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細菌バイオ フィルム解析法 としてのATP測 定 の意義

岡山大学医学部泌尿器科学教室

竹 中 皇

(平成6年2月14日 受付)

(平成6年4月8日 受理)

Key words: chemiluminescence, ATP, Pseudomonas

aeruginosa, biofilm

要 旨

細 菌 バ イ オ フ ィル ム のbio-activityの 解 析 を 行 うた め に,バ イ オ フィル ム のATP量 をATP

bioluminescence法 に よって測 定 した.ATP量 と浮 遊系 の緑 膿菌 の菌 数 との間 に は直線 関係 が認 め られ

た. Modified Robbins device (MRD) を用 い てin vitro実 験 系 を設定 した.緑 膿菌 バ イ オ フ ィル ムは,

MRDを 人 工尿 で灌 流 させ て,シ リコンデ ィス ク表 面 に形 成 させ た.

こ の 緑 膿 菌 バ イ オ フ ィル ム のbio-activityをATP bioluminescence 法 で 測 定 し た と こ ろ,bio-

activityは 灌 流開 始4時 間 まで は急速 に増加 し,以 後灌 流開 始後32時 間 まで定 常状 態 を維持 していた.緑

膿 菌 バ イオ フ ィル ム形成 後,灌 流 液 を piperacillin, clarythromycin, お よびofloxacinを 含 む人工 尿 に

交 換 して,薬 剤 を8時 間作用 させた.そ の結 果,緑 膿 菌 バ イオ フ ィル ムのbio-activityは,抗 菌 剤 の作用

に よ り変化 し,そ の変化 はATPの 測定 に よ りとらえ る ことが で きた.今 回検 討 したATP量 の変化 は走

査 型電 子顕 微鏡 所見 とよ く一 致 して いた.

以上 の成 績 よ り,細 菌 バ イオ フ ィル ムのATP量 測定 は,in vitro実,験 系 にお け る細 菌 バ イオ フ ィル ム

のbio-activity解 析 に有 用 であ る と考 え られた.

序 文

カ テ ー テ ル 留 置 複 雑 性 尿 路 感 染 症 を は じめ とす

る慢 性 難 治 性 感 染 症 に お い て,細 菌 バ イ オ フ ィル

ムの存 在 は そ の難 治 性 の要 因 と し て最 近 注 目を浴

び て い る1)2).し か し,完 成 され た 細 菌 バ イ オ フ ィ

ル ムに お い て は,菌 体 同士 は菌 体 外 産 生 物 質 で あ

るglycocalyxに よ っ て 結 合 し て お り,単 個 菌 に

分 散 す る こ とは 困 難 で あ る.

今 回,細 菌 バ イ オ フ ィル ム を一 つ のbio-active

materialと して と ら え,そ のbio-activity測 定 の

一 方 法 と して 細 菌 バ イ オ フ ィル ム のATP量 を 測

定 した.

細 菌 を 含 む 細 胞 の 代 謝 はATPを 介 し て 行 わ

れ,そ のATP量 は 細 胞 の 体 積 に 比 例 し て い る こ

と3),な ら び に, chemiluminescence 反 応 で の 蛍 光

量 はATP量 に比 例 し,従 来 よ り細 菌 数 の 定 量 な

ど に 用 い られ て い る こ と3)よ り,細 菌 バ イ オ フ ィ

ル ム の形 成 と抗 菌 性 物 質 の 効 果 の解 析 にATP量

の 測 定 が応 用 可 能 と考 え て検 討 を 加 え た.

材 料 と方 法

1. 試 験 菌

臨 床 分離 株 のPseudomonas aeruginosaを 用 い

て 以 下 の 実 験 を 行 った.菌 株 は 西 谷4)の 報 告 を 参

考 と し,14-210株 を 用 い た.菌 株 は2代 継 代 培 養

後,対 数 増 殖 期 の状 態 で 使 用 した.尚,今 回 液 体

培 地 と して は,す べ て0.4%の 乾 燥 ブ イ ヨ ンを 添 加

した 人 工 尿 を 用 い た4).

2. カ テ ー テ ル 素 材(シ リコ ン樹 脂)表 面 に お け

る細 菌 バ イ オ フ ィル ム形 成 と走 査 型 電 子 顕 微 鏡 に

別刷請求先:(〒700)岡 山市鹿田町2-5-1

岡山大学 医学部泌尿器科学教室

竹 中 皇

平成6年6月20日

760 竹中 皇

よ る観 察

細 菌 バ イ オ フ ィル ム の形 成 に はmodified Rob-

bins device (以 下MRD) を 用 い た4)5).MRDは10

個 のsampling portを 持 ち,各 々のsampling port

に は 直 径10mmのsilicon discが 装 着 で き る よ う

に作 成 した.

人 工 尿 に 終 濃 度 が106cfu/mlと な る よ うに菌 を

接 種 し,接 続 し たMRD内 を40ml/hrの 流 速 で

灌 流 し た.灌 流 開 始 後 経 時 的 にsampling port

よ りsampling discを 無 菌 的 に採 取 し,走 査 型 電

子 顕 微 鏡 に よ る観 察 を す る と と も に,後 述 す る

chemiluminescence法 に よ るATP測 定 を 行 っ

た.

走 査 型 電 子 顕 微 鏡 用 試 料 作 成 は,試 料 を2.5%グ

ル タ ール ア ル デ ヒ ド-PBS(pH7.4)お よ び1%四

酸 化 オ ス ミウ ム-PBS(pH7.4)に て二 重 固 定 後 エ

タ ノ ール 系 列 で 脱 水 し,臨 界 点 乾 燥,白 金-パ ラヂ

ウ ム蒸 着 を 行 い 日立 製 作 所s-570型 走 査 型 電 子 顕

微 鏡 に て 観 察 を 行 った.

3. 浮 遊 系 細 菌(CFU)の 調 製 とATP測 定

人 工 尿 中 の浮 遊 系 細-菌 と し て のP.aeruginosa

の菌 数 測 定 は 通 常 の定 量 培 養 を行 った6).

人 工 尿 中 に てP.aeruginosaを24時 間 培 養 した

定 常 期 の細 菌 を 用 い,菌 液 を0.01M PBS(pH7.4)

に て10倍 段 階 希 釈 を 行 い,0.7%agar powder

(Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japan)

を 含 有 した nutrient broth (Nissui Pharmaceuti-

cal Co. Ltd., Japan) を 用 い た 半 固形 培 地 に接 種

した.37℃ で1晩 培 養 後,そ の コ ロ ニ ー数 を 計 算

した.ま た,段 階 希 釈 し た 菌 液 を 浮 遊 系 細 菌 の

ATP測 定 に 用 い た.

4. ATP測 定

Sampling discを1度 滅 菌 蒸 留 水 で 洗 浄 し た

後,500μlの 滅 菌 蒸 留 水 と と もに 滅 菌 試 験 管(15×

100mm)に て10分 間 煮 沸,sonicationを 行 った の

ち,ATP抽 出 液 を-70℃ で 測 定 ま で 凍 結 保 存 し

た.

ATP測 定 に は ホ タ ル ・ル シ フ ェ リン ・ル シ フ ェ

ラ ーゼ 反 応 を 用 いた7).

50μ1の200mM HEPES (N-2-Hydroxy-

ethilpiperazine - N' - 2 - ethanesulfonic Acid,

Katayama Chemical Co., Ltd., Japan) buffer

(pH7.75), 5μlの200mM MgSO4, 20μlの 滅 菌 蒸

留 水,適 当 な 濃 度 に 希 釈 したATP抽 出 液20μlを

96穴 マ イ ク ロ プ レ ー トに 注 入 し,混 和 した.5μlの

1mg/ml luciferase (SIGMA Chemical Co.,

USA), 100μlの0.125mM D-luciferin (SIGMA

Chemical Co., USA) を加 えて 反 応 を 開 始 し,反

応 開 始 後5秒 毎 の 発 光 値 を 読 み 取 り,1分 間 の 発

光 値 の 積 分 値 を 発 光 量 と した.発 光 値 の 読 み 取 り

に は MDL - 100 MICROLUMINO READER

(CORONA Co. Ltd., Japan) を 用 い た.

5. 抗 菌 剤 作 用 時 に お け る細 菌 バ イ オ フ ィル ム

の観 察

細 菌 バ イ オ フ ィル ム の 抗 菌 剤 作 用 時 の 変 化 を

ATP量 測 定,お よび 走 査 型 電 子 顕 微 鏡 に よ る 観

察 を 行 った.

菌 液 を 接 種 した 人 工 尿8時 間 灌 流 後,piperacil-

lin(以 下PIPC), ofloxacin (以 下OFLX), claryth-

romycin (以 下CAM) を 含 有 した 人 工 尿 に 交 換

し,更 に8時 間灌 流 し た.PIPCの 濃 度 は800μg/

ml, OFLXは500μg/ml, CAMは100μg/ml に 調

製 して 用 いた.な お,各 薬 剤 の 濃 度 は 尿 中 排 泄 を

参 考 に した8)～10).ま た,P.aeruginosa 14-210株

に 対 す る 人 工 尿 中 で の PIPCの MICは 12.5μg/

ml,OFLX の MICは 6.25μg/ml, CAMは800μg/

mlで あ っ た.対 照 と して,P.aeruginosaお よ び

抗 菌 剤 を 含 ま な い 新 し い 人 工 尿 に 交 換 し て 灌 流

し,同 様 にATP測 定 を 行 った.尚,ATP量 の 変

化 は,抗 菌 剤 作 用 前 の 細 菌 バ イ オ フ ィル ム の

ATP量 と比 較 し,そ の増 減 を%で 表 示 した.

成 績

1. 既 知 のATP量 と発 光 量 との 関 係

まず,ATPア ッセ イ系 の 測 定 感 度 と定 量 性 を

確 認 す るた め,既 知 濃 度 のATPと 発 光 量 との 関

係 を 見 た(Fig.1a).ATP量 が2.5×10-12M以 上

の濃 度 に お い てATPと 発 光 量 との 間 に は 直 線 関

係 が 認 め られ た.

2. ATP量 と浮 遊 系 細 菌 数 との 関 係

段 階 希 釈 した 既 知 の 菌 数 のP.aeruginosa浮 遊

菌 液 と,発 光 量 と の 間 に は103か ら108の 菌 数 に お

い て 直 線 関 係 が 認 め られ た(Fig.1b).発 光 量 を

感染症学雑誌 第68巻 第6号

細菌バ イオフ ィル ムのATP量 の変化 761

Fig.1 The relationship between ATP content, P. aeruginosa cell numbers, and luminescence

a: ATP content and luminescence, b: P. aeruginosa cell numbers and luminescence. c: P.

aeruginosa cell numbers and ATP content

a b c

ATP量 に 換 算 してATP量 と浮 遊 系 の 細 菌 数 と

の 関 係 をFig.1cに 示 した.以 上 の 成 績 よ り,定 常

状 態 の 浮 遊 系P.aeruginosaの 場 合 に は,103か ら

108の 範 囲 に お い て,菌 数 測 定 がATP量 か ら定 量

可 能 と思 わ れ た.

3. カ テ ーテ ル 素 材(シ リコ ン樹 脂)表 面 に お け

る細 菌 バ イ オ フ ィル ム形 成 過 程 とATP量

P.aeruginosa菌 液 灌 流 開始 1, 2, 4, 8 時 間

後 のsilicon disc表 面 の 走 査 型 電 子 顕 微 鏡 像 を

Fig.2に 示 す.

菌 液 灌 流 開 始1時 間後 の 電 子 顕 微 鏡 像 で は菌 体

はdisc表 面 に 散 在,局 所 的 にmicrocolonyの 形

成 を 認 め た(Fig.2a).菌 液 灌 流2時 間後 の 電 子 顕

微 鏡 像 に お い て はdisc表 面 の 付 着 菌 数 は増 え,菌

体 同 士 は集 族 す る傾 向 を示 し,microcolonyの 形

成 も菌 液 灌 流1時 間 後 の 像 と比 べ 著 明 で あ った

(Fig.2b).3時 間 を 経 過 す る とdisc表 面 は ほ ぼ

菌 体 で 覆 わ れ る よ うに な る もの の,glycocalyxの

産 生 は 電 子 顕 微 鏡 的 に は著 明 で は な か った.4時

間 を 経 過 す る とglycocalyxに よ っ て 各 々 の 菌 体

は被 覆 され 細 菌 バ イ オ フ ィル ムの様 相 を呈 して い

た(Fig.2c).又,菌 液 灌 流 開 始8時 間 後 で は菌 体

同士 はglycocalyxに よ って 結 合 し て お り,細 菌

バ イ オ フ ィル ム は ほ ぼ 完 成 され た 状 態 に あ る と思

わ れ た(Fig.2d).

ATP量 に よ る細 菌 バ イ オ フ ィル ムの 変 化 に つ

い て は,菌 液 灌 流 開 始4時 間 目 まで は対 数 増 殖 的

にdisc 1枚 当 た りのATP量 の増 加 を認 め た.菌

液 灌 流4時 間 目 に はATP量 と し て はdisc 1枚

当 た り(0.5024cm2)4.2×10-11molと な り,細 菌

バ イ オ フ ィル ム は菌 液 灌 流 と と もに 急 速 に形 成 さ

れ て い く こ と がATP量 の 変 化 か ら は 示 唆 さ れ

た.し か し,菌 液 灌 流4時 間 以 後 は灌 流32時 間 を

経 過 して もほ ぼ 一 定 の値 を と り,細 菌 バ イ オ フ ィ

ル ムのATP量 は ほ ぼ定 常 状 態 に あ る と思 わ れ た

(Fig.3).

4. 抗 菌 剤 作 用 時 の 細 菌 バ イ オ フ ィル ム の 変 化

とATP量

菌 液 灌 流8時 間 後,抗 菌 剤 を 作 用 させ た 時 の 緑

膿 菌 バ イ オ フ ィル ム のATP量 の 変 化 を,Fig.4

に示 す.

菌 液 灌 流 後,細 菌 を 含 ま な い人 工 尿 に交 換 して

更 に8時 間 灌 流 す る と,細 菌 バ イ オ フ ィル ム の

ATP量 ば 灌 流 前 に比 し増 加 し,灌 流8時 間 後 に

は230%に な っ て い た.

抗 菌 剤 作 用 時 に お い て はPIPC,お よ びCAM

作 用 時 に は緑 膿 菌 バ イ オ フ ィル ムのATP量 は 作

用 前 に 比 し 増 加 し て お り,PIPC作 用 時 に は

199%,CAM作 用 時 に は273%に そ れ ぞ れ 増 加 し

て い た.

平成6年6月20日

762 竹中 皇

Fig. 2 SEM of bacterial colonization on a silicon disc surface.a: lhr after contact with artificial urine containing 106cfu/ml of P. orruginosa

14-210, b: 2hrs, c: 4hrs, d: 8hrs.

2.a

2.c

2.b

2.d

OFLX作 用 時 に は 緑 膿 菌 バ イ オ フ ィル ム の

ATP量 は,作 用4時 間 ま で は 減 少 傾 向 を 認 め た.

作 用4時 間 後 に は 細 菌 バ イ オ フ ィル ムのATP量

は57%に ま で 減 少 し て い た が 作 用8時 間 後 に は

80%に ま で 回 復 して い た.

電 子 顕 微 鏡 に よ る観 察 で は,抗 菌 剤 を含 ま ない

人 工 尿 灌 流 時,お よ びCAM作 用 時 に は 菌 数,

glycocalyxと も に増 加 し,作 用 前 に比 しそ の 厚 み

を増していた.PIPC作 用時には,個 々の菌体は伸

長化していたが,菌 数の増加は明らかではなかっ

た.OFLX作 用時には菌数は作用前に比 しやや減

少し,菌 体の伸長化は認められなかった.

考 察

慢性の感染症において,そ の原因菌を同定し,

薬剤感受性成績に基づいて最適 と思われ る抗菌剤

を投与 しても一時的な菌の陰性化が認められるの

感染症学雑誌 第68巻 第6号

細菌バイオフィルムのATP量 の変化 763

Fig. 3 The change of ATP content of biofilm

during the circulation of atificial urine

Fig. 4 The change of %ATP during the circula-

tion of artificial urine with antibiotics

みで,長 く同一の菌が検 出され ることは臨床の場

面においてよく経験 される.特 に泌尿器科領域に

おいてはカテーテル留置症例において問題 とな

り,compromised hostに おけるuro-sepsisの 要

因となっている.こ のような難治性感染症の病態

として,最 近,細 菌バイオフィルムの存在が注 目

を浴びている.し かし,そ の実態についての解析

は十分になされているとはいえないのが現在の状

況である.

尿路感染症の発症には病原細菌の尿路腔への付

着並びに定着が必要であ り,そ の様式 として,1)

細菌側のadhesinと,尿 路内腔面を構成する上皮

細胞上のreceptorと の間での特異的 な結合お よ

び,2)細 菌 と尿 路 粘 膜 や 尿 路 異 物 表 面 との 非 特 異

的 な結 合 とに 大 別 され る2).Escherichia coliな ど

に よ る単 純 性 尿 路 感 染 症 が 典 型 的 な前 者 の 結 合 で

あ り,尿 路 留 置 カ テ ー テル な どの 尿 路 異 物 存 在 時

の 慢 性 尿 路 感 染 症 に お け る結 合 様 式 が 後 者 の 結 合

で あ る と考 え られ る4).後 者 の 結 合 様 式,即 ち 細 菌

バ イ オ フ ィル ム形 成 時 の 生 体 側 の反 応 は前 者 の 反

応 と比 べ 比 較 的 弱 い もの と考 え られ て お り,そ れ

が 感 染 の難 治 性 に もつ な が っ て い る も の と思 わ れ

る.

細 菌 は固 体(カ テ ー テ ル表 面)に 付 着 す る と多

糖 体 を 産 生 し,glycocalyx(exopolysaccharide

matrix)を 形 成,時 間 経 過 と共 に細 菌 バ イ オ フ ィ

ル ム が 固 体 表 面 に 完 成 さ れ る1)2).菌 体 同 士 は

glycocalyxに よ っ て結 合 し て お り,完 成 され た細

菌 バ イ オ フ ィル ムに お い て は,も はや 菌 体 を 分散

す る こ とは 不 可 能 とな る.

細 菌 バ イ オ フ ィル ム の解 析 に お い て は形 成 さ れ

た バ イ オ フ ィル ム をsonication,vortex等 に か げ

る こ とに よ っ て あ る程 度 分 散 し うる と考 えて,通

常 の 定 量 培 養 法 が行 わ れ て い る11).し か し,先 程 述

べ た よ うに 個 々 の菌 体 に 分 散 し え な い こ と こそ が

細 菌 バ イ オ フ ィル ム の 特 性 で あ り,菌 量 に 対 す る

解 析 法 と して は問 題 が 残 る.即 ち,今 回 の よ うな

実 験 系 に お け る細 菌 バ イ オ フ ィル ム に対 す る ア プ

ロ ー チ と し て は,細 菌 バ イ オ フ ィル ム を1つ の

bio-active materialと して と らえ,そ の菌 数 で は

な く他 の 指 標 に よ っ て そ のbio-activityを 把 握 す

る方 が 有 利 で あ る と考 え られ る.

ATPは 生 体 に は 必 ず 含 ま れ て お り,そ の 量 は

細 胞 の体 積 に 比 例 す る こ とか ら,ATP量 の 定 量

はbiomassのactivity,細 胞 数 の定 量 に用 い られ

て きた3).ま たchemiluminescence反 応 に お げ る

そ の 蛍 光 量 はATP量 に 比 例 し,測 定 時 間 も短 時

間 で す む こ とか ら,ホ タ ル ・ル シ フ ェ リン ・ル シ

フ ェ ラ ーゼ 反 応 は 従 来 か ら,ATPの 微 量 定 量 に

用 い られ て きた7).そ こで,今 回,本 方 法 を用 い て

緑 膿 菌 バ イ オ フ ィル ム の 解 析 を 試 み る こ と と し

た.

今 回,ア ッセ イ系 の信 頼 性 を 確 認 す る 目的 で,

まず,浮 遊 系 の細 菌 に お い てATP量 と細 菌 数 と

平成6年6月20日

764 竹中 皇

の関係に検討を加えた ところ,103か ら108の菌数

において,直 線関係が認められた.バ イオフィル

ム形成菌において,個 々の菌体のATP量 が浮遊

系細菌 とどの程度に相関するのかは必ずしも明確

ではない.し かし,今 回の実験系のようにsilicon

disc1枚 に形成 され る細菌バイオフィルムの変

化を検討す る場合には,細 菌バイオフィルムを全

体 としてひとつのbio-active materialと 考 えて

定量的に比較するのには極めて優れた測定系 とい

える.

電子顕微鏡 により細菌バイオフィルムの形成過

程を観察すると,時 間経過 と共にdisc表 面の菌数

は増 え,菌 液灌流開始4時 間後 よりglycocalyx

の産生が著明となり,そ の後にdisc表 面の細菌バ

イオフィルムは厚みを増 してい くものと思われ

た.一 方,ATP量 は菌液灌流開始4時 間までは対

数的に増加していくものの,以 後は灌流開始後32

時間が経過 しても一定の値を示 した.即 ち,ATP

量からみると,MRDを 用いた今回のin vitro実

験系においては,菌 液灌流4時 間後にはdisc全 表

面に細菌が付着 し,そ のbio-activityは 定常化す

るものと思われる.

た だ し,こ こで菌液灌 流開 始4時 間 以降 の

ATP量 の定常化が果 して細菌 バイオフィルム中

の総菌数の一定化を示すのか,そ れ ともバ イオ

フィルム形成菌におけるmetabolismの 変化の結

果 としてATP量 が定常化するのかは判然 としな

い.01sonら12)はStaphylococcus aureusを 用いた

細菌バイオフィルムの形成実験において,菌 液灌

流8時 間以降,総 菌数の変化は認められなかった

と報告している.4時 間 と8時 間 とい う時間経過

の違いはあるものの,菌 種ならびに実験条件の差

を考慮すると,今 回の成績 とほぼ一致するものと

考 えられる.し たがって,ほ ぼfull-growthに 至 っ

た浮遊菌を含む一種の閉鎖系においては,バ イオ

フィルム形成の場 としての固相の面積(こ の場合

はシリコンデ ィスク)が 付着細菌で占有された後

には,菌 体数その ものの増加は比較的少ないもの

と思われる.

一方,菌 液を8時 間灌流 し,ほ ぼ完成 された と

思われる細菌バイオフィルムに対し,細 菌を含ま

な い新 しい 人 工 尿 で 更 に灌 流 す る と,定 常 化 した

細 菌 バ イ オ フ ィル ム のATP量 は 再 増 加 傾 向 を示

した.細 菌 のATP量 は栄 養 状 態 やpH,温 度 な ど

の ス トレ ス に よ って 変 化 す る こ とが 知 られ て い る

が13),こ の場 合,完 成 され た細 菌 バ イ オ フ ィル ムに

お い て も栄 養 条 件 が 改 善 す る と さ らに 増 殖 方 向 に

進 み得 る こ とが示 唆 され た.

一 方,細 菌 バ イ オ フ ィル ム に対 し,抗 菌 剤 を 作

用 させ る と,細 菌 バ イ オ フ ィル ムは そ のATP量

を 変 化 させ た.PIPC,CAM作 用 時 に は細 菌 バ イ

オ フ ィル ム のATP量 は 作 用 前 に 比 し増 加 し,

OFLX作 用 時 に は 減 少 した.

Wheatら は14)15)グラ ム陽 性 菌,お よ び腸 内 細 菌

科 の 細 菌 を用 い て,作 用 抗 菌 剤 濃 度 とATP量 と

の 関 係 に つ い て 報 告 し て い る が,そ の 中 で

Proteus mirabilisに お い て,β ラ ク タ ム剤 に お け

るMIC濃 度 とATP量 との 間 に 不 一 致 が 認 め ら

れ た と報 告 して い る.こ の 現 象 は,酸 素 付 加 お よ

び 長 時 間 作 用 に て解 消 され て お り,不 一 致 の 要 因

と し て,ペ ニ シ リ ン誘 導 性 のspheroplastがP.

mirabilisで は 溶 菌 し て い な か った た め で あ ろ う

と述 べ て い る15).ま た,Limbら16)は 浮 遊 系 のE.

coliに 対 し,ciprofloxacinを 短 時 間 作 用 させ る こ

とに よ り,菌 体 の伸 長 化 お よ びATP量 の 明 ら か

な増 加 を 認 め た と報 告 して い る.即 ち,抗 菌 剤 作

用 時 に認 め られ る菌 体 の 伸 長 化 は,菌 体 が 溶 菌 を

お こす ま で は,菌 体 のbio-activityの 増 加 と し て

と らえ られ る こ とを 意 味 して い る.

緑 膿 菌 バ イ オ フ ィル ム 中 の 菌 体 に お い て も

PIPCは 菌 の伸 長 化 を 起 こす こ とが 報 告 され て い

る4)が,今 回 の 実 験 系 に お い て も 同 様 の 結 果 で

あ っ た.ま た,PIPC作 用 時 の 緑 膿 菌 バ イ オ フ ィル

ム のATP量 の 増 加 が更 に 長 時 間 作 用 させ た 時 に

ど う変 化 す る か に つ い て は 今 後 の 検 討 が 必 要 で あ

る が,PIPC作 用8時 間 の 時 点 に お い て は,緑 膿 菌

ノミイ オ フ ィル ム中 の 菌 は伸 長 化 す る もの の 溶 菌 し

て お らず,結 果 と し て 緑 膿 菌 バ イ オ フ ィル ム の

ATP量 は増 加 した も の と考 え られ る.

CAM,お よ びOFLXを 作 用 させ る と緑 膿 菌 バ

イ オ フ ィル ム はPIpc作 用 時 と 同 様,そ のbio-

activityを 変 化 させ た が,個 々の 菌 体 に お い て は

感染症学雑誌 第68巻 第6号

細菌バイオフィルムのATP量 の変化 765

PIPC作 用 時 とは 異 な り,特 に 伸 長 化 等 の 変 化 は

今 回 の 実 験 系 に お い て は 認 め られ な か った.即 ち,

そ のbio-activityの 変 化 は緑 膿 菌 バ イ オ フ ィル ム

中 の 生 菌 数 の変 化 を 主 に反 映 して い る もの と思 わ

れ た.

細 菌 バ イ オ フ ィル ム に対 し,薬 剤 を作 用 させ た

時,そ のATP量 の変 化 の 要 因 と して,菌 体 数 の 変

化,お よび 個 々 の 菌 体 中 のATP量 の 変 化 の2つ

が 考 え られ る.特 に後 者 の場 合,そ のATP量 の 変

化 が 抗 菌 剤 の 効 果 を ど う反 映 して い るか に つ い て

は,今 後 の検 討 が必 要 で あ ろ う.し か し,抗 菌 剤

作 用 に対 す る 細 菌 バ イ オ フ ィル ム側 の 反 応 と し

て,細 菌 バ イ オ フ ィル ム は そ のbio-activityを 変

化 させ,そ の 変 化 はATP定 量 に よ っ て検 討 す る

こ とが 可 能 で あ る と思 わ れ る.

い ず れ に して も,細 菌 バ イ オ フ ィル ムを1つ の

bio-active materialと して と ら え る な らぽ,全 体

のATP量 を 細 菌 バ イ オ フ ィル ム の 持 つactivity

と して と らえ る こ とが 可 能 で あ る.従 っ て,ATP

量 の 増 減 は 細 菌 バ イ オ フ ィル ム の 持 つactivity

の増 減 と し て と ら え られ,細 菌 バ イ オ フ ィル ム に

対 す る各 種 薬 剤 の 効 果 な どを検 討 す る の に 大 き な

問 題 は な い も の と思 わ れ る.

稿 を終 えるにあた り,御 指導,御 校閲を頂いた恩師大森

弘之教授,直 接御指導頂いた公文裕 巳助教授,適 切な御助

言を頂 いた細菌学教室友近健一講師,細 胞工学教室保田立

二教授,な らびに研究遂行 にあた り御協力頂いた小野憲昭

助手,渡 辺豊彦大学院生,大 野勝雄技官,光 畑律子および

的野由夏技術補佐員に深謝致 します.

本論文は岡山大学大学院の学位審査論文である.

文 献

1) Costerton, J. W.: The etiology and persistence

of cryptic bacterial infections: A hypothesis.

Rev. Infect. Dis., 6: 608-616, 1984.

2) 公 文裕 巳: 複雑 性 尿 路感 染 症 とBiofilm Disease.

化学 療 法 の 領域, 8: 245-252, 1992.

3) Stanley, P. E.: A Concise Beginner's Guide toRapid Microbiology Using Adenosine Triphos-

phate (ATP) and Luminescence. ATP Lumines-cence: Rapid Methods in Microbiology, p.1-10

, Blackwell Scientific Publications, Oxford,

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4) 西 谷 嘉 夫: In vitro実 験 モ デル に よ る複 雑性 尿 路

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平成6年6月20日

766 竹中 皇

An ATP Bioluminescence Assay for the Analysis of Bacterial Biofilms

Tadasu TAKENAKA

Department of Urology, Okayama University Medical School

(Director: Prof. H. OHMORI, M.D.)

To analyze the bio-activity of the bacterial bioflim, the ATP content of the biofilm was assayedusing the ATP bioluminescence assay. A linear relationship between the ATP content and the numberof the planktonic Pseudomonas aeruginosa cells was observed. An in vitro experiment was set up usinga modified Robbins device (MRD). A biofilm of P. aeruginosa was developed on the silicon discs of thisdevice by recirculating artificial urine medium through the MRD. The activity of the biofilm, assayedby ATP luminescence, increased rapidly during the first 4 hrs of circulation, and essentially remainedunchanged for 32 hrs during medium circulation. After the biofilm developed, the medium wasexchanged to the new artificial urine with piperacillin or clarythromycin or ofloxacin and circulatedfor 8 hrs. The biofilm changed its bio-activity by the antibiotics, and the change could be detected bymeasuring the ATP content. These changes of ATP content studied were corelated well with thefindings detected by scanning electron microscopy.

Finally, ATP measurement of the bacterial biofilm was useful in analyzing the bio-activity ofbacterial biofilm.

感染症学雑誌 第68巻 第6号