirúrgicos, como son sangrado,

inflamación, infección y dolor crónico [1].

Los aloinjertos representan la segunda opción de injerto óseo más común; implican el

trasplante de tejido óseo de un donante, a menudo de un cadáver. El hueso alogénico

también es considerado histocompatible, y está disponible en varias formas, incluyendo

matriz de hueso desmineralizado (DBM), esponjoso, injertos cortico-cancerosos, corticales,

y segmentos osteocondrales y de hueso entero. En comparación con los autoinjertos, los

aloinjertos están asociados con riesgos de inmunorreacciones y transmisión de infecciones.

Tienen propiedades osteoinductoras reducidas y no poseen componentes celulares, debido

a que los injertos de los donantes se desvitalizan mediante irradiación (esterilización) o

liofilización. Pese a que son menos costosos que los autoinjertos, los injertos alogénicos

tampoco son económicos. Además, el mercado de injertos óseos está experimentando una

gran demanda y actualmente existe una escasez de varios de estos productos comerciales.

Otras técnicas de reparación ósea comúnmente utilizadas incluyen rellenos de cemento

óseo y proteínas morfogénicas óseas. Aunque se ha demostrado que las intervenciones

clínicas mencionadas anteriormente mejoran la reparación del hueso, ninguna posee todas

las características ideales: alto potencial osteoinductivo y angiogénico, seguridad biológica,

8

baja morbilidad del paciente, sin restricciones de tamaño, fácil acceso a los cirujanos y larga

vida útil [1].

El objetivo de la ingeniería tisular ósea es inducir la regeneración de nuevo hueso funcional,

y es una alternativa potencial al injerto óseo convencional, debido a la fuente ilimitada de

materia prima y a la baja incidencia de transmisión de enfermedades. Para la preparación

de hueso artificial se deben considerar los siguientes criterios: morfología, estructura,

porosidad, suficiente resistencia mecánica, biocompatibilidad y biodegradabilidad. Desde

un punto de vista clínico, el uso de andamios artificiales puede ser atractivo para minimizar

la incomodidad del paciente, evitar la transmisión de infecciones, la formación de heridas y

reducir el costo del tratamiento [29].

En la ingeniería de tejidos óseos la osteogénesis se inicia por los osteoblastos, que son, en

su mayoría, células diferenciadas de células madre proporcionadas por el material de

injerto. Después del inicio de la osteogénesis, las células madre locales y también los

osteoblastos serán atraídos al material participando en la regeneración ósea. La aplicación

de diferentes tipos de células, tales como células madre embrionarias, células fetales, de

placenta, células de líquido amniótico, células de cordón umbilical, células madre

hematopoyéticas de médula ósea, células madre mesenquimales, células derivadas de

tejido adiposo y células madre derivadas de tejido dental han sido investigadas en

ingeniería tisular ósea [30].

El paradigma clásico de la ITO consta de los siguientes elementos clave: (1) un andamio

biocompatible que imite la matriz extracelular ósea natural, (2) células osteogénicas para

formar la matriz de tejido óseo, (3) señales morfogénicas que ayudan a dirigir a las células

al fenotipo deseable, y (4) vascularización suficiente para satisfacer las necesidades de

suministro y eliminación de nutrientes del tejido en crecimiento [3].

1.2 Soportes o andamios

Los andamios se utilizan para proporcionar un sustrato temporal para que las células

formadoras de hueso se unan, proliferen y formen tejido nuevo. Para mantener el fenotipo

celular adecuado que dé lugar a la formación ósea funcional, el andamio debe ser capaz

de guiar la diferenciación osteogénica de los preosteoblastos a través de la interacción

apropiada célula-material [17]. La matriz extracelular (MEC) que rodea las células en el

cuerpo regula la proliferación y diferenciación celular. En consecuencia, los andamios

9

deben ser sintetizados para producir in vitro la reconstrucción de tejidos, así como para la

regeneración mediada por células in vivo [17], [31].

El andamio ideal permitirá la fijación, la proliferación, la diferenciación celular y el

almacenamiento de la matriz extracelular, la neovascularización para que el oxígeno y los

nutrientes puedan alcanzar el centro del andamio y facilitar la eliminación de toxinas. El

constructo implantado debe activar los mecanismos de curación innatos y degradarse a una

tasa proporcional al crecimiento de nuevo tejido sin la producción de subproductos tóxicos.

El andamio se debe preparar estratégicamente de manera que posea la geometría y el

tamaño de poro adecuado para la difusión de las células y los nutrientes, debe permitir la

diferenciación adecuada de las células sin afectar a su progenie, así como imitar el

ambiente natural de los tejidos y ser biocompatible; el grado de biocompatibilidad de un

material depende de propiedades tales como la forma, el tamaño, la química de superficie,

porosidad, la esterilidad, la duración de contacto y la degradación [31]. El andamio debe

tener la resistencia mecánica requerida, apoyar la unión de células in vitro, y poseer

propiedades biodegradables. La velocidad de degradación debe coincidir con la velocidad

de formación de tejido [14].

Estudios recientes han demostrado que las propiedades del material como la topografía de

la superficie, la rigidez, la hidrofilicidad y la composición química juegan un papel importante

en la diferenciación osteogénica de las células madre [32]. La biocompatibilidad y

biodegradabilidad de un biomaterial son dos parámetros cruciales para las aplicaciones

exitosas, tanto en sistemas biomédicos, como en andamios de ingeniería de tejidos [33],

[34].

Acerca de la regeneración ósea del hueso alveolar, el primer objetivo del andamio debe ser

contribuir al mantenimiento del espacio para los tejidos periodontales. Otro punto para el

éxito de la regeneración es proteger el tejido en formación de posibles infecciones por

microorganismos orales. El tejido periodontal es el único tejido en el cual los tejidos blandos

y duros están expuestos al ambiente exterior. Se han desarrollado materiales poliméricos

con nanofibras para liberar agentes antibacterianos de bajo peso molecular durante la

regeneración ósea guiada (GBR) los cuales fracasaron cuando las membranas se

expusieron a la cavidad oral y se infectaron. Para evitar la contaminación, se llevaron a

cabo varios estudios para incorporar agentes antibacterianos, tales como hidróxido de

tetraciclina y metronidazol. Sin embargo, no se ha llevado a cabo el desarrollo de un

andamio antiinfeccioso especialmente diseñado para la regeneración periodontal. La

10

exploración adicional de los métodos para el control de la infección mediante los andamios

puede contribuir a la eliminación de las bacterias, lo que resultaría en la generación de

nuevo tejido [5].

Los materiales biodegradables han ganado atención debido a que poseen la ventaja de

permitir que los nuevos tejidos asuman su carga u otras funciones sin crear problemas

crónicos asociado a la presencia de éstos. La biodegradación de los andamios también es

un fenómeno complejo, cuya tasa depende de varios factores intrínsecos y morfológicos

tales como el tamaño de poro, la composición química, la morfología, el área superficial, la

hidrofilicidad, entre otros.[35]

Entre los materiales sintéticos aprobados por la administración de drogas de los Estados

Unidos (FDA por sus siglas en inglés), para la elaboración de andamios, se encuentran la

poli(ε-caprolactona), el poli ácido(láctico-co-glicólico) (PLGA), el poli(ácido glicólico) (PGA)

y el poli(ácido-L-láctico) (PLA) [15], [36].

Los polímeros naturales han atraído la atención de varios investigadores debido a sus

excelentes propiedades de biocompatibilidad [13]. La mayoría de los biomateriales de

origen natural en uso hoy en día poseen la capacidad para interactuar con las células y

mediar la degradación. Los materiales en esta categoría incluyen colágeno, quitosano,

dextrano, alginato, y la fibrina [7].

Entre las limitaciones de los polímeros naturales se encuentra principalmente su baja

resistencia mecánica y la tasa de degradación. En contraste, los polímeros sintéticos

pueden ser diseñados para degradarse a una velocidad controlada y su resistencia

mecánica a la compresión puede llegar a ser similar a la del hueso. Sin embargo, debido a

que son sintéticos, pueden provocar una respuesta inmune y los subproductos de

degradación ácidos, en el caso del PCL, PLA y PGA, puede conducir a la inflamación [27].

Los polímeros naturales como el quitosano, el alginato y el ácido hialurónico contienen

grupos funcionales protonables que pueden ser fácilmente utilizados con el fin de

proporcionar factores bioactivos tales como proteínas, fármacos y ácidos nucleicos [36]. En

las últimas dos décadas, se ha publicado activamente acerca de las aplicaciones de la

quitina y quitosano en la liberación de medicamentos, la ingeniería de tejidos, la piel e

injertos óseos [14], [37].

11

1.3 Quitosano

La quitina es el segundo polímero más abundante en el mundo después de la celulosa. Se

encuentra principalmente en todas las conchas de crustáceos e insectos, así como en

ciertos hongos, algas y levaduras. Es químicamente inerte, con más del 90% de grado de

acetilación, altamente insoluble en agua y ácido. Eso hace que su forma hidrolizada, el

quitosano (CHT), sea un derivado importante para varios propósitos [38].

Comercialmente, la quitina y sus derivados se extraen de la cáscara del camarón, cangrejo,

cigalas y del krill. Algunos estudios han señalado que los huevos de insectos, hongos,

corales y crustáceos pueden ser fuentes alternativas de quitina. La quitina se encuentra en

la superficie externa del cuerpo de los terópodos y, en estructuras celulares de algas y

levaduras [39].

El quitosano, poli(1-4)-2-amino-2-desoxi-D-glucopiranosa, (figura 1.1) es un biopolímero

que se obtiene en medios alcalinos mediante la desacetilación completa de quitina [poli-1-

(1-4)-2-acetamida-2-desoxi-D-glucopiranosa], la cual es uno de los polisacáridos más

abundantes en la naturaleza, al igual que la celulosa [39]. El grado de N-desacetilación

(DD), que representa la fracción molar de unidades N-desacetiladas en la cadena

polimérica, se ha utilizado en gran medida como un parámetro para distinguir a la quitina

del quitosano [40]. Cada unidad desacetilada posee tres grupos funcionales reactivos: un

grupo amina y grupos hidroxilo primarios y secundarios. Los grupos amina tienen un valor

pKa de 6.5 dependiendo del peso molecular, por lo que lo convierte en un polímero sensible

al pH. A un pH de 7.4, la columna principal de amina del quitosano es neutra, mientras que

en un pH>5.5 90% de los grupos amina están protonados, haciendo al quitosano soluble

en ácidos orgánicos. Gran parte del atractivo de quitosano es debido a la presencia de

grupos amino primarios en sus unidades repetitivas, los cuales se protonan en condiciones

ácidas [38]. En una solución ácida, los grupos amino de quitosano se protonan a NH3+ por

lo tanto, las propiedades polielectrolíticas y quelantes del quitosano se rigen principalmente

por la acidez del NH3 [41], [42].

Los grupos químicamente activos en la estructura de quitosano son los grupos amina libres

y los grupos hidroxilo, que pueden modificarse y formar enlaces de hidrógeno o

electrostáticos. Los grupos amina pueden ser protonados fácilmente en un entorno ácido

que hace que el quitosano sea soluble en soluciones ácidas acuosas. Debido a los enlaces

β (1 ~ 4) entre los residuos que constituyen la cadena, el quitosano puede formar películas

12

las cuales se obtienen fácilmente por evaporación de soluciones ácidas diluidas del

polímero. [43], [44]

Figura. 1.1. Estructura molecular de la quitina y el quitosano

El quitosano posee múltiples propiedades, como antiinflamatorio, antimicrobiano [45], [46],

hipocolesterolémico [47], inmunoestimulante [48], y actividad antitumoral [49]; actividad

antifúngica y antimicrobianas [50], además de ser biocompatible, no tóxico y no alergénico

para los tejidos vivos, lo cual lo convierte en un candidato ideal para elaboración de

andamios en ingeniería de tejidos [51], [52], sustitutos óseos, así como para el transporte

de fármacos [53]–[56].

El quitosano es un producto disponible comercialmente. La FDA (Food and Drug

Administration) aprueba su uso como apósito para heridas ya que acelera el cicatrizado y

también se ha empleado como suplemento alimenticio, ya que su uso en alimentos se

considera seguro en los EE.UU. (GRAS: Generally Recognized As Safe) [37].

Se ha encontrado que la N-acetil-ᴅ-glucosamina, componente del quitosano, posee

propiedades anti-inflamatorias haciendo al quitosano adecuado para aplicaciones in vivo;

también puede interactuar con los receptores de superficie, como el receptor de manosa y

el receptor tipo Toll de macrófagos, induciendo respuestas inmunes innatas [57].

Una de las características más importantes del quitosano para aplicaciones en ingeniería

de tejidos es que se pueden fabricar estructuras de diversas formas; se puede utilizar para

hacer nano y micropartículas, esponjas, geles, membranas y andamios porosos. El

quitosano es degradable in vivo; cuando posee un mayor grado de desacetilación, se

degrada lentamente y puede durar varios meses in vivo [27].

13

La despolimerización del quitosano (CHT) puede ocurrir por enzimas como las

glucosaminidasas, lipasas y lisozima. El quitosano posee una semejanza estructural con

los glicosaminoglicanos (GAG), uno de los componentes de la MEC que interactúa con las

fibras de colágeno y desempeña un papel importante en la adhesión célula-célula [58]. El

quitosano, después de la despolimerización, produce quitooligosacáridos bioactivos con

propiedades antimicrobianas, y sus productos monoméricos (glucosamina) son

metabolizados y excretados del cuerpo. Por lo tanto, el quitosano es biodegradable y tiene

una excelente biocompatibilidad con casi todos los tejidos del cuerpo [59].

Gracias a sus grupos amino cargados positivamente en su estructura, el CHT es un

biomaterial hemostático autoadhesivo, con la capacidad de unirse a las membranas

celulares. En combinación con factores de crecimiento, el CHT puede usarse con éxito para

la curación de defectos óseos [60]. Puede usarse sólo o en combinación con otros

materiales en forma de nanofibras para proporcionar las señales estructurales y

bioquímicas, y promover la regeneración ósea [28].

Por medio de estudios in vivo e in vitro se ha demostrado que incrementa la osteogénesis,

y posee propiedades osteoconductivas. Su naturaleza catiónica también permite la

interacción electrostática con los glicosaminoglicanos (GAGs) y otros proteoglicanos, lo cual

es importante, ya que se sabe que los GAGs controlan las acciones de algunas citocinas y

factores de crecimiento [61].

Muzzarelli y col. fueron los primeros en reportar el uso del quitosano para regeneración

ósea in vivo. Implantaron un gel de quitosano ascorbatado y membranas de quitosano en

defectos craneales en gatos; reportando osteogénesis en el los andamios de quitosano [62].

Actualmente, existen varias investigaciones que indican el papel que desempeña el CHT

para mejorar la adhesión celular, la proliferación, la diferenciación de osteoblastos y la

mineralización ósea (Tabla 1.1).

A pesar de que en la literatura se cuenta con una gran cantidad de antecedentes que

señalan que el CHT es un biomaterial aceptable para aplicaciones de ingeniería de tejidos,

existen varios trabajos de investigación que reportan la ineficacia del CHT en la misma.

Dichos estudios sugieren que el potencial de reparación del CHT por sí solo es dudoso,

debido a su baja biodegradabilidad, osteoconductividad limitada y a la generación de tejido

conjuntivo fibroso y células inflamatorias en el neotejido formado [63]. Sin embargo, estos

estudios también señalan que al emplearlo en combinación con biomateriales más

biodegradables y biocompatibles, así como con factores de crecimiento, podría mejorar su

14

potencial de reparación y biocompatibilidad [60]. La aplicación del CHT como soporte

interno durante un largo período (generalmente de 2 a 6 meses) no ha sido fácil de llevar a

cabo, en comparación con otros polímeros biocompatibles como el colágeno y el poli(ácido

láctico-co-glicólico), una de las posibles razones es su grado de desacetilación, que se

cree, está directamente correlacionado con su propiedad de biocompatibilidad [57].

No obstante, los resultados obtenidos por los diferentes grupos de investigación no son

equiparables debido a la diversidad de derivados de quitosano, líneas celulares, métodos

utilizados, etc. [63].

Se han empleado esponjas de quitosano, en ingeniería de tejidos óseos, como material de

relleno. Las esponjas no son más que espumas con una porosidad abierta. Estas

estructuras sólidas pueden absorber una gran cantidad de fluidos (más de 20 veces su peso

seco), debido a su microporosidad. Por lo general, ofrecen una buena interacción celular,

siendo suaves y flexibles. Las esponjas de quitosano se utilizan principalmente como

materiales de curación de heridas, ya que pueden absorber los exudados de la herida, al

tiempo que ayudan a la regeneración del tejido [16]. Estas esponjas se obtienen,

principalmente, mediante liofilización, un proceso simple y eficaz que consiste en congelar

una solución de quitosano seguida de la sublimación del disolvente a presión reducida [16].

La técnica de liofilización es una de las más utilizadas para aplicaciones de ingeniería de

tejidos para obtener andamios [64]. Estas estructuras proporcionan un entorno apropiado

para la unión de las células, el crecimiento y la formación final de nuevos tejidos [65], [66].

A pesar de que el quitosano ha sido un polímero ampliamente estudiado, aún se

desconocen muchas de sus propiedades. Es importante conocer el comportamiento del

material en relación con sus propiedades térmicas debido a que podría someterse a altas

temperaturas; por ejemplo, para procesos de esterilización, en ocasiones la temperatura

programada llega a 120ºC, por lo que la temperatura no debe reducir la estabilidad de la

película [67]. Sin embargo, las propiedades de superficie que determinan la respuesta de

las células después de la implantación del material son las más importantes. Una superficie

hidrofílica permite la adhesión de las células y, como resultado, mejora la compatibilidad de

la película con los tejidos circundantes [68].

El quitosano y otros polímeros solubles acuosos, por ejemplo, alginato de sodio, gelatina y

poli(alcohol vinílico) han disminuido su solubilidad después de la interacción con

formaldehído o glutaraldehído; sin embargo, estos agentes entrecruzantes son tóxicos y los

residuos en el producto final pueden causar reacciones adversas en la piel y las membranas

15

mucosas. Un método alternativo para aumentar la resistencia al agua de los polímeros

solubles acuosos es someter los polímeros a tratamiento térmico [55].

1.3.1 Quitosano y tratamientos térmicos

Existen polisacáridos que forman complejos cristalinos con moléculas de agua debido a su

naturaleza anfifílica. Algunos polisacáridos tales como el almidón y la quitina se presentan

de forma natural como cristales hidratados. En estos cristales, se considera que las

moléculas de agua forman puentes de hidrógeno con las moléculas de polisacáridos [44].

La hidratación causa cambios en sus propiedades físicas y morfológicas; por lo tanto, es

importante entender sus roles biológicos in vivo, sus propiedades y procesabilidad como

materiales [69].

Los polisacáridos tienen afinidad por el agua y, dependiendo de su estructura, pueden

establecerse diferentes interacciones entre el agua y sus cadenas, por lo que pueden

perder agua a diferentes temperaturas dependiendo de las interacciones. Ostrowska-

Czubenko et al [70] reportaron que el quitosano existen tres tipos diferentes de agua

dependiendo de las interacciones: agua libre que se libera a aproximadamente 40–60°C;

agua unida a través de enlaces de hidrógeno, que se libera a 80-120°C, y; a temperaturas

más altas hasta 160°C se libera el agua más fuertemente unida a través de interacciones

polares con grupos carboxilo.

Cabe destacar que las propiedades físicas y químicas del quitosano pueden verse

significativamente alteradas por la presencia de pequeñas cantidades de agua [71].

Además, el quitosano es un material semicristalino; la estructura cristalina polimorfa del

quitosano fue reportada por primera vez por Sakurai; al calentar el quitosano, las formas

hidratadas se convirtieron en forma anhidra o “recocida”[72]. Estos cambios en la estructura

del quitosano durante el proceso de calentamiento pueden afectar las propiedades de

relajación del material [73].

El quitosano es un polisacárido semicristalino que contiene una fracción amorfa

considerable. Un parámetro importante del estado amorfo es la temperatura de transición

vítrea la cual se acompaña de cambios significativos en las propiedades físicas [74]. Existe

una controversia en la comunidad científica sobre si el quitosano exhibe una temperatura

de transición vítrea (Tg). Algunos autores, mediante el empleo de varias técnicas, incluida

la calorimetría diferencial de barrido (DSC) y el análisis térmico mecánico-dinámico (DMTA),

han reportado valores de Tg de 30 a 222ºC, mientras que otros no observan la transición

16

vítrea mediante DSC y DMTA. [74] Sakurai et al. por medio de DSC y DMTA asignaron

una Tg de 203ºC en películas no neutralizadas, sin embargo, otros estudios, basándose en

análisis de TGA, DSC y mediciones dieléctricas, señalan que este valor está muy cerca de

la degradación química. Realizaron dos ciclos de calentamiento y enfriamiento calentando

hasta 180ºC; sin embargo, la degradación del quitosano comienza a 170º C [75]–[77].

En algunos polímeros, el fenómeno de transición vítrea se ha relacionado con los procesos

de relajación dieléctrica a través de la ecuación de Vogel-Fulcher-Tammann (VFT). Las

propiedades físicas y químicas del quitosano pueden verse significativamente modificadas

por la presencia de pequeñas cantidades de agua. Los polisacáridos tienen una gran

afinidad por el agua y, por lo tanto, pueden hidratarse fácilmente formando macromoléculas

con estructuras bastante desordenadas [78]. Como se informa en la literatura, en estos

biopolímeros, el agua puede estar presente en tres estados: (1) agua que no puede

congelarse a 0°C, (2) agua enlazada pero congelable, y (3) agua libre, con comportamiento

normal (congelación a 0ºC) [79].

La degradación térmica del quitosano ocurre principalmente a través del mecanismo de

radicales libres. Los productos radicales intermedios pueden recombinarse

espontáneamente dando como resultado la formación de estructuras reticuladas. Tales

redes reticuladas son más estables que las cadenas lineales y, por lo tanto, pueden estar

presentes en el residuo carbonoso después de que el quitosano es expuesto a altas

temperaturas [80].

Los fuertes eventos exotérmicos en presencia de O2 indican que tiene lugar una oxidación

eficiente, seguida de una descomposición adicional del quitosano oxidado. Estas etapas

con alta pérdida de peso se atribuyen a una escisión de la cadena muy eficiente, con la

formación de productos de degradación volátiles. El primer pico exotérmico aparece a

282ºC, mientras que el pico principal, aparece alrededor de 430ºC, debido a una oxidación

eficiente. El rendimiento de la degradación térmica en condiciones oxidantes es muy alto,

ya que solo un 4% de residuo carbonoso se encontró a 600ºC [80].

El calor puede cambiar las propiedades físicas del quitosano afectando su solubilidad en

agua, reología y apariencia [81]–[83]. De acuerdo con Rivero et al [84] , el tratamiento

térmico de películas de quitosano conduce a un cambio estructural caracterizado por picos

situados en 2Ө a 15º y 20º [85].

En la presente investigación se llevó a cabo la caracterización del quitosano empleando 2

temperaturas de secado, 1) temperatura ambiente (TA) a 25ºC y 2) con un secado adicional

17

a 150ºC, dicha temperatura se seleccionó con base a la Tg reportada en estudios previos y

analizada en las muestras. La finalidad fue conocer cómo afectan estas variaciones de

temperatura en la cristalinidad y biocompatibilidad del polímero.

1.4 Polietilenglicol Diglicidil Éter

La interacción entre los materiales y las células huésped es un factor clave para determinar

la biocompatibilidad de un material, mientras que la elección del agente de

entrecruzamiento marca la diferencia en la citocompatibilidad del material [14]. Existe una

demanda creciente de un método de entrecruzamiento, que no sea no tóxico en

aplicaciones biomédicas y así mismo pueda mantener la biocompatibilidad, mejorar la

solubilidad en agua y las propiedades mecánicas de los materiales [86]. Cuando el

quitosano se entrecruza o se mezcla con otros polímeros, su comportamiento en el agua y

las propiedades fisicoquímicas pueden mejorar considerablemente [87].

El entrecruzamiento es un paso útil para preparar un andamio con mejor estabilidad y

degradación más prolongada. Se han utilizado varios agentes entrecruzantes en ingeniería

de tejidos, incluidos el formaldehído, el glutaraldehído, las carbodiimidas, la genipina y el

polietilenglicol diglicidil éter [88]. El poli (etilenglicol) diglicidil éter (PEGDE) se usa

ampliamente como entrecruzante de polímeros que contienen grupos amina, hidroxilo o

carboxilo [89].

El polietilenglicol (PEG) también conocido como poli (óxido de etileno), es un poliéter

sintético anfifílico y soluble en agua, así como en muchos disolventes orgánicos, incluyendo

etanol, acetona, tolueno y cloroformo. Se ha encontrado que este polímero no es tóxico y

es aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) de EE.UU., para su uso como

excipiente o como portador en diferentes formulaciones farmacéuticas, alimentos y

cosméticos. Además, se conoce que la mayoría de los PEGs con pesos moleculares (Mw)

<1,000 daltons pueden ser eliminados rápidamente del cuerpo humano después de su

consumo, lo que contribuye a su amplio uso en la investigación biomédica, administración

de fármacos, andamios para ingeniería de tejidos, entre otras aplicaciones [90], [91]. El

PEG posee un carácter muy hidrófilo lo que restringe la adhesión de proteínas y células,

pero mediante el uso de PEG en un copolímero, se mejora la biocompatibilidad de la

composición del polímero [92].

La amplia gama de grupos terminales disponibles, por ejemplo, azida, biotina, tiol, ácido

carboxílico, hidroxilo, y epoxi, también mejora el uso generalizado de los PEG en la

18

investigación biomédica y biomateriales. El PEG es conocido por su reactividad frente a

grupos hidroxilo y, por lo tanto, se ha empleado como un entrecruzante en oligosacáridos y

polisacáridos debido a su hidrofilicidad y biocompatibilidad con baja biodegradabilidad. Es

un material adecuado para aplicaciones biológicas debido a que generalmente no provoca

una respuesta inmune [90], [93], [94].

En el PEGDE es fácil de llevar a cabo la hidrólisis y la reacción de escisión del anillo en

solución acuosa para producir grupos hidroxi. Se emplea como entrecruzante y modificador

de superficies y posee una buena solubilidad en agua. El PEGDE posee una baja toxicidad

y es de bajo costo [89], [95].

El PEGDE puede emplearse como agente entrecruzante dependiendo de, si uno o ambos

de los grupos epóxidos funcionales reaccionan con los grupos amina libres y/o con los

grupos hidroxilo. Mediante el uso de PEGDE como entrecruzante, el quitosano puede

volverse insoluble en medios ácidos y su hinchamiento en agua se reduce. La modificación

química por entrecruzamiento o mezcla química mejora las propiedades de estabilidad y

mecánicas de dicho polímero [96], [97]. Se ha empleado como entrecruzante del quitosano

debido a que puede desempeñar una doble función: retención de agua y entrecruzante, lo

que da lugar a hidrogeles con diferente afinidad por el agua, dependiendo de la

concentración empleada de PEGDE [98].

Se ha reportado que los andamios de quitosano/PEGDE poseen actividad antimicrobiana

significativa contra Staphylococcus aureus así como actividad pro-angiogénica [98].

También se ha empleado PEGDE para inmovilizar proteínas en biosensores de

microelectrodos basados en glucosa oxidasa, d-aminoácido oxidasa y glutamato oxidasa.

Los biosensores hechos con PEGDE exhiben una alta sensibilidad y un tiempo de

respuesta del orden de segundos, que es suficiente para observar procesos biológicos in

vivo [89].

1.5 Ácido hialurónico

El ácido hialurónico, fue aislado por primera vez del humor vítreo de los ojos por Meyer en

1934 [99], [100]. Demostró que esta sustancia contenía un ácido urónico y un aminoazúcar,

por lo que se le otorgó el nombre de "ácido hialurónico" o “Hialuronato”, lo que refleja el

hecho de que existe in vivo como un polianión y no en forma de ácido protonado. Es un

glicosaminoglicano ya que cada unidad de glucuronato lleva una carga aniónica a pH

19

fisiológico; las cargas negativas asociada con su grupo carboxilato están equilibradas por

cationes móviles como el sodio [8].

El ácido hialurónico es un polisacárido mucoadhesivo natural, compuesto de unidades de

repetición alternadas de ácido d-glucurónico (GlcA) y N-acetil-d-glucosamina (GlcNAc)

unidas entre sí a través de enlaces β-(1,4) y β-(1,3) [101].

La estructura química del ácido hialurónico (figura 1.2) posee tres grupos funcionales que

pueden modificarse fácilmente por medio de reacciones covalentes: el ácido carboxílico de

la unidad GlcA, el grupo hidroxilo primario de GlcNAc (aunque los grupos hidroxilo

secundarios también pueden ser reactivos) y, el grupo amina de GlcNAc formado después

de una reacción de desacetilación. Los grupos hidroxilo pueden modificarse químicamente

mediante la formación de un enlace éter o éster, mientras que los grupos carboxilo y amina

pueden formar nuevos enlaces éster y amida respectivamente [102].

El ácido hialurónico está presente en el cuerpo, en la piel, humor vítreo, cartílago y líquido

sinovial. Se utiliza como factor de diagnóstico para muchas enfermedades, como tumores,

artritis reumatoide y enfermedades hepáticas [100], [103].

Figura. 1.2. Estructura molecular del ácido hialurónico

El ácido hialurónico desempeña un papel importante en el mantenimiento de la lubricación

de las articulaciones, en la hidratación de los tejidos, el movimiento, la diferenciación y la

división de las células. En comparación con otros polímeros naturales y polímeros

sintéticos, tiene mucha más capacidad de retención de agua, hasta mil veces su propio

volumen. Se ha demostrado que el ácido hialurónico desempeña un rol importante en la

realización de funciones biológicas, especialmente para células sin suministro sanguíneo

directo, como las células de cartílago [11].

Es un polímero natural biocompatible y biodegradable con un esqueleto lineal de agrecano

que es el proteoglicano predominante en el cartílago [104]. Recientemente, el AH ha sido

20

reconocido como un soporte importante para la creación de nuevos biomateriales con

utilidad en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa [52]

El ácido hialurónico puede modificarse de muchas maneras para alterar las propiedades de

los materiales resultantes, incluidas las modificaciones que conducen a la hidrofobicidad y

la actividad biológica. Las modificaciones químicas del ácido hialurónico se han revisado

exhaustivamente y se dirigen a los siguientes grupos funcionales: el ácido glucurónico,

ácido carboxílico, los grupos hidroxilo primarios y secundarios y el grupo N-acetilo (después

de la desamidación) [105]. La conformación del ácido hialurónico en solución se estabiliza

mediante enlaces de hidrógeno intramoleculares, lo que da como resultado una

conformación del polímero relativamente rígida. Los enlaces de hidrógeno intramoleculares

se rompen por la presencia de NaOH y/o por la temperatura, dando como resultado una

conformación más flexible.

Cuando el pH se reduce a 2.5, el ácido hialurónico forma un gel debido a la disminución en

la disociación de carboxilato que favorece la interacción intermolecular; sin embargo, una

disminución adicional del pH da como resultado una transición de gel a solución,

probablemente relacionada con la protonación de grupos acetamido que causa una

repulsión electrostática. Del mismo modo, un aumento del pH por encima de 3 convertirá el

gel débil formado a un pH 2.5, en una solución. Como el AH es un polímero natural, se

modifica químicamente o se entrecruza covalentemente para formar un gel menos

degradable para su uso en aplicaciones biomédicas [106].

Los derivados del ácido hialurónico se dividen en dos categorías principales: "monolítico" y

"vivo". Los derivados monolíticos del ácido hialurónico son formas de ácido hialurónico

"modificadas terminalmente" que no pueden formar nuevos enlaces químicos en presencia

de células o tejidos, y deben procesarse y fabricarse en diferentes formas. Por el contrario,

los derivados vivos de ácido hialurónico pueden formar nuevos enlaces covalentes en

presencia de células, tejidos y agentes terapéuticos. En la mayoría de los casos, se

requieren derivados de ácido hialurónico vivos para usos clínicos y preclínicos en cultivos

de células 3D y experimentos in vivo [107].

Entre las propiedades del ácido hialurónico destaca su viscoelasticidad, lo que permite su

uso en diversas aplicaciones biomédicas, tales como relleno de tejidos blandos,

regeneración de cartílago y tratamiento de osteoartritis.[108].

El ácido hialurónico, tiene una alta capacidad de absorción y retención de agua, lo que

influye en varias funciones celulares [88].

21

El ácido hialurónico ofrece muchas ventajas como andamio en ingeniería tisular entre las

que destacan: biodegradabilidad, biocompatibilidad, biodegradación propiedades

mucoadhesivas e hidrofílicas; es un componente intracelular importante de los tejidos

conectivos donde juega un papel importante en la lubricación, la diferenciación celular y el

crecimiento celular, y estas funciones pueden transferirse al andamio; contiene grupos

funcionales (ácidos carboxílicos y alcoholes) que pueden usarse para introducir dominios

funcionales o para formar un hidrogel [102].

Mediante el ácido hialurónico se pueden crear andamios para ingeniería de tejidos, que

sean bioactivos, tanto en su longitud total como en su forma degradada; además exhibe

una baja adsorción inespecífica de proteínas y las interacciones específicas entre el

andamio y las células en crecimiento se pueden adaptar utilizando receptores celulares

(CD44, RHAMM, ICAM-1) para mejorar el crecimiento y la reparación de los tejidos [8].

Dependiendo de la técnica de procesamiento, los andamios se pueden preparar en forma

de hidrogeles, esponjas, criogeles e hidrogeles inyectables [23]. Se ha reportado que los

andamios fabricados con ácido hialurónico pueden inducir o promover la diferenciación

celular de células troncales [109].

Una las desventajas del ácido hialurónico es que carecen de estabilidad mecánica contra

la degradación por hialuronidasa y especies reactivas de oxígeno (ROS) [110] Esta

limitación da como resultado una baja funcionalidad bioquímica para la unión y proliferación

celular [111].

También se han elaborado andamios de ácido hialurónico modificados con fosfatos de

calcio para obtener cementos óseos reforzados y / o inyectables [112]. Por ejemplo,

Subramaniam et al [113] demostraron que el ácido hialurónico combinado con hidroxiapatita

y con sulfato de calcio puede emplearse como sustituto del hueso alveolar.

El ácido hialurónico se usa ampliamente en el campo biomédico, por ejemplo, en cirugía

oftálmica, tratamiento artrítico y rellenos dérmicos, así como en ingeniería de tejidos. Sin

embargo, debido a su incapacidad para formar geles físicos en un amplio rango de pH y su

rápida degradación por las hialuronasas que existen en el cuerpo, se recomienda emplearlo

entrecruzado o en presencia de otro material. [106]

Los grupos funcionales disponibles para el entrecruzamiento son los grupos hidroxilo y

carboxilo. Se ha logrado el entrecruzamiento exitoso del ácido hialurónico en películas

usando, entre otros, 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), glutaraldehído

22

(GA), poli (etilenglicol) diglicidil éter (PEGDE) y divinil sulfonato (DVS) como entrecruzantes

[8].

Se ha demostrado la efectividad del ácido hialurónico entrecruzado con polietilenglicol

diglicidil éter (PEGDE) para fines biomédicos y de crecimiento celular [114], [115]. El

PEGDE contiene grupos epóxido en ambos extremos y se ha usado ampliamente con

entrecruzante con biopolímeros que poseen grupos hidroxilo y amino. Dado que los grupos

hidroxilo en las moléculas de ácido hialurónico pueden reaccionar con el PEGDE, se forman

entrecruzamientos intermoleculares durante la gelificación, lo que puede generar la

formación de una red de AH tridimensional [116].

El ácido hialurónico se ha empleado en andamios en ingeniería tisular para promover la

regeneración de tejido óseo [24]. Se ha investigado su aplicación para cráneo [117], [118]

y hueso alveolar [113], [119]. Diversos estudios (Tabla 1.1) han reportado mejoras en las

propiedades mecánicas y de biocompatibilidad cuando el quitosano se emplea en

combinación con ácido hialurónico [120].

En virtud de lo mencionado anteriormente, uno de los objetivos de este estudio fue

investigar la efectividad de los andamios fabricados de quitosano modificados con

hialuronato de sodio para la aplicación de ingeniería de tejidos.

23

Tabla 1.1 Ejemplos de andamios a base de quitosano, ácido hialurónico y quitosano/ácido hialurónico para ingeniería tisular ósea reportados en la literatura

Referencia Año Biomaterial Células-Tejido Principales resultados Yang [17] 2009 Nanofibras de

policaprolactona (PCL) y quitosano

Osteoblastos MC 3T3 E1

Adhesión y proliferación de células MC 3T3-E1, depósito de calcio, actividad de la fosfatasa alcalina (ALP), formación uniforme de tejido con mineralización significativa a los 21 días.

Patterson [118] 2010 Hidrogel de AH/BMP-2 Calota de rata Mineralización ósea en seis semanas. Park [121] 2011 Poli (ácido láctico-co-

glicólico) AH (HA-PLGA) BMP-2 / poli (etilenglicol).

Osteoblastos, defectos óseos de la calota de ratas Sprague Dawley (SD)

Proliferación de osteoblastos in vitro e in vivo, altos niveles de expresión génica de fosfatasa alcalina y osteocalcina.

Arakaw [122] 2014 Hidrogel de metacrilato glicol quitosano (MeGC) y colágeno

Células estromales de médula ósea (BMSC) de ratón

Unión celular, diseminación, proliferación y diferenciación osteogénica, actividad de la fosfatasa alcalina (ALP), mineralización.

Miranda [123] 2015 Hidrogel de CHT/AH NIH3T3 y MG63 Aumento significativo en la viabilidad celular y alta expresión de CD44

Do Yoon [124] 2016 Hidrogeles de AH con peryodato de sodio y quitosano

ATDC5 Viabilidad celular in vitro, biocompatibilidad y durabilidad en condiciones fisiológicas.

Hyun-Ji [119] 2016 Hidrogel de catecol/AH Células madre Angiogénesis y diferenciación osteogénica, formación ósea mineralizada, expresión de marcador osteogénico en defectos óseos.

Subramaniam [113]

2016 Hidroxiapatita, sulfato de calcio hemihidratado, AH y colagenasa (HAP/CS/HA-Col)

Hueso alveolar de rata

Neoformación ósea con morfología de hueso maduro.

Zhu [125] 2016 Hidrogeles de AH con N-Cadherina

Células madre mesenquimales humanas (hMSCs)

Promoción de la actividad de fosfatasa alcalina, la deposición de colágeno tipo I y la mineralización de la matriz, osteogénesis y adhesión celular de osteoblastos.

Demirtras [126] 2017 CHT/hidroxiapatita Osteoblastos MC3T3-E1

Viabilidad celular, niveles máximos de expresión para marcadores osteogénicos en etapas tempranas y tardías. Mineralización y diferenciación osteogénica después de 21 días de cultivo.

Kutlusoy [11] 2017 Criogeles de CHT-co-AH

Células 3T3 fibroblastos y SAOS-2.

Mejora en las propiedades mecánicas y biocompatibilidad del quitosano puro

Hamlet [127] 2017 Policaprolactona (PCL) con osteoblastos encapsulados en hidrogeles de AH

Osteoblastos humanos, BMP-7, rata atímica

Viabilidad celular, formación de matriz de colágeno mineralizada después de 6 semanas.

Chun Liu [128] 2018 Hidrogel de glicol CHT/AH oxidado

Células madre mesenquimales de médula ósea, defectos en cartílago de ratas

Reparación de defectos de cartílago de las ratas, formación de tejido con niveles altos de glucosaminoglucanos (GAG) y colágeno tipo II in vitro e in vivo.

Demir [129] 2018 Composite CHT/montmorillonite

Osteoblastos humanos (hOBs)

Proliferación de osteoblastos.

Sharif [130] 2018 Nanofibras PCL/carboximetil quitosano

Osteoblastos humanos MG63

Proliferación celular especialmente a concentraciones máximas de quitosano.

Ranganathan [131]

2019 CHT/ Gelatina Defectos óseos en cráneos de ratas

Neo-formación ósea. Regeneración ósea in vivo.

Koca [132] 2019 Hueso cortical humano liofilizado, AH

Calota de rata Mineralización en defectos óseos.

24

CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Materiales

Quitosano (CHT) con un peso molecular de 183,364 gmol-1, (determinado

experimentalmente [133]) y un grado de desacetilación del 84% (Número de lote:

STBF4197V proporcionado por el proveedor), polietilenglicol diglicidil éter (Mn promedio

500) y solución de glutaraldehído (GA) Grado II, 25% en H2O fueron adquiridos de Sigma-

Aldrich (Saint Louis, MO, EE. UU.). Hialuronato de sodio grado oral, peso molecular bajo,

fue adquirido de Bioibérica (Barcelona, España). El ácido acético, ácido clorhídrico y el

peróxido de hidrógeno fueron proporcionado por J.T. Baker. El hidróxido de sodio, la

lisozima, LZ (Catalogo No. L6876) y el BES (N, N-Bis(2-hydroxyethyl) taurina) se obtuvieron

de Sigma-Aldrich. El buffer fosfato salino PBS (PBP07-10LT), lote 11160007, de Caisson

labs.

Para los ensayos biológicos se emplearon MTS CellTiter 96® Proliferación celular acuosa

no radioactiva obtenida de Promega (Madison, WI, EE. UU.), medio de Eagle modificado

de Dulbecco (DMEM) de Biowest (Riverside, MO, EE. UU.), osteoblastos humanos

hFOB1.19 de ATCC® CRL-11372 ™ (Manassas, VA, EE. UU.), kit LIVE/DEAD™ Molecular

Probes™ ThermoFisher SCIENTIFIC. La Integrina β1 (A-4): sc-374429, vinculina (7F9)

sc-73614 y anticuerpos (IgG de ratón: sc-3891 SCBT) se adquirieron de Santa Cruz

Biotechnology (Dallas, TX, EE. UU.)

2.2 Métodos

2.2.1 Preparación de películas de quitosano sin agente entrecruzante, entrecruzadas

con GA (glutaraldehído) y polietilenglicol diglicidil éter (PEGDE) secas 25°C y 150°C

Se disolvió quitosano (200 mg) en 30 ml de en ácido acético 0.4 M. Esta solución se agitó

en una placa agitadora magnética a 100 rpm a 25°C, durante una hora hasta obtener una

solución clara. Posteriormente, se vertieron 25 ml de la solución en placas de Petri de

plástico, dejándolas secar a 25°C durante 7 días aproximadamente. Las películas

resultantes se neutralizaron con una solución de hidróxido de sodio (5% en peso), se

lavaron con agua destilada y se secaron a 25°C durante aproximadamente 24 h. Las

25

películas de quitosano entrecruzado se obtuvieron de manera similar, adicionando 0.3744

mmol (150 µL) de glutaraldehído ó 0.114 mmol (50 µL), 0,228 mmol (100 µL) y 0,342 mmol

(150 µL) de PEGDE. Esto se denominará PEGDE1, PEGDE2 y PEGDE3, respectivamente.

Dichas soluciones se mantuvieron en agitación durante 5 h hasta la completa

homogeneización de la mezcla. Después se vertieron las soluciones en placas de Petri de

plástico y se secaron a 25°C. Las películas obtenidas después de la evaporación del

disolvente se neutralizaron con NaOH al 5% en peso y se enjuagaron con agua destilada.

Otro lote de películas de quitosano con y sin entrecruzamiento fueron tratadas

térmicamente a 150°C durante 24 h en condiciones de vacío.

2.2.2 Preparación de espumas de quitosano sin agente entrecruzante, entrecruzadas

con GA y PEGDE

Se prepararon espumas para los estudios de citotoxicidad, debido a que por su porosidad

poseen una arquitectura similar a la del tejido a reparar. Para la preparación de las

espumas se siguió la misma metodología descrita en la sección 2.1.1 Las soluciones de

quitosano con y sin entrecruzante se secaron parcialmente a temperatura ambiente (25ºC

+/- 1) durante 5 días y se congelaron durante 48 horas, previas a la liofilización. Las

condiciones para la liofilización fueron 0.024 mBar a -52ºC. Se empleó una liofilizadora

FreeZone 4.5 litros -50C Benchtop, LABCONCO. Posterior a la liofilización, las espumas

se enjuagaron con NaOH al 5% y agua destilada para su neutralización.

2.2.3 Preparación de películas de quitosano y hialuronato de sodio, quitosano-ácido

hialuronato de sodio entrecruzado con glutaraldehído y quitosano-hialuronato de

sodio entrecruzados con polietilenglicol diglicil éter

Se estudiaron 2 concentraciones de hialuronato de sodio (HNa) 15% y 30%. Las películas

se obtuvieron mediante la disolución de 100 mg de quitosano en 20 ml ácido acético al 0.4

M. La solución se agitó durante una hora hasta obtener soluciones claras; a continuación,

se añadieron 30 mg y 60 mg de HNa correspondientes a concentraciones de 15% y 30%

respectivamente, dispersos en 10 ml de agua destilada. La solución se dejó en agitación

durante 1 hora, posteriormente se vaciaron en placas Petri de plástico, se secaron a

temperatura ambiente (25°C) durante aproximadamente 7 días, hasta la completa

evaporación del ácido acético. Las películas obtenidas fueron neutralizadas con NaOH al

5%. Se enjuagaron con agua destilada y dejaron secar a 25°C durante 24 horas.

26

Al igual que para la obtención de las películas sin entrecruzante, se probaron

concentraciones de HNa del 15% y 30%, siguiendo la misma metodología de la sección

2.2.1 variando únicamente la incorporación de las soluciones entrecruzantes (0.3744 mmol

(150 µL) de glutaraldehído ó 0.114 mmol (50 µL), 0,228 mmol (100 µL) y 0,342 mmol (150

µL) de PEGDE.). Las soluciones se vaciaron en placas Petri de plástico, se secaron a

temperatura ambiente (25°C) durante aproximadamente 7 días, hasta la evaporación del

ácido acético residual y la obtención de las películas. Dichas películas se lavaron con NaOH

al 5% para su neutralización y se enjuagaron con agua destilada. Para finalizar se secaron

a 25°C durante 24 horas.

2.2.4 Caracterización fisicoquímica de las películas de quitosano, quitosano-GA,

quitosano-PEGDE, quitosano-HNa, quitosano-HNa-GA, quitosano-HNa-PEGDE

Determinación de grupos de amino libres

Se depositó quitosano entrecruzado (0.125 g) en 25 ml de una solución acuosa de HCl 0,1

M y se dejó durante 20 h para permitir la protonación de los grupos amino. Posteriormente,

la solución se tituló con una solución de NaOH al 0.1M y se midió el pH con un medidor de

pH pH-Ion 510 (OAKTON Instruments, Vernon Hills, IL, EE. UU.). Se repitió el mismo

procedimiento con películas de quitosano puro. El porcentaje de grupos amino libres en la

muestra se calculó con las ecuaciones (1) y (2) [134].

��% = �� .�� %�� Ec. 1.

��% �� = �� %�.��%� � 100 Ec. 2.

Donde C1 es la concentración de HCl, C2 es la concentración de NaOH, V1 es el volumen

de la solución de HCl, V2 es el volumen de la solución de NaOH añadida durante la

valoración, 0.016 es el contenido de NH2 en g/mL de HCl al 0.1M, w es la masa de la

muestra (g). El porcentaje de contenido teórico de NH2 en el quitosano se consideró como

9.94% [34]. El contenido de agua (w) se calculó por la pérdida de masa de la muestra antes

y después del secado a 150°C utilizando el termograma de análisis termogravimétrico

(TGA) [135].

27

FTIR

Los espectros infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) de las películas se obtuvieron

utilizando el espectrómetro Thermo Scientific Nicolet 8700 FT-IR (Madison, WI, EE. UU.),

con cristal de seleniuro de zinc (ZnSe) para reflectancia total atenuada (ATR). Los espectros

se adquirieron en el intervalo espectral de 4000 y 650 cm-1 con un promedio de 100

exploraciones con una resolución de 4 cm-1 con corrección de H2O y CO2.

Raman

Cuando la muestra lo permitió (películas de CHT modificadas con AH), se obtuvieron los

espectros por Raman empleando un equipo InVia™ Raman microscope Renishaw (Wotton-

under-Edge, Gloucestershir). Se utilizó el láser de 633 nm a una potencia de 50% y se

analizó en el intervalo espectral de 100 a 3200 cm-1 con 2 acumulaciones, rejilla de 1800,

objetivo 50X, con un tiempo de exposición de 10 s.

DSC

El análisis de Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) se realizó para conocer el

comportamiento térmico del quitosano cuando ésta era calentada a una tasa específica,

para la posible observación de alguna transición de baja temperatura en los materiales La

prueba se llevó a cabo en un DSC Diamond Perkin Elmer (fig. 4). Las muestras de 5 mg de

peso fueron colocadas en una charola de aluminio y se sometieron a un programa de

calentamiento en un intervalo de 30 a 250 °C con una rampa de 10°C/min, en atmósfera de

nitrógeno.

TGA

El análisis termogravimétrico (TGA) se realizó en un TGA 8000™ de Perkin-Elmer

(Waltham, MA, EE. UU.) Se empleó una muestra de 5-10 mg por cada película. El intervalo

de la temperatura de calentamiento fue de 50 a 700°C a 10°C/min bajo flujo continuo de

nitrógeno seco. Se reporta la masa residual contra temperatura y la primera derivada de la

masa residual contra temperatura.

28

DRX

Los patrones de difracción de rayos X (DRX) de las películas se registraron utilizando un

difractómetro de rayos X avanzado Bruker D-8 (Karlsruhe, Alemania). El voltaje, la corriente

y el tiempo de paso fue de 40 mV, 55 mA y 6 s, respectivamente. El índice de cristalinidad

(CrI020) se calculó utilizando la siguiente ecuación:

CrI�� = [�I�� − I'(�/�I��]x100 Ec. 3.

Donde I020 es la intensidad máxima por debajo de 13° y Iam, la intensidad de difracción

amorfa a 16° [136].

Esta ecuación fue empleada ya que se intentó calcular la cristalinidad con la fórmula

reportada por Focher [137] pero debido a la presencia de múltiples picos, y a la baja

intensidad del pico Iam, los resultados no fueron concluyentes.

Se calculó la distancia intermolecular (d-spacing) de cada película a partir de la ley de Bragg

(ecuación 4):

nλ= 2d �sin� θ Ec. 4.

Donde:

n: número entero (n=1)

λ: constante de longitud de onda (1.54 Å) de la radiación

θ: es el ángulo de la difracción exhibido por el polímero

de donde d se obtiene como:

d = 34� 563 �7

� Ec. 6.

MEB

La morfología de las partículas fue definida mediante microscopía electrónica de barrido

(MEB). Las muestras se recubrieron con oro en un Denton Desk II Sputter Coater

(Moorestown, NJ, EE. UU.) (50 s, 40 mA). La morfología de la superficie de las películas se

examinó utilizando un microscopio JEOL, JMS 6360LV (Akishima Tokio, Japón) con un

voltaje de aceleración de 20 kV. Adicionalmente la composición elemental de las películas

fue obtenida mediante el microanálisis por energía dispersiva de Rayos X (EDX por sus

siglas en inglés), se empleó un equipo X-sight Model 7582 de Oxford Instruments

(Wycombe, Reino Unido), acoplado al MEB utilizando un haz de 20 keV.

29

XPS

Adicionalmente se realizó el análisis por espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS,

por sus siglas en inglés), para realizar dicho análisis se empleó un espectrómetro de

fotoelectrones de rayos X Thermo Scientific K-Alpha X-ray Photoelectron Spectrometer

(Waltham, MA, EE. UU.), con una fuente monocromática de Al Kα con una energía de

1486.6 eV sin erosión. El área elíptica de análisis tuvo un diámetro mayor de 0.4 mm. Los

espectros de inspección (survey) se adquirieron en un intervalo de energía de enlace de

0 a 1100 eV, utilizando una energía de paso de 50 eV. Se calculó la deconvolución de

los picos principales para la determinación de su composición elemental (at. %) mediante

el uso del programa es el avantage V 5.9902

AFM

La topografía de la superficie de las muestras se obtuvo mediante microscopía de fuerza

atómica utilizando un AFM de la marca Bruker modelo INNOVA SPM utilizando el modo

Tapping. Las imágenes se obtuvieron en aire a temperatura ambiente con una punta de

silicón comercial en forma de cantiléver, con una frecuencia de resonancia de 300 kHz. La

punta utilizada es la RTESP nanoprobe Bruker, con una constante de resorte de 40N/m y

8 nm de radio de la punta. La frecuencia de escaneo fue 0.5 Hz. Se llevó a cabo un análisis

estadístico para calcular la rugosidad de las muestras, el cual consistió en seccionar el área

escaneada de 100 µm x 100 µm en 4 subáreas de 50 µm x 50 µm, y la rugosidad fue

calculada para cada subárea usando el software Nanoscope Analysis. El promedio

estadístico y la desviación estándar de la rugosidad de cada tipo de muestra fue reportada

tomando en cuenta 12 mediciones.

Ángulo de contacto

Para la evaluación de los ángulos de contacto se usó un goniómetro / tensiómetro ramé-

hart modelo 250 con DROPimage Advanced v2.8 (Succasunna, NJ, EE. UU.). El ensayo se

realizó a temperatura ambiente (25°C). Se colocó una muestra de cada película, de 1cm x

6 cm, en un soporte móvil y se niveló horizontalmente. Se depositaron 5 µL de agua

destilada o medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) en la superficie de la película

usando una microjeringa. Se promediaron diez réplicas por muestra. La imagen de la gota

de agua o DMEM se capturó dentro de los 10 s posteriores al depósito.

30

Caracterización Mecánica

Las pruebas mecánicas de tensión se realizaron según la norma ASTM D882, usando una

máquina de pruebas universales MINI SHIMADZU con una celda de carga de 1 kN. La

prueba de tensión consistió en colocar la probeta entre dos mordazas, una fija y otra móvil

sujeta al cabezal de la máquina de pruebas universales, con una distancia entre mordazas

inicial de 25 mm. Se utilizaron probetas cortadas en forma de rectángulo, con un tamaño

de 5 mm de ancho, 50 mm de largo, y 0.1 mm de espesor, siguiendo las proporciones

indicadas en la norma, y se deformaron a una velocidad de 50 mm/min; la carga fue aplicada

hasta que el material falló. Las muestras fueron probadas por quintuplicado (n ≥ 5) para

cada material ensayado.

2.2.6 Pruebas de Degradación in vitro

Degradación química acelerada

Las pruebas de degradación in vitro se realizaron por reflujo a 100ºC durante 24 horas en

soluciones de H2O2 al 30%, HCl 2M, NaOH 5M, utilizando agua destilada como control. La

degradación química de las películas se llevó a cabo por triplicado para cada muestra

(quitosano, quitosano/GA, quitosano/PEGDE), siendo el peso inicial promedio de 50 mg.

Se emplearon 80 ml de cada una de las soluciones de estudio. Los residuos de la

degradación fueron lavados y secados a temperatura ambiente (25ºC) por un mínimo de 48

h; se realizó el cálculo de porcentaje de pérdida de masa mediante las ecuaciones 7 y 8.

%masa remanente = < =65> ?@3'A=65> @3@B@'AC 100 Ec. 7.

%masa perdida = <E'5' @3@B@'A�('5' ?@3'A('5' @3@B@'A C 100 Ec. 8.

31

Degradación enzimática

La degradación in vitro de la quitosana se estudió a 37ºC en PBS (pH 7.4) ya que es el

mismo que se encuentra en el suero humano [138], y BES (pH 6.4) por el pH salival (6.5 a

7), que contenían 1.5 mg/mL de lisozima (figura 2.1). Esta concentración fue elegida ya que

es la misma que se reporta para el suero humano. La solución de lisozima se cambió

diariamente para asegurar la actividad enzimática. Se colocaron andamios con una masa

aproximada de 10 mg en cajas de 24 pozos que contenían 1 mL de solución de lisozima y

se incubaron durante 21 días. Después de 7, 14 y 21 días, las muestras se retiraron del

medio y se enjuagaron con agua destilada. Los andamios se secaron a 60°C durante 24 h

y se pesaron. La degradación se expresó como pérdida de masa de los andamios mediante

la ecuación 8.

Figura. 2.1. Caja de 24 pozos con películas y lisozima para degradación enzimática

2.2.7 Estudios de viabilidad y proliferación celular

Cultivo celular (osteoblastos)

Para llevar a cabo este ensayo, se procedió en primer lugar a tripsinizar los cultivos

celulares (osteoblastos humanos ATCC hFOB1.19), agregando 2 ml de TrypLE™ Express

ThermoFisher Scientific, durante 10 min, y 2 ml de medio de cultivo DMEM (medio de Eagle

modificado por Dulbecco) Biowest adicionado con 10% Suero Fetal Bovino (SFB)

Biowest, antibióticos (500 U/ml Penicilina G, 500 mg/ml Estreptomicina), y antimicóticos

(1. 25 mg/ml Anfoterecina B), dentro de cajas Falcon de 25 ml. Seguidamente se decantó

la mezcla en tubos de ensayo estériles y se centrifugó para obtener un precipitado o pellet,

32

el cual se dispersó en una pequeña cantidad de medio de cultivo. A continuación, se

tomaron 50 μl de la suspensión celular obtenida, los cuales se incubaron en un tubo tipo

Eppendorf de 1.5 ml con un volumen equivalente (50 μl) de solución de azul tripán al 4%

durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se tomaron 10 μl de la mezcla

y se colocaron en la cámara de Neubauer.

La fórmula que se empleó para el calcular el número de células obtenidas fue la siguiente:

�F/4F̄10�10� Ec. 9.

Donde:

x̄= Promedio de las células contadas en la cámara de Neubauer

10= Dilución empleada entre las células y azul de tripán (10 μL de células, 90 μL azul de

tripán) 104= Constante (4 cuadrantes de la cámara)

Proliferación celular por MTS

Los estudios de viabilidad celular se realizaron usando el ensayo de proliferación celular

CellTiter 96® MTS. Se utilizaron muestras de 10 mg de peso de cada una de las películas

y de cada una de las espumas, para los ensayos de contacto directo. También se obtuvieron

extractos para los ensayos de contacto indirecto. La concentración de la muestra para la

obtención de los extractos fue de 2.5 mg/ml en medio de cultivo DMEM (medio de Eagle

modificado por Dulbecco) Biowest, según la guía práctica para preparación de muestras

y materiales de referencia, ISO 10993-12. [139] Se colocaron las muestras (por triplicado)

en cajas nuevas y estériles de 96 pozos, se esterilizaron con UV durante 15 minutos. Para

la prueba de contacto indirecto, los extractos reemplazaron el medio de cultivo en una placa

de 96 pocillos. Para ambas pruebas se emplearon osteoblastos, los cuales se sembraron

con una densidad de 2 x 103 células/andamios para contacto directo y 2 × 103 células/pocillo

para contacto indirecto. Las células sembradas se incubaron a 37°C, 5% de CO2 y 95% de

humedad durante 48 h. Para ambas técnicas (directa e indirecta) se incluyó un control

positivo que consistía en células con solo medio de cultivo (C+), un control negativo (C−) a

base de peróxido de hidrógeno, así como el blanco para la lectura el cual solo contenía

solución de MTS.

Posterior a las 48 horas, se añadieron a cada pozo 20 l de MTS CellTiter 96® AQueous

Non-Radioactive Cell Proliferation, siguiendo las instrucciones del fabricante. Para las 34

muestras, se mezclaron 648 µL de MTS [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil)

-2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolio] con 32 µL PMS (metosulfato de fenazina) previa

33

descongelación de dichos reactivos. Todo el procedimiento se realizó a 25 ° C y protegido

de la luz. Las soluciones de MTS se usaron inmediatamente después de la preparación. Se

dejó en incubación durante 3 horas. El valor de absorbancia se midió en un

espectrofotómetro de múltiples pozos (Thermo Scientific™) a 490 nm.

Análisis de adhesión celular mediante Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)

En una placa de 24 pozos se sembraron 2 x 10^4células/ml (osteoblastos). Las células se

cultivaron sobre películas de 10 mg de peso para el análisis por contacto indirecto, o en 300

µL de los extractos obtenidos de cada muestra para el ensayo por contacto indirecto. Se

incubaron a 37°C, 5% de CO2 y 95% de humedad durante 48 h. Después del cultivo de

osteoblastos se lavaron las muestras dos veces con PBS, y fueron fijadas en glutaraldehído

al 25%, durante 2 horas. Posteriormente las muestras fueron lavadas tres veces por 10

minutos con PBS y deshidratadas en series graduales de etanol (70, 80, 90% y etanol

absoluto) durante 1 hora por cada porcentaje. Las células fijadas fueron observadas en un

Microscopio Electrónico de Barrido marca JEOL, JSM-6360 LV, a diferentes amplificaciones

(150X, 500X, 1500X, 5000X) utilizando un voltaje de 20 kV, en platina fría a -20°C.

Análisis de expresión de integrina y vinculina

Las alteraciones del citoesqueleto se midieron mediante la expresión de las proteínas de

adhesión integrina y vinculina. Para llevar a cabo estos ensayos, se utilizaron extractos

obtenidos de los andamios de quitosano, quitosano entrecruzado con PEGDE y GA. En una

placa de 24 pozos se sembraron 20 x 103 células / ml (osteoblastos ATCC hFOB1.19), se

añadieron 120 µL de cada muestra y se incubaron a 37°C, 5% de CO2 y 95% de humedad

durante 48 h. Pasado el tiempo de incubación, las muestras se enjuagaron con PBS, se

fijaron con formalina al 4% y se bloquearon con interpolación de ABS al 1%. Se añadió el

primer anticuerpo, Integrina β1 (A-4): sc-374429 (50 µL por placa, diluido con PBS-Tween

1: 150) y se incubó a 4°C durante la noche. Después de lavar con PBS, se añadió el

segundo anticuerpo (IgG de ratón: sc-3891 SCBT, (50 µL por placa diluida con PBS-Tween

1: 500) y se dejó durante 2 h. Las muestras se observaron en un microscopio de

fluorescencia marca Leica , equipado con una cámara digital, utilizando el software LAS

AF (Leica, Wetzlar, Alemania). Se realizó el mismo procedimiento para la vinculina (7F9 sc-

73614). Todos los anticuerpos fueron proporcionados por Santa Cruz Biotechnology

(Dallas, Texas, EE. UU.)

34

Ensayos de viabilidad y proliferación Vida/Muerte (LIVE / DEAD)

En la realización de este ensayo de viabilidad - citotoxicidad se empleó el kit LIVE/DEAD™

Molecular Probes™ ThermoFisher SCIENTIFIC. Para realizar este ensayo se colocaron

en una caja estéril de 24 pozos, 10 mg de cada muestra en forma de películas. Se

esterilizaron durante 15 min con luz UV. Posterior a la esterilización se agregaron 160 l de

osteoblastos, (osteoblastos humanos ATCC hFOB1.19), a una densidad celular de 2 x

10^4células/ml y 1 ml de medio de cultivo en cada pozo. Las células cultivadas se incubaron

en una atmósfera humidificada a 37°C y 5% de CO2 durante 48 horas. Posterior a las 48

horas se retiró el medio de cultivo, se lavó cada pozo 2 veces con PBS, y se añadieron a

cada pozo 200 l de reactivo (2.4 l de bromuro de etidio 0.6 l de calceina en 1 ml de

PBS). Después de 45 minutos, se realizaron 2 lavados adicionales con PBS. Las células se

examinaron con un microscopio de fluorescencia marca Leica equipado con una cámara

digital, empleando el software LAS AF.

2.3 Análisis de resultados

Los resultados obtenidos mediante las diferentes pruebas realizadas se registraron y

analizaron con Microsoft Excel (Microsoft Corporation) y Origin (Origin Lab), para ser

tabulados, graficados y realizar su análisis estadístico. Los resultados se reportan indicando

los valores de media y desviación estándar. Adicionalmente se le realizó a la prueba de

proliferación celular un análisis de la varianza (ANOVA, por sus siglas en inglés) de una vía,

con una prueba de Tukey para comparación entre grupos, utilizando el software Minitab

(Minitab Inc.). Para las pruebas estadísticas, fue utilizado un mínimo de n = 3, y un nivel de

significancia del 5% ( = 0.05), por lo que valores de p < 0.05 fueron considerados

significativos.

35

CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 Andamios de quitosano, quitosano entrecruzado con glutaraldehído o

polietilenglicol diglicil éter en forma de película

3.1.1 Caracterización fisicoquímica de las películas de quitosano sin agente

entrecruzante, entrecruzadas con GA (glutaraldehído) y polietilenglicol diglicidil éter

(PEGDE) secas 25°C y 150°C

FTIR

Efecto de la neutralización en la quitosana pura

En la figura 3.1 se observan las bandas características del espectro de quitosano en polvo

con peso molecular medio, y el espectro de las películas de quitosano ácidas y

neutralizadas. En el espectro del quitosano en polvo se observa una banda a 3350 cm-1

correspondiente a los grupos O-H del polímero, una banda en 3280 cm-1 que es

característica de la vibración de tensión simétrica del grupo amida (N-H), en 2923 y 2850

cm-1 del grupo C-H, en 1647 cm-1 se localizó el grupo N-H de una amida primaria asociada

con los restos del grupo acetamida después de la desacetilación. En 1561 cm-1 aparece el

grupo amino N-H2, a 1420 cm-1 corresponde a vibraciones C-H, la banda de 1375 cm-1 se

atribuye a vibraciones de C-H3 en grupo acetamida. La banda ubicada a 1150 cm-1 se

asigna al C-O-C del enlace glucosídico, así como la de 1068 cm-1. Las vibraciones del

esqueleto propias de la estructura de quitosano aparecen en 1029 - 890 cm-1.

Debido a que se ha reportado la formación de sales entre los grupos amino protonados y

los iones provenientes del ácido utilizado para disolver a la quitosana, en la figura 3.1 se

observan los espectros de FTIR de las películas de quitosano ácidas (ácido acético) y

neutralizadas (NaOH). La banda a 1588 cm-1 (situada originalmente a 1561 cm-1) se

observa con mayor intensidad en la película ácida mientras que la absorción a 1647 cm-1

fue más intensa en el polvo y la quitosana neutralizada. Se observó una banda de absorción

a 1152 cm-1, la cual coincide con lo reportado por Correira et al [140], corresponde a la sal

formada durante la disolución del quitosano en ácido acético aunque esta banda estaba

originalmente presente debido al enlace glucosídico de la quitosana.

36

Figura 3.1. Espectros de FTIR del quitosano en polvo de peso molecular medio, película de quitosano ácida y película de quitosano neutra.

El polvo de quitosano se puede disolver en soluciones ácidas como son el ácidos acético,

cítrico, glicólico, láctico, málico y propiónico entre otros a causa de que el quitosano es una

polibase débil. Esto es considerablemente ventajoso ya que estos ácidos se clasifican como

inocuos, incluso algunos de ellos son productos comestibles o de degradación en el cuerpo

humano [141]. Cuando el quitosano se asocia a ácidos carboxílicos simples, como el

fórmico, el acético, etc., se producen interacciones electrostáticas que provocan la

formación de una sal, en mayor o menor grado [58].

A diferencia de las poliaminas clásicas como la polilisina, la función amino del quitosano es

de una base débil y, por lo tanto, está en equilibrio con una parte significativa de los ácidos

que quedan en la forma no disociada. Lo cual representa un gran interés para aplicaciones

biológicas ya que en este caso el quitosano se consideraría como un vector ácido para los

sistemas de liberación sostenida. Dado que el contraión afecta el pKa aparente de las sales

de quitosano, el pH de tales soluciones puede elevarse a 5 o más, simplemente por la

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

10

29

10

68

89

28

98

10

62

107

71

157

115

01

257

12

65

13

14

13

1713

19

13

75

137

61

420

15

58

15

61

285

02

86

7

33

78

CHT-película neutra

CHT-película ácida

CHT-polvo

328

0

891

102

5

137

9

156

91

647

286

02

923

335

0

Abs

orba

ncia

Numero de onda (cm-1)

37

protonación parcial del polisacárido con ácido butírico o valérico. Por lo que las reacciones

no deseadas en los medios biológicos debido a la acidez de algunas sales de quitosano,

pueden ser minimizadas [43].

La formación de la sal se da a partir de la interacción electrostática entre el grupo amino

protonado en el esqueleto del quitosano y el ion carboxilato del ácido carboxílico. Esto se

observa en nuestras muestras ya que las películas exhiben bandas correspondientes a los

grupos amino y carboxilato en el número de onda de 1647 y 1561 cm− 1 respectivamente.

La banda de amina se desplazó de 1561 cm-1 a 1569 cm-1. El cambio en el espectro de

quitosano puro indica que produjo alguna interacción entre el ácido acético y los grupos

amino del quitosano [142].

Efecto de la temperatura de secado en películas de quitosano sin entrecruzante

Los espectros de infrarrojo de las películas secas a 25℃ y 150°C de la quitosana pura se

presentan en la figura 3.2 (CHT). A 25°C se observa la banda de absorción a 1650 cm− 1

que se asocia a la vibración C = O en el grupo amida I N–H (acetamida), la banda a 1560

cm− 1 se atribuye a la flexión de C–N y N–H2 en la región de la amida II. Cuando la quitosana

fue calentada a 150°C la banda de la amida I se desplazó de 1650 cm-1 a1640 cm-1 y se

redujo significativamente, en comparación con la banda a 1560 cm− 1 (amida II).

El quitosano, debido a la gran cantidad de grupos polares que tiene, es un polímero

hidrofílico. El agua adsorbida provoca un aumento en la absorción a 3450 cm-1 asociado

con el aumento simultáneo de la absorbancia a 1640 cm-1, por lo que esta banda también

podría estar asociada al agua. La complejidad de los espectros de infrarrojo del quitosano

se debe a la complicada y específica red de enlaces de hidrógeno en la que están

implicados los grupos O-H, C -O y N-H. En la interpretación cuantitativa de bandas de

vibraciones de estiramiento O-H, se deben tener en cuenta varios valores de coeficiente de

absorción para formas particulares de H2O adsorbida [80].

El quitosano sin entrecruzante en forma de película neutralizada (CHT en la figura) (figura

3.2 ) exhibió una absorción amplia característica, entre 3677 cm − 1 y 3000 cm − 1 (con picos

máximos a 3360 cm − 1 y 3285 cm− 1) correspondiente al O–H (del quitosano y el agua) y la

vibración de N–H en los grupos amino. En 2920 cm−1 y 2850 cm− 1 se observaron las

absorciones correspondientes al estiramiento C–H en el metileno, C–H del anillo, CH2 del

quitosano no acetilado y acetilado, y metilos del quitosano acetilado). Mientras que la banda

de absorción a 1650 cm− 1 se asocia a la vibración C = O y N–H (acetamida) del grupo

38

amida I, la banda a 1560 cm− 1 se atribuye a la flexión de C–N y N–H2 en la región de la

amida II. A 1422 cm− 1 se observaron las bandas relacionadas con la flexión de los

metilenos. La absorción a 1380 cm−1 puede relacionarse con la vibración de CH3 y,

finalmente, a 1319 cm− 1, se observa la amida III. La amida III se usa comúnmente para

calcular el grado de acetilación. Las vibraciones características de la estructura de

quitosano aparecen a 1150 cm− 1 (C–O–C), 1080 cm − 1 y 1030 cm− 1 (anillo de piranosa).

Figura 3.2. a) Espectros de FTIR de las películas de quitosano secas a 25°C y b) secas a 150°C. CHT: películas de quitosano, CHT-GA: quitosano entrecruzado con

glutaraldehído, CHT-PEGDE, quitosano entrecruzado con PEGDE 1,2,3.

Efecto del agente entrecruzante y temperatura en películas de quitosano

Los espectros FTIR de las películas de quitosano entrecruzadas secas a 25°C y a 150°C

se presentan en la figura 3.2 a y b respectivamente.

Cuando el CHT se entrecruzó con GA, el espectro presentó una banda a 1650 cm− 1, la cual

en este caso se atribuyó a la amida I y a el enlace imina correspondiente [36,37] (–C=N–

típicamente observado a 1655 cm−1), sin embargo, la amida II (1560 cm-1) presentó mayor

intensidad que la amida I (1640 cm-1).

Los espectros de FTIR de las películas de quitosano entrecruzadas con PEGDE mostraron

una mayor intensidad de la amida I (1640 cm-1) en comparación con la amida II (1560 cm-

1). Esta diferencia fue aún más marcada a medida que aumentó la cantidad de PEGDE. Los

(a) (b)

3500 3000 2500 2000 1500 1000

Número de onda (cm-1)

1330

1420

1080

1150 10

30

1380

1560

1650

2850

29203

360

CHT-PEGDE3

CHT-PEGDE2

CHT-PEGDE1

CHT-GA

CHT

Abso

rban

cia

3500 3000 2500 2000 1500 1000

33

50

16

40

156

0

13

80

1070


CHT

CHT-GA

CHT-PEGDE1

CHT-PEGDE2

CHT-PEGDE3

Abs

orb

anci

a

103

0

39

grupos amino, ahora ubicados a 1577 cm− 1, son más reactivos que los grupos hidroxilo, y

pueden reaccionar con el anillo epoxi dando lugar a una estructura entrecruzada, por lo que

se observan intensidades menores a concentraciones más altas de PEGDE. Las bandas a

1030 cm-1 aumentan su intensidad conforme aumenta la concentración de PEGDE, en las

muestras secas a 150°C; estas absorciones se han asignado al estiramiento asimétrico del

enlace C-O -C de PEG. [143]. Las bandas más intensas en el espectro puro del PEGDE se

encuentran ubicadas a 1140 cm− 1 y 1103 cm− 1 como lo muestra la figura 3.3

El PEGDE puro exhibe bandas a 1350 cm− 1 y 1460 cm− 1, por lo que se esperaba

encontrarlas en los espectros del quitosano entrecruzado con el PEGDE, según lo

informado por Song et al [38]. Sin embargo, estas absorciones no se detectaron, o bien, los

picos de quitosano se superpusieron. Del mismo modo, aunque se esperaba una reducción

de las vibraciones asociadas con el enlace N -H, la introducción de nuevos grupos de O–H

enmascararon este efecto.

Figura 3.3. Espectro de FTIR del Polietilenglicol diglicidil éter (PEGDE).

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

1350

1460

1103

1140

1350

2865

Abso

rbanci

a


40

Los espectros infrarrojos de las películas secas a 150°C se presentan en la figura 3.2 (b).

La banda ubicada a 1640 cm− 1 (amida I) se redujo significativamente, en comparación con

la banda a 1560 cm− 1 (amida II). Con el entrecruzamiento con GA, la amida II se observó

de menor intensidad que la amida I, la absorción a 1380 cm− 1 permaneció sin cambios.

En las películas de CHT entrecruzado con PEGDE, se observó nuevamente una mayor

intensidad de la amida I, en comparación con la amida II. Esto indica que estas bandas no

son una buena referencia para estimar el grado de entrecruzamiento, o que el mecanismo

de entrecruzamiento es diferente para el GA en comparación con el PEGDE. Finalmente,

las absorciones a 1380 cm−1 y 1315 cm−1 exhibieron mayor intensidad en comparación con

la banda a 1418 cm− 1.

Lim et al. estudiaron los espectros IR de películas de quitosano antes y después del

tratamiento térmico a 150°C durante 1 hora, los resultados que obtuvieron fueron similares

para ambos tratamientos térmicos, excepto por un pico más agudo a 1652 cm-1 después

del tratamiento térmico. En ambos espectros, se observó una banda fuerte a 1560 cm-1 para

la amida II (N-H) y una a 1652 cm-1 correspondiente a la amida I (-C = O). La duración del

tratamiento térmico afectó la resistencia al agua de las películas de quitosano, haciéndolas

menos solubles [144].

Nuestro estudio demuestra que el secado a 150°C reduce la intensidad de O–H. Esto se

confirmó por el aumento en la intensidad de las absorciones de 2922 cm– 1 y 2850 cm− 1 con

respecto al quitosano seco a 25°C. Por lo tanto, no solo se eliminaría el agua adsorbida,

sino que también se puede esperar la ruptura de los puentes de hidrógeno dentro y/ o entre

las cadenas, de las moléculas de agua y los grupos N-H u O-H de la molécula de quitosano.

La reducción en la intensidad O–H y N–H también se observó en las películas

entrecruzadas, sin embargo, fue menos notoria en el CHT entrecruzado con PEGDE, ya

que es más hidrófilo. En cuanto a la banda correspondiente a la amida I, no se presentaron

cambios aparentes; sin embargo, exhibió una significativa reducción en su intensidad. Esto

concuerda con lo reportado por Zawadzki et al. [80], quienes encontraron no solo una

disminución en la intensidad de la banda amplia centrada aproximadamente a 3370 cm-1,

sino también una reducción en la absorción del grupo C=O de quitosano (es decir, la banda

de amida I). Este resultado muestra que la interacción de las moléculas de agua adsorbidas

se ve disminuida no solo en la región de 3400 cm−1 – 3200 cm−1, sino también en la región

del grupo carbonilo, lo que también implicaría que la deshidratación tiene lugar no solo a

nivel de la superficie, sino también en la estructura del quitosano.

41

Determinación de grupos de amino libres

En la Tabla 3.1 se presentan los valores obtenidos en el porcentaje de grupos amino libres,

de las películas de quitosano sin entrecruzante, de las películas de quitosano entrecruzadas

con glutaraldehído y PEGDE, a diferentes concentraciones, con secado 25°C y 150°C.

Como se observa en la tabla, es evidente que los grupos amino se reducen tanto por el

entrecruzamiento como por tratamiento térmico a 150°C, es decir, de 72.5% a 25°C pasa a

54.9% a 150°C para CHT sin entrecruzante y de 53.4% a 25°C a 49.9% a 150°C para CHT

con mayor concentración de PEGDE. A partir de estos resultados, también está claro que

el PEGDE puede ser un entrecruzante igual de efectivo que el GA, especialmente a

concentraciones más altas.

Tabla 3.1. Porcentaje de grupos amino en películas de quitosano y películas de quitosano entrecruzado, secadas a 25ºC y a 150ºC

Grupos amino (%) 25ºC 150ºC

CHT 72.5 + 3.8 54.9 + 7.1 CHT-PEGDE1 56.5 + 4.1 55.3 + 3.0 CHT-PEGDE2 55.4 + 5.6 52.3 + 2.2 CHT-PEGDE3 53.4 + 4.3 49.9 + 5.2 CHT-GA 51.5 + 2.5 47.7+ 1.9

El tratamiento térmico a 150°C genera andamios de quitosano insolubles cuando se tratan

con soluciones ácidas (ver figura 3.4). Después del tratamiento térmico a 150 ° C es posible

que algunas reacciones químicas que involucran grupos amino conduzcan al

entrecruzamiento del andamio de quitosano como, por ejemplo, la oxidación de alcoholes

podría generar la producción de aldehídos, que a su vez reaccionarían con los grupos

amino, lo que conduciría a la formación de iminas. Esto podría explicar porque el porcentaje

de los grupos amino cuantificados a 150°C fue muy bajo. Packer y Vaughan en 1958

reportaron que los ácidos, posterior a la deshidratación, producen ésteres (con alcoholes)

o amidas (con aminas) [145].

Figura. 3.4. a) Película de quitosano seco a 25ºC en solución de HCl, b) Película de

quitosano seco a 150ºC en solución de HCl

a b

42

El tratamiento térmico afecta la microestructura de las películas de quitosano como se

discute más adelante, pero la coloración amarilla de las películas se intensificó, y las

películas tratadas a 150°C se tornaron de color marrón amarillento. Este cambio de

coloración se ha reportado después de que el quitosano reaccione con el GA, y se ha

atribuido a la formación de enlaces entre las cadenas de ambos polímeros dando lugar a

las iminas [144].

Ogawa et al. [146] reportan resultados similares, señalando que la coloración de la película

de quitosano se intensificó con el aumento de la temperatura y la duración del tratamiento.

Sin embargo, estos resultados deben tomarse con precaución, ya que es posible que el

ácido acético no se haya eliminado completamente. El quitosano comercial empleado en

esta investigación fue disuelto en ácido acético. El ácido acético se clasifica como un ácido

carboxílico débil, cuando se emplea como disolvente del quitosano los iones en el grupo

amino del quitosano interactuarán fácilmente con el agua a través de puentes de hidrógeno.

La presencia de residuos de dicho ácido podría enmascarar los grupos amino durante la

titulación [147].

Balázs señala que el uso de concentraciones de quitosano de aproximadamente 1 g/L (y

alrededor de 0.010 M de concentraciones de ácido fuerte) parece ser la óptima para realizar

titulaciones de manera precisa. También menciona que concentraciones elevadas de ácido

dan como resultado puntos de equivalencia más distantes, esto a causa de la presencia de

ácido extra en el CHT seco (polvo). Por ejemplo, un poco de ácido acético residual, que a

menudo se usa en la purificación del producto durante el proceso de fabricación, puede

permanecer en la muestra, o el quitosano comercial empleado se encontraba en forma

parcialmente protonada durante la precipitación [148]. En la presente investigación, no se

observó evidencia por IR de sales de acetato residuales; sin embargo, en estado sólido, es

posible que no se puedan detectar rastros de ácido acético por FTIR.

La unión y el crecimiento de las células en sustratos de quitosano se ha atribuido a la

naturaleza catiónica de éste debido a la presencia de los grupos de amino. Los datos

sugieren que, a medida que aumenta el nivel de desacetilación, aumenta la densidad de

carga positiva en el quitosano y, en consecuencia, hay un aumento en la atracción de

células con carga negativa. Factores como el grado de desacetilación y las modificaciones

químicas influyen en las propiedades hidrofílicas de las películas de quitosano y sus

interacciones con el entorno biológico. Estos efectos se discutirán más a fondo en términos

de biocompatibilidad.

43

Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC)

En las figuras 3.5 y 3.6 se observan los termogramas obtenidos durante la primera y

segunda corrida de las películas de quitosano secas a 25°C y a 150°C. En la Tabla 3.2 se

presenta el cálculo del área correspondiente a la primera corrida en las películas secas a

25°C y a 150°C.

En la primera corrida, todas las películas, exhiben un amplio pico endotérmico en torno a

100ºC. Este pico se atribuye a la pérdida de agua asociada con los grupos hidrófilos del

polímero. En la segunda corrida no se observa el pico endotérmico a 100ºC en ninguna de

las muestras.

Figura 3.5. Termograma DSC de la primera (a) y de la segunda (b) corrida de las películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA),

quitosano entrecruzado con PEGDE 1, 2, 3 (CHT-PEGDE) secas a 25°C.

Figura 3.6. Termograma DSC (a) y de la segunda (b) corrida de las películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA), quitosano

entrecruzado con PEGDE 1, 2, 3 (CHT-PEGDE) secas a 150°C

(a) (b)

40 60 80 100 120 140 160 180 2000.2

0.0

-0.2

-0.4

-0.6

-0.8

-1.0

-1.2

-1.4

-1.6

Flu

jo d

e ca

lor

(W/g

)

Temperatura T (°C)

CHT CHT-PEGDE 1 CHT-PEGDE 2 CHT-PEGDE 3 CHT-GA

40 60 80 100 120 140 160 180 200

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

Flu

jo d

e ca

lor

(W/g

)


Temperatura T (°C)

(a) (b)

40 60 80 100 120 140 160 180 2000.2

0.0

-0.2

-0.4

-0.6

-0.8

-1.0

-1.2

-1.4

-1.6

Flu

jo d

e ca

lor

(W/g

)


Temperatura T (°C)40 60 80 100 120 140 160 180 200

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Flu

jo d

e ca

lor

(W/g

)


Temperatura T (°C)

44

Tabla 3.2 Entalpía de evaporación de la primera corrida de películas de quitosano y películas de quitosano entrecruzado, secas a 25ºC y a 150ºC

En la Tabla 3.2 se puede apreciar que en todas las películas secadas a 25°C el área es

mayor a comparación de las secadas a 150°C, lo que indicaría que se pierde una mayor

cantidad de agua en las películas secas a TA (25°C). La película que exhibe una mayor

pérdida de agua (50) es la de quitosano sin entrecruzante, secada a 25°C, y la que presenta

una menor pérdida (26) corresponde a la película de quitosano entrecruzada con mayor

concentración de PEGDE (PEGDE 3), secada a 150°C.

Lim et al. informaron que una endoterma con una temperatura máxima cercana a los 100°C

representa la energía requerida para vaporizar el agua presente en las muestras de película

[144].

Ostrowska-czubenko et al. [70] estudiaron el efecto del entrecruzamiento iónico en

hidrogeles de quitosano, empleando un secado de 60°C en sus muestras. Reportaron una

endoterma debajo de 100°C y la asignan a la pérdida de agua que no se pudo eliminar por

completo al secarse. Los polisacáridos tienen una fuerte afinidad por el agua y sus

propiedades de hidratación dependen de sus estructuras primarias y supramoleculares.

Además, liberan agua a diferentes temperaturas, dependiendo de las diferentes

interacciones del agua con sus cadenas.

Como se puede observar, el calentamiento de la muestra hasta 150° C seguido de una

segunda corrida inmediata en el mismo intervalo de temperatura produjo un termograma

con un pico muy reducido comparado con el secado a 25°C. Este resultado respalda la

conclusión de que la evaporación del agua ocurrió durante la primera corrida [70].

Secado a 25°C Secado a 150°C J J CHT 50 + 6 41 + 2 CHT/PEGDE1 45 + 3 31 + 2 CHT/PEGDE2 35 + 5 30 + 3 CHT/PEGDE3 42 + 2 26 + 4 CHT/GA 37 + 4 34 + 1

45

Análisis Termogravimétrico (TGA)

La estabilidad térmica se evaluar determinando la temperatura de inicio de la etapa de

degradación, la temperatura máxima durante la cinética de descomposición y la

temperatura correspondiente al 50% de masa perdida. En este estudio utilizamos la

temperatura máxima y el 50% de masa perdida para comparar la estabilidad térmica. La

Figura 3.7 muestra los termogramas por TGA de las películas de quitosano sin

entrecruzante y entrecruzadas con GA y PEGDE tratadas a 25°C (Figura 3.7 a, c) y 150 °

C (Figura 3.7 b, d).

Figura 3.7. Análisis termogravimétrico (TGA) (a, b) y DTGA (c, d) de termogramas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA) y entrecruzado

con PEGDE 1,2,3 (CHT-PEGDE)

25°C 150°C

(b)

100 200 300 400 500 600 70010

20

30

40

50

60

70

80

90

100

CHT

CHT-GA

CHT-PEGDE1

CHT-PEGDE2

CHT-PEGDE3

Temperatura (°C)

Masa

(%

)

(a)

100 200 300 400 500 600 70010

20

30

40

50

60

70

80

90

100

CHT

CHT-GA

CHT-PEGDE1

CHT-PEGDE2

CHT-PEGDE3

Ma

sa (

%)

Temperatura (°C)

(d)

100 200 300 400 500 600 700

-8

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

Temperatura (°C)

Prim

era

Deriva

da (

% T

)

CHT

CHT-GA

CHT-PEGDE1

CHT-PEGDE2

CHT-PEGDE3

100 200 300 400 500 600 700-8

-6

-4

-2

0

CHT

CHT-GA

CHT-PEGDE1

CHT-PEGDE2

CHT-PEGDE3

Temperatura (°C)

Prim

era

deriv

ada

(% T

)

(c)

46

El perfil de degradación consta de dos etapas principales; sin embargo, en el

entrecruzamiento de CHT con GA se puede apreciar una tercera etapa de degradación

según con lo reportado por López y et al. [149]. Esta tercera etapa también se observa en

el quitosano sin entrecruzante, seco a 150°C.

Las películas de CHT secas a 25°C exhibieron dos etapas de pérdida de masa, la primera

pérdida fue aproximadamente del 15% (65°C). Esta pérdida de masa se atribuye a la

eliminación de moléculas de agua que se adsorben en la superficie del quitosano [40].

Corazzari et al. reportaron que el quitosano con un grado de desacetilación de 78% exhibió

una pérdida de peso de aproximadamente 67% en un intervalo de temperatura de 30°C a

800ºC. En el intervalo de temperatura entre 30 y 150°C (tasa más alta a 76°C), se observó

una primera pérdida de masa de aproximadamente 5%. [40]

López et al. señalan que la degradación térmica del quitosano se produce en tres etapas,

pero estrictamente desde el punto de vista de la descomposición del polímero, la más

importante es la que se observa entre 268ºC y 312ºC, ya que está asociada con la

descomposición de la cadena polimérica [150].

En cuanto a las mediciones termogravimétricas en condiciones no oxidantes (atmósfera de

nitrógeno) Zawadzki et al. [80] indican que la muestra de quitosano contienen

aproximadamente 10% de agua adsorbida, que se evapora a temperatura relativamente

baja (por debajo de 100ºC); lo anterior significa que esta agua está unida débilmente a las

moléculas de quitosano. La descomposición que acompaña a la siguiente pérdida de peso

(10%) comienza alrededor de 100ºC y alcanza su tasa máxima a 168ºC. Es probable que

en esta etapa se libere el agua fuertemente ligada.

La etapa predominante de la degradación térmica aparece a un intervalo de 230-400ºC (con

un máximo a 274ºC) durante la cual se observa una caída de la masa de quitosano del

43%. Esta es causada por la despolimerización de las cadenas de quitosano, la

descomposición de los anillos de piranosa por deshidratación y desaminación y, finalmente

la reacción de apertura del anillo [151].

El análisis termogravimétrico permite concluir que el quitosano es térmicamente estable

hasta 230ºC en atmósfera de nitrógeno, mientras que es menos resistente al calentamiento

en oxígeno. Sin embargo, la evolución del agua enlazada comienza a temperaturas muy

bajas [80].

47

Zawadzki et al [80] demostraron un aumento de temperatura de hasta 200ºC conduce a la

eliminación de moléculas de H2O fuertemente unidas por puentes de hidrógeno. El

calentamiento adicional al vacío provoca la ruptura de las cadenas y la apertura de anillos

de piranosa con formación simultánea de residuo carbonoso poliaromático. El curso de la

degradación térmica en atmósfera de oxígeno está relacionado con la oxidación de

macromoléculas y la posterior descomposición de productos oxidados. Finalmente, a 600ºC

se encontraron residuos carbonosos del quitosano (alrededor del 4%). [80]

En la figura 3.7 se observa que el CHT previamente secado a 150°C muestra una pérdida

de masa menor que el seco a 25°C, esto como resultado del proceso de secado previo que

eliminó parte del agua adsorbida. En la segunda etapa, las muestras de quitosano seco a

25°C y 150°C mostraron un 50% (297°C) y un 72% (300°C) de pérdida de masa,

respectivamente. Esta pérdida de masa se puede atribuir a la descomposición parcial de la

estructura de CHT [136]. La pérdida de masa total para el CHT seco a 25°C fue del 65% y

para CHT seco a 150° C fue del 81%.

La mayor pérdida de masa registrada en el CHT seco a 150°C, en comparación con el seco

a 25°C, podría deberse al hecho de que el agua induce la formación de compuestos más

estables térmicamente, por lo que el proceso de secado podría verse afectado por la

estabilidad térmica del material [44]. Las temperaturas de descomposición y las pérdidas

de masa de las muestras de CHT entrecruzadas con glutaraldehído y con diferentes

concentraciones de PEGDE se resumen en la Tabla 3.3.

Tabla 3.3 Temperaturas máximas y pérdida de peso de las películas CHT

secas a 25°C y 150°C.

Películas Secas 25°C Secas 150°C Secas a 25°C Secas a 150°C Td (°C) T (°C) 50% pérdida de masa Td1 Td2 Td1 Td2

CHT 65 297 68 300 351 390 CHT-PEGDE 1 45 298 66 303 350 376 CHT-PEGDE 2 55 302 59 304 337 368 CHT-PEGDE 3 64 302 54 304 347 361 CHT-GA 68 272 55 292 333 392

48

Con relación al CHT entrecruzado con PEGDE con secado de 25°C, se observa una menor

pérdida de masa correspondiente al agua adsorbida en comparación con el quitosano puro.

No obstante, a concentraciones más altas de PEGDE, el agua adsorbida se mantiene igual.

Esto podría estar asociado con el entrecruzamiento entre el quitosano y PEGDE, lo que

disminuiría la absorción de agua en el material [45]. Además, se observa una estabilidad

térmica (Td2) ligeramente mayor en las muestras entrecruzadas con PEGDE, en contraste

con el CHT puro y el CHT/ glutaraldehído. También se observó que había más agua

presente en las muestras secadas a 25°C que en las tratadas a 150°C.

Sin embargo, la pérdida de masa en la segunda etapa de degradación fue similar. Para el

CHT seco a bajas temperaturas (25°C), la cantidad de agua retenida fue mayor en el CHT

entrecruzado con GA que en el CHT entrecruzado con PEGDE, lo que demuestra su mayor

eficiencia como entrecruzante para producir un hidrogel de baja absorción de agua.

En la segunda etapa de se esperaría la degradación de la cadena (despolimerización) y la

eliminación de productos volátiles, a partir de la destrucción y desaminación del anillo de

piranosa, según lo informado por Zawadski et al. [32].

Aunque, cuando el agente entrecruzante está presente, se deben esperar otros

compuestos. Finalmente, para todas las muestras de CHT entrecruzadas con PEGDE y

secas a 150°C, generalmente se observa que exhiben una mejor estabilidad térmica que el

quitosano puro y el quitosano entrecruzado con PEGDE a 25°C. Esto podría indicar que el

tratamiento de secado a 150°C promueve un mejor entrecruzamiento entre el quitosano y

el PEGDE, lo que genera muestras con mayor estabilidad térmica. En otras palabras, el

CHT-PEGDE secado a 150°C exhibió una menor pérdida de masa (53-54%) a intervalos

de 300-700°C en comparación con CHT (72%).

Del mismo modo, todas las muestras de CHT-PEGDE secadas a 150°C revelaron una

menor pérdida de masa que CHT-PEGDE a 25°C (58–70%). Petrova et al. reportaron una

pérdida de solubilidad de sus muestras, atribuida a la formación de entrecruzamientos

iónicos posterior a la deshidratación [46]. Observamos el mismo efecto en nuestras

películas después de secar a 150°C.

49

Difracción de rayos X (DRX)

En la figura 3.8 se presenta el patrón de difracción por rayos X (DRX) del polvo de

quitosano. Los picos característicos del quitosano se presentan en 2θ = 9.5 y 20º. El pico

de 9.5º es atribuido a la forma I y el pico en 20º es atribuido a la forma cristalina II, la cual

presenta cadenas menos hidratadas y más rígidas, dispersas en una fase amorfa

Figura 3.8. Difractograma del polvo de quitosano

La figura 3.9 muestra los difractogramas de las películas de quitosano secas a 25°C y

150°C.

El patrón de difracción de las películas de CHT neutralizadas secas a 25°C (figura 3.9 a)

presenta los dos picos característicos agudos a 2θ = 9.54° y 2θ = 20.3° típicos de la

conformación del quitosano [44], [152]. Esta estructura altamente ordenada surge de los

grupos hidroxilo y amino que pueden formar fuertes enlaces de hidrógeno intermoleculares

e intramoleculares. Dicha estructura se mantuvo a niveles bajos de entrecruzamiento (CHT

PEGDE1) pero dando lugar a picos adicionales a 2θ = 5.6° y 2θ =15° en las muestras más

entrecruzadas (CHT PEGDE2 y CHT PEGDE3).

Baroudi et al. atribuyen el pico ubicado a 2θ=15 ° a un cristal polimorfo de quitosano

hidratado debido a un complejo entre el agua y ácido [153]. Cuando se empleó el GA como

5 10 15 20 25 30 350

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

20

9.5

Inte

nsi

da

d (

U.A

.)

2q

50

entrecruzante, el estado amorfo se hizo más evidente (pico a 2θ= 19,7°), lo que indicaría la

pérdida de la estructura cristalina.

Figura 3.9. Difractograma de (a) películas de CHT, CHT entrecruzado con GA (CHT-GA), CHT entrecruzado con PEDGE 1,2,3 (CHT-PEDGE) secas a 25°C y (b) a 150°C.

La variación en el estado cristalino del quitosano entrecruzado con PEGDE, podría

atribuirse a los siguientes efectos del PEG: un debilitamiento de la interacción entre el

quitosano y el agua y, por lo tanto, permitir que el quitosano cristalice en forma de estructura

anhidra. Debido a que el PEG es una molécula soluble en agua, al aumentar la

concentración de PEG, éste podría atraer más agua a la membrana y por lo tanto hacer

que se forme la estructura cristalina hidratada.

La Figura 3.9-b corresponde al patrón de difracción de películas CHT secas a 150°C. Está

claro que el cambio en el proceso de secado de la estructura de CHT lo hace más amorfo,

es decir, aunque se observaron los mismos picos, exhibieron una menor intensidad.

También se encontró el pico máximo de intensidad corresponde a la reflexión 1 1 0 (2θ =

20) , el segundo pico máximo de intensidad en la reflexión 0 2 0 (2θ = 9.5), acorde a lo

encontrado en literatura [154].

5 10 15 20 25 30

Inte

nsi

dad

(U

.A.)

CHT

CHT-PEGDE 1

CHT-PEGDE 2

CHT-PEGDE 3

CHT-GA

2q

9.5°5.5°

14.9°20°

5 10 15 20 25 30

Inte

nsid

ad (

U.A

.)

CHT

CHT-PEGDE 1

CHT-PEGDE 2

CHT-PEGDE 3

CHT-GA

2q

9.515

19.5

(a) (b)

51

Con respecto a la película de CHT con menor cantidad de entrecruzante PEGDE (1), se

aprecia que el pico a 2θ = 20°disminuye en su intensidad, mientras que el pico a 2θ = 9.58°

no solo se reduce, sino que se desplaza a ángulos más bajos; este resultado sugiere un

aumento en la separación de las cadenas. Curiosamente, las películas de CHT PEGDE2

presentaron múltiples picos (2θ = 9.5°, 15° y 20.4°) que denotan una estructura

heterogénea; contrario a CHT PEGDE3, que corresponde a la muestra más entrecruzada,

se observan solamente dos reflexiones a 2θ = 9.68° y 2θ = 20.2° bien definidas.

Algunas investigaciones han sugerido que los tratamientos térmicos con quitosano pueden

cambiar sus propiedades físicas, afectando no solamente su apariencia sino también su

solubilidad acuosa y reología [81], [83].

Aunque el quitosano es un polisacárido semicristalino, éste no posee una estructura

cristalina única ya que se presentan estructuras de diferente estabilidad y nivel de

hidratación. Clark y Samuels [152] le asignaron una celda unitaria ortorrómbica con a= 8.9

Å, b= 10.25 Å y c= 17 Å, la cual contiene cuatro cadenas de quitosano con ocho moléculas

de agua [155]. Se sabe que el quitosano posee formas cristalinas hidratadas y anhidras.

[156] Demarger-andre et al. reportan tres estructuras cristalinas de quitosano: una forma

hidratada, independiente de la naturaleza química de la sal, y dos formas deshidratadas

que dependen de la estructura química del quitosano [43]. La transición del complejo de

quitosano / ácido acético a quitosano anhidro progresa con el aumento de la temperatura

[157], [158].

El quitosano hidratado es estable en condiciones de baja humedad relativa. Por lo tanto, la

deshidratación del quitosano hidratado no se logra mediante un simple secado, sino

mediante dos vías específicas. Una es el tratamiento hidrotérmico del quitosano hidratado

y el otro es el tratamiento del complejo quitosano/ácido monocarboxílico, bajo condiciones

de alta humedad relativa que causa la eliminación de las moléculas de ácido y agua del

complejo [159]. El quitosano anhidro producido a través de estas dos vías tiene una

estructura cristalina idéntica caracterizada por tener una célula unitaria ortorrómbica que

contiene dos cadenas moleculares [160]. Las transiciones del cristal hidratado al anhidro

son procesos irreversibles [44].

La presencia de moléculas de agua en la red cristalina aumenta considerablemente las

distancias entre las cadenas de quitosano. Por lo tanto, podemos entender parcialmente

por qué la estructura química del quitosano hidratado no influye en la estructura cristalina,

contrariamente al quitosano deshidratado, donde un cambio en la naturaleza química de

52

las moléculas, mucho más compactas, tendrá una gran influencia en los arreglos de la

cadena dentro de los cristales [44].

Nuestros resultados muestran claramente que la cristalinidad de la película disminuye con

el tratamiento térmico, es decir, los grupos amino aún disponibles, pueden ser usados en

la reacción con el grupo aldehído (GA) o el anillo epoxi (PEGDE) para la formación de un

CHT amorfo [ 53]. Para una comparación más precisa, la Tabla 3.4 resume los resultados

obtenidos del cálculo del índice de cristalinidad (CrI) de cada una de las películas.

Se observa cómo la cristalinidad disminuyó con el grado de entrecruzamiento y con el

secado a 150°C.

Tabla 3.4. Porcentaje de cristalinidad de películas CHT secas a 25°C y 150°C.

CrI%

Películas 25ºC 150ºC CHT 64.17+ 3.9 40.33 + 1.4 CHT-PEGDE 1 64.17+ 5.2 51.33 + 2.8 CHT-PEGDE 2 37.39 + 2.4 7.64 + 6.2 CHT-PEGDE 3 52.58 + 2.6 26.79 + 1.7 CHT-GA 21.59 + 3.8 8.36 + 3.6

En nuestros resultados, se esperaba que hubiera más agua presente en las muestras con

un índice cristalino más bajo (CrI), ya que el agua puede penetrar fácilmente en las regiones

amorfas. Esto no se observó, ya que Td1 fue del 15% cuando las muestra se secaron a

25°C, y solo del 9%, para el quitosano sin entrecruzante, cuando la muestra se secó a

150°C. La disminución en la cristalinidad en las películas tanto secas a 25° como a 150°C,

entrecruzadas con GA y PEGDE puede ser atribuida a la ruptura de los enlaces de

hidrógeno debido a la sustitución de los grupos amino por los agentes de entrecruzamiento,

dando lugar a la formación de una estructura amorfa en las películas de quitosano

entrecruzadas [161], [162].

Los valores del espaciamiento d para los distintos ángulos observados en los

difractogramas, se reportan en la Tabla 3.5. Raut et al. [154] reportan valores de

espaciamento d (2θ:9.68°= 8.41 y 2θ:20.2°= 4.48) para el quitosano puro, similares a los

encontrados en nuestras muestras. También se observó la presencia de ángulos (2θ) más

bajos cuando las películas se entrecruzan con PEGDE 1 y 2, generando un aumento de la

distancia intermolecular en 2θ=9.45.

53

Tabla 3.5 Resultados de la distancia intermolecular (d) de las películas de quitosano secadas a 25°C obtenidos mediante la Ley de Bragg

Película Ángulo (grados) d-espaciamiento (nm) 2θ d

Quitosano polvo 10

21

8.8

4.22 Película Quitosano 9.8 20 9.05

4.33

Q-Glutaraldehído

19.7

4.49

4.49 Q-PEGDE1 5.6 9.6 15 20 15.8 9.20 5.76 4.40 Q-PEGDE2 5.6 9.5 15 20 15.7 9.35 5.88 4.35 Q-PEGDE3 9.8 15.2 20.5

8.98 5.81 4.33

3.1.1.6 Composición elemental por EDX

En la Tabla 3.6 se presenta la composición elemental de las películas de quitosano, secas

a diferentes temperaturas. Como puede observarse, el análisis reveló que, en las muestras

secas a 25°C, el oxígeno tiende aumentar a medida que aumenta la cantidad de PEGDE

durante el entrecruzamiento del quitosano. Lo anterior puede deberse al oxígeno presente

en la estructura PEGDE. En el caso del nitrógeno, según lo esperado se observó una ligera

disminución a medida que las películas se entrecruzaban. Las películas de CHT sin

entrecruzante tratadas a 150°C también experimentaron un ligero aumento en el contenido

superficial de oxígeno con respecto a las muestras con secado de 25°C, pero

permanecieron constantes durante el entrecruzamiento con PEGDE o GA. En contraste, el

nitrógeno superficial tiende a reducirse con tratamiento el térmico y entrecruzamiento con

PEGDE, pero no con GA. Esto indica que hay más oxígeno que nitrógeno disponible en el

CHT entrecruzado con PEGDE.

Tabla 3.6. Porcentaje atómico por EDX de C, O, N de películas de quitosano entrecruzadas con GA y PEGDE secas a 25 ° C y 150 ° C.

CHT CHT-PEGDE1 CHT-PEGDE2 CHT-PEGDE3 CHT-GA % 25ºC 150ºC 25ºC 150ºC 25ºC 150ºC 25ºC 150ºC 25ºC 150ºC

C 55+ 4 37+ 0 8+ 1

53+ 5 41+ 5 6+ 1

52+ 2 41+ 1 7+ 1

58+ 7 40+ 6 2+ 1

53+1 41+1 6+ 0

59+ 4 40+ 5 1+ 0

50+ 1 44+ 1 6+ 0

60+ 6 39+ 5 1+ 0

57+ 1 37+ 1 6+ 0

56+ 7 O 39+ 4 N 5+ 1

54

XPS

Los espectros de exploración por XPS de las películas de quitosano sin entrecruzante,

quitosano entrecruzado con GA, y quitosano entrecruzado con PEGDE, secas a 25°C y

150°C se muestran en la figura 3.10.

El porcentaje atómico obtenido por XPS se presenta en la Tabla 3.7. El análisis detectó

que, en las muestras secas a 25°C, el oxígeno aumenta a medida que la concentración de

entrecruzante es mayor (PEGDE), este efecto también se observó en las películas

entrecruzadas con GA. En las muestras secas a 150°C también se observó un ligero

aumento en el porcentaje de oxígeno. Estos resultados coinciden con los obtenidos

mediante EDX. Sin embargo, el contenido de nitrógeno permanece constante en todas las

muestras, tanto en las secas a 25°C como a 150°C. Con relación al carbono se observa un

ligero aumento en las muestras con mayor concentración de entrecruzante (PEGDE 3 y

GA) secas a 150°C.

Figura 3.10. Espectros de inspección (survey) por XPS del quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA), y quitosano entrecruzado con PEGDE 1, 2, 3

(CHT-PEGDE) secas a 25°C (a) y a 150°C (b)

Las posibles reacciones de entrecruzamiento entre el quitosano y glutaraldehído o el

PEGDE se muestran en la sección de anexos (Anexo 1). Como se esperaba, en los

espectros de XPS, solo se detectaron C1s, N1s y O1s. Sin embargo, una inspección

minuciosa (Anexo 2) del CHT puro seco a 25°C reveló al menos cuatro tipos de carbonos:

(a) (b)

1000 800 600 400 200

0

1

2

3

4

5

CHT

CHT-GA

CHT-PEGDE1

CHT-PEGDE2

CHT-PEGDE3

Inte

nsi

dad

(C

onte

o/ s

)

Energía de enlace (eV)

O1s

C1s

N1s

1200 1000 800 600 400 200 0

0

1

2

3

4

5

CHT

CHT-GA

CHT-PEGDE3

CHT-PEGDE1

Inte

nsi

da

d (C

onte

o/s)


O1s

C1s

N1s

CHT-PEGDE2

55

C – C (284.5 eV), C – O (286.4 eV), C = O y C – N (288.5 eV). Dado que la estructura del

quitosano parcialmente desacetilado es bastante compleja, una primera aproximación al

espectro XPS esperado para la región C1s es complicada porque se deben considerar los

segmentos de glucosamina y N-acetilglucosamina [163].

Tabla 3.7. Porcentaje atómico por XPS de C, O, N de películas de quitosano entrecruzadas con GA y PEGDE secas a 25°C y 150°C.

Además, de los tres posibles tipos de oxígeno: C – OH, C – O – C y C = O, solo se

detectaron dos a 532 eV y 533 eV, respectivamente, que producen un pico simétrico de

O1s después del secado a altas temperaturas. Finalmente, el nitrógeno debe exhibir al

menos dos tipos (–NH2 y O = C – N – H), pero solo se observó un pico a 399.5 eV, el cual

se ensancha durante su secado a 150°.

Las películas de quitosano entrecruzado con GA exhibieron tres tipos de carbonos a 25°C,

pero tienden a desaparecer con el secado a 150°C, es decir, la banda de C1s se ensancha.

El CHT entrecruzado con GA también presentó un pico de O1s simétrico tanto para

películas secas a 25°C como a 150°C. Finalmente, los N1s se amplían a medida que

aumenta el tratamiento térmico; sin embargo, se observaron tres picos (399 eV, 400.5 eV y

402.5 eV) con el secado a menor temperatura, lo cual evidenciaría la reacción de

entrecruzamiento.

Con relación a las muestras entrecruzadas con PEGDE, se observaron tres tipos de C1s,

pero cuando se empleó PEGDE a una concentración media y alta, el C – O (286.4 eV) se

observó con mayor claridad (mayor at. %) en las muestras tratadas a 25°C; sin embargo,

recuperó su intensidad original cuando se secó a 150°C. El CHT entrecruzado con PEGDE

mostró también un pico de O1s simétrico para películas secas a 25°C y 150°C. En el caso

de N1s, no se observaron cambios visibles a bajas concentraciones (PEGDE1) en ambas

condiciones de secado; sin embargo, se presenta (N1s) con picos más anchos o con dos

picos anchos (399 eV y 402.5 eV) a la concentración más alta (PEGDE 3) con el secado de

25°C.

CHT CHT-PEGDE1 CHT-PEGDE2 CHT-PEGDE3 CHT-GA % 25ºC 150ºC 25ºC 150ºC 25ºC 150ºC 25ºC 150ºC 25ºC 150ºC

C 70+ 1 25+ 2 5+ 1

70+ 4 26+ 4 4+ 0

72+ 2 24+ 3 4+ 0

68+ 4 28+ 3 4+ 0

70+ 4 26+ 4 4+ 0

69+ 2 27+ 4 4+ 1

67+ 3 29+ 2 4+ 1

70+ 6 26+ 4 4+ 0

68+ 3 28+ 3 4+ 1

72+ 4 O 24+ 2 N 4+ 0

56

Topografía de superficie por MEB y AFM

Microscopia electrónica de barrido

La figura 3.11 se presentan las fotografías y las imágenes por microscopía de las películas

secas a diferentes condiciones. El único cambio evidente fue la coloración de las películas

las cuales cambiaron de amarillo claro a rojo/marrón con el tratamiento térmico a 150°C.

Sin embargo, por medio del MEB no se detectaron cambios en la morfología de la superficie

de las películas con secado adicional a 150°C, en contraste con Lewandowska et al.,

quienes informaron una estructura con forma de isla, bien definida que parece estar

asociada a la cristalinidad de la muestra [164].

Balau et al. compararon dos películas de quitosano con espesores diferentes, reportaron

que tiempos de secado prolongados a una temperatura de 50°C, produce la formación de

una película más delgada con una densidad más alta. Señalan que las películas delgadas,

con espesores inferiores a 20 µm, son transparentes, muy flexibles y de superficie lisa. Las

películas más gruesas son bastante rígidas, quebradizas y con superficie escamosa. El

cambio de la morfología de la superficie sugiere que las tensiones internas aumentan con

el espesor de la película [145].

57

Figura 3.11. Morfología de la superficie por MEB de las películas de CHT secas a 25°C

(a) y 150°C (b)

Microscopía de fuerza atómica (AFM)

La microscopía de fuerza atómica también se utilizó para evaluar la topografía de la

superficie de las películas. Al comparar la rugosidad superficial media (Ra) de las películas

secas a 25°C (figura 3.12), se observó que el CHT sin entrecruzante y el CHT entrecruzado

con PEGDE, a la concentración más baja (PEGDE1), mostraron valores bajos de Ra (44-

45 nm) la cual aumentó conforme aumentó la concentración de PEGDE (64.1 nm y 91.2 nm

para PEGDE 2 y PEGDE3 respectivamente). Sorprendentemente, la superficie más lisa se

obtuvo con el CHT entrecruzado con GA, ya que el valor de Ra fue de 26.3 nm.

58

Figura 3.12. Topografía 2D y Ra (nm) de las películas de quitosano secas a 25°C (superior, a - e) y con secado adicional a 150°C (inferior, f – j); a: CHT, b: CHT/PEDGE1,

c: CHT/PEDGE2, d: CHT/PEDGE3, e: CHT/GA, f: CHT, g: CHT/PEDGE1, h: CHT/PEDGE2, i: CHT//PEDGE3, j: CHT/GA

Cuando las películas se secaron a 150°C, la muestras que presentaron valores de Ra más

altos fueron la de CHT entrecruzado con GA, seguida del CHT sin entrecruzante con un

Ra=103.7 nm y Ra =75.9 nm, respectivamente. En contraste, el CHT entrecruzado con

PEGDE mostró una disminución en Ra en comparación con el secado a 25°C, es decir,

28.2 + 7.9 nm, 44.7 + 10.8 nm y 16.5 + 2.3 nm para PEGDE1, PEGDE2 y PEGDE3,

respectivamente. Aunque no hay una tendencia clara es posible cierta heterogeneidad en

las muestras a niveles nanométricos. Factores como la rugosidad, la porosidad y la

topografía de la superficie pueden influir en el comportamiento celular de un material. [165]

En este sentido, Croisier et al. [166] reportaron una disminución en la rugosidad en

superficies químicamente modificadas con PEG, las cuales se observan más uniformes.

Sugieren que el PEG parece suavizar la topografía de la superficie, lo que confirma la

presencia del PEG quimio-absorbido en la superficie, siendo las películas con PEG más

lisas e hidrófilas [51].

59

Medición del ángulo de contacto

En la figura 3.13 se presentan los valores de ángulo de contacto en agua destilada y DMEM,

de las películas de quitosano secas a diferentes temperaturas.

Deldritch et al. [167] proponen la siguiente clasificación en relación a los ángulos de

contacto obtenidos mediante la técnica de la gota depositada: las superficies

superhidrofílicas son aquellas en las que el agua se extiende completamente, visualmente

"ángulo de contacto cero" (0); hidrofílicas con valores de 0 a 56°, débilmente hidrofílicas

(56°-65°) > Θ > 0 y las débilmente hidrófobas 90° > Θ > (56°–65°) son aquellas en las que

las películas al contacto con agua son inestables; y por último las superficies hidrofóbicas

son aquellas con ángulos de contacto 120° > Θ > 90° [55].

El ángulo de contacto con el agua es un buen indicador del grado de hidrofilia de las

películas. El estado final de una gota de agua sobre la superficie de la película se toma

como un indicador de la humectabilidad de la superficie por el agua. Es bien sabido que el

ángulo de contacto con el agua disminuye cuando la hidrofilia de la superficie es mayor. En

este sentido, se han reportado valores hasta de 105° en ángulos de contacto con agua en

películas de quitosano [83].

La hidrofilia de la superficie de las películas CHT entrecruzadas, con los diferentes

tratamientos de secado (25°C y 150°C), se presentan en la figura 3.13. Las películas CHT

mostraron, en general, ángulos de contacto con el agua inferiores a 72°, lo que las clasifica

como débilmente hidrofílicas [168]. Sin embargo, el tratamiento térmico a 150°C aumentó

ligeramente el ángulo de contacto para el quitosano sin entrecruzante, y en las muestras

de PEGDE 2 y PEGDE 3 (media y mayor concentración), pero no se observó un efecto en

las muestras entrecruzadas con GA. Cuando se empleó DMEM, se observaron ángulos de

contacto más bajos en las muestras entrecruzadas con PEGDE y GA.

Los grupos polares introducidos por diferentes procedimientos tienden a “enterrarse” en

conjunto cuando entran en contacto con el aire durante un período prolongado; sin

embargo, permanecen en la superficie cuando están en contacto con agua o cualquier otro

ambiente polar [169]. En nuestro estudio, los grupos aceptores de enlaces de hidrógeno (a

saber, átomos de O) como las unidades de etilenglicol o como los O-H producidos durante

la apertura del anillo epoxi aumentaron la afinidad del agua de la superficie amino-PEGDE

[169] .

60

Figura 3.13. Imágenes de los ángulos de contacto en H2O (a) y DMEM (b) de las películas de quitosano secas a 25°C y con secado adicional a 150°C

Romero-Vargas et al. reportan que la funcionalización de la superficie con PEG inhibe la

adsorción de biomoléculas, una propiedad que se debe en parte a la capacidad del PEG de

participar en interacciones de enlaces de hidrógeno con las moléculas de agua

circundantes, es decir, la hidrofilia de la superficie [170]. Señalan que las películas con

PEGDE posee una capa activa más hidrofílica reflejándose con un ángulo de contacto

menor. Los grupos aceptores de enlaces de hidrógeno (a saber, átomos de O) en

monómeros de etilenglicol refuerzan la afinidad del agua de las superficies de amino-

PEGDE [170].

Estos resultados concuerdan con la composición de la superficie de oxígeno obtenida por

EDX, ya que está claro que los grupos que contienen oxígeno se encontraban en la

superficie haciéndola más hidrofílica.

Zhang et al. [171] reportan resultados similares con PEG, señalando que el ángulo de

contacto se redujo ligeramente al agregar PEG pero no varió considerablemente o incluso

61

aumentó ligeramente cuando aumentó la proporción de PEG al quitosano. En contraste,

estos resultados fueron inesperados ya que un valor Ra más alto debería haber llevado a

un ángulo de contacto más bajo. Por lo tanto, parece que la composición química de la

superficie juega un papel más importante en la determinación del comportamiento del

ángulo de contacto.

En general, la humectabilidad de la superficie está fuertemente asociada no solo con el

ángulo de contacto sino también con la energía libre superficial, y se ve afectada por

diversos aspectos como la composición elemental de la superficie y la rugosidad. La

humectabilidad es quizás el factor más importante para determinar la cantidad y calidad de

las proteínas adsorbidas, lo que a su vez afecta la adhesión celular [171].

Yinghui et al. [165] señalaron que la alta biocompatibilidad del quitosano se debe a su alta

hidrofilia y a la carga superficial positiva que promueve el crecimiento celular. Además,

algunos estudios han indicado que los ángulos de contacto más pequeños en los materiales

pueden aumentar la afinidad celular [172], [173]. Sin embargo, algunos investigadores han

demostrado que, en lugar de una correlación directa entre el ángulo de contacto y la unión

celular, parece haber un ángulo de contacto ideal que permite a una mejor proliferación y

comportamiento celular, esto ocurre alrededor de 60°- 80° [68], [174]. Aun así, existe

evidencia por parte de varios autores que indican que esto no es necesariamente cierto y

que el ángulo de contacto no es un buen predictor de la unión celular y el comportamiento

[68].

3.1.2 Propiedades mecánicas de tensión

En la figura 3.14 se presentan los resultados de la caracterización mecánica a tensión de

las películas de quitosano. Como se observa en la Tabla 3.8, la película con mayor valor de

módulo elástico fue la de quitosano con mayor concentración de PEGDE (18.9 MPa), y la

que registró menor valor fue la de quitosano sin entrecruzante. La película en la que se

registró menor valor de esfuerzo máximo fue la de quitosano entrecruzado con GA (29

MPa), y la de mayor esfuerzo fue la de quitosano con mayor concentración de PEGDE (42

MPa). Como puede observarse, el esfuerzo a la tensión aumentó con la adición del

entrecruzante. En cuanto a la deformación máxima se obtuvieron los valores más altos en

la muestra correspondiente al quitosano con PEGDE 2 (7%) y la de menor valor fue la de

62

quitosano con glutaraldehído (1.66 MPa). La diferencia entre las películas entrecruzadas

puede deberse a los enlaces que se forman con cada entrecruzante (GA y PEGDE).

Figura 3.14. Curvas esfuerzo-deformación típicas de películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA), y quitosano entrecruzado con

PEGDE 1, 2, 3 (CHT-PEGDE) secas a 25°C.

Tabla 3.8. Propiedades mecánicas de películas de quitosano sin entrecruzante, quitosano entrecruzado con glutaraldehído, quitosano entrecruzado con PEGDE

Material

(MPa) max (MPa)

ԑ último (%)

Quitosano 11.1 ± 0.9 30.5 ± 0.8 6 ± 0.5 Quitosano/GA 14.1 ± 0.1 29 ± 0.3 1.7 ± 0.1

Quitosano/PEGDE1 12.9 ± 0.2 34.3 ± 0.1 5.8 ± 02 Quitosano/PEGDE2 16.5 ± 0.1 38.6 ± 0.2 7 ± 0.1 Quitosano/PEGDE3 18 ± 5.2 42 ± 2.9 4.6 ± 2.3

0 2 4 6 8

0

10

20

30

40

50 CHT

CHT-PEGDE 1

CHT-PEGDE 2

CHT-PEGDE 3

CHT-GA

Deformación (%)

Esf

uerz

o (M

Pa)

63

3.1.3 Pruebas de Degradación in vitro

Degradación química acelerada

En la Tabla 3.9 se presentan los resultados de la degradación química de las películas de

quitosano sin entrecruzante y entrecruzadas con glutaraldehído y con PEGDE1, 2 y 3.

Tabla 3.9. Masa perdida después de la degradación química de películas de quitosano entrecruzado secado a 25℃.

La mayor pérdida de masa que se registró en agua destilada (H2O d) fue en la película de

CHT sin entrecruzante (20%) seguida de las entrecruzadas con PEGDE 1 y PEGDE2. La

menor pérdida de masa se registró en las muestras entrecruzadas con GA y PEGDE3 i.e.

12.4% y 11.4% respectivamente. En la degradación con HCl las películas entrecruzadas

con PEGDE se degradaron en su totalidad al igual que para el H2O2. Sin embargo, la

película con GA solo se degrado 65.3%, lo que podría indicar un mayor entrecruzamiento

en dicha película. Finalmente, en hidróxido de sodio, el quitosano entrecruzado con

glutaraldehído exhibió la mayor pérdida de masa mientras que el quitosano puro presentó

la menor pérdida de masa.

Ritthidej et al. [141] reportan resultados similares en películas de citrato de quitosano y

malato. Todas las películas fueron solubles en agua desionizada y HCl. Esto se debió a la

ionización de la sal de quitosano en las soluciones.

La presencia de grupos hidrofóbicos e hidrofílicos, especialmente el grupo carboxilo en la

molécula de ácido, afectó profundamente la absorción de agua y la disolución de la película

tratada. La inmersión en agua destilada hizo que las películas de quitosano se hincharan y

se disolvieran. Sin embargo, la disolución total de las películas no se completó en las

primeras 24 horas de inmersión.

Películas Masa perdida (%) H2O HCl H2O2 NaOH

CHT 20.3 + 5.3 96.18+ 3.9 100 18.1+ 1.2

CHT/PEGDE1 13.8 + 3.5 100 100 37.9 + 2.9 CHT/PEGDE2 11.7 + 3.2 100 100 21.16+ 4.2 CHT/PEGDE3 11.4 + 4.1 100 100 28.8+ 2.4 CHT/GA 12.4 + 4.7 65.3 + 5.5 100 79.5+ 6.1

64

Al igual que en nuestras muestras también observaron pequeños trozos de gel

transparente en el medio, pero estos eran demasiado blandos para ser recuperados para

mediciones de peso [144].

La diferencia en la solubilidad de una película de quitosano en los diferentes medios puede

atribuirse a la ionización de grupos amino en las moléculas de quitosano. En un medio

ácido, la protonación de los grupos amino aumenta la densidad de carga a lo largo de la

cadena molecular, lo que hace que las cadenas se desplieguen y asuman una conformación

alargada.

Las moléculas de quitosano en la película aún pueden protonarse en agua destilada debido

a la presencia de ácido acético residual en la película. Por lo tanto, es posible que se

observen grados considerables de hinchamiento y disolución tras la inmersión de la película

de quitosano en agua destilada. El tratamiento térmico mejoró la resistencia al agua de las

películas de quitosano [144].

Degradación enzimática

En la figura 3.15 y en la Tabla 3.10 se presentan los resultados de la degradación

enzimática de las películas de quitosano a diferentes temperaturas de secado y con

diferentes medios, PBS (pH 7.4) y BES (pH 6.4).

La mayor pérdida de masa se registró en las películas de quitosano sin entrecruzante seca

a 25°C, siendo similar para ambas soluciones (47% PBS y 44% BES). Las películas de

quitosano con secado adicional presentaron una menor pérdida de masa (28% para PBS y

29 para BES), esto puede deberse a que el secado adicional promueve el entrecruzamiento.

En relación con las películas entrecruzadas se observó una disminución en la degradación

a medida que aumentó la concentración de PEGDE, registrándose la menor pérdida a

PEGDE 2 y 3. Al igual que en las películas sin entrecruzante, la degradación disminuyó con

el tratamiento térmico a 150°C.

65

Figura 3.15 Degradación enzimática con lisozima de películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con GA (CHT/GA) y quitosano entrecruzado con PEGDE 1,2,3,

(CHT/PEGDE) secas a 25°C (TA) y 150°C (S), en (a) PBS y (b) BES.

Tabla 3.10. Porcentajes de pérdida de masa obtenidos de la degradación enzimática de las películas de quitosano

Ritthidej et al., [141] reportaron que la solubilidad de las películas de quitosano difiere

según el medio de disolución utilizado. Las películas son más solubles en HCl y menos

solubles en soluciones mayores a pH de 7.4. Las películas sumergidas durante 24 horas

en PBS mantuvieron su integridad mientras que las películas en el medio ácido se hincharon

considerablemente, se suavizaron y finalmente se disolvieron dentro del mismo período de

Película Pérdida de masa (%) PBS BES

CHT-25°C 47 + 1.5 44 + 3.6 CHT-150°C 28 + 4.1 29 + 5

CHT-PEGDE1-25°C 37 + 1.5 36 + 4.7 CHT-PEGDE1-150°C 28 + 3.7 33 + 2.9 CHT-PEGDE2-25°C 29 + 3.8 33 + 3

CHT- PEGDE2-150°C 19 + 2.6 30 + 2 CHT-PEGDE3-25°C 27 + 1.5 29 + 2

CHT-PEGDE3-150°C 18 + 1.5 27 + 2.5 CHT-GA-25°C 22 + 3 28 + 1.7

CHT-GA-150°C 17 + 2.6 32+ 1

0 5 10 15 20

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

CHT-TA

CHT-PEGDE1-TA

CHT-PEGDE2-TA

CHT-PEGDE3-TA

CHT-GA-TA

CHT-S

CHT-PEGDE1-S

CHT-PEGDE2-S

CHT-PEGDE3-S

CHT-GA-S

Pér

dida

de

mas

a (%

)

Tiempo de degradación (días)

0 5 10 15 20

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50 CHT-TA

CHT-PEGDE1-TA

CHT-PEGDE2-TA

CHT-PEGDE3-TA

CHT-GA-TA

CHT-S

CHT-PEGDE1-S

CHT-PEGDE2-S

CHT-PEGDE3-S

CHT-GA-S

Pé

rdid

a d

e m

asa

(%

)

Tiempo de degradación (días)

(a) (b)

66

tiempo. Las diferencias de peso, antes y después de la inmersión, mostraron que el 30%

de las películas de quitosano se habían disuelto en PBS con pH de 7.4.

Lin et al. obtuvieron de su degradación [144] restos de película recuperados del medio; (los

medios de disolución utilizados fueron HCl, agua destilada y buffer fosfato). Los residuos

que obtuvieron del agua destilada presentaron un índice de hinchamiento el cual le indicó

a los autores que las películas poseen la capacidad para absorber 3.5 veces su peso de

agua. La inmersión en agua destilada hizo que las películas de quitosano se hincharan y

se desintegraran. Sin embargo, la disolución total de las películas no se completó hasta

después de 24 horas de inmersión.

Lim et al. reportan que el tratamiento térmico a 90 ° C redujo notablemente la solubilidad de

las películas de quitosano en agua destilada; este mismo efecto se observó en nuestras

muestras. La solubilidad de las películas en medios ácidos, así como en PBS, disminuyó

proporcionalmente con temperaturas más altas de tratamiento térmico. Sin embargo, el

grado de disminución de la solubilidad en PBS fue menor que en el medio ácido. El

tratamiento térmico también redujo las diferencias en la solubilidad de la película en los tres

medios. Las películas no tratadas tenían solubilidades dispares, mientras que las películas

tratadas térmicamente a 150 ° C se disolvieron en la misma medida (15%) en los tres

medios [144].Estas observaciones indican que los cambios inducidos por el calor en las

cadenas de quitosano obstaculizaron la capacidad de las moléculas de desplegarse tras la

ionización en un medio adecuado. Consecuentemente, se redujeron los grados de

hinchamiento y disolución de las películas de quitosano. Cuando se evitó que las moléculas

de quitosano se desplegaran después del tratamiento a una temperatura suficientemente

alta, las películas de quitosano mostraron grados similares de resistencia al agua en los

tres medios de pH diferente [144].

Los resultados de la presente investigación concuerdan con los reportados por Reyna et al.

[138], quienes reportan que el entrecruzante juega un papel importante en el

comportamiento de degradación de los andamios de quitosano, debido a que en sus

muestras se registró una menor pérdida de masa en los andamios entrecruzados con GA.

67

3.1.4 Caracterización biológica de los andamios

Proliferación celular con osteoblastos determinada con MTS

Los andamios de quitosano deben ser capaces de permitir la adhesión celular, así como el

crecimiento y desarrollo de la matriz extracelular. La adhesión celular y la proliferación en

sustratos de quitosano se ha atribuido a la naturaleza catiónica de los grupos amina de

quitosano [175].

En la Figura 3.16-a se presenta la viabilidad celular en contacto directo (D) y en contacto

indirecto (I) en andamios de CHT sin entrecruzar y entrecruzados, secos a 25°C. En la figura

3.17 se presentan las gráficas de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de

proliferación celular por MTS.

Como se puede apreciar en la figura 3.16, los osteoblastos en contacto con extractos

producen una viabilidad celular similar o mayor que cuando se prueban en contacto directo.

También queda claro que el mayor porcentaje de viabilidad celular, en contacto directo e

indirecto, se observó en los andamios de quitosano entrecruzados con PEGDE (CHT-

PEGDE) en la concentración mínima (PEGDE1), sin existir una diferencia estadísticamente

significativa entre las tres concentraciones empleadas (p=0.999). De todas las muestras

estudiadas, las entrecruzadas con GA exhibieron la viabilidad celular más baja, con un valor

de p=0.001 para los ensayos de contacto directo e indirecto.

En la Figura 3.16b se muestra el análisis de la viabilidad celular correspondiente a los

andamios tratados a 150°C, en los que también se observó una mayor viabilidad celular en

los andamios de CHT-PEGDE1 y CHT-PEGDE2, con un valor de p=0.001, en comparación

con las muestras de CHT puro y CHT/GA; lo mencionado anteriormente se observó en los

ensayos en contacto directo e indirecto.

En contraste con los andamios secos a 25°C, se registró una diferencia estadísticamente

significativa (p=0.005) en los andamios entrecruzados con mayor concentración de PEGDE

(PEGDE3) en comparación con las concentraciones menores (PEGDE 1 y 2), lo que nos

indica que una mayor concentración de PEGDE disminuyó considerablemente la

proliferación celular en las muestras secas a 150°C; este efecto solo se hizo presente en

los ensayos en contacto indirecto.

68

De nuevo las muestras que exhibieron menor proliferación celular fueron las entrecruzadas

con GA (p=0.000) para ambos ensayos (directo e indirecto).

La viabilidad celular en contacto directo disminuyó en los andamios secos a 150°C para

CHT sin entrecruzar (menor absorbancia), a pesar de eso, la diferencia no fue

estadísticamente significativa (Tabla 3.11).

Al comparar el efecto de la temperatura de secado en la viabilidad celular de los andamios

estudiados, solo se presentó una diferencia estadísticamente significativa en los andamios

de CHT/PEGDE 2 y CHT/GA en los ensayos en contacto indirecto (Tabla 3.11). En los

primeros (PEGDE2) la proliferación celular aumento cuando los andamios se sometieron al

secado adiciona a 150°C; a diferencia de los andamios de CHT-GA en los cuales la

proliferación celular disminuyo con el secado adicional.

Esto significa que se logró una alta viabilidad celular en contacto directo en el CHT

semicristalino puro (CrI = 64.1%) con secado a 25°C, 72.5% de grupos amino libres, Ra =

45.8 , 72° de ángulo de contacto en DMEM, siendo semicristalino y en el CHT – PEGDE1

con secado a 150°C, a pesar de las siguientes diferencias: CrI = 51.3%, menor porcentaje

de grupos amino libres (55.3%), menor rugosidad (Ra = 28.2 ) y menor ángulo de contacto

en DMEM (57°). Lo que también significa que, para una menor cantidad de grupos amino,

una mayor hidrofilia hace que la viabilidad sea mayor en presencia de una estructura menos

semicristalina. Sin embargo el CHT entrecruzado con GA seco a 25°C exhibió la viabilidad

celular más baja en contacto directo con 51.5% de grupos amino libres, Ra = 26.3, y un

ángulo de contacto en DMEM de 56°. A pesar de que el ángulo de contacto es menor que

en el CHT puro, hay menos grupos amino disponibles, lo que resulta en una viabilidad más

baja. Además, el glutaraldehído se considera un agente de entrecruzamiento tóxico que

produce una superficie de CHT amorfa (CrI = 21.5%) y lisa, lo que conlleva a una pobre

unión celular.

69

Figura. 3.16 (a) Viabilidad de osteoblastos en contacto directo (D) e indirecto (I) en películas de quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA) y quitosano entrecruzado con PEDGE 1,2,3 (CHT-PEDGE) secas a 25°C y (b) 150°C.

(a)

(b)

70

Figura 3.17. Gráfica de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de

proliferación celular por MTS a) Secado 25°C contacto directo, b) Secado 25°C contacto directo, c) Secado 150°C contacto directo, d) Secado 150°C contacto indirecto

Tabla 3.11 Valor de p (ANOVA-Tukey) de las medias de películas de quitosano con

secado a 25°C vs secado adicional a 150°C en contacto directo (C.D) y contacto indirecto (C.I)

Películas Valor p

C.D C.I CHT-25°C /CHT-150°C 1.000 0.581 CHT/PEGDE1-25°C - CHT-PEGDE1/150°C 0.437 0.224 CHT/PEGDE2-25°C - CHT-PEGDE2/150°C 0.997 0.003* CHT/PEGDE3-25°C - CHT-PEGDE3/150°C 0.982 0.840 CHT/GA-25°C - CHT-GA/150°C 1.000 0.002*

(b)

(c) (d)

(a)

71

Análisis de la adhesión celular mediante microscopía electrónica de barrido (MEB)

La distribución de las células en andamios secos a 25°C y 150°C se observó después de

48 h de incubación por contacto directo e indirecto (figura 3.18). Se observa una mejor

interacción y morfología de los osteoblastos en contacto directo, en los andamios de

quitosano entrecruzados con PEGDE tratados térmicamente a 150°C. La presencia de

osteoblastos redondeados en el CHT entrecruzado con GA en lugar de células poligonales

sugiere una respuesta a estímulos. Jayakumar et al. [176] evaluaron la citotoxicidad con

fibroblastos (L929) en andamios de quitosano/polietilenglicol diacrilato (PEGDA) e informan

que el material no mostró citotoxicidad y presentaba biocompatibilidad in vitro. La

observación mediante MEB indicó que la estructura superficial microporosa de los

andamios quitosano / PEGDA permite el crecimiento, la proliferación y la diferenciación

célular [176].

Figura 3.18. Imágenes por MEB de osteoblastos cultivados en andamios de CHT en contacto directo e indirecto, secados a 25°C y a 150°C.

CONTACTO DIRECTO CONTACTO INDIRECTO

72

Análisis de expresión de vinculina e integrina

La vinculina es una proteína del citoesqueleto asociada con las uniones célula-célula y

célula-matriz, así como con las interacciones célula-biomaterial. La Figura 3.19 presenta la

expresión de vinculina en andamios de CHT entrecruzado con tratamientos de secado a

25°C y 150°C. Como puede observarse, el CHT con menor concentración de entrecruzante

(PEGDE1 y PEGDE2) seco a 150°C exhibió una fuerte expresión de proteínas en múltiples

células alargadas, incluso mejor que en el CHT sin entrecruzar. Esto implica que las fuerzas

contráctiles aumentan debido a la presencia de vinculina. Por el contrario, los andamios con

GA mostraron una forma celular irregular.

La capacidad de generar y transmitir fuerzas depende de la fuerza de la conexión entre los

receptores de adhesión de integrina y el citoesqueleto de actomiosina mediado por

proteínas de adhesión focal. La vinculina conecta el citoesqueleto de actomiosina con las

subunidades de integrina β mediante la unión a la talina, o con las subunidades de integrina

α4 y α9 mediante la unión a la paxilina, respectivamente. En la figura 3.19 se presentan las

imágenes obtenidas de la prueba de adhesión, usando el anticuerpo de integrina.

Se observó un mayor número de células en los andamios de CHT con PEGDE en

comparación con CHT sin entrecruzante y CHT-GA. Estos hallazgos indican que el PEGDE

mejora la adhesión celular. Se observó una morfología celular más definida en los andamios

con secado adicional de 150°C. Esto fue más evidente en el CHT entrecruzado con PEGDE,

cuando se empleó a la concentración más baja.

Las características de la superficie del polímero podrían afectar las cantidades y los tipos

de proteínas adheridas, así como la conformación, orientación o fuerza de unión de la

proteína adsorbida. Zhang et al. [171] informaron que los grupos hidroxilo y las cadenas de

PEG hidrófilas mejoran significativamente la adsorción de proteínas y el crecimiento celular.

El quitosano es un polisacárido con una carga positiva que promueve el crecimiento celular

y la adsorción de proteínas, a diferencia de la mayoría de las proteínas que tienen puntos

isoeléctricos por debajo de 7.4 y una carga negativa. La introducción de la cantidad

apropiada de PEG puede no influir en esta propiedad, pero las altas concentraciones de

PEG pueden reducir la carga positiva, debido al entrecruzamiento [57].

Saladino et al. [177] analizaron por fluorescencia hidrogeles de quitosano con PEGDE,

empleando condrocitos. Observaron un núcleo verde bien definido, en las muestras de

CHT/PEGDE, por lo que sugieren que dichas formulaciones no producen genotoxicidad.

73

En el análisis de la morfología celular por medio del microscopio confocal se observaron

células con una forma redondeada, similar a la del tejido del cartílago, siendo más evidente

en las muestras de quitosano/PEGDE. Dichos resultados concuerdan con los encontrados

en nuestro estudio.

Figura 3.19. (A-J) Imágenes de fluorescencia de osteoblastos cultivados en andamios de CHT marcados con vinculina (7F9): sc-73614, durante 48 h. (K-T) Imágenes de

fluorescencia de osteoblastos cultivados en andamios de CHT marcados con intregrina 1β (A-4) durante 48

Aunque todos los andamios de CHT entrecruzados con PEGDE sustentan la adhesión

celular, vale la pena tener en cuenta que ésta, como se demostró en este estudio, no es

indicativa de qué tan favorable es un sustrato para la proliferación celular y que la

proliferación celular no se correlaciona con la formación de contactos focales [178].

VINCULINA (7F9) INTEGRINA 1β

74

Biocompatibilidad andamios de quitosano en forma de espuma

En las figuras 3.20 y 3.21 se presentan los resultados obtenidos de los ensayos de

biocompatibilidad por MTS, de las espumas en contacto indirecto (D) e indirecto (I).

En el caso de las espumas, en ensayos por contacto directo, la muestra que presentó una

mayor proliferación celular fue la de quitosano con menor cantidad de entrecruzante

(PEGDE1), sin embargo, las diferencias entre las muestras de CHT sin entrecruzante y

entrecruzadas con PEGDE no fue estadísticamente significativa (p=0.078). Los andamios

de CHT/GA exhibieron menor proliferación celular por contacto directo (p=0.001). Para

contacto indirecto, la espuma que mostró una mayor viabilidad celular fue la de quitosano

sin entrecruzante, no obstante, solo se registró una diferencia estadísticamente significativa

(p=0.030) entre los andamios de CHT sin entrecruzante y de CHT/GA.

En las imágenes de MEB (Anexo 3) se observa la morfología de la microestructura de las

espumas CHT, CHT/GA y CHT/PEGDE, liofilizadas, previo secado y congelación. Se

puede apreciar una superficie irregular y porosa en todas las muestras debido a la

liofilización la cual es una buena para aplicación de ingeniería tisular.

Figura 3.20 (a) Viabilidad de osteoblastos en contacto directo (D) e indirecto (I) en espumas quitosano (CHT), quitosano entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA) y

quitosano entrecruzado con PEDGE 1, 2, 3 (CHT-PEDGE)

75

Figura 3.21. Gráfica de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de proliferación celular por MTS de espumas de quitosano en a) contacto directo, b) contacto

indirecto

(a)

(b)

76

3.2 Andamios de quitosano-hialuronato de sodio, quitosano- hialuronato de sodio

entrecruzado con glutaraldehído y quitosano- hialuronato de sodio entrecruzados

con polietilenglicol diglicil éter

3.2.1 Caracterización fisicoquímica de las películas de quitosano- hialuronato de sodio, quitosano- hialuronato de sodio entrecruzado con GA y quitosano- hialuronato de sodio entrecruzados PEGDE

Espectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier (FTIR)

Se obtuvieron los espectros del hialuronato de sodio (HNa) en polvo y en forma de película

(figura 3.22). Así como el de las películas de quitosano con HNa al 15% y 30% sin

entrecruzante, y de las películas de quitosano con HNa al 15% y 30% entrecruzadas con

PEGDE en concentraciones de 0.114 mM (50 µL), 0.228 mM (100 µL) y 0.342 mM (150 µL)

y entrecruzadas con glutaraldehído, 0.3744 mM (150 µL), (figura 3.23).

En el espectro del hialuronato de sodio en polvo (figura 3.20), la banda ubicada 1033 cm-1

se asigna al estiramiento C-O-C, la banda en 1076 cm-1 se atribuye al estiramiento C-O, la

banda en 2876 cm-1 corresponde al estiramiento C-H y la banda ubicada en 3300 cm-1 se

asigna al estiramiento O-H. La banda ubicada a 1615 cm-1 corresponde a la amida I.

Figura 3.22. Espectro FTIR del hialuronato de sodio en polvo (HA-p) y de las películas de hialuronato de sodio con ácido acético (HA-f)

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000


Ab

sorb

anci

a

1734

2920

1380

14

05

10

36

1081

1322

10

33

107

6

1615

2890

3300

HA-F

HA-P

77

En la figura 3.22 también se observa del espectro de infrarrojo de la película obtenida con

HNa y ácido acético. La banda ubicada a 1734 cm-1 la cual correspondería al grupo

carboxilo, se observa con mayor intensidad. También se observa un aumento en la

intensidad de las bandas a 2920 cm-1 a 2890 cm-1. La aparición de la banda del carbonilo a

1734 cm-1, el incremento de las bandas de correspondientes al estiramiento C-H, podría ser

atribuido ácidos carboxílicos del HNa ya una vez neutralizado (utilizado durante la

elaboración de la película).

En la figura 3.23 se presentan los espectros de FTIR del quitosano puro y de las películas

de quitosano/HNa 15% (a) y al 30% (b), entrecruzadas con PEGDE y GA a diferentes

concentraciones.

Figura 3.23. Espectros de FTIR de las películas de a) CHT/HA15%, CHT/HA15% entrecruzadas con glutaraldehído (CHT- HA15%-GA) y entrecruzadas con PEDGE (CHT-

HA15%-PEDGE1, 2, 3) y b) de las películas de CHT/ HA30%, CHT/ AH30% entrecruzadas con glutaraldehído (CHT- HA30%-GA) y entrecruzadas con PEDGE (CHT-

HA30%-PEDGE1, 2, 3)

Con respecto al quitosano puro se observan varios cambios cuando se mezcla con HNa:

las bandas a 3350 cm-1 (O-H) y 3291 cm-1 (N-H) desaparecen, observándose una sola

banda amplia a 3320 cm-1. También se observa un desplazamiento de la banda 2851 cm-1

(estiramiento C-H2) a 2862 cm-1 en la película con AH al 15% y 2870 cc-1 con AH al 30%.

Adicionalmente se observa una disminución de la banda 1650 cm-1 (C=O, banda amida I) y

un desplazamiento de la banda 1561 cm-1 (N-H2) a 1550 cm-1 en las películas con AH en

ambas concentraciones. En las muestras con HNa no se observa la banda correspondiente

(a)

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

33

50

329

1

CHT

89

5

CHT-HA30%

CHT-HA30%-GA

CHT-HA30%-PEGDE1

CHT-HA30%-PEGDE2

CHT-HA30%-PEGDE3

138

01

37

513

701

410

107

01

02

0

137

0

116

0

13

00

15

50

16

50

28

70

29

20

333

0

Ab

sorb

an

cia


28

50

15

61

13

75

13

14

12

57

11

50

10

68

102

9

892

(b)

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

16

50

894

CHT

CHT-HA15%-PEGDE3

CHT-HA15%-PEGDE2

CHT-HA15%-PEGDE1

CHT-HA15%-GA

10

70

10

26

14

10

11

50

13

80

15

50

16

40

28

62

29

20

332

0

CHT-HA15%

Ab

sorb

an

cia


33

50

32

91

28

50

15

61

13

75

131

41

25

7

10

68

10

29

78

al grupo amida ubicada a 1375 cm-1. La banda a 1640 cm-1 se asigna al estiramiento C=O

de la amida I, a 1550 cm-1 (amida II), la de 1380 cm-1 corresponde a la amida III (estiramiento

C-N) [11]. La banda ubicada a 895 cm−1 en los espectros CHT y CHT/HNa se atribuye al

enlace beta-glucosídico del quitosano [179].

Entre las principales diferencias observadas en estos espectros (quitosano/HNa al 15% y

30%) destaca que la banda de 2890 cm-1 del HNa fue desplazada a 2862 cm-1 cuando el

HNa se mezcló con el CHT. Por otro lado, la banda ubicada 1550 cm−1 en los espectros de

CHT/HNa aumentó cuando la concentración de HNa fue mayor, debido a la presencia de

más grupos amida provenientes de la interacción entre el quitosano y el HNa [179].

El ácido hialurónico y el quitosano son polisacáridos, por lo que ambos poseen espectros

similares. La naturaleza catiónica del quitosano le permite interactuar con polímeros

cargados negativamente para formar un complejo de polielectrolítico (CPE) a través de

enlaces iónicos. Se podría esperar que el grupo amino cargado positivamente, del

quitosano, (1650 cm-1) interactuará con el COO con carga negativa de ácido hialurónico

(1734 cm-1) [180].

La formación de CPE y el entrecruzamiento dan como resultado una disminución de la

absorción en las bandas características a la vibración de estiramiento O-H y N-H.

En los espectros de IR de las películas de CHT/HNa/PEGDE al 15% y 30% de HNa (figura

3.23), las bandas a 2890 cm-1 y 2863 cm-1 disminuyen de intensidad cuando aumenta la

concentración de HNa (30%). La banda ubicada a 1640 cm-1 aumenta de intensidad

conforme la aumenta la concentración de PEGDE en las películas con HNa al 15%, dicho

efecto también se observa en las películas con HNa al 30%. En contraste, la banda a 1550

cm-1 disminuye de intensidad cuando aumenta la concentración de PEGDE. Las vibraciones

de deformación de la amina usualmente producen bandas bien definidas en la región de

1638–1575 cm-1. En consecuencia, la banda ubicada a 1550 cm− 1 también puede ser

asignada a la vibración de deformación de la amina. La disminución en la intensidad de

dicha banda, cuando aumenta la concentración de PEGDE, podría deberse a que los

grupos epoxídicos del PEGDE reaccionan con los grupos amino del quitosano y con los

grupos carboxilo de las moléculas de HNa, disminuyendo la concentración de grupos

amino.

Las bandas a 1410 cm-1 y 1370 cm-1 se observan más intensas en las películas de

CHT/HNa30%/PEGDE 1 y 2, en comparación con las de 15% de HNa. También se observa

79

una disminución de las bandas a 1070 cm-1 y 1026 cm-1, atribuidas al estiramiento simétrico

C-O-C, conforme aumenta la concentración de PEGDE.

Las interacciones iónicas entre el quitosano y el ácido hialurónico pueden darse tanto en

los grupos amina del quitosano como en los grupos hidroxilo del ácido hialurónico. Cuando

se emplea GA. En las muestras entrecruzadas con GA la banda ubicada a 1630 cm-1 se

observa con menor intensidad en comparación con la de 1550 cm-1 atribuida a N-H. Al igual

que en las muestras entrecruzadas con PEGDE se observa una diminución de las bandas

a 1070 cm-1 y 1026 cm-1 conforme aumenta la concentración de PEGDE.

La interpretación de los resultados obtenidos es difícil debido a la complejidad de los

polisacáridos y a la superposición de las bandas características de los polímeros en la

misma región. La formación de puentes de hidrógeno entre dos macromoléculas diferentes

compite con la formación de este tipo de enlaces entre moléculas del mismo polímero. La

influencia del HNa en los espectros de CHT-HNa puede verse minimizada debido a la

diferencia en la concentración entre el quitosano y el HNa.

Kutlusoy et al [11]. reportaron espectros de FTIR de criogeles de quitosano-ácido

hialurónico. Encontraron bandas amplias a 3272 cm-1 y 3266 cm-1, las cuales fueron

atribuidas a grupos hidroxilo, mientras que en nuestras muestras solo se observa la banda

ubicada a 3320 cm-1. También encontraron bandas de flexión del C-H a 1405 cm-1 y 1374

cm-1 y una banda del estiramiento C-N a 1248 cm-1. Estos resultados concuerdan con los

obtenidos en nuestro análisis.

Hwang et al. [181] analizaron el espectro de FTIR de una matriz de HNa entrecruzadas con

PEGDE; indicaron que el grupo epóxido de PEGDE puede reaccionar con los grupos –

COOH (1035 cm-1) y –OH (3200–3600 cm-1) en el HNa para formar enlaces éster y éter

después de reaccionar con el PEGDE. Sin embargo, tanto en su estudio como en el nuestro,

no se observaron bandas representativas de la formación de enlaces tipo éster (1730 cm-

1), lo que es consistente con lo reportado acerca de que la relación de formación de enlaces

éster es bastante baja. Hwang et al sugieren que el entrecruzamiento del HNa y PEGDE,

se basa principalmente en la formación de enlaces de éter entre el grupo hidroxilo del HNa

y el grupo epóxido de PEGDE. En nuestras películas de quitosano/HNa/PEGDE las bandas

características del PEGDE, a 1300 cm-1y 1370 cm-1, se desplazan cuando la concentración

de PEGDE aumenta, lo que confirmaría en entrecruzamiento del PEGDE con AH [181].

80

Espectroscopía Raman

Se presentan los espectros Raman del hialuronato de sodio en polvo (figura 3.24), así como

de las películas de quitosano modificadas con HNa a diferentes concentraciones y PEGDE

(figura 3.25).

Figura 3.24. Espectro Raman de películas hialuronato de sodio en polvo

Los espectros Raman pueden dividirse en varias subregiones: (1) vibraciones de

estiramiento de compuestos de carbonilo (1800–1500 cm− 1), (2) modos de deformación de

CH2 y C – OH (1500–1200 cm −1), (3) vibraciones de estiramiento de C-O y C-C (1200–950

cm − 1) y (4) vibraciones complejas esqueléticas fuera del plano (950–600 cm − 1) [182].

Las bandas características del CHT (figura 3.22) puro se observan 1100 cm-1 indican el

estiramiento de banda ẟ (C-C). La banda a 1370 cm-1 corresponde a la amida III. La banda

ubicada a 2830 cm-1 se asigna al C-CH3 [183].

En la figura 3.23 se presentan los espectros obtenidos de las películas de quitosano con

hialuronato de sodio al 15% (figura 3.22-a) y al 30% (figura 3.22-b), entrecruzadas con

PEGDE a diferentes concentraciones. Las principales señales que se observaron en las

películas de CHT/HNa/PEGDE fueron 2940 cm1, atribuida enlaces C-H y CH3. La banda a

1370 cm-1 fue asignada a vibraciones combinadas de flexión en el plano de varios grupos

(CH2), (CH), (OH). También se observa un aumento de intensidad de la banda de 2890

cm-1 al aumentar la concentración de PEGDE en las películas con 30% de HNa.

500 1000 1500 2000 2500 30000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1048

2900

1645

2934

1130 1360

In

tensi

dad

Ram

an (

u.a

)


2940

81

Figura 3.25. Espectros Raman de películas de quitosano a) CHT/HNa15% y entrecruzadas con PEDGE (CHT-HA15%-PEDGE 1, 2, 3) y b) de las películas de CHT/

HNa 30%, CHT/ HNa 30% entrecruzadas con PEGDE (CHT-PEGDE 1,2,3)

Análisis Termogravimétrico (TGA)

En la figura 3.26 y la Tabla 3.12 se presentan los resultados obtenidos del análisis

termogravimétrico (TGA) y la primera derivada de la pérdida de masa (DTG) de las películas

de quitosano con hialuronato de sodio a 15%y 30%, entrecruzado con PEGDE a distintas

concentraciones y quitosano con hialuronato de sodio entrecruzado con glutaraldehído.

Los polisacáridos son generalmente altamente afines al agua, por lo que pueden hidratarse

rápidamente debido a estructuras irregulares en sus macromoléculas; por lo tanto, las

películas pueden presentan una degradación térmica a varias temperaturas cuando se

agrega ácido hialurónico o algún entrecruzante [11].

Se puede observar que el perfil de degradación (Tabla 3.12) para todas las películas

presenta dos etapas: la primera ubicada entre 56 y 70°C (Td1) y la segunda de 285 a 300ºC

(Td2) para la concentración de HNa 15%, y de 60-63°C (Td1) y de 272 a 300°C (Td2) para

la concentración de 30% de HNa. La primera pérdida de masa para todas las películas de

las muestras investigadas se situó entre 7-12%. Esta etapa se relacionó con la pérdida de

agua y ácido residual por evaporación, lo que significa que el agua es retenida físicamente

por los débiles enlaces de hidrógeno al quitosano.

500 1000 1500 2000 2500 3000

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

Inte

nsi

da

d R

am

an

(u

.a)

Desplazamiento Raman (cm-1)

1377

28822935

1110

CHT-HA15% -PEGDE1

CHT-HA15%

CHT-HA15% -PEGDE2

CHT-HA15% -PEGDE3

1000 2000 3000

0

1

2

3

4

Inte

nsi

dad

Ra

ma

n (u

.a)

Desplazamiento Raman (cm-1)

1373

28822930

1110

CHT-HA30% -PEGDE1

CHT-HA30%

CHT-HA30% -PEGDE2

CHT-HA30% -PEGDE3

(a) (b)

82

Figura 3.26. Análisis termogravimétrico (a, c) y DTGA (b, d) de termogramas (superior) quitosano/HNa 15% (CHT-HA15%), (inferior) quitosano/ HNa 30% (CHT-HA30%),

quitosano / HNa 15% y 30% entrecruzado glutaraldehído (CHT-HA 15% y 30%-GA) y quitosano HNa 15% y 30% entrecruzado con polietilenglicol diglicidil éter (CHT-HA 15% y

30%-PEGDE)

La segunda pérdida de masa se situó entre 52-66%. Dicha pérdida de masa se atribuyó a

la degradación (térmica) del quitosano, vaporización y eliminación de productos volátiles.

La descomposición térmica de la estructura del quitosano tiene lugar después de su

calentamiento a 200-300°C. Réef et al. reportan que la degradación del ácido hialurónico se

produce entre la temperatura ambiente y 200°C, con una pérdida de aproximadamente

16%, la cual corresponde a la evaporación del agua libre y estructural y una pronunciada

(b)

100 200 300 400 500 600 700-12

-11

-10

-9

-8

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

Q-AH15%

Q-AH15%-PEGDE1

Q-AH15%-PEGDE2

Q-AH15%-PEGDE3

Q-AH15%-GA

AH

Pri

me

ra d

eri

vad

a (

% T

)

Temperatura (°C)

(d)

100 200 300 400 500 600 700-12

-11

-10

-9

-8

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

Q-AH30%

Q-AH30%-PEGDE1

Q-AH30%-PEGDE2

Q-AH30%-PEGDE3

Q-AH30%-GA

AH

Prim

era

deriva

da (

% T

)

Temperatura (°C)

(a)

100 200 300 400 500 600 700

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100 Q-AH15%

Q-AH15%-PEGDE1

Q-AH15%-PEGDE2

Q-AH15%-PEGDE3

Q-AH15%-GA

AH

Ma

sa (

%)

Temperatura (°C)

100 200 300 400 500 600 700

0

20

40

60

80

100 Q-AH30%

Q-AH30%-PEGDE1

Q-AH30%-PEGDE2

Q-AH30%-PEGDE3

Q-AH30%-GA

AH

Mas

a (

%)

Temperatura (°C)

(c)

83

pérdida de masa a 210°C que atribuyen la degradación del propio ácido hialurónico [184].

En nuestro estudio el HNa presentó una Td de 220°c similar a la reportada en la literatura.

Al comparar la Td1 de las películas de quitosano puro sin entrecruzantes (secas a 25°C), no

se observan cambios importantes para ambas concentraciones de HNa. Para la Td2 se

observa un aumento de la temperatura en la película con HNa al 15% (386°C) en

comparación con el quitosano puro (297°C), mientras que la temperatura para el HNa al

30% se mantienen similares (292°C). Esto indica que al aumentar la concentración de HNa,

no disminuye la estabilidad térmica del material.

Cuando las películas se entrecruzan con PEGDE se observan un aumento de la Td1 y Td2

(Tabla 3.12) con ambas concentraciones de HNa, siendo más evidente en las películas de

HNa al 15%. Mientras que para las películas entrecruzadas con PEGDE3 solo se observa

un ligero incremento de la Td2 en las películas con HNa al 15%. Esto concuerda con lo

observado para la Td1 que al aumentar la concentración de AH en presencia del PEGDE,

disminuye la estabilidad térmica del material y se asemeja más a los valores registrados

para el quitosano puro.

En las películas con 15% de HNa, la que exhibió una pérdida de masa de 50% a

temperaturas menos elevadas corresponde a la de quitosano entrecruzada con GA (276°C),

y la que presentó una mejor estabilidad térmica fue la de quitosano entrecruzado con mayor

concentración de PEGDE (PEGDE3) (298°C). En contraste en las películas con 30% de

HNa la que presentó una mayor estabilidad térmica fue la película de quitosano

entrecruzado con GA (348°C) debido a que la densidad del entrecruzamiento con GA, así

como las interacciones secundarias entre las cadenas de quitosano y hialuronato de sodio

son las más altas en esta composición [11].

Esto indicaría que una mayor concentración de HNa cuando se entrecruza con PEGDE

disminuye la estabilidad térmica de las películas.

Kutlusoy et al. [11], reportan que a medida que aumenta la cantidad de ácido hialurónico,

la estabilidad térmica y la cantidad de carbón disminuyen, este efecto lo notamos en

nuestras películas ya que se observó que una disminución de Td1 y Td2 cuando la

concentración de HNa fue mayor (30%).

84

Tabla 3.12 Temperaturas máximas y pérdida de peso de las películas de

quitosano/AH 15%/PEGDE entrecruzadas con glutaraldehído y con PEGDE.

La pérdida de masa al 50% de las películas de CHT/HNa15% es mayor en comparación

con las películas de CHT seco a 25°C dicho efecto se observa en todas las películas con

HNa al 15%, registrándose un descenso de la temperatura de aproximadamente 50°C. Sin

embargo, al incrementar la concentración de AH al 30%, la temperatura aumenta, llegando

a niveles muy parecidos a los del quitosano sin hialuronato de sodio.

Difracción de Rayos X (DRX)

En la figura 3.27 se observa el patrón por difracción de rayos X, del ácido hialurónico

empleado en la presente investigación. Como puede apreciarse es mucho más amorfo que

la quitosana pura. En la Tabla 3.13 se presenta el porcentaje de cristalinidad de las películas

de CHT con hialuronato de sodio.

Figura 3.27. Difractograma del ácido hialurónico

Películas HA 15 % HA 30% HA 15% HA 30%

Td (°C) T (°C) a 50% pérdida de masa

Td1 Td2 Td1 Td2

CHT-HNa 68+ 2 386+ 1 60+ 4 292+ 1 295+ 3 360+ 4

CHT- HNa -PEGDE 1 70+ 1 344+ 2 63+ 2 285+ 1 295+ 5 349+ 1

CHT- HNa -PEGDE 2 70+ 2 348+ 3 63+ 5 295+ 3 290+ 2 340+ 2

CHT- HNa -PEGDE 3 64+ 2 338+ 3 62+ 2 300+ 2 298+ 1 340+ 2

CHT- HNa -GA 56+ 1 354+ 1 61+ 2 272+ 1 276+ 2 358+ 1

85

Acerca de la difracción de rayos X del ácido hialurónico, Meyer sugirió que los hialuronatos

de alto peso molecular pueden contener algunos enlaces no glucosídicos que actúan como

puntos de ramificación. La eliminación de estas ramas mediante tratamiento ácido puede

causar despolimerización y al mismo tiempo permitir la organización cristalina [185].

Sheehan et al. reportaron que la conformación de las cadenas de hialuronato en estado

sólido es dependiente de la naturaleza de los cationes presentes, del pH y de la temperatura

a la que se realiza la cristalización, pero no a la fuerza iónica de la solución a partir de la

cual se moldean las películas. Dependiendo del catión presente, la cristalización exitosa de

estas conformaciones requiere la presencia de varias moléculas de agua [186]. Sin

embargo, el hialuronato de sodio empleado en nuestras muestras fue amorfo. Se han

reportado picos de hialuronato aproximadamente a 2θ= 26° y 32°, sin embargo, estos no

se observaron en nuestras muestras [187].

Los estudios de difracción de rayos X han demostrado, hasta ahora, que las películas o

fibras de ácido hialurónico son de naturaleza amorfa [188]. En la figura 3.28 se presentan

los difractogramas de las películas de quitosano con HNa al 15% y 30%, entrecruzadas con

PEGDE y GA.

En todos los difractogramas se observa el patrón de difracción característico del quitosano

con picos ubicados a 2θ = 9.5 y 20º.

Figura 3.28. Difractogramas de las películas de (a) quitosano-HNa 15%, (CHT-HA15%), CHT-AH15% entrecruzado con glutaraldehído (CHT-HA15%GA), CHT/HNa entrecruzado con PEDGE (CHT-HA15%PEDGE 1,2,3) (b) quitosano-HNa 30% (CHT-HA30%), CHT-

HNa15% entrecruzado con glutaraldehído (CHT-HA30%GA), CHT/HNa entrecruzado con PEDGE (CHT-HA30%PEDGE 1,2,3)

(a) (b)

5 10 15 20 25 30

Inte

nsi

dad

(U.A

.)

CHT-HA30%

CHT-HA30%-GA

CHT-HA30% -PEGDE1

CHT-HA30% -PEGDE2

CHT-HA30% -PEGDE3

2q

9.5°

5.6°

20°

5 10 15 20 25 30

Inte

nsid

ad (

U.A

.)

CHT-HA15%

CHT-HA15%-GA

CHT-HA15% -PEGDE1

CHT-HA15% -PEGDE2

CHT-HA15% -PEGDE3

2q

9.5°

5.6°

20°

86

En los difractogramas de las película de quitosano con ácido hialurónico sin entrecruzante,

se observan un pico adicional en la región de 5º, similares a los reportados por Nath et al.

[88] quienes señalan que puede atribuirse a la formación de complejos más ordenados,

induciendo un cambio en la cristalinidad. En la película con 30% de HNa, la intensidad del

pico a 2θ = 20º aumenta ligeramente en las muestras entrecruzadas con PEGDE3.

Las películas entrecruzadas con PEGDE a diferentes concentraciones se exhiben picos

similares a los de las películas sin entrecruzante, es decir, la formación de una estructura

más amorfa donde, por ejemplo, se observa una disminución del pico ubicado a 2θ = 9.5°

conforme aumenta la cantidad de PEGDE. No se observan cambios evidentes en los

difractogramas de las películas de HNa al 15% en comparación con las de 30%. Las

muestras entrecruzadas con GA fueron amorfas para ambas concentraciones de HNa.

La cristalinidad de las muestras de quitosana con ácido hialurónico disminuyó con la

presencia de este último y cuando la muestra fue entrecruzada; es decir, una forma de

modificar la cristalinidad sin recurrir a tratamientos térmicos o entrecruzamiento es mediante

la adición de una segunda fase polimérica.

Tabla 3.13 Porcentaje de cristalinidad de películas CHT-HNa al 15% y 30%

XPS

En la figura 3.29 se muestra el espectro de inspección de las películas de CHT/ NHa con

y sin entrecruzante mediante espectroscopia fotoelectrónica de rayos X. Los elementos

presentes en todas las muestras fueron carbono, oxígeno y nitrógeno. El contenido de

dichos elementos se resume en la tabla 3.14

CrI%

Películas 15% 30% CHT 60.76 46.05 CHT-PEGDE 1 42.12 43.24 CHT-PEGDE 2 31.56 46.66 CHT-PEGDE 3 19.5 27.86 CHT-GA 25.66 16.88

87

Figura 39. Espectros de inspección (survey) de XPS de (a) quitosano- NHa 15%, (CHT-HA15%), CHT- NHa 15% entrecruzado con glutaraldehído (CHT-HA15%GA), CHT- NHa

entrecruzado con PEDGE (CHT-HA15%PEDGE 1,2,3) (b) quitosano-AH 30% (CHT-HA30%), CHT- NHa 15% entrecruzado con glutaraldehído (CHT-HA30%GA), CHT- NHa

entrecruzado con PEDGE (CHT-HA30%PEDGE 1,2,3)

Tabla 3.14 Porcentaje atómico por XPS de C, O, N de películas de quitosano/AH 15%

entrecruzadas con GA y PEGDE

Debido a que el AH y el quitosano son polisacáridos, sus estructuras moleculares son muy

similares y su única diferencia radica en el grupo carboxilo en el AH y los grupos amino en

quitosano [179].

En las muestras de quitosano/NHa 15% el contenido de oxígeno aumento cuando se

entrecruzaron PEGDE (28%). Mientras que el del nitrógeno disminuyó de 5% a 3%. Sin

embargo, la presencia de NHa no fue fácilmente detectada ni como un aumento en oxigeno

o disminución de nitrógeno ni como aumento en la concentración de sodio.

En la sección de anexos (Anexo 4 y 5) se presentan las deconvoluciones de C, O, y N de

cada una de las muestras analizadas, con HNa al 15% y 30%.

CHT CHT-PEGDE1 CHT-PEGDE2 CHT-PEGDE3 CHT-GA

AH 15% 30% 15% 30% 15% 30% 15% 30% 15% 30%

%C 69.14+ 3 76.6+ 5 76.2+ 2 74.93 + 4 69.3+ 1 75.22+ 2 66 + 5 74 + 3 75.5+ 1 75+ 2 %O 24.67+ 2 18.4+ 1 20.56+ 1 20.11 + 2 25.67+ 3 22 + 1 27.8+ 3 20 + 2 21.2+ 2 22 + 3 %N 4.79+ 2 3+ 0.2 2.72+ 0.9 3.21+ 0.8 3.7+ 0.9 1.85+ 1 4.10+ 1 3.9 + 1 2.62+ 0.8 3 + 1 %Na 0.27+ 0.2 1.26+0.5 0.52+ 0.4 0.73+ 0.1 0.8+ 0.2 0.9+ 0.3 0.83+ 0.2 0.96+ 0.1 0.68+ 0.2 - %Si 0.88+ 0.8 0.74+0.3 - 1.02+ 0.9 - - 1.27+ 1 0.79+ 0.3 - - %Ca 0.25+ 0.1 - - - 0.5+ 0.2 - - 0.35+ 0.5 - -

1400 1200 1000 800 600 400 200

CHT-HA30%-GA

CHT-HA30%-PEGDE3

CHT-HA30%-PEGDE2

CHT-HA30%-PEGDE1

CHT-HA30%

Inte

nsi

dad (

Conte

o/ s)


O1sC1s

N1s

1400 1200 1000 800 600 400 200 0

CHT-HA15%-GA

CHT-HA15%-PEGDE3

CHT-HA15%-PEGDE2

CHT-HA15%-PEGDE1

CHT-HA15%

Inte

nsid

ad (

Con

teo/ s

)


O1s C1s

N1s

(a) (b)

88

Ángulos de contacto

En la figura 3.30 se presentan las fotografías y los valores obtenidos de la medición de

ángulos de contacto en películas de quitosano con HNa al 15% y 30%, entrecruzadas con

PEGDE y GA. Las mediciones se llevaron a cabo utilizando H2O destilada y DMEM bajo

en glucosa.

La humectabilidad de una superficie está determinada por la química de la superficie y la

topografía de esta. En una superficie para una película ideal, que es plana, lisa y

químicamente homogénea, el ángulo de contacto disminuirá a medida que aumente la

polaridad de la superficie. Como se observa en los resultados obtenidos de la medición de

ángulos de contacto, la incorporación de una mayor concentración de HNa, disminuye los

ángulos de contacto, esto concuerda con lo reportado en la literatura [179].

Por lo que se puede sugerir que la humectabilidad y la hidrofilia de las películas CHT-HNa

mejoraron notablemente con la incorporación de HNa. Este efecto también puede

explicarse debido a que las películas de quitosano con ácido hialurónico poseen una

estructura química compleja con grupos amida, amina y carboxilo, y el ángulo de contacto

en una superficie CHT-AH debe reflejar la integración de estos grupos. Quizás esta

integración da como resultado una mayor polaridad en la superficie de la película de CHT-

HNa, reflejándose como un menor ángulo de contacto.

Figura 4 Imágenes y valores obtenidos de las películas de quitosano modificadas con HNa al 15% y 30%, y de las películas de quitosano modificadas con HNa entrecruzadas

con PEGDE 1, 2 y 3 y con GA.

89

Todas las películas se mostraron hidrofílicas, cuando se empleó H2O; la película que

presentó más hidrofilia fue la de CHT/HNa 30% con mayor concentración de PEGDE

(PEGDE3) con un ángulo de 7°, seguida de la película de CHT/AH 30% entrecruzada con

GA, presentando un ángulo de 12°. Las películas menos hidrofílicas fueron las de quitosano

sin entrecruzante.

Cuando se empleó DMEM, se observó una mayor hidrofilia en las muestras de CHT/HNa

30% entrecruzada con GA (18°), y al igual que en las muestras donde se utilizó H2O las

películas menos hidrofílicas fueron las de quitosano sin entrecruzante (74°).

La mejora de la hidrofilia cuando se incorpora ácido hialurónico al quitosano puede tener

efectos positivos en la citocompatibilidad [170].

Análisis de microscopía de fuerza atómica (AFM)

Se empleó microscopía de fuerza atómica (AFM) para evaluar la topografía de la superficie

de las películas de quitosano con ácido hialurónico entrecruzadas con glutaraldehído y

PEGDE a diferentes concentraciones. En la Tabla 3.15 se presentan los cálculos de

rugosidad obtenidos. En la figura 3.31 se observan las micrografías de cada tipo de

muestra.

Tabla 3.15 Rugosidad de las superficies de las películas de quitosano y ácido

hialurónico entrecruzado con PEGDE y GA

Tipo de muestra Rugosidad (nm) Q-AH15 150.5 + 16.8* QP1-AH15 85.3 + 9.6 QP2-AH15 56.8 + 5.8 QP3-AH15 61.2 + 5.2 QGA-AH15 44.6 + 5.9 Q-AH30 31.7 + 2.6 QP1-AH30 106.2 + 8.9* QP2-AH30 87.8 + 6.9 QP3-AH30 134.3 + 14.2* QG-AH30 52.6 + 7.2 Q50-AH50 64.7 + 7.3

90

Figura 3.31. Topografía 2D de las películas de quitosano con HNa al 15% (superior, a - e) y al 30% (inferior, f – j); a: CHT, b: CHT/PEDGE1, c: CHT/PEDGE2, d: CHT/PEDGE3,

e: CHT/GA, f: CHT, g: CHT/PEDGE1, h: CHT/PEDGE2, i: CHT/PEDGE3, j: CHT/GA.

Las películas que exhibieron mayor rugosidad fueron las de quitosano con ácido hialurónico

al 15%, con un valor de Ra de 150.5, seguida de las películas de CHT/HNa30%/PEGDE3

y CHT/HNa30%/PEGDE1 con valores de 134.3 y 106 respectivamente. La muestra de

CHT/HNa30% presentó una superficie relativamente plana y lisa.

Estos valores son importantes cuando se relacionan con el efecto que puedan tener sobre

la adhesión celular [189]. La adhesión celular y la proliferación en soportes poliméricos se

pueden modular por muchos factores relacionados con los parámetros de la superficie y la

respuesta mecánica, como la hidrofilia, la rugosidad, la carga o la rigidez. Se considera que

una carga positiva en la superficie polimérica tiene un impacto positivo en la adhesión y

proliferación celular ya que las membranas celulares tienen carga negativa.[190]

La topografía superficial de las películas de quitosano exhibe una estructura de bien

definida que podría estar relacionada con la cristalinidad de la muestra. En el caso de las

películas de CHT/HNa, los parámetros de rugosidad cambian de manera no uniforme y son

visiblemente mayores a comparación con las películas de quitosano sin HNa.

Lewandowska [191] señala que las fuerzas de repulsión y/o las interacciones electrostáticas

entre los componentes de este tipo de mezclas pueden llevar a un aumento en el tamaño

del microdominio. Estas interacciones juegan un papel importante en la estructura y

propiedades de las mezclas de polímeros binarios y ternarios. Los biopolímeros usados, es

91

decir, el ácido hialurónico y el quitosano son polielectrolitos, en los cuales las propiedades

están fuertemente asociadas con las interacciones electrostáticas que determinan la forma

de la macromolécula. En la solución acuosa de un polielectrolito, las macromoléculas se

estiran debido a las fuerzas repulsivas electrostáticas entre las cargas en los grupos

funcionales. Por lo que, en estas mezclas, predominan principalmente las interacciones

por enlaces de hidrógeno y las fuerzas repulsivas. Estos factores pueden conducir a la

disminución de la homogeneidad de la superficie y aumentar la rugosidad en estas

composiciones [191].

3.2.2 Estudios de viabilidad celular y proliferación de los andamios de quitosano/AH,

quitosano/AH entrecruzado con glutaraldehído y quitosano/AH entrecruzado con

PEGDE

Proliferación de osteoblastos determinada con MTS

Cuando se desarrollan materiales para aplicaciones biomédicas un factor muy importante

a considerar es la toxicidad. Los estudios de citotoxicidad pueden realizarse mediante la

determinación de la viabilidad celular por medio de ensayos como MTS [192]. La ausencia

de efectos citotóxicos hace que el material se considere un candidato adecuado para

futuras investigaciones biomédicas. En el presente estudio, se realizó la prueba de

citotoxicidad por MTS, de las películas de quitosano con hialuronato de sodio al 15% y 30%,

entrecruzadas con glutaraldehído y con diferentes concentraciones de PEGDE. En la figura

3.32 se presentan los resultados obtenidos de la viabilidad celular de las muestras antes

mencionadas.

92

Figura 3.32. (a) Viabilidad de osteoblastos en contacto directo en películas de quitosano (CHT) con ácido hialurónico (AH) al 15% y 30%, y de quitosano- ácido hialurónico

entrecruzado con glutaraldehído (CHT-GA) y quitosano-ácido hialurónico entrecruzado con PEDGE (CHT-PEDGE) a 0.114 mM (1), 0.228 mM (2) y 0.342 mM (3)

Los resultados nos muestran que la viabilidad celular de los andamios de quitosano con

HNa fue mayor cuando se empeló una concentración del 15%, ya que se puede observar

una ligera disminución de la viabilidad, en todos los andamios (CHT sin entrecruzante y

entrecruzados con PEGDE1,2,3 y con GA) cuando se aumenta la concentración de HNa a

30%. Esto se confirma con el análisis estadístico arrojando un valor de p=0.004, al comparar

los andamios con 15% y 30% de HNa (figura 3.33).

93

Figura 3.33. Gráfica de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de proliferación celular por MTS de los andamios de quitosano con HNa al 15% y 30%.

Los andamios de quitosano sin hialuronato manifestaron un aumento en el porcentaje de

viabilidad con la adición de HNa, siendo estadísticamente significativo (p=0.000) para

ambas concentraciones, 15% y 30. Al realizar la comparación de la proliferación celular de

los andamios de CHT/PEGDE con los de CHT/PEGDE/HNa se encontró una diferencia

estadísticamente significativa (p=0.001) en CHT/PEGDE1 seco a 25°C con su homólogo

con 15% de HNa. Para la concentración intermedia (PEGDE2) no se detectaron diferencias

estadísticamente significativas entre ninguna de las muestras; es decir, los andamios secos

a 25°C y 150°C sin HNa, y con la adición de 15% y 30% de HNa presentan la misma

proliferación celular, independientemente de la temperatura de secado o la concentración

de hialuronato.

En cuanto a PEGDE3, los andamios con HNa presentaron una mayor viabilidad celular

sobre los andamios sin hialuronato, secos a 25°C y 150°C. En ambas muestras de (HNa

15% y 30%) se obtuvo un valor de p=0.000. Lo que nos indica que para los andamios con

la mayor concentración de PEGDE (3), la adición de HNa sí mejora la viabilidad celular.

Cabe mencionar que entre las muestras con HNa al 15% y HNa al 30% con PEGDE 3

también se registró una diferencia significativa, p=0.001, siendo mayor la proliferación de

osteoblastos en las muestras con HNa al 15%.

p=0.004

94

Con relación a los andamios con GA, solo se observa una mejora de la proliferación celular

en los andamios con la menor concentración de HNa (15%) (p=0.039), tanto para las

muestras con secado a 25°C como para las de secado a 150°C.

Analizando las muestras en cuanto al efecto de la concentración de HNa (figura 3.34), todos

los andamios presentaron valores semejantes de proliferación, siendo el andamio de

CHT/HNa con GA el único que presentó un valor menor al de las demás muestras, p=0.000

para la concentración del 15% y p=0.005 para la concentración del 30%.

Basándonos en estos resultados podemos inferir que si bien si existe una mejora en la

proliferación celular al emplear PEGDE como entrecruzante, esta diferencia no es

estadísticamente significativa al valor registrado para los andamios de CHT puro con HNa.

Kutlusoy et al. reportan que el uso de bajas concentraciones de glutaraldehído no afecta el

crecimiento y la proliferación celular, lo que coincide con lo encontrado en la presente

investigación. A pesar de que se observa proliferación de osteoblastos en las muestras con

GA, estas presentaron los valores más bajos para ambas concentraciones de HNa (15% y

30%) [11].

La mayor capacidad de absorción y retención de agua en las películas de quitosano cuando

se les incorpora grandes concentraciones de AH, hace que se retenga significativamente

más agua. Este efecto de podría minimizar la adhesión celular, lo que explicaría porque las

películas con HNa al 30% mostraron menor viabilidad celular [193].

Nath et al. [88] evaluaron la adhesión y proliferación celular en andamios de quitosano-

ácido hialurónico después de 1, 3, 5 y 7 días de cultivo. Reportan una diferencia significativa

en el comportamiento celular de los andamios a partir del tercer día, por lo que concluyen

que la superficie y la estructura extracelular del ácido hialurónico mejora la proliferación

sobre los andamios. Estos resultados coincidieron con estudios previos que sugieren que

los andamios basados en quitosano-ácido hialurónico (hidrogeles, fibras electrohiladas)

proporcionan una superficie favorable para la adhesión y proliferación celular.

Cuando se incorporó PEGDE a nuestros andamios el mayor porcentaje de viabilidad celular

se observó en los andamios con la concentración más baja (PEGDE1). Una concentración

relativamente alta de PEGDE y EGDE con un alto grado de entrecruzamiento podría

generar una disminución en la biocompatibilidad de los andamios con HNa [115].

95

Figura 3.34. Gráfica de caja del ANOVA con prueba de Tukey de las pruebas de proliferación celular por MTS de andamios de quitosano con HNa a) 15% b) 30%

(a)

(b)

96

Análisis de adhesión celular mediante Microscopía Electrónica de Barrido (MEB)

Se realizó el análisis por microscopia electrónica de barrido, para conocer la localización y

la posible adhesión de los osteoblastos en los andamios de este estudio. La distribución

celular, se evaluó al cabo de 2 días de incubación mediante ensayos en contacto directo e

indirecto. Las imágenes obtenidas se presentan en la figura 3.35. Como se puede apreciar

en las imágenes, se observa una mejor interacción y morfología celular en el ensayo en

contacto directo, ya que las prolongaciones citoplasmáticas y las células se van

organizando en forma de racimos.

En las películas de quitosano con HNa al 15%, la biocompatibilidad mejora cuando se

entrecruza con PEGDE, observándose una mejor morfología celular en las muestras con

menor concentración de PEGDE (PEGDE 1), este mismo efecto se observa en las películas

de AH al 30%. Lo anterior nos sugiere que el contenido del PEGDE ejerce una influencia

mayor en aumentar la biocompatibilidad que inclusive el HNa.

La viabilidad es nula o escasa en las muestras de CHT/AH entrecruzadas con

glutaraldehído, en ambas concentraciones de AH.

Balagangadharan et al. reportan una buena adhesión y viabilidad de condrocitos, en

andamios con ácido hialurónico. Observaron proliferación y distribución celular a manera

de nódulos conformados por grandes acúmulos de células redondeadas [28]. Nuestros

resultados no solo mostraron la adhesión y una buena viabilidad de osteoblastos a los

andamios de CHT/NHa/PEGDE, sino que también se observa dicha agregación celular en

forma de grandes nódulos compuestos por grupos de células esféricas, a lo que seguiría la

síntesis y secreción de componentes de la matriz autóloga y la consiguiente formación ósea

[181].

Mediante los resultados obtenidos por los ensayos de biocompatibilidad se puede concluir

que los andamios de quitosano con ácido hialurónico no son citotóxicos y presentan

suficiente viabilidad y proliferación celular. Al igual que en los andamios libres de HNa,

cuando se emplea PEGDE como entrecruzante la proliferación celular aumenta en los

andamios de quitosano con hialuronato de sodio.

97

Figura. 3.35. Imágenes por MEB de osteoblastos cultivados en andamios de CHT/AH en contacto directo e indirecto.

98

4. CONCLUSIONES

Con base en los resultados obtenidos se puede concluir que existe entrecruzamiento del

quitosano con los agentes entrecruzantes empleados (glutaraldehído y PEGDE) en las

películas elaboradas. Esto se corroboró mediante FTIR donde se detectaron cambios en la

relación amida I /amida II de las películas con entrecruzante en comparación con las

películas de quitosano sin entrecruzante.

Por medio de los análisis termogravimétricos se determinó que la degradación térmica de

las películas de quitosano se lleva a cabo en 2 etapas la primera corresponde a la pérdida

de agua terminando alrededor de 150 ℃ y la segunda corresponde a la degradación del

polímero a partir de 300 ºC.

En los difractogramas obtenidos mediante difracción de rayos X, se observó que las

películas entrecruzadas con PEGDE son menos cristalinas (es decir, tienden a ser más

amorfas) que las películas de quitosano sin agente entrecruzante, este efecto se incrementa

en las películas secadas en la estufa a 150ºC. Sin embargo, también fue evidente la

presencia de múltiples estructuras ordenadas (picos adicionales a 9.5° y 20° encontrados

a 5.5°, 12° y 15°) las cuales fueron dependientes no solo del agente de entrecruzamiento

empleado sino también del tratamiento térmico o de secado empleado. Estas estructuras

cristalinas u ordenadas también pueden perderse mediante la adición de un segundo

polímero de naturaleza amorfa como el ácido hialurónico.

En el análisis de EDX, el contenido de oxígeno aumento a medida que aumentaba la

concentración de PEGDE lo que confirma el entrecruzamiento con la incorporación de esta

molécula en el quitosano.

En el análisis por XPS el contenido de carbono aumentó en todas las películas, de igual

manera el oxígeno aumentó en las películas entrecruzadas con GA y PEGDE.

El entrecruzamiento también condujo a películas con mayor módulo elástico donde éste fue

mayor en el quitosano entrecruzadas con PEGDE3.

99

La viabilidad de osteoblastos no fue afectada por el entrecruzamiento de la quitosana con

PEGDE a bajas concentraciones. En este estudio fue evidente que la presencia de grupos

amino no es el único requerimiento para garantizar una buena adhesión en el quitosano ya

que muestras entrecruzadas con PEGDE, con menor concentración de grupos amino libres,

mostraron una alta proliferación celular. Mediante la expresión de vinculina e integrina 1β

también se demostró una buena adhesión celular.

La incorporación del AH al quitosano fue evidente mediante FTIR, Raman y DRX y se

observó que el PEGDE no solo es capaz de entrecruzar al quitosano sino también al ácido

hialurónico. En el análisis de XPS, el contenido de oxígeno aumentó a medida que

aumentaba la concentración de PEGDE y con la presencia de AH, lo que confirma su

incorporación al quitosano

La modificación de quitosano, quitosano/AH, con PEGDE permitió la obtención de

andamios con propiedades biocompatibles para el crecimiento de osteoblastos

En los ensayos de biocompatibilidad las películas de CHT-AH que mostraron una mejor

adhesión y viabilidad celular fueron las entrecruzadas con PEGDE. Sin embargo, un exceso

de AH (30%) no mejora su viabilidad celular. En contraste, muestras entrecruzadas con

glutaraldehído si son beneficiadas con la adición del ácido hialurónico.

Por lo tanto, el quitosano entrecruzado con PEGDE es una buena alternativa al

glutaraldehído no solo en términos de una mejor adhesión y alta viabilidad de osteoblastos.

Esto puede explotarse en la ingeniería del tejido óseo ya que no solo puede aplicarse en

forma de películas sino también para el relleno de grandes defectos óseos en forma de

esponjas obtenidas mediante liofilizado. La adición del ácido hialurónico no mejora mucho

más las propiedades conferidas por la incorporación del PEGDE, pero su naturaleza

antiadherente puede explotarse en el tratamiento de úlceras (aftas) donde no solo se

requieran propiedades antibacterianas sino también reparativas en la mucosa oral. En este

sentido, el entrecruzamiento con PEGDE es beneficioso ya que permite retener al ácido

hialurónico, compuesto altamente soluble en agua y que puede disolverse fácilmente si no

está unido químicamente al quitosano.

100

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115

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Modified Chitosan Films,” AAPS PharmSciTech, vol. 18, no. 4, pp. 974–982, 2017.

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[191] K. Lewandowska, A. Sionkowska, S. Grabska, B. Kaczmarek, and M. Michalska,

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116

solutions and solids,” J. Mol. Liq., vol. 220, pp. 726–730, 2016.

[192] B. Kaczmarek, A. Sionkowska, K. Łukowicz, and A. Maria Osyczka, “The cells

viability study on the composites of chitosan and collagen with glycosaminoglycans

isolated from fish skin,” Mater. Lett., vol. 206, pp. 166–168, 2017.

[193] C. H. Chen et al., “Injectable thermosensitive hydrogel containing hyaluronic acid

and chitosan as a barrier for prevention of postoperative peritoneal adhesion,”

Carbohydr. Polym., vol. 173, pp. 721–731, 2017.

117

ANEXOS

Anexo 1 Reacciones de entrecruzamiento esperadas entre a) el grupo NH2 del quitosano y el

PEGDE. b) entre el OH del quitosano y el PEGDE. c) entre el NH2 del quitosano y el GA.

d) entre el OH del quitosano y el GA.

118

Anexo 2 Deconvoluciones de carbono de las películas de quitosano secas a 25°C

Figura A3.

ANEXO 4

280282284286288290292294296298

Binding Energy (eV)

C1s Scan4 Scans, 38.2 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV

C1s C-C

C1s C-OC1s N-C=O

280282284286288290292294296298

Binding Energy (eV)


C1s C-C

C1s C-O

C1s N-C=O

280282284286288290292294296298

Binding Energy (eV)


C1s C-C

C1s C-O

C1s N-C=O

280282284286288290292294296298

Binding Energy (eV)


C1s C-C

C1s C-O

C1s N-C=OC1s Scan D

280282284286288290292294296298

Binding Energy (eV)


C1s C-O

C1s C-C

C1s N-C=O

CH

T-P

EG

DE

1

CH

T

CH

T-P

EG

DE

2

CH

T-P

EG

DE

3

CH

T-G

A

119

Anexo 3

Imágenes de MEB de las esponjas obtenidas por liofilización de quitosano, quitosano entrecruzado con GA (CHT/GA) y quitosano entrecruzado con PEGDE, (CHT/PEGDE 1,

2, 3).

120

Anexo 4

Espectro XPS de carbono, oxígeno y nitrógeno de las películas de quitosano/AH al 15%

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

280282284286288290292294296

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)


C1s

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

6.00E+04

7.00E+04

526528530532534536538540542544

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)

O1s Scan2 Scans, 20.1 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV

O1s

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

6.00E+04

526528530532534536538540542544

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)


O1s

5.00E+03

6.00E+03

7.00E+03

8.00E+03

9.00E+03

1.00E+04

1.10E+04

1.20E+04

392394396398400402404406408

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)

N1s Scan8 Scans, 1 m 12.4 s, 400µm, CAE 50.0, 0.10 eV

N1s

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

6.00E+04

7.00E+04

280282284286288290292294296

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)


C1s

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

6.00E+04

7.00E+04

526528530532534536538540542544

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)


O1s

5.00E+03

6.00E+03

7.00E+03

8.00E+03

9.00E+03

1.00E+04

1.10E+04

1.20E+04

392394396398400402404406408

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)


N1s

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

280282284286288290292294296

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)


C1s

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

6.00E+04

7.00E+04

8.00E+04

526528530532534536538540542544

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)


O1s

5.00E+03

6.00E+03

7.00E+03

8.00E+03

9.00E+03

1.00E+04

1.10E+04

1.20E+04

1.30E+04

1.40E+04

392394396398400402404406408

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)


N1s

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

280282284286288290292294296

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)


C1s

6000

7000

8000

9000

10000

394396398400402404406408410

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)


N1s

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

526528530532534536538540542544

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)


O1s

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

280282284286288290292294296

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)


C1s

CH

T-P

EG

DE

1

CH

T

CH

T-P

EG

DE

2

CH

T-P

EG

DE

3

CH

T-G

A

121

Anexo 5

Espectro XPS de carbono, oxígeno y nitrógeno de las películas de quitosano/AH al 30%

CH

T-P

EG

DE

1

5.00E+03

6.00E+03

7.00E+03

8.00E+03

9.00E+03

1.00E+04

1.10E+04

1.20E+04

392394396398400402404406408

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)


N1s

CH

T-G

A

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

6.00E+04

7.00E+04

8.00E+04

526528530532534536538540542544

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)

O1s Scan

O1s

8.00E+03

9.00E+03

1.00E+04

1.10E+04

1.20E+04

1.30E+04

1.40E+04

1.50E+04

1.60E+04

392394396398400402404406408

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)

N1s Scan

N1s

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

6.00E+04

7.00E+04

8.00E+04

9.00E+04

1.00E+05

280282284286288290292294296

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)

C1s Scan

C1s

CH

T

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

6.00E+04

7.00E+04

8.00E+04

526528530532534536538540542544

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)

O1s Scan

O1s

6.00E+03

8.00E+03

1.00E+04

1.20E+04

1.40E+04

1.60E+04

1.80E+04

2.00E+04

392394396398400402404406408

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)

N1s Scan

N1s

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

6.00E+04

7.00E+04

8.00E+04

9.00E+04

280282284286288290292294296

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)

C1s Scan

C1s

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

6.00E+04

7.00E+04

8.00E+04

526528530532534536538540542544

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)

O1s Scan

O1s

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

6.00E+04

7.00E+04

8.00E+04

9.00E+04

280282284286288290292294296

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)

C1s Scan

C1s

CH

T-P

EG

DE

2

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

6.00E+04

7.00E+04

8.00E+04

526528530532534536538540542544

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)

O1s Scan

O1s

6000

7000

8000

9000

10000

392394396398400402404406408

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)

N1s Scan

N1s

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

6.00E+04

280282284286288290292294296

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)

C1s Scan

C1s

CH

T-P

EG

DE

3

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

6.00E+04

7.00E+04

526528530532534536538540542544

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)

O1s Scan

O1s

7.00E+03

8.00E+03

9.00E+03

1.00E+04

1.10E+04

1.20E+04

1.30E+04

1.40E+04

1.50E+04

1.60E+04

392394396398400402404406408

Co

unts

/ s

Binding Energy (eV)

N1s Scan

N1s

0.00E+00

1.00E+04

2.00E+04

3.00E+04

4.00E+04

5.00E+04

6.00E+04

7.00E+04

8.00E+04

280282284286288290292294296

Cou

nts

/ s

Binding Energy (eV)

C1s Scan

C1s

122

Anexo 6

Productos Académicos Derivados de esta Investigación

Presentación de Trabajos en Congresos Internacionales

Presentación de Cartel Científico “POLYETHYLENE GLYCOL DIGLYCIDYL ETHER CROSSLINKED CHITOSAN AS BIOMATERIAL”. XV Simposio Latinoamericano de Polímeros. Cancún – Riviera Maya, México. Octubre 23 – 27 2016.

Ponencia “BIOCOMPATIBILIDAD DE ANDAMIOS DE QUITOSANO ENTRECRUZADO CON POLIETILENGLICOL DIGLICEDIL ÉTER COMO BIOMATERIAL”. XXV Encuentro Nacional y XVI Iberoamericano de Investigación en Odontología. Zacatecas, México. 10 de noviembre de 2017

Presentación de Cartel Científico “THE EFFECT OF DRYING TEMPERATURE ON PROPERTIES OF CROSSLINKED CHITOSAN”. 4th US-Mexico Symposium on Advances in Polymer Science MACROMEX 2017, XXX Congreso Nacional de la S.P.M.” Los Cabos, Mexico. Diciembre 3 al 7 de 2017.

Presentación de Cartel Científico “BIOCOMPATIBILIDAD DE ANDAMIOS DE QUITOSANO SOMETIDOS A DIFERENTES TEMPERATURAS DE SECADO”. 5º. Congreso Internacional de REDBIOT. Centro de Investigaciones Científicas de Yucatán. 24 al 26 de octubre de 2018

Presentación de Cartel Científico “BIOCOMPATIBILIDAD DE ANDAMIOS DE QUITOSANO SOMETIDOS A DIFERENTES TEMPERATURAS DE SECADO”. XXVI Encuentro Nacional y XVII Iberoamericano de Investigación en Odontología. León Guanajuato 7 al 9 de noviembre de 2018”

Artículos Originales en Revistas Arbitradas y Enlistadas en JCR

Chuc-Gamboa, M.G.; Vargas-Coronado, R.F.; Cervantes-Uc, J.M.; Cauich-Rodríguez, J.V.; Escobar-García, D.M.; Pozos-Guillén, A.; San Román del Barrio, J. The Effect of PEGDE Concentration and Temperature on Physicochemical and Biological Properties of Chitosan. Polymers 2019, 11, 1830.

Documents

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. EFECTO