Charakterisierung des Tegumentproteins pUL24 des Humanen

Universität Ulm

Institut für Virologie

Leiter: Prof. Dr. med. Th. Mertens

Charakterisierung des Tegumentproteins

pUL24 des Humanen Zytomegalievirus und

seiner Beteiligung am Zelltropismus des Virus

Dissertation zur Erlangung

des Doktorgrades der Humanbiologie (Dr. biol. hum.)

der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm

vorgelegt von

Robert-Elmar Pretsch

aus Günzburg

2006

II

Amtierender Dekan: Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Thomas Mertens 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Barbara Spellerberg Tag der Promotion: 17.11.2006

Widmung III

Meiner geliebten Frau Annette und meiner neugeborenen Tochter Lena

Es gibt nichts ergreifenderes im Leben

als einem kleinen Menschen das erste Mal

die Hand zu reichen und zu spüren,

dass wir seine Wurzeln im Baum des Lebens sind,

die ihm Halt und Geborgenheit geben.

Inhaltsverzeichnis IV

Inhaltsverzeichnis:

Abkürzungsverzeichnis ................................................................VI

1 Einleitung .................................................................................. 1

1.1 Das Humane Zytomegalievirus (HCMV)............................................... 1

1.2 Tegument ............................................................................................... 5

1.3 US22 Genfamilie .................................................................................... 6

1.4 Endothelzelltropismus des HCMV........................................................ 6

1.5 Ziel der Arbeit ........................................................................................ 8

2 Material und Methoden ............................................................ 9

2.1 Biologisches Material............................................................................ 9

2.2 Radiochemikalien ................................................................................ 11

2.3 Nukleinsäuren...................................................................................... 11

2.4 Enzyme................................................................................................. 15

2.5 Standardlösungen und Puffer ............................................................ 15

2.6 Molekularbiologische Standardmethoden ........................................ 17

2.7 Reagenzsysteme ................................................................................. 18

2.8 DNA Methoden..................................................................................... 18

2.9 Sawano-Mutagenese [Sawano et al., 2000] ....................................... 21

2.10 redαβ-Rekombination.......................................................................... 23

2.11 Ko-Immunpräzipitation........................................................................ 26

2.12 RNA ligase mediated rapid amplification of cDNA ends.................. 27

2.13 RT-PCR ................................................................................................. 28

2.14 Prokaryote Expression und Immunisierung von Kaninchen........... 29

2.15 Immunfluoreszenzanalyse .................................................................. 30

2.16 Zellkulturverfahren .............................................................................. 31

2.17 Retrovirale Transduktion .................................................................... 34

2.18 Luziferaseassay................................................................................... 35

3 Ergebnisse .............................................................................. 36

3.1 Prokaryote Expression von MBP-pUL24 ........................................... 36

3.2 Charakterisierung einer pUL24/ppUL32 Interaktion ......................... 39

3.3 Funktionelle Analyse von pUL24 mittels Luziferaseassay .............. 42

Inhaltsverzeichnis V

3.4 Generierung und Charakterisierung einer UL24-Deletionsmutante im Hintergrund des endotheliotropen HCMV-Stammes TB40E ............ 45

3.5 Charakterisierung der UL24-/UL25-Genregion mittels rapid amplification of cDNA ends (RACE)................................................... 51

3.6 Herstellung und Charakterisierung von Punktmutanten ................. 52

3.7 Transkomplementation durch retroviralen Gentransfer .................. 57

3.8 Einfluss auf Epithelzelltropismus ...................................................... 59

3.9 Einfluss auf Makrophagentropismus................................................. 61

3.10 Verringerte Infektiösität in Endothelzellen durch Zentrifugation kompensierbar ..................................................................................... 62

3.11 Beteiligung von pUL24 an Entry-Prozessen des HCMV in Endothelzellen ..................................................................................... 64

4 Diskussion .............................................................................. 67

4.1 Herstellung von Antikörpern und Lokalisation von pUL24.............. 67

4.2 Interaktion von pUL24 und ppUL32 ................................................... 68

4.3 Funktionelle Analyse von pUL24........................................................ 69

4.4 Bedeutung von UL24 für den Endothelzelltropismus ...................... 70

4.5 Bedeutung von UL24 für Epithelzell- und Makrophagentropismus 72

4.6 Mechanismus des Endothelzelltropismus ........................................ 73

5 Zusammenfassung................................................................. 76

6 Literaturverzeichnis ............................................................... 77

Abkürzungsverzeichnis VI

Abkürzungsverzeichnis AIDS aquired immunodeficiency syndrome

AK Antikörper

BAC bacterial artifical chromosome

BES N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid

BSA bovine serum albumin

CPE cytopathic effect

DMSO Dimethylsulfoxid

dpi day(s) post infection

DTT 1,4-dithio-DL-threitol

E early

EC(s) Endothelzelle(n)

EBV Epstein-Barr Virus

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

FCS fetal calf serum

FRT Flp recombination target

HCMV Humanes Zytomegalievirus

HEPES [4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino]-ethansulfonsäure

HFF human foreskin fibroblast

HHV humanes Herpesvirus

HIV human immunodeficiency virus

hpi hour(s) post infectionem

HRP horseraddish peroxidase

HSV Herpes simplex Virus

HUVEC Human Umbillical Vein Endothelial Cell

IE immediate early

IP Immunpräzipitation

kB Kilobasen

kDa Kilodalton

L late

LB Luria-Bertani-Medium

LTR long terminal repeat

MOI multiplicity of infection

MCMV murines Zytomegalievirus

MCP major capsid protein

MEM minimal essential medium

Abkürzungsverzeichnis VII

NIEP noninfectious enveloped particle

OD optische Dichte

ORF open reading frame

PBS Phosphat-gepufferte Saline

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

pp Phosphoprotein

PVDF Polyvinyliden Difluorid

rpm rounds per minute

RT Reverse Transkriptase

SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate - Polyacrylamidgelelektrophorese

SSC salted sodium citrate

UL unique long

US unique short

WT, wt Wildtyp

Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Das Humane Zytomegalievirus (HCMV)

1.1.1 Taxonomie

Das Humane Zytomegalievirus wird nach der Klassifikation des Internationalen

Komitees für Taxonomie in die Familie der Herpesviren eingeordnet [Roizman et

al., 1981, Smith 1956]. Zu dieser Familie gehören über 100 Vertreter, von denen

acht als humane Herpesviren bezeichnet werden (Tabelle 1). Alle Vertreter dieser

Virusfamilie zeichnen sich durch Gemeinsamkeiten im Partikelaufbau und ihren

biologischen Eigenschaften aus.

HCMV ist, wie alle Herpesviren, ein komplexes Virus und gehört zur Unterfamile

der β-Herpesvirinae. Deren Mitglieder zeichnen sich durch einen hohen

Verwandtschaftsgrad im Hinblick auf ihre Genomorganisation, ein begrenztes

Wirtsspektrum als auch einen relativ langen Replikationszyklus aus [Roizman et

al., 2001].

Tabelle 1: Klassifizierung der humanen Herpesviren [Roizman et al., 1991].

Subfamilie Art Abk. Erstbeschreibung

α-Herpesvirinae Herpes-simplex-Virus 1 HSV1 [Gruter, 1924]

Herpes-simplex-Virus 2 HSV2 [Schneeweis, 1962]

Varizella-Zooster-Virus VZV [Dumas et al., 1981]

β-Herpesvirinae Humanes Zytomegalievirus HCMV [Smith 1956]

Humanes Herpesvirus 6 HHV6 [Lindquester et al., 1991]

Humanes Herpesvirus 7 HHV7 [Frenkel et al., 1990]

γ-Herpesvirinae Epstein-Barr-Virus EBV [Epstein 1985]

Humanes Herpesvirus 8 HHV8 [Chang et al., 1994]

Einleitung 2

1.1.2 Morphologie

Das reife HCMV-Partikel hat einen Durchmesser von ungefähr 150-200 nm und

setzt sich aus einem 100 nm großen ikosaedrischen Kapsid, welches das Genom

enthält, einer im Vergleich zu HSV großen Tegument-Komponente und einer das

Partikel umgebenden Hülle zusammen. Diese besteht aus einer zellulären

Doppellipidmembran mit eingelagerten viralen Glykoproteinen (Abb. 1).

HCMV-infizierte Zellen produzieren drei verschiedene Partikeltypen: Die oben

beschriebenen reifen, infektiösen Virionen, sowie sogenannte NIEPs (non

infectious enveloped particles) und Dense Bodies (DBs). NIEPs setzen sich aus

denselben viralen Proteinen wie infektiöse Partikel zusammen und verfügen

ebenfalls über ein Kapsid, welches jedoch kein elektonendichtes, virales Genom

enthält. Somit können sie elektronenmikroskopisch von Virionen unterschieden

werden [Mocarski et al., 2001]. Bei den DBs handelt es sich um nicht

replikationsfähige, fusionskompetente, umhüllte Partikel, die zu ca. 60% (ca. 15%

bei Virionen) aus dem Tegumentprotein pp65 (ppUL83) bestehen. Der Anteil

anderer Proteine, wie z. B. ppUL32, ppUL82, pUL48, pUL80, pUL86 nimmt um

Faktor 5-10 ab [Varnum et al., 2004]. Die zahlenmäßigen Verhältnisse der drei

Abb. 1: Struktur eines HCMV Virions [Reddehase 2006]

Einleitung 3

Partikeltypen in Zellkultur sind abhängig vom verwendeten Virusstamm und von

der eingesetzten MOI (multiplicity of infection).

Das HCMV verfügt über ein lineares, doppelsträngiges DNA-Genom einer Größe

von zirka 235.000 Basenpaaren und gehört somit zu den humanpathogenen Viren

mit der höchsten Kodierungskapazität. Das Genom enthält mehr als 200 offene

Leserahmen (ORFs). Von vielen der ORFs konnte bisher noch nicht gezeigt

werden, dass sie tatsächlich für virale Proteine kodieren. Eine hohe Konservierung

in fünf sequenzierten, klinischen Isolaten gilt aber als deutlicher Hinweis darauf

[Dolan et al., 2004, Murphy et al., 2003].

1.1.3 Replikationszyklus

Durch ihre Oberflächenproteine adsorbieren Herpesviren an bestimmte Strukturen

der Zelloberfläche. Seit geraumer Zeit ist bekannt, dass HCMV über eine

Interaktion von Virionen mit Heparansulfat Proteoglykanen auf der Zelloberfläche

die Infektion initiiert [Compton et al., 1993]. Außerdem gibt es Hinweise darauf,

dass das Virus über das virale Glykoprotein gB (pUL55) an den zellulären EGF-

Rezeptor bindet [Wang et al., 2003]. Ebenso konnte eine Beteiligung von

Integrinen am Eintritt des Virus in die Zelle gezeigt werden [Feire et al., 2004].

Nach der Bindung des Viruspartikels an die Zelloberfläche kommt es zur Fusion

des Virus mit der Zelle. Hierbei wird das Nukleokapsid ins Zytoplasma der Zelle

freigesetzt. Die Kapside lagern sich an Mikrotubuli an und werden zu den

Kernporen transportiert, durch die das Genom in das Nukleoplasma gelangt

[Dolan et al., 2004, Murphy et al., 2003].

Nach der Infektion werden die viralen ORFs in einer organisierten und regulierten

Kaskade exprimiert. Man unterscheidet wie bei allen Herpesviren drei operational

definierte Replikationsphasen: Die sehr frühe (immediate early, IE) Phase, die

frühe (early, E) Phase und die späte (late, L) Phase [Honess et al., 1975, Stinski

1978]. In der IE-Phase kommt es bereits nach wenigen Stunden zur Expression

hauptsächlich regulatorischer Proteine wie z.B. des IE2-Proteins, dem wohl die

größte Bedeutung zukommt, da es essentiell für die Expression der frühen Gene

ist [Marchini et al., 2001, White et al., 2004]. Die Genprodukte aus der nun

folgenden frühen Phase haben unterschiedlichste Funktionen und sind

beispielsweise an der Replikation des viralen Genoms beteiligt (DNA-Polymerase

pUL54 und Proteinkinase pUL97). Gene der L-Phase kodieren überwiegend für

Einleitung 4

Strukturproteine, welche das Kapsid oder das Tegument bilden oder als

Glcoproteine in die Virushülle integriert werden.

Der gesamte Replikationszyklus läuft wie schon unter 1.1.1 erwähnt

vergleichsweise langsam ab und dauert zwischen 48 und 72 Stunden bis die

neuen, reifen Viruspartikel freigesetzt werden. Hierbei fusioniert das mit DNA

beladene virale Kapsid mit dem Zellkern und wird anschließend im Zytoplasma

tegumentiert. Die Umhüllung des tegumentierten Kapids findet bei der Knospung

in das Transgolgi-Netzwerk statt. Das Vesikel, welches nun das umhüllte Partikel

enthält, wird zur Plasmamembran transportiert, wo Vesikel und Membran unter

Freisetzung der Viruspartikel fusionieren [Mettenleiter 2004].

Alternativ zur Infektion von Zellen, bei der freie Viruspartikel mit Bestandteilen der

Zelloberfläche interagieren, können HCMV auch in Zellen gelangen, welche nicht

über diese Bestandteile verfügen. Die Kapside können durch Verschmelzen der

Membranen von infizierter zu nichtinfizierter Zelle weitergegeben werden. Man

spricht hier von einer Übertragung von Zelle zu Zelle (cell to cell spread) [Silva et

al., 2005].

1.1.4 Medizinische Relevanz

Seit fast einem Jahrhundert werden klinische Erkrankungen mit HCMV-Infektionen

in Verbindung gebracht. Zunächst wurde in der Literatur eine klinische Relevanz

des Virus bei prä- oder perinatalen Infektionen beschrieben. Diese können zu

ernsthaften Schädigungen von Embryonen oder Neugeborenen führen. Nach der

Einführung von Gewebe- und Organtransplantationen wurden die Mediziner

darauf aufmerksam, dass HCMV das am häufigsten vorkommende

opportunistische Pathogen bei immunsupprimierten Patienten darstellt [Ho 1991,

Rubin 2001]. Die klinische Manifestation einer HCMV-Infektion variiert hierbei in

Abhängigkeit von der zugrundeliegenden Erkrankung und vom Grad der

Immunsuppression, wie z. B. das Auftreten von Retinitis und Gastroenteritis bei

AIDS-Patienten oder einer Pneumonie bei Knochenmarktransplantierten. Die

Beteiligung von HCMV als Risikofaktor bei Vaskulopathien und Atherosklerose

wird gegenwärtig diskutiert. Es wird angenommen, dass eine veränderte

Migrationsfähigkeit infizierter vaskulärer Zellen pathogene Veränderungen der

Gefäßwand verstärken [Reinhardt et al., 2002, Streblow et al., 2001].

Einleitung 5

Das Virus kann über Speichel, Muttermilch oder Urin, aber auch Cervixsekret und

Sperma infizierter Personen ausgeschieden werden. Letztere machen den

Sexualverkehr zu einem wichtigen Übertragungsweg [Pass 2001]. Eine

Weitergabe ist auch durch Organtransplantation möglich.

Je nach sozioökonomischem Status kann die Serumprävalenz Jugendlicher bei

40-90% liegen. In der Regel laufen Primärinfektionen bei Immungesunden

inapparent ab; nur in ca. 5% der Fälle kommt es zu mononukleoseähnlichen

Beschwerden. Bei der intrauterinen Übertragung kommt es abhängig von

Hygienestandards und Durchseuchungsgrad der entsprechenden

Bevölkerungsgruppe in bis zu 0,1% aller Fälle zur Geburt von geschädigten

Kindern.

1.2 Tegument

Das Tegument ist eine zwischen Hüllmembran und Kapsid gelegene Schicht, die

aus mehr als 20 verschiedenen Proteinen [Gibson 1996]. Noch vor kurzem ging

man davon aus, dass das Tegument eine willkürliche Ansammlung viraler Proteine

sei. Die Struktur des HCMV-Teguments ist im Vergleich zu HSV1 und

Pseudorabies Virus (PrV) noch weitgehend unbekannt. Inzwischen zeigte sich die

Bedeutung dieser Struktur für die virale Replikation und als Aktivatoren viraler

Promotoren [Liu et al., 1992, Romanowski et al., 1997]. Es konnten außerdem

mehrere Tegumentprotein-Komplexe identifiziert werden [Bechtel et al., 2002,

Schierling et al., 2004], was darauf hinweist, dass es sich um eine gut organisierte

und strukturierte Schicht handelt. Die Hauptbestandteile des Teguments in reifen

Viruspartikeln bilden ppUL83 (pp65), ppUL32 (pp150) und ppUL82 (pp71)

[Varnum et al., 2004]. Letzteres wurde als erster Partikelbestandteil mit

transaktivierender Wirkung beschrieben [Liu et al., 1992]. Neben weiteren

transaktivierenden Tegumentproteinen wie ppUL35 und pUL69 wird es mit dem

Virion in die infizierte Zelle aufgenommen und in den Kern transportiert [Baldick,

Jr. et al., 1997, Liu et al., 2002, Winkler et al., 1996].

Durch die Charakterisierung von HCMV-Deletionsmutanten wurde gezeigt, dass

die Gene UL35, UL69 und UL82, zum Teil MOI-abhängig, sehr wichtig für die

Vermehrung des Virus sind [Bresnahan et al., 2000, Dunn et al., 2003, Hayashi et

al., 2000, Schierling et al., 2005]. Für das in HCMV essentielle ppUL32 [Dunn et

Einleitung 6

al., 2003] konnte gezeigt werden, dass es mit seinem Aminoterminus an Kapside

bindet [Baxter et al., 2001]. Weiterhin konnte dieses Protein in unserem Labor

mittels Yeast Two-Hybrid Analyse als Interaktor von pUL24 identifiziert werden.

1.3 US22 Genfamilie

Die US22 Genfamilie wurde zuerst bei HCMV beschrieben [Chee et al., 1990] und

beinhaltet 12 Mitglieder [Ménard et al., 2003], u.a. pUL24, die alle über

mindestens eins von vier konservierten Aminosäuresequenzmotiven verfügen

[Efstathiou et al., 1988, Kouzarides et al., 1988]. Bei den bisher untersuchten

Genprodukten handelte es sich überwiegend um Tegumentproteine [Adair et al.,

2002, Varnum et al., 2004]. Andere beta-Herpesviren kodieren für eine jeweils

identische Anzahl an US22 Genprodukten, was auf eine bedeutende Rolle dieser

Genfamilie für den Replikationszyklus der Viren hindeutet [Gompels et al., 1995,

Nicholas 1996, Megaw et al., 1998, Rawlinson et al., 1996, Vink et al., 2000, Bahr

et al., 2001].

Die Mitglieder der US22 Genfamilie haben unterschiedlichste Funktionen. HCMV

pUL36, pIRS1 und pTRS1 fungieren beispielsweise als transkriptionelle

Transaktivatoren des HCMV-Haupt-IE-Promotors [Colberg-Poley et al., 1992,

Stasiak et al., 1992]. In HHV6 bewirkten U16 und U3, die Homologe zu UL36 und

UL24, in transienten Transfektionsstudien eine Transaktivierung des HIV-1 LTR

[Geng et al., 1992, Mori et al., 1998]. pUL36 wurde zusätzlich eine

antiapoptotische Wirkung nachgewiesen [Skaletskaya et al., 2001]. Für MCMV

m139, m140 und m141 wurde gezeigt, dass sie für das Viruswachstum in

Makrophagen in vivo [Hanson et al., 2001] und in vitro [Ménard et al., 2003] von

großer Bedeutung sind. Bisher konnte keinem HCMV-kodierten Mitglied der US22

Genfamilie eine Beteiligung am Zelltropismus des Virus nachgewiesen werden.

1.4 Endothelzelltropismus des HCMV

Es wird angenommen, dass die Verbreitung des HCMV über den Blutstrom eine

wichtige Rolle bei der vertikalen Übertragung von der Mutter zum Kind und bei der

Organmanifestation im Verlauf einer akuten systemischen Infektion

immunsupprimierter Patienten spielt. Neben polymorphnukleären und

Einleitung 7

mononukleären Leukozyten wurden vaskuläre Endothelzellen (EC) als Zielzellen

des Virus in vivo identifiziert, die an der Ausbreitung von HCMV über den

Blutkreislauf beteiligt sein könnten [Sinzger et al., 1995]. Im Verlauf einer akuten

HCMV-Infektion kann sich das Virus im gesamten Organismus verbreiten und

anschließend praktisch jedes Organ infizieren [Bissinger et al., 2002]. Infizierte

Endothelzellen wurden hierbei in verschiedensten Geweben nachgewiesen.

Offensichtlich können sich ECs von der Gefäßwand ablösen und in den Blutstrom

eintreten, wo sie als zirkulierende, zytomegalische, infizierte Zellen nachgewiesen

werden konnten [Grefte et al., 1993].

Man unterscheidet zwischen schwach und hochgradig endotheliotropen

Virusstämmen. Bei ersten erfolgreichen Infektionen von human umbilical vein

endothelial cells (HUVECs) mit HCMV wurde deutlich, dass patientennahe

Virusisolate diesen Zelltyp effizienter infizieren als Laborstämme wie z.B. AD169

oder Towne [Ho et al., 1984], deren Infektionsrate unter normalen Bedingungen

auf wenige Prozent begrenzt ist. HCMV-Stämme, die direkt nach ihrer Isolierung

auf ECs propagiert wurden, wie z.B. TB40/E oder VHL/E [Sinzger et al., 1999],

werden als hochgradig endotheliotrop bezeichnet. Die schwach endotheliotropen

Isolate haben anscheinend bereits einen Defekt bei oder nach der Aufnahme der

Partikel. Die gegenwärtige Hypothese lautet, dass der Transport der viralen

Nukleokapside und damit auch des viralen Erbgutes zum Zellkern beeinträchtigt

ist, wodurch eine produktive Infektion unterbunden wird [Sinzger et al., 1999]. Auf

molekularer Ebene konnte bisher die Region UL128-131 als Determinante für EC-

Tropismus identifiziert werden. Jedes der Gene dieses Lokus ist per se notwendig

für ein effizientes Viruswachstum in EC [Hahn et al., 2004]. Im besonderen

zellkulturadaptierte Stämme besitzen Mutationen in den ORFs UL128, UL130 und

UL131A [Dolan et al., 2004].

Einleitung 8

1.5 Ziel der Arbeit

Die gegenwärtig zur Behandlung des Humanen Zytomegalievirus verwendeten

Medikamente wie Ganciclovir/Valganciclovir, Cidofovir, Foscarnet und das

Antisense-Oligonukleotid Fomivirsen haben mit Ausnahme des Letztgenannten

alle die virale DNA-Polymerase als Ziel. Berichte von immer häufigerem Auftreten

klinisch relevanter, resistenter HCMV zeigen, dass dringend neue Substanzen und

Mechanismen zur erfolgreichen Behandlung infizierter Personen identifiziert

werden müssen. Hier könnten Medikamente, die andere virale Proteine oder

deren Interaktionen blockieren einen neuen Ansatz darstellen. Die in

vorangegangenen Arbeiten identifizierte Interaktion der viralen Tegumentproteine

ppUL32 und pUL24 sollte dazu näher charakterisiert werden.

Die Fähigkeit zur Infektion von Endothel- und Epithelzellen durch das HCMV ist im

Hinblick auf die Pathogenität des Virus von großer Bedeutung. Endothelzellen sind

als Schnittstelle zwischen Organgewebe und Blutkreislauf von großer,

strategischer Bedeutung. Sie ermöglichen eine Ausbreitung des Pathogens im

gesamten Wirtsorganismus.

Epithelzellen sind hoch empfänglich für HCMV und bereits vor Jahrzehnten konnte

Virus aus den Speicheldrüsen infizierter Personen isoliert werden. Auch im

Epithelgewebe der Lunge, des Gastrointestinal- und des Urogenitaltraktes konnte

virale Repilikation nachgewiesen werden. Daher wird Epithelzellen eine wichtige

Rolle als Eintrittspforte und für die Verbreitung des Virus zugeschrieben. Für

HCMV ist bisher die Genregion UL128-131 als eine Determinante für Endothelzell-

und vor kurzem auch für Epithelzelltropismus identifiziert worden. Die

Identifizierung neuer Tropismusdeterminanten und das Wissen um deren

Wirkungsweise bringt somit die Möglichkeit mit sich, die Pathogenität des Virus zu

manipulieren. Mitgliedern der US22-Genfamilie konnte bisher nur in MCMV eine

Rolle am Zelltropismus des Virus bescheinigt werden.

Die Herstellung verschiedener Virusmutanten und nachfolgende

Infektionsexperimente mit unterschiedlichen Zelltypen sollten durchgeführt

werden, um eine mögliche Beteiligung von pUL24 am Zelltropismus von HCMV zu

untersuchen.

Material und Methoden 9

2 Material und Methoden

2.1 Biologisches Material

2.1.1 Bakterien

Escherichia coli DH10B: E. coli K12 F- araD139 Δ(ara, leu)7697 ΔlacX74 galU

galK rpsL deoR φ80dlacZΔM15 endA1 nupG recA1 mcrA Δ(mrr hsdRMS mcrBC)

[Grant et al., 1990]

2.1.2 Zellen

HFF primäre humane Vorhautfibroblasten [Chang et al., 2002]

HUVEC primäre humane Endothelzellen der Nabelschnurvene

HeLa Zervixkarzinom Epithelzellen [Nelson-Rees et al., 1976]

SK-N-SH humane Neuroblastomazelllinie [Biedler et al., 1973]

293T humane embryonale Nierenzelllinie, welche das SV40 T-Antigen

exprimiert [DuBridge et al., 1987]

Phoenix Amphotrope Verpackungszelllinie zur Herstellung rekombinanter

MLV-Retroviren [Pear et al., 1993]

U373MG humane Glioblastoma/Astrozytoma Zelllinie [Ponten et al., 1968]

RPE1 Retina Pigment Epithelzellen [Bodnar et al., 1998]

2.1.3 Viren

HCMV AD169 Ein attenuierter Laborstamm, der ursprünglich von

[ROWE et al., 1956] isoliert wurde.

TB40E Patientennaher Virusstamm [Sinzger et al., 2000]

RVTB4-BAC Rekombinantes Virus aus TB4-BAC

RV TB4delUL24-BAC Rekombinantes Virus aus TB4delUL24-BAC

RV TB4repUL24-BAC Rekombinantes Virus aus TB4repUL24-BAC

RV TB4mutUL24-1.ATG Rekombinantes Virus aus TB4mutUL24-1.ATG

RV TB4mutUL24-2.ATG Rekombinantes Virus aus TB4mutUL24-2.ATG

RV TB4mutUL24-1.+2.ATG Rekombinantes Virus aus TB4mutUL24-1.+2.ATG

RVRetro-GFP Rekombinantes Virus aus p617-neo-T-EGFP-tTA3


RVRetro-UL24 Rekombinantes Virus aus pMLV-Retro-tTA3-DEST

Myc-UL24

2.1.4 Antikörper

2.1.4.1 Seren

αUL35 Antiserum: eingesetzt in 1:200 (Immunfluoreszenz) bzw. 1:5000 (Western

Blot) Verdünnungen [Liu et al., 2002]

αUL69 Antiserum: eingesetzt in 1:2000 (Immunfluoreszenz) bzw. 1:5000 (Western

Blot) Verdünnungen [Winkler et al., 1994]

αIE1/2 Antiserum: eingesetzt im Western Blot in einer 1:2000 Verdünnung [Gebert

et al., 1997]

αUL24 Antiserum: eingesetzt in einer 1:50 Verdünnung (Immunfluoreszenz, Ko-

Immunpräzipitation) [R. Pretsch, nicht publiziert]

2.1.4.2 monoklonale Antikörper

Zellkulturüberstände: unverdünnt eingesetzt

69-66 monoklonaler Antikörper aus Maus gegen pUL69 [W. Britt, nicht

publiziert]

CMV 355 monoklonaler Antikörper aus Maus gegen ppUL82 [Nowak et al.,

1984]

12CA5 monoklonaler Antikörper aus Maus gegen HA-tag [Niman et al.,

1983]

9E10 monoklonaler Antikörper aus Maus gegen Myc-tag [Evan et al., 1985]

63-27 monoklonaler Antikörper aus Maus gegen IE1 [Plachter et al., 1993]

aUL24 monoklonaler Antikörper aus Maus gegen UL24 [Adair et al., 2002]

XP-1 monoklonaler Antikörper aus Maus gegen pp150, 1:2000 verdünnt im

Western Blot eingesetzt [Scholl et al., 1998]

αUL25 monoklonaler Antikörper aus Maus (Ascites) 1:200 (Western Blot)

[Battista et al., 1999]


2.1.4.3 kommerzielle Antikörper

I.E.A. [clone E13] monoklonaler Antikörper aus Maus gegen HCMV-immediate

early antigen [Argene, Vailhes, Frankreich]

AAC10 monoklonaler Antikörper aus Maus gegen das HCMV late-

Protein ppUL83 [DAKO, Glostrup, Dänemark]

CCH2 monoklonaler Antikörper aus Maus gegen das HCMV early-

Protein pUL44 [DAKO, Glostrup, Dänemark]

Vimentin monoklonaler Antikörper aus Maus gegen Vimentin (Ab-1)

[Oncogene, Boston]

2.1.4.4 Sekundäre Antikörper

Ziege-anti-Maus, Cy3-gekoppelt, polyklonal Dianova, Hamburg

Ziege-anti-Kaninchen, Cy3-gekoppelt, polyklonal Dianova, Hamburg

Ziege-anti-Maus, Alexa 488-gekoppelt, polyklonal Invitrogen, Karlsruhe

Ziege-anti-Kaninchen, Alexa 488-gekoppelt, polyklonal Invitrogen, Karlsruhe

Ziege-anti-Maus, HRP-gekoppelt, polyklonal Pierce, Rockford, IL, USA

Ziege-anti-Kaninchen, HRP-gekoppelt, polyklonal Pierce, Rockford, IL, USA

2.2 Radiochemikalien

[α32P]dCTP 10 mCi/ml Amersham, Braunschweig

2.3 Nukleinsäuren

2.3.1 Oligonukloetide

Die Oligonukleotide wurden von MWG Biotech (Ebersberg), Sigma-ARK

(Darmstadt) und biomers.net (Ulm) bezogen.

UL24rt5’ CGGGAACGGAACTGCGTCTA

UL24rt3’ TGCTGACGTCCTTTGGGGCA

Aktin4 AGCCATGTACGTAGCCATCCAGGCT

Aktin5 GGATGTCAACGTCACACTTCATGATGG


UL25 5’myc Eco TATGAATTCCACCATGGAACAGAAACTCATCTCTGAAGA-

GGATCTGATGTCGTCGCGGCGTCGCAG

IE2 5’ CAACACCAATCGCTCTCTTG

IE2 3’ CGCATCCACCTCACTCTTC

UL24 5’RACE ip CGAATTCTGCGCACGTAAGCTTCCAGACAGCCCAG

UL24 5’RACE op ATCTCCTGCAGCACTAGGTT

UL25 5’RACE ip CGCGGTACCCGTTTCTTTTCGCTCGGTTTCTTGGC

UL25 5’RACE op TTCTGCTACTGTTACTGGTGGTGCGA

UL23 5’RACE ip GCTCGAGAAAGTTGTAGGTGCAGATGCTGCCGACG

UL23 5’RACE op AATTCAGTGATGCTCTCGGC

UL24-5’ CGCGGATCCTACATGGAGGAGACCCGG

UL24-3’OK GCGAATTCAACGGTGCTGACGTCC

UL24-3’-KO GTCGGTGTTTTATGCCCCAAGCAGCGTCGTCGTCACTC-

GTGGCGTCACAGACAAGGACGACGACGACAAGTAA

UL24-5’-KO CGACATCCTCTCGTCTGCTGAGGTGCGTTCGGCTCAGT-

TGCTTACCTGCACGTCGTGGAATGCCTTCGAATTC

UL24-rev CATCCTCTCGTCTGCTGAGGTGCGTTCGGCTCAGTTGC-

TTACCTGCATACATGGAGGAGACCCGGGCGGG

UL24-rev-dATG CATCCTCTCGTCTGCTGAGGTGCGTTCGGCTCAGTTGC-

TTACCTGCATACGCGTAGGAGACCCGGGCGGGACGTT

UL24del-3’ GCGAGTCAAACGGGAAGTAG

UL24del-5’ AAATCACCGTCGAGGGTTCG

UL24-M59A ACTGACTCGGCGCGTCACGCGTCAGATCTGGCTAGCCT-

GGCG

Myc-UL24-5' ATAGAATTCCACCATGGAACAGAAACTCATCTCTGAAGA-

GGATCTGATGGAGGAGACCCGGGCGGG

UL24-3’-XhoI ATACTCGAGTCAACGGTGCTGACGTCCTTTGG


2.3.2 Plasmide

pBlueKan: Von pBluescript KS II abgeleiteter Klonierungsvektor, bei dem die

Ampizillinresistenz durch das Resistenzgen für Kanamycin ersetzt wurde

[Schierling et al., 2005].

pCDNA3: Eukaryoter Expressionsvektor mit CMV-Promotor, Apr und Neor

(Invitrogen GmbH, Karlsruhe).

pENTR1a: Klonierungsvektor, codiert für ccdB (negativer Selektionsmarker), Knr

(Invitrogen GmbH, Karlsruhe)

pIRES2-EGFP: Eukaryoter Expressionsvektor, bei dem EGFP über eine IRES

koexprimiert wird, Knr [Invitrogen GmbH, Karlsruhe]

pFastBac-CMV: Transfervektor zur Herstellung rekombinanter Baculoviren, Apr,

Gmr [GIBCO, BRL]

pBabepuro: Vektor für retroviralen Gentransfer, Puromycinr [Morgenstern et al.,

1990]

pLNCX2: Vektor für retroviralen Gentransfer, Apr, Neor [Clontech]

pHM287: Luziferase-Reporterkonstrukt mit dem HCMV IE1/2 Enhancer (-1228 bis

+53) [Winkler et al., 1996]

pCB6: Eukaryoter Expressionsvektor mit CMV-Promotor, Apr und Neor [Brewer

1994] pp150-CB6: eukaryotes Expressionsplasmid; enthält den UL32-ORF unter

Kontrolle des HCMV IE1/2 Enhancer/Promotors [B. Plachter, Mainz]

pCDNA3-IE2: Eukaryotes Expressionsplasmid, das für IE2 kodiert [Schierling et

al., 2004]

pCDNA-UL69: Eukaryotes Expressionsplasmid, das für UL69 kodiert [Schierling

et al., 2004]

pSL-FRT: Trägt Knr flankiert von minimalen FRT-Sequenzen [Wagner et al., 1999]

pKD46: Ein low copy Plasmid mit Apr und temperatursensitivem Ori (30°C);

Enthält γ- β- und exo-Gene des Red Recombinase-System [Datsenko et al., 2000].

pCP20: Enthält den Leserahmen für die pSC-FLP-Rekombinase, repliziert und

induziert die FLP-Synthese temperaturabhängig (30°C) [Cherepanov et al., 1995].

pBRep-cre: Codiert für die Cre-Rekombinase [Hobom et al., 2000]

pCM1015: Cosmid; enthält das HindIII-Fragment des HCMV-AD169, welches die

Leserahmen UL11 bis UL37 umfasst [Fleckenstein et al., 1982].


pBK-UL24- full: Enthält den Leserahmen UL24 des HCMV-AD169, jedoch ohne

Start- und Stopcodon [R. Pretsch, Diplomarbeit] .

pcDNA3-Myc-N-UL24: Enthält den UL24-Leserahmen aus pBK-UL24-full, der

nach EcoRI/BamHI-Verdau in pcDNA3-Myc-N ligiert wurde.

pCMV71: Enthält den Leserahmen HCMV Towne UL82 [Liu et al., 1992]

pSL-FRT-TB4-mycUL24: Trägt mycUL24 und Knr flankiert von minimalen FRT-

Sequenzen

pSL-FRT-TB4-mycUL24 mut 2.ATG: Über Sawano-Mutagenese unter

Verwendung des Primers UL24-M59A aus pSL-FRT-TB4-mycUL24 hergestellt.

pTST101: Prokaryotes Expressionsplasmid; enthält ein Fusionsgen aus EGFP

und Maltose Bindeprotein (MBP) [G. Muth, Tübingen]. pTST-UL24: Der UL24-ORF wurde über BamHI/HindIII in pTST101 kloniert.

p617-neo-T-EGFP-tTA3 [Kühnel et al., 2004]

pMLV-Retro-tTA3-DEST: EGFP in p617-neo-T-EGFP-tTA3 wurde durch

pBabepuro Myc-UL24 TB1 : Primer UL24 5' mit Myc-Tag und UL24-3'OK EcoRI

aus TB1-BAC DNA amplifiziert, mit EcoRI gespalten und in die EcoRI-Schnittstelle

von pBabepuro ligiert.

pENTR-mycUL24-TB1: Das Myc-UL24-TB1-EcoRI Fragment aus pBabepuro

Myc-UL24 TB1 wurde über EcoRI in pENTR1a einkloniert. pMLV-Retro-tTA3-DEST Myc-UL24: Myc-UL24 aus pENTR-mycUL24-TB1 wurde

über die Gateway-Klonierungstechnik in pMLV-Retro-tTA3-DEST gesetzt

pFastBac-CMV Myc-UL24 TB4: pIRES2-EGFP Myc-UL24: Myc-UL24 wurde aus pFastBac-CMV Myc-UL24 TB4

über EcoRI in pIRES2-EGFP kloniert.

pLNCX2 Myc-UL24: Myc-UL24 wurde aus pIRES2-EGFP Myc-UL24 über EcoRI

in pLNCX2 kloniert.

HIV luc: HIV1 LTR Luziferase-Konstrukt [Winkler et al., 1994] SV40 luc: SV40 enhancer/promoter Luziferase-Konstrukt [Christian Aepinus]


2.3.3 BACs

TB4wtBAC [Hahn et al., 2003]

TB4delUL24 Mittels recET-abhängiger Rekombination wurde UL24 aus

TB4-BAC deletiert.

TB4repUL24 Der UL24 ORF wurde durch Rekombination in die

Deletionsmutante wieder hergestellt.

TB4mut1.ATG Der UL24 ORF wurde durch einen mutierten ORF ersetzt.

TB4mut2.ATG Der UL24 ORF wurde durch einen mutierten ORF ersetzt.

TB4mut1.+2.ATG Der UL24 ORF wurde durch einen mutierten ORF ersetzt.

2.3.4 Sonstige Nukleinsäuren

Größenstandard GeneRuler 1 kB DNA ladder (Fermentas, St. Leon-Rot)

2.4 Enzyme

Die verwendeten Restriktionsenzyme wurden von MBI Fermentas (St.Leon-Rot)

und New England Biolabs (Schwalbach) bezogen.

Das Expand High Fidelity System stammt von der Firma Roche (Mannheim),

Klenow-Fragment wurde von MBI-Fermentas (St.Leon-Rot) bezogen. RNaseA und

Proteinase K stammen von Roche (Mannheim), Mungbean Exonuclease, T4-DNA-

Ligase und T4 Polynukleotidkinase wurden von New England Biolabs

(Schwalbach) bezogen.

2.5 Standardlösungen und Puffer

Alle Medien und Lösungen wurden, soweit nicht anders beschrieben, mit bidest

H2O hergestellt.

Denaturierungslösung für Southern Blot: 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH

Transferpuffer für Southern Blot: 1,5 M NaCl, 0,25 M NaOH

20x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M Trinatriumcitrat pH 7.0

50x Denhardt: 1 g Ficoll, 1 g Polyvinylpyrrolidon, 1 g BSA, ad 100 ml bidest H2O,

sterilfiltriert.


Prä-/hybridisierungslösung für Southern Blot: 50 % Formamid, 5xSSC, 1x

Denhardt, 0,05 M Phosphat, Hefe-RNA ca. 50 mg

10% APS-Lösung: 1 g APS in 8 ml bidest H2O gelöst, ad 10ml bidest H2O.

1x Laemmlipuffer: 2 M Glycin, 0,25 M Tris/HCl (pH 8,5), 0,5 % SDS (v/v)

5x SDS-Probenpuffer: 200 mM Tris, 5 mM EDTA, 1 M Sucrose, 0,1 %

Bromphenolblau (w/v) ,1 mM DTT, pH 8,8 mit HCl eingestellt.

Coomassie-Färbelösung: 2,5 g Coomassie Brilliant Blue R-250, 450 ml Methanol,

100 ml Eisessig, ad 1 l bidest H2O.

Coomassie-Entfärbelösung: 450 ml Methanol, 100 ml Essigsäure 99,9%, ad 1 l

bidest H2O

Transferpuffer für Westernblots: 25 mM Tris, 0,1 % SDS (v/v), 1,5 % Glycin (v/v),

20 % Methanol (v/v), pH 8,3 mit HCl eingestellt.

Ponceau S-Färbelösung: 0,5% Ponceau S (w/v), 1% Trichloressigsäure (v/v)

Blockierungslösung für Western Blot: 1x PBS, 5% Milchpulver (MP) (w/v)

Waschlösung für Western Blot: 1x PBS, 1% MP (w/v), 0,1% NP40 (v/v)

1x PBS (phosphat-buffered saline): 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 2,68 g Na2HPO4-7H2O,

0,24 g KH2PO4, mit HCl auf pH 7,4 eingestellt, ad 1 l bidest H2O, autoklaviert.

0,01 M PBS: 150 mM NaCl, 1 mM KH2PO4, mit NaOH auf pH 7,8 eingestellt.

0,01 M PBS / EDTA: 0,01 M PBS, 1% EDTA Stammlösung (v/v)

0,01 M PBS / BSA: 0,01 M PBS, 1% BSA (v/v)

40xTAE Agarosegelelektrophoresepuffer: 1,6 M Tris, 1,6 M NaAcetat x 3 H2O,

0,04 M EDTA x 2H2O, pH 7,2 mit Eisessig eingestellt.

10x Agarosegel-Probenpuffer: 50 mM Tris (pH 7,6), 60 % Glycerol (v/v), 0,25 %

Bromphenolblau (w/v), 0,25 % Xylencyanol (w/v)

Puffer 1-3 für modifizierte Alkali-Lyse:

Puffer 1: 50 mM Glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris/HCl pH 8,0

Puffer 2: 0,2 M NaOH, 1 % SDS (v/v)

Puffer 3: 3 M K-Acetat pH 4,8

2x BES (N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid): 50mM BES, 280

mM NaCl, 1,5mM Na2HPO4, pH 6,95

10x PCR-Puffer: 100 mM Tris pH 9,0, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2

LB-Medium: 10 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt, 8 g NaCl, pH 7,5 mit NaOH

eingestellt., ad 1 l bidest H2O, autoklaviert. LB-Agarplatten enthielten zusätzlich

1,5 % Agar (w/v) und die entsprechenden Antibiotika.


MEM und DMEM-komplett: 500 ml MEM oder DMEM (Gibco BRL, Eggenstein)

wurden jeweils mit, 10 % FCS (v/v), 1% Penicillin/Streptomycin (v/v), 1% Glutamin

(v/v), 1% nicht-essentielle Aminosäuremix.

Sucrose-Phosphatpuffer: 74,62 g Sucrose, 1,218 g K2HPO4, 0,52 g KH2PO4, ad 1 l

bidest H2O, autoklaviert.

KoIP-Lysepuffer: 50 mM Tris/HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5 % NP-

40, 1x Protease Inhibitormix (Roche, Mannheim, Germany)

2 x Lysispuffer für Luziferase-Assays: 62,5 ml 100 mM Tris / H3PO4, 0,5 ml 1M

DTT, 2,5 ml Triton X-100, 0,1732 g CDTA und 25 ml Glycerol mischen, pH 7,8 mit

NaOH einstellen; H2O ad 125 ml.

Reaktionspuffer für Luziferase-Assay: 100 mM Kaliumphosphat pH 7,8, 15 mM

MgSO4, 5 mM ATP

Substratpuffer für Luziferase-Assay: Reaktionspuffer plus 1 mM D-Luziferin,

(Roche, Mannheim)

2x HBS: 8,2 g NaCl, 5,95 g Hepes, 105 mg Na2HPO4•2 H2O, 1 g Dextrose

(Glucose), 370 mg KCl, H2O ad 450 ml, pH 7,05, H2O ad 500 ml.

MBP-Elutionspuffer: 20 mM Maltose

MBP-Waschpuffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) , 0.2 M NaCl ,1 mM EDTA

2.6 Molekularbiologische Standardmethoden

Folgende Methoden gelten als Standardmethoden und werden daher im

Methodenteil dieser Arbeit nicht genauer beschrieben:

• Kleine Plasmidpräparation [Zagursky et al., 1985]

• Ethanol-Präzipitation von Nukleinsäuren

• Phenol-Chloroform-Extraktion

• Bestimmung von DNA-Konzentrationen mit dem Photometer

• Restriktionsspaltungen

• Ligationen

• Dephosphorylierungsreaktionen mit SAP oder CIP

• Auffüllreaktion mit Klenowfragment oder Mung-bean Nuklease für

Klonierungen mit glatten Enden

• Agaroregelelektrophorese [Sambrook et al., 1989]


2.7 Reagenzsysteme

- große Plasmidpräparation mit dem Jetstar Plasmid Maxi Kit 20 (Genomed,

Bad Oyenhausen)

- große BAC-Präparation mit dem Nucleobond AX500 Maxi Kit (Marchery-

Nagel, Düren)

- nicht-radioaktive Sequenzierung von DNA wurde mit einem

Sequenziergerät 310 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer, Norwalk, USA) der

Firma ABI (Weiterstadt) durchgeführt. Der verwendete Sequenzier-Kit

(BigDye Termination Kitb 1.0) stammte von der Firma ABI.

- die Herstellung radioaktiver DNA-Sonden für Southern Blot Analysen wurde

mit Hilfe von Ready-to-go™ DNA Labeling Beads (Amersham Pharmacia,

Piscataway, NJ, USA) durchgeführt. Die Abtrennung radioaktiver

Nukleotide erfolgte über Sephadex G50 Fine Quick Spin™ Säulen (Roche,

Mannheim).

- die Aufreinigung von PCR-Produkten und DNA-Fragmenten nach

Restriktionsspaltungen erfolgte mittels GFX PCR DANN and Gel Band

Purification Kit (Amersham Biosciences, Buckinghamshire).

- Super Signal West Dura Extended Duration Substrate (Pierce, Rockford, IL)

- Reaktionen der Reversen Transkription mit cDNA first strand synthesis Kit

(MBI Fermentas, St. Leon-Rot)

2.8 DNA Methoden

2.8.1 PCR

Polymerase Kettenreaktionen wurden nach [Mullis et al., 1986] durchgeführt.

Annealingtemperatur (X) und Elongationszeit (Y, 1 min/kB) waren

anwendungsabhängig variabel.

2.8.1.1 High Fidelity-PCR

Die PCRs zur Klonierung von HCMV ORFs wurde mit Expand High Fidelity-Taq-

DNA-Polymerase (Roche), einem Gemisch aus Taq-DNA-Polymerase und Pwo-

DNA-Polymerase, durchgeführt.


Reaktionsbedingungen:

5 min 94°C

30 s 94°C

30 s X°C

Y s 72°C

7 min 72°C

∞ 4°C

30 Zyklen

Reaktionsmix:

50ng -1 µg Template-DNA

100 pm forward primer

100 pm reverse primer

1 µl dNTPs (10 mM)

5 µl 10x Expand High Fidelity -Puffer

0,5 µl Expand High Fidelity-Taq

1,25 µl DMSO

ad 50 µl H2O

2.8.1.2 Touchdown-PCR

Diese PCR wurde zur Herstellung der Fragmente für die Klonierung der

Virusmutanten in einem Geneamp PCR System 9700 (Perkin Elmer, Norwalk,

USA) durchgeführt, wobei das gleiche Pipettierschema wie unter 2.8.1.1

verwendet worden ist. Folgende Reaktionsbedingungen wurden verwendet:

2 min 94°C

30 s 94°C

30 s 72°C

3 min 72°C

7 min 72°C

∞ 4°C

jeweils nach 2 Zyklen schrittweise Herabsetzung

der Annealingtemperatur um 1°C bis auf 61°C,

dann 12 weitereZyklen.


2.8.1.3 Kolonie-PCR

Bei der Kolonie-PCR wurde DNA direkt aus Koloniematerial amplifiziert und der

Reaktionsmix nach folgendem Schema hergestellt:

Reaktionsmix :

Eine Bakterienkolonie

10 pm 5’-Primer Reaktionsbedingungen:

5 min 94°C

30 s 94°C

30 s X°C

X s 72°C

7 min 72°C

35 Zyklen

10 pm 3’-Primer

1 µl dNTPs (20 mM)

5 µl 10x PCR-Puffer

2 µl Taq-DNA-Polymerase [Pluthero 1993]

1,25 µl DMSO

ad 50 µl H2O

2.8.2 Präparation von BAC-DNA

Bei der Isolierung von BAC-DNA wurde versucht, eine Fragmentierung der DNA

durch Scherkräfte zu vermeiden. Deshalb wurde auf kräftiges Schütteln zugunsten

von mehrmaligem Invertieren verzichtet, und alle weiteren Schritte, in denen BAC-

DNA pipettiert wurde, wurden mit abgeschnittenen Pipettenspitzen durchgeführt.

Für Mini-Präparationen wurden 5 ml Übernachtkultur 5 min bei 3500 rpm

zentrifugiert, das Pellet in 300 µl Puffer P1 (Qiagen) aufgenommen, 300 ml Puffer

P2 (Qiagen) zugegeben, 2-3mal invertiert und 4 min bei Raumtemperatur

inkubiert. Nach Zugabe von 300 µl Puffer N3 (Qiagen) ruhte der Reaktionsmix 10

min auf Eis, bevor er 5 min bei 14000 rpm und 4°C zentrifugiert wurde, um das

Zellmaterial abzutrennen. Der Überstand wurde in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß

überführt, wobei abgeschnittene Pipettenspitzen verwendet wurden, um die DNA

so wenig wie möglich Scherkräften auszusetzen. Die DNA wurde mit 600 µl

Isopropanol versetzt, 15 min bei 14000 rpm und RT gefällt, der Überstand

abgekippt und das Pellet nach Zugabe von 100 µl 70% EtOH wiederum 15 min bei

14000 rpm gewaschen. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet 10 min an der

Luft getrocknet, in 50 µl Wasser aufgenommen und für 1 h bei Raumtemperatur

gelöst.


Um eine größere Menge an BAC-DNA zu erhalten, wurden BAC-Maxi-

Präparationen mit dem Nucleobond-BAC-Maxi-Kit (Machery-Nagel) durchgeführt.

Die Präparation erfolgte nach dem von der Herstellerfirma mitgelieferten Protokoll.

2.8.3 Southern Blot - DNA-DNA-Hybridisierung [Southern 1975]

Für die Hybridisierung wurde BAC-DNA mindestens 4 h mit Restriktionsenzymen

gespalten und anschließend über Nacht bei 30 V in einem 0,6%-igen Agarosegel

aufgetrennt. Danach wurde das Gel für 20 min in 0,25 M HCl geschwenkt, was zu

DNA-Doppelstrangbrüchen führt und den Transfer der DNA erleichtert. Nachdem

das Gel mit demin H2O gespült wurde, folgte eine 30minütige Inkubation in 1,5 M

NaCl, 0,5 M NaOH. Anschließend wurde das Gel 15 min in Transferpuffer (1,5 M

NaCl, 0,25 M NaOH) equilibriert und ein Kapillarblot aufgebaut (Sambrook et al,

1989).

Der DNA-Transfer erfolgte über Nacht. Am nächsten Tag wurde die Membran kurz

in 2x SSC gewaschen und die DNA durch 2 h Inkubation bei 80°C im

Hybridisierungsofen (Robbins Scientific Corp.) kovalent an die Membran

gebunden.

2.9 Sawano-Mutagenese [Sawano et al., 2000]

Zunächst wurde das Oligonukleotid UL24-M59A in einer Kinasereaktion nach

folgendem Ansatz phosphoryliert:

Oligo 100 pmol/ul 15 ul

10 mM ATP 2 ul

10x PNK Puffer 2 ul

PNK 1 ul

Die Reaktion fand über 2 h bei 37°C statt.


Die Mutagenese des Plasmids pSL-FRT-TB4-mycUL24 selbst fand in einer

zweistufigen PCR-Reaktion statt:

Reaktionsansatz:

50 ng pSL-FRT-TB4-mycUL24

14 pmol UL24-M59A (phosphoryliert)

1,25 µl dNTP (10mM)

2,5 µl 10x Pfu Buffer

2,5 U Pfu Polymerase

2,5 µl 10x Taq Ligase Buffer

20 U Taq Ligase

Reaktionsbedingungen 1:

5 min 65°C

2 min 95°C

30s 95°C

30s 55°C 18 Zyklen

10 min 65°C

7 min 75°C

je Ansatz 1 ul (20 U) DpnI zugeben, mischen;

Reaktionsbedingungen 2:

1 h 37°C

30 s 95°C

30 s 95°C 2 Zyklen

1 min 55°C

10 min 70°C

2 µl des Reaktionsansatzes nach Ablauf beider Reaktionen wurden in kompetente

DH10B transformiert, auf Selektionsplatten inkubiert (37°C) und positive Klone

mittels Sequenzanalyse identifiziert.


2.10 redαβ-Rekombination

Die gerichtete, PCR-basierte Mutagenese eines HCMV-BAC erfolgt in der Regel

ohne Klonierung viraler Sequenzen und damit unabhängig von geeigneten

Schnittstellen innerhalb des zu modifizierenden Genoms. Mutationen bestimmter

Gene erfolgen über homologe Rekombination in E. coli mit Hilfe des redαβ-

Rekombinase-Systems des Phagen λ, welches in den Bakterien induziert werden

kann. Das zu mutierende Gen wird durch einen Selektionsmarker (Kanamycin)

ersetzt, welcher von FRT-Sequenzen flankiert wird und in einem zweiten Schritt

mit Hilfe der FLP-Rekombinase wieder aus dem BAC entfernt werden kann

[Wagner et al., 1999]. Abb. 2 stellt das Prinzip der ET-Klonierung schematisch dar.

Abb 2: SchematischeDarstellung des dreiteiligenPrinzips der RecET-Klonierungnach Wagner (1999). FRT-

Sequenzen (rote Balken),

homologe Sequenzen zwischen

Pimern und BAC (blaue und

grüne Linien) und BAC- bzw.

Plasmid–Sequenzen (schwarze

Linien) wurden dargestellt.


2.10.1 Amplifikation von PCR-Fragmenten für die redαβ-

Rekombination

Zunächst wurde mittels Touchdown-PCR (siehe 2.8.1.2) das von FRT-Sequenzen

flankierte Kanamycinresistenzgen durch die Primer UL24-3’-KO und UL24-5’-KO

aus pSL-FRT [Wagner et al., 1999] amplifiziert (Abb. 2.1). Um die UL24 TB4

Wildtypsituation wiederherzustellen, wurde die Primerkombination UL24-rev/UL24-

5’-KO und pSL-FRT-TB4-mycUL24 als Template verwendet. Für die Mutation des

ersten Startkodons wurde pSL-FRT-TB4-mycUL24 mit den Primern UL24-rev-

dATG and UL24-5’-KO amplifiziert. Zur Herstellung von BACs bei denen das

zweite oder das erste und zweite Startkodon mutiert waren, wurde pSL-FRT-TB4-

mycUL24-M59A als Matrize und die Primerpaare UL24-rev/UL24-5’-KO oder

UL24-rev-dATG/UL24-5’-KO verwendet. Die Primer wurden so gewählt, dass sie

gleichzeitig homologe Sequenzbereiche zur HCMV-AD169-Sequenz [Chee et al.,

1990] von ca. 50 bp 5‘ bzw. 3‘ von UL24 besaßen. Das entstandene PCR-Produkt

wurde aufgereinigt (PCR Purification-Kit, Qiagen, Hilden), für 1 h bei 37°C mit dem

Restriktionsenzym DpnI verdaut, um Reste der eingesetzten Template-DNA zu

entfernen (DpnI spaltet nur methylierte DNA und somit nicht das PCR-Fragment)

und nach Ethanolpräzipitation in 10 µl sterilem Wasser aufgenommen.

2.10.2 Herstellung kompetenter E. coli DH10B [TB4-BAC, pKD46]

Das Plasmid pKD46 [Datsenko et al., 2000] wurde in E. coli DH10B [TB4-BAC]

transformiert. 250 ml LB (mit 25 µg/ml Cm und 100 µg/ml Ap) wurden 1:100 mit

Vorkultur angeimpft. Nach Wachstum der Kultur bei 30°C und 200 rpm bis zu einer

OD600 von 0,1-0,15 wurde Arabinose bis zu einer Endkonzentration von 0,1%

zugegeben, um das redαβ-Rekombinasesystem zu induzieren. Nach Erreichen

einer OD600 von 0,4-0,6 wurden die Bakterien für 15 min auf Eis inkubiert, 10 min

bei 7000 rpm und 4°C zentrifugiert (Beckman J2-21, Beckman, München) und das

Pellet dreimal mit 10%iger Glycerinlösung gewaschen (10 min bei 7000 rpm, 4°C).

Nach Abkippen des Überstandes wurden die Bakterien im Restvolumen

resuspendiert, in Aliquots à 60 µl aufgeteilt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren

und bei –70°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.


2.10.3 Einbau der Resistenzkassette ins BAC-Genom

2-5 µl eines in 2.10.1 hergestellten PCR-Fragmentes wurden zu 60 µl

elektrokompetenten E. coli DH10B [TB4-BAC, pKD46] gegeben (siehe 2.10.2) und

sofort elektroporiert (2,5 kV, 200 Ω, 25 µF). Anschließend wurde 1 ml LB

dazugegeben und der Ansatz 1,5-2 h bei 37°C inkubiert. Nach kurzem

Abzentrifugieren wurden die Zellen in 150 µl LB resuspendiert, auf Platten mit 25

µg/ml Kn und 25 µg/ml Cm ausgestrichen und über Nacht bei 37°C im Brutschrank

inkubiert. Bei diesem Schritt werden Klone mit homologer Rekombination des

Amplifikats mit dem BAC (Abb. 2.2) selektioniert und pKD46 geht aufgrund seines

temperatursensitiven Replikationsorigin verloren. Die erfolgreiche Rekombination

wurde mittels Kolonie-PCR, BAC-DNA-Minipräparation mit anschließendem

Restriktionsverdau und Southern Blot-Analyse kontrolliert.

2.10.4 Entfernung der Resistenzkassette

Um die Kanamycinkassette zu entfernen, wurden Bakterien, welche das jeweilige,

mutierte BAC inklusive Kn-Resistenz enthielten mit pCP20 transformiert. Die von

dem Plasmid codierte FLP-Rekombinase schneidet die Kanamycinkassette über

die FRT-Sequenzen aus dem BAC heraus (Abb. 2.3). 1/10 des

Transformationsansatzes wurde auf LB-Agarplatten mit Chloramphenicol

(25µg/ml) und Ampicillin (100µg/ml) ausplattiert und über Nacht bei 30°C im

Brutschrank inkubiert. Es wurden fünf Kolonien gepickt, auf einer LB-Agarplatte

mit Chloramphenicol (25µg/ml) ausgestrichen und für 24 h bei 43°C inkubiert. Bei

diesem Schritt repliziert pCP20 nicht und geht deshalb verloren. 10 Kolonien von

dieser Platte wurden parallel auf Platten mit Cm, Cm und Ap oder Cm und Kn

ausgestrichen, um den Verlust der Kanamycinkassette und von pCP20 zu

überprüfen. Bakterienklone, die nur auf Cm-Platten wuchsen, wurden mittels PCR,

Restriktionsverdau, Southern Blot Analyse und Sequenzanalyse der modifizierten

Bereiche analysiert.


2.11 Ko-Immunpräzipitation

2.11.1 Ko-Immunpräzipitation aus transfizierten 293T Zellen

293T Zellen wurden in 6-Loch Zellkulturplatten bis zu einer Konfluenz von 70 %

kultiviert. In einem 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß wurden je 2 μg pro zu

transfizierendem Plasmid mit sterilem H2O auf ein Endvolumen von 225 μl

verdünnt. Dann wurden 25 μl 2,5 M CaCl2 zugegeben, die Lösungen kurz

gevortext und 250 μl 2 x HBS pH 7,12 (mit sofortigem Vortexen für ca. 10 sec)

zugegeben. Das entstandene Präzipitat wurde anschließend auf die Zellen

getropft. Die Zellen wurden über Nacht inkubiert, am nächsten Tag dreimal

vorsichtig mit warmen 0,01 M PBS gewaschen und mit frischem DMEM

überschichtet. Für die Ko-Immunpräzipitation wurden die Zellen nach weiteren 24

h geerntet. Dazu wurden sie zweimal vorsichtig mit 0,01 M PBS gewaschen und

anschließend in 1 ml 0,01 M PBS vom Plattenboden abgespült. Die Zellen wurden

5 min bei 2300 × g sedimentiert, der Überstand verworfen, das Pellet in 500 μl

Lysepuffer (50 mM Tris/HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 plus

einmal Protease-Inhibitor-Mix, Roche, Mannheim) aufgenommen und unter

mehrmaligem Vortexen für 20 min auf Eis inkubiert. Die Zelltrümmer wurden bei

16000 × g (10 min, 4 °C) abgetrennt. Vom Überstand wurden 80 μl als

Lysatkontrolle verwendet und mit 20 μl 5 x SDS-Probenpuffer 10 min bei 95 °C

denaturiert. Der restliche Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt,

mit 300 μl Lysepuffer aufgefüllt und mit dem für die Präzipitation verwendeten

Antikörper versetzt. Es wurden 100 μl Hybridomüberstand bzw. 1 μl der

polyklonalen Seren verwendet. Die Immunpräzipitation erfolgte für 1,5 h bei 4 °C

unter ständigem Mischen im Überkopf-Taumler. Anschließend wurden zu jedem

Ansatz 40 μl Protein A-Sepharose (25 mg/ml in Lysepuffer) zugegeben und

weitere 2 h inkubiert. Die Sepharose wurde sedimentiert (5 min, 2000 × g, 4 °C)

und dreimal mit Lysepuffer gewaschen. Der letzte Zentrifugationsschritt erfolgte

bei 16000 × g, der Überstand wurde komplett entfernt, das Sediment in 10 μl 2 x

SDS-Probenpuffer aufgenommen und 10 min bei 95 °C denaturiert. Die

Auftrennung der Proteine erfolgte in einer 10 %igen SDS-PAGE mit

anschließendem Nachweis der ko-präzipitierten Proteine im Western Blot.


2.11.2 Ko-Immunpräzipitation aus infizierten HFF Zellen

HFF Zellen wurden in einer 10 cm Zellkulturschale ausgesät und mit HCMV

TB40E mit einer MOI von 2 infiziert. 96 h nach Infektion wurden die Zellen

trypsiniert, sedimentiert und zweimal mit 0,01 M PBS gewaschen. Die weiteren

Schritte erfolgten wie unter 2.11.1 beschrieben, die Zelllyse erfolgte jedoch in

einem Volumen von 300 μl.

2.12 RNA ligase mediated rapid amplification of cDNA ends

Bei dieser Methode handelt es sich um eine Weiterentwicklung der herkömmlichen

RACE, die eine alleinige Amplifikation von Volllänge-mRNA erlaubt. Die

Experimente wurden mit dem FirstChoiceTM RLM RACE Kit von Ambion

durchgeführt.

5’-Race:

In einem ersten Schritt wurden 10 µg gesamtzelluläre RNA mit Kälberdarm-

Phosphatase behandelt, um freie 5’-Phospate degradierter mRNA-, rRNA-, tRNA-

oder DNA-Stücke zu entfernen (Abb. 3.1). Komplette mRNAs sind durch ihre 5’-

cap-Struktur geschützt. Die nachfolgende TAP-(tobacco acid pyrophosphatase)

Behandlung führte zur Abspaltung des 5’-caps der Volllänge-mRNA, wobei ein 5’-

Monophosphat stehen blieb (Abb. 3.2). Dieses wird für die Ligation eines

Adapteroligonukleotids benötigt (Abb. 3.3).

Über eine anschließende Reverse Transkription erhielt man cDNAs mit einem

definierten 5’-Ende (Abb. 3.4). Durch die Verwendung von genspezifischen

Primern konnten die 5’-Regionen mittels PCR und nested PCR (Abb. 3.5)

amplifiziert, kloniert und sequenziert werden.

3’-RACE:

Über eine RT-Reaktion unter Verwendung eines Oligo-dT-Adaptermoleküls erhielt

man cDNAs mit definierter 3’-Sequenz (Abb. 3.6). Durch die Verwendung von

genspezifischen Primern konnten die 3’-Regionen mittels PCR und nested PCR

(Abb. 3.7) amplifiziert, kloniert und sequenziert werden.


Abb. 3: Schematische Darstellungeiner RLM-RACE. Homologe

Sequenzen zwischen Primer und

mRNA (schwarze Linie) wurden als

schwarze Balken dargestellt.

2.13 RT-PCR

Die RT-PCR dient als Methode, um eine Aussage über die Expression von viralen

als auch zellulären Genen auf mRNA-Ebene treffen zu können. Aus HFF-Zellen

wurde mit TRIZOL-Reagenz (Invitrogen, Karlsruhe) nach Angaben des Herstellers

gesamtzelluläre RNA isoliert. Diese wurde in einem ersten Schritt mit RNase-freier

DNase verdaut (MBI Fermentas, St. Leon-Rot; 30 min bei 37°C). Anschließend

wurde die mRNA in cDNA umgeschieben, welche später in der PCR als Matrize

dienen sollte. Pro Ansatz wurden 0,5 µg RNA, 1 µl Oligo d(T)18-Primer und DEPC-

H2O ad 11 µl für 5 min bei 70°C inkubiert und danach sofort auf Eis gekühlt. Nach

Zugabe von 4 µl 5x-Puffer (Fermentas), 3 µl dNTPs und 1 µl RNase-Inhibitor-Mix

wurden die Reaktionsgefäße weitere 5 min bei 37°C inkubiert. Im Anschluss daran

wurde 1 µl Reverse Transkriptase (200 u) hinzugefügt. Nach 1 h Inkubation bei

42°C, wurde das Enzym durch 10minütiges Erhitzen auf 70°C inaktiviert und sofort

auf Eis gestellt. Die Amplifikation erfolgte mit genspezifischen Primerpaaren,

wobei folgende Bedingungen verwendet wurden:


Reaktionsmix: Reaktionsbedingungen:

5 min 94°C

30 s 94°C

30 s 60°C 35 Zyklen

30 s 72°C

7 min 72°C

∞ 4°C

1 µl cDNA aus der RT-Reaktion

10 pm 5’-Primer

10 pm 3’-Primer

1 µl dNTPs (10 mM)

5 µl 10x PCR-Puffer

2 µl Taq-Polymerase

ad 50 µl H2O

Primerbindungstemperatur und Elongationszeit waren so gewählt, dass alle

Amplifikationen unter den selben Bedingungen ablaufen konnten. Die Auswertung

der RT-PCR-Reaktionen fand mittels 2%iger Agarosegelelektrophorese statt.

2.14 Prokaryote Expression und Immunisierung von Kaninchen

4x 500ml LB(Amp) wurden mit je 100ml Übernachtkultur DH10B pTST-UL24

inokuliert und bei 37°C bis zu einer OD578=0,5 wachsen gelassen. Nach der

Induktion des rhamnoseabhängigen Promotors mit 10 ml 10% Rhamnose je

Kolben wurden die Zellen bei Raumtemperatur bis zu einer OD578 von 2,0 weiter

wachsen gelassen. Die Bakterien wurden sedimentiert (10 min bei 5000 g) und

das Pellet in 10 ml Columnbuffer aufgenommen. Das Gesamtvolumen von zirka

25 ml wurde in einer Frenchpress (SLM Aminco, Schwäbisch Gmündt) bei einem

Druck 1500 bar, 4x aufgeschlossen, 75min bei 7000 g und 4°C zentrifugiert und

der Überstand mit 1 ml Amylose–Matrix (New England Biolabs, Ipswich, MA) für 3

h bei 4°C im Überkopftaumler geschüttelt. Nach drei Waschschritten mit

Columnbuffer (5 min, 1000 g) wurde das an die Matrix gebundene, rekombinante

Fusionsprotein in drei Schritten mit zweimal je 1 ml Elutionspuffer (20mM Maltose)

bzw. 1ml 0,1% SDS eluiert. Die Fraktionen wurden in einem Coomassieblau

gefärbten 10%igen SDS-Gel analysiert. Die anschließende Immunisierung von

Kaninchen wurde nach dem Schema in Abbildung 4 durchgeführt.


Abb. 4: SchematischeDarstellung derProbenaufbereitung fürdie Immunisierung von

Kaninchen.

2.15 Immunfluoreszenzanalyse

Für Immunfluoreszenzuntersuchungen wurden eukaryote Zellen in 24-Loch-

Platten auf Deckgläsern kultiviert und anschließend transfiziert bzw. infiziert. Zum

Nachweis von viralen Proteinen mittels spezifischer Antikörper, wurden indirekte

Immunfluoreszenzanalysen durchgeführt. Die Zellen wurden hierzu zweimal mit

0,01 M PBS gewaschen und mit 250 μl 4 % Paraformaldehyd überschichtet. Nach

10 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen erneut dreimal

gewaschen und entweder zur weiteren Lagerung bei 4 °C mit 300 μl 0,01 M PBS

überschichtet, oder aber bei sofortiger Verwendung für 2 min mit 0,1 % Triton-

X/0,01 M PBS permeabilisiert., und anschließend 30 min bis 1 h bei 37°C mit

einem entsprechend verdünnten Primärantikörper inkubiert. Polyklonale Antiseren

wurden 1:50 bis 1:5000 in 0,01 M PBS mit 1% BSA verdünnt, monoklonale

Hybridomzellüberstande wurden unverdünnt verwendet. Danach wurden die

Zellen dreimal mit 0,01 M PBS gewaschen und mit einem Fluorophor-gekoppelten,

1:200 bis 1:1000 in 0,01 M PBS/BSA verdünnten Sekundär-Antikörper für weitere

30 min bis 1 h bei 37°C inkubiert. Zur Gegenfärbung wurde der Lösung mit dem

Sekundärantikörper DAPI (1:1000 Verdünnung der Stocklösung) zugegeben.

Nach zweimaligem Waschen mit 0,01 M PBS wurden die Deckgläser kopfüber mit

einem Tropfen Vectashield Mounting Medium (Vector, Burlingame, CA, USA) auf

einen Objektträger gegeben. Die Zellen konnten nun bei UV-Licht unter dem

Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden. Aufnahmen zur Untersuchung der

Lokalisation rekombinant exprimierter Proteine wurden mit Hilfe konfokaler


Mikroskopie (Leica TCS laser scanning system (Bensheim) unter Verwendung der

Leica LCS Software) durchgeführt.

2.16 Zellkulturverfahren

Arbeiten mit eukaryoten Zellen wurden stets mit sterilen Materialien an einer

sterilen Arbeitsbank durchgeführt.

2.16.1 Kultivierung der Zellen

Eukaryote Zellen wurden bei 37°C, 96% Luftfeuchtigkeit und 5% CO2-Gehalt in

einem Inkubator (Heraeus, Hanau) kultiviert. 293T- und Phoenix-Zellen wurden in

Kulturflaschen mit DMEM (mit 1% Glutamin, 1% Pen/Strep und 10% FCS),

Fibroblasten, U373MG-, HeLa- und SK-N-SH-Zellen mit MEM (mit 1% Glutamin,

1% Pen/Strep und 10% FCS) angezogen. RPE1 (HAM’s F12 : D-MEM = 1:1 mit

1% Glutamin, 1% Pen/Strep, 10% FCS und 0,348% NaHCO3), HSGE (humane

Speicheldrüsen-Epithelzellen, McCoy´s 5a, 10% FCS, 1% Pen/Strep, 1%

Glutamin, 1% AS), HUVEC (EBM mit 5% FCS, 0,4% BBE (bovine brain extract),

0,1% Hydrokortison, 0,1% GA-1000, 0,1% hEGF), Makrophagen (RPMI mit 1%

Glutamin, 1% Pen/Strep und 10% FCS). Bei den 293T-, Phoenix- und HeLa-Zellen

wurde darauf geachtet, dass sie nie eine höhere Zelldichte als 75% erreichen, da

sie sich ansonsten nicht mehr effizient genug transfizieren lassen.

Zur Subkultivierung wurden adhärent wachsenden Zellen zunächst zweimal mit

0,01 M PBS/EDTA gewaschen und anschließend mit 1 ml 0,01 M PBS/EDTA und

1 ml 0,25%igem Trypsin/EDTA vom Boden der Kulturflasche gelöst (für 5 min bei

37°C), mit frischem serumhaltigen Medium heruntergespült und anschließend auf

neue Zellkulturgefäße verteilt.

2.16.2 Infektion von Zellen

Die Zellen wurden je nach Versuchsansatz in festgelegter Anzahl in

entsprechenden Zellkulturschalen ausgebracht und für 24 h im Brutschrank

inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen nach einem Medienwechsel mit der

benötigten Infektiosität (plaque forming units pfu/ml) pro Infektionsansatz infiziert.


Mock-infizierte Zellen wurden zur Kontrolle genau wie die zu infizierenden Zellen

behandelt. Anstelle der Viruslösung wurde das entsprechende Volumen eines

Gemisches aus MEM-komplett und Sucrosephosphat auf die Zellen gegeben.

Dies entspricht der Situation bei den zu infizierenden Zellen, da das Virus in

50%iger Sucrosephosphatlösung eingefroren war. Es folgte eine einstündige

Inkubation (37°C, 5% CO2, 96%Luftfeuchtigkeit), wobei die Zellkulturgefäße im

Abstand von 15 min geschwenkt wurden. Anschließend wurde der Virusüberstand

wieder von den Zellen abgenommen, durch frisches serumhaltiges Medium ersetzt

und die Zellen bis zum jeweiligen Erntezeitpunkt weiter kultiviert.

2.16.3 Herstellung und Titration von Virusstocks

Zur Herstellung zellfreier Virusstocks wurden 106 HFF in einer 25 cm2

Zellkulturflasche ausgesät und nach 24 h mit einer MOI von 0,1 infiziert. Nachdem

diese Kultur zu 90 % infiziert war (nach ungefähr 5 Tagen), wurden die Zellen

trypsiniert und zusammen mit ca. 4 x 107 nicht infizierten HFF Zellen auf

insgesamt zehn 175 cm2 Zellkulturflaschen ausgebracht. Diese wurden so lange

kultiviert, bis die Infektion zur Lyse der Zellen führte. Der Kulturüberstand wurde in

einem sterilen Gefäß gesammelt, die restlichen adhärenten Zellen mit einem

Zellschaber vom Flaschenboden entfernt und die gesamte Kultur vereinigt. Nach

Zentrifugation für 5 min bei 2500 × g wurde der Überstand in ein weiteres steriles

Gefäß gegeben und das Zellpellet in ca. 3 ml MEM resuspendiert. Diese Zellen

wurden dann auf Eis in einem Homogenisator aufgeschlossen (30 Hübe pro

Aufschluss), die Zelltrümmer sedimentiert (10 min, 2500 × g) und der Überstand

mit den bereits geernteten Überständen vereinigt. Das Virus wurde nun in einer

Beckmann Ultrazentrifuge mit dem SW28 Rotor für 1 h bei 22000 rpm (4 °C)

pelletiert. Nach Abkippen des Überstands wurde das Viruspellet über Nacht bei 4

°C in 250 μl Sucrosephosphat gelöst. Die vollständig resuspendierten

Viruspräparationen wurden vereinigt und als Aliquots von 250-500 μl bei -80 °C

gelagert.

Für die Titration der Virusstocks wurden 1,6 x 104 HFF pro Loch in einer 96-Loch-

Platte ausgebracht. Am darauffolgenden Tag wurden Verdünnungsreihen (1:10)

der Stocks hergestellt und je 100 μl dieser Verdünnungen auf die Zellen pipettiert.

Um den statistischen Fehler gering zu halten, wurden die Infektionen pro


Verdünnung im Dreifach-Ansatz durchgeführt. Nach Zentrifugation der 96-Loch-

Platte für zweimal 15 min bei 900 × g wurden die Zellen für vier Tage im

Brutschrank inkubiert. Der Nachweis infizierter Zellen erfolgte durch die Detektion

von viralem E-Antigen mittels Immunoperoxidasefärbung. Hierzu wurde der

Zellkulturüberstand entfernt, die Zellen zweimal mit 0,01 M PBS gewaschen und

mit eiskaltem Methanol für 10 min bei –20 °C fixiert. Nach dem Entfernen des

Methanols wurden die Zellen für mindestens 10 min bei RT getrocknet. Zur

Rehydrierung wurden die Zellen anschließend zweimal mit 0,01 M PBS

gewaschen und dann für 30 min bei RT mit einem HCMV E-Ag Antikörper (CCH2,

DAKO, Glostrup, Dänemark) in einer Verdünnung von 1:50 in 0,01 M PBS/1 %

BSA inkubiert. Nach dreimaligen Waschen mit PBS erfolgte die Inkubation mit

einem horseradish-peroxidase (HRP)-gekoppelten anti-Maus Sekundärantikörper

(DAKO, Glostrup, Dänemark; 1:100 in 0,01 M PBS / 1 % BSA für 30 min, RT). Die

Zellen wurden abermals mit 0,01 M PBS gewaschen und die Antigen-

Antikörperkomplexe nach einer Färbereaktion mit AEC-Lösung (DAKO, Glostrup,

Dänemark) detektiert. Die Reaktion wurde durch Waschen mit 0,01 M PBS

gestoppt und die gefärbten Zellkerne gezählt.

2.16.4 Wachstumskinetik

Um das Replikationsverhalten von Virus vergleichen zu können, wurden „Ein-

Schritt-Wachstumskurven“ bestimmt. Ca. 5x104 HFF bzw. HUVEC pro Loch

wurden auf 24-Loch-Platten verteilt und in einem Endvolumen von 500 µl MEM-

komplett für 1 h infiziert. Parallel dazu wurde eine Titration des Inokulums

durchgeführt, um zu gewährleisten, dass initial vergleichbare Mengen an

Infektiosität eingesetzt wurden. Nach Entfernen des Virus und zweimaligem

Waschen mit 0,01 M PBS wurde der Überstand abgenommen, mit dem gleichen

Volumen Sucrosephosphat bei –70°C weggefroren (Zeitpunkt t0) und durch

frisches Medium (im Fall der HUVECs EBM) ersetzt. Ebenso wurde zu den

weiteren Erntezeitpunkten verfahren.

Im Anschluss wurde eine Titration durchgeführt, um die Anzahl der plaque forming

units über den Zeitverlauf bestimmen und somit das Replikationsvermögen der

Viren vergleichen zu können.


2.17 Retrovirale Transduktion

Amphotrope Phönix Helferzellen [Pear et al., 1993] die in 6 Loch Platten kultiviert

wurden, wurden durch Kalzium-Phosphat-Präzipitation mit 5 µg der retroviralen

Vektoren p617-neo-T-EGFP-tTA3 oder pMLV-Retro-tTA3-DEST Myc-UL24

transfiziert (Abb. 5.1). Am Folgetag wurde das Medium gewechselt und die Zellen

bei 32°C inkubiert. Nach weiteren 24 h wurde der mit Retroviren angereicherte

Überstand geerntet und die Zelltrümmer pelletiert (5 min, 1500 rpm ). HFF wurden

mit 1 ml frischem Virusüberstand infiziert und für 24 h bei 32°C inkubiert (Abb.

5.2). Die Infektion wurde hierbei durch einen 45minütigen Zentrifugationsschritt bei

1800 rpm verstärkt. Die transduzierten HFF wurden nach einem Waschschritt mit

TB4delUL24-BAC überinfiziert (MOI=1, Abb. 5.3). Die Überstände der infizierten

HFF wurden 5 dpi geerntet um eine erfolgreiche Transkomplementation in HFF

und HUVEC testen zu können. HFF und HUVEC wurden mit jeweils 1 ml

Überstand infiziert (Abb 5.4) und infizierte Zellen durch Immunfluoreszenzanalyse

unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (E13, Argene) gegen das

HCMV IE1-Protein nachgewiesen (Abb 5.5). Zur Bestätigung einer erfolgreichen

Transduktion wurden die infizierten Zellen ebenfalls geerntet, und über RT-PCR

auf die Expression von UL24-mRNA Transkripten untersucht.

Abb. 5: Schematische Darstellung zur Vorgehensweise bei Retroviraler Transduktion.


2.18 Luziferaseassay

U373 Zellen wurden mit 3x105 Zellen pro Loch in einer 6 Loch-Platte ausgesäht.

Am nächsten Tag wurde das Medium durch 750 μl frisches DMEM ersetzt. Die zu

transfizierende DNA (0,5 μg Reporterplasmid und je 2 μg Transaktivator-DNA)

wurde mit 8 μl DEAE-Dextran (50 mg/ml) versetzt, mit 250 μl DMEM aufgefüllt und

auf die Zellen getropft. Nach 3stündiger Inkubation im Brutschrank wurden die

Zellen zweimal mit warmem 0,01 M PBS gewaschen, mit 2 ml frischem DMEM

überschichtet und weitere 48 h kultiviert. Für die Herstellung der Zellextrakte

wurden die Zellen zweimal mit 0,01 M PBS gewaschen, mit 300 μl 1 x Lysepuffer

überschichtet und für 30 min auf einem Schüttler inkubiert. Der Überstand wurde

in Reaktionsgefäße überführt und die Zelltrümmer sedimentiert (16000 × g, 10

min, 4 °C). Für die Messung der Luziferase-Aktivität wurden 100 μl Zelllysat mit

100 μl Reaktionspuffer (100 mM Kaliumphosphat pH 7,8, 15 mM MgSO4, 5 mM

ATP) gemischt. Die Luminiszenz-Reaktion wurde durch Einspritzen von 100 μl

Substratpuffer (Reaktionspuffer plus 1 mM D-Luziferin, Roche, Mannheim) in

einem Luminometer (Lumat LB9507, Berthold, Bad Wildheim) vermessen und in

relativen Luminiszenzeinheiten (RLU) angegeben.

Ergebnisse 36

3 Ergebnisse

3.1 Prokaryote Expression von MBP-pUL24

Für die Immunisierung von Kaninchen sollte pUL24 zunächst prokaryot exprimiert

werden. Da sich in vorangegangenen Versuchen Fusionsproteine wie His-pUL24

oder GST-pUL24 gar nicht oder nur in sehr geringen Mengen herstellen ließen,

wurde pUL24 als Maltose Bindeprotein (MBP)-Fusionsprotein in E. coli DH10B in

löslicher Form exprimiert. Bereits im Überstand des Zelllysats konnte in einem

Coomassieblau gefärbten SDS-Gel eine distinkte Bande von ca. 75 kDa

nachgewiesen werden, die der erwarteten Molekularmasse des Fusionsproteins

entspricht. Das Fusionsprotein wurde durch anschließende Reinigungsschritte

über ein Amyloseresin weiter angereichert (Abb. 6 A). Das Fusionsprotein wurde

in mehreren Fraktionen eluiert, auf Nitrozellulose transferiert und mittels Ponceau-

Rot-Färbung nachgewiesen (Abb. 6 B). Die entsprechende Bande wurde

ausgeschnitten, in DMSO aufgelöst und für die Immunisierung eingesetzt.

Das Kaninchenserum wurde in Immunfluoreszenzanalysen an mit pcDNA-Myc-

UL24-IRES-EGFP transient transfizierten HeLa-Zellen getestet. Hierbei wurden

erfolgreich transfizierte Zellen über die Fluoreszenz des bicistronisch exprimierten

Abb. 6: Prokaryote Expression eines UL24-Fusionsproteins. (A) Der Überstand und mehrere gereinigte Fraktionen von

E.coli Zelllysaten wurden in einer 10%igen SDS-PAGE aufgetrennt. Die Bande des überexprimierten pMal-UL24

Fusionsproteins konnte nach Coomassieblaufärbung bei einem Molekulargewicht von ca. 75 kDa detektiert werden. (B)

pMal-UL24 auf Nitrozellulosemembran transferiert und nachgewiesen durch Ponceau-Rot. Die Bande des rekombinanten

Proteins (schwarzer Pfeil) wurde ausgeschnitten und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt.

Ergebnisse 37

EGFP nachgewiesen. Als Positivkontrolle diente ein monoklonaler

Mausantikörper, der gegen das Myc-tag des Fusionsproteins gerichtet war (Abb. 7

a, d, g). Es konnte gezeigt werden, dass das Immunserum rekombinantes, Myc-

getaggtes pUL24 detektierte (Abb. 7 b, e, h), wohingegen das als Negativkontrolle

verwendete Präimmunserum kein Signal lieferte (Abb. 7 c, f, i). Nur transfizierte,

EGFP-positive Zellen zeigten eine Expression von Myc-pUL24, wohingegen nicht

transfizierte Zellen nur eine schwache Hintergrundfluoreszenz aufwiesen.

Abb. 7: Immunfluoreszenzanalyse transient transfizierter HeLa-Zellen. HeLa-Zellen wurden mit dem eukaryoten

Expressionsplasmid Myc-UL24 IRES EGFP transfiziert. Transfizierte Zellen wurden durch die Grünfluoreszenz des EGFP

detektiert (a-c und g-h). Zum Nachweis von myc-UL24 wurden anti-myc Antikörper (d, g) sowie anti-UL24 Kaninchenserum

(1:50 verdünnt, e, h) oder Präimmunserum (1:50 verdünnt, f, i) verwendet und mit Cy3-konjugierten Sekundärantikörpern

dargestellt.

Im Anschluss wurde untersucht, ob das anti-UL24 Kaninchenserum auch für die

Detektion von pUL24 in Western Blot Analysen eingesetzt werden kann. 293T-

Zellen wurden mit den Plasmiden pCDNA3-N Myc-UL24 oder pCDNA3-N Myc-

MIF über Kalzium-Phosphat Präzipitation transient transfiziert und 48 Stunden

nach Transfektion geerntet. Die Zellen wurden in Ko-IP-Lysepuffer lysiert und die

Lysate in einer 15%igen SDS-PAGE aufgetrennt.

Ergebnisse 38

Nichttransfizierte 293T dienten hierbei als Negativkontrolle. Die Detektion fand

entweder mit dem gegen Myc gerichteten monoklonalen Mausantikörper 9E10 und

dem 1:500 verdünnten monoklonalen Mausantikörper E13, welcher das zelluläre

Protein Vimentin detektiert (Abb. 8 A), oder dem anti-UL24 Serum (Abb. 8 B) statt.

Myc-getaggtes pUL24 als auch Myc-MIF ließen sich mit den erwarteten Signalen

von 41 bzw. 13 kDa nachweisen. Die Verwendung von vergleichbaren,

gesamtzellulären Proteinmengen wurde durch den Nachweis des zellulären

Proteins Vimentin dokumentiert. Ein Signal ähnlicher Intensität von ca. 57 kDa

konnte in allen Spuren detektiert werden. Wie in Abb. 8 B zu sehen war bei

Verwendung des Anti-UL24 Kaninchenserums nur in Spur 1 ein dem viralen

Protein UL24 entsprechendes Signal von 41 kDa nachweisbar. Die Expression

des irrelevanten Myc-getaggten Proteins zeigte keine entsprechende Reaktion

(Abb. 8 B, Spur 2). Das ebenfalls 1:50 verdünnte Präimmunserum war nicht

reaktiv (Abb. 8 C, Spuren 1-3). Somit wurde gezeigt, dass das neu generierte,

gegen HCMV pUL24 gerichtete Kaninchenserum sowohl im

Immunfluoreszenznachweis als auch im Western Blot reaktiv und für HCMV

pUL24 spezifisch war.

Abb. 8: Western Blot Analyse zum Test des Anti-UL24 Kaninchen-serums. 293T-Zellen wurden mit pCDNA-Myc N

UL24 oder pCDNA-Myc-N- MIF (Spuren 1 bzw. 2) transient transfiziert, und die Zellysate 48 h nach Transfektion in einer

15%igen SDS-PAGE aufgetrennt. In Spur 3 wurden Lysate nicht transfizierter 293T aufgetragen. (A) Parallele Detektion von

Myc-getaggtem Protein (schwarze Pfeile) und der Positivkontrolle Vimentin (ca. 57 kDa). (B) Nachweis von rekombinantem

pUL24 (schwarzer Pfeil) mit Anti-UL24 Kanin-chenserum (1:50 ver-dünnt). (C) Verwendung von Präimmunserum.

Ergebnisse 39

3.2 Charakterisierung einer pUL24/ppUL32 Interaktion

Daten aus Yeast Two-Hybrid Screens (Schierling, nicht veröffentllicht) wiesen

pUL24 als Interaktor von ppUL32 aus. Um diese Daten in menschlichen Zellen zu

bestätigen, wurden 293T oder HeLa-Zellen transient mit eukaryoten

Expressionsvektoren transfiziert, welche für pUL24 oder ppUL32 kodieren oder

HFF mit HCMV infiziert und die gewonnenen Lysate für

Koimmunpräzipitationsanalysen eingesetzt.

3.2.1 Charakterisierung und Bestätigung der pUL24/ppUL32 Interaktion durch Ko-Immunpräzipitation

Die Interaktionsdaten von pUL24 und ppUL32 aus den Experimenten in Hefe

konnten nach transienter Kotransfektion in 293T-Zellen über ein Ko-

immunpräzipitationsexperiment bestätigt werden (Daten nicht gezeigt). Um

herauszufinden, welche Art von Protein-Protein Bindung der identifizierten

pUL24/ppUL32-Interaktion zugrunde liegt, wurden in diesem Experiment

verschiedene Lysepuffer mit zunehmenden Ionenkonzentrationen (150mM,

300mM und 500mM NaCl) verwendet. Dadurch sollten Interaktionen, die auf

elektrostatischen Bindungen basieren inhibiert werden. 293T-Zellen wurden mit

Abb. 9: Koimmunpräzipitation austransient transfizierten Zellen in Gegenwartansteigender Salzkonzentrationen.Angegebene Proteine wurden in 293T-Zellen

überexprimiert. (A) Die Immunpräzipitation

erfolgte mit dem monoklonalen

Mausantikörper XP1. Kopräzipitiertes pUL24

wurde mit dem spezifischen

Kaninchenantiserums detektiert. (B) In allen

Zelllysat-Kontrollen konnte pUL24

nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde das

virale Protein IE1 nachgewiesen (Spur 4 ).

Ergebnisse 40

pCDNA3-UL24 und pCB6-UL32 bzw. pCDNA3-UL24 und pCDNA3-IE1

kotransfiziert und 48 Stunden nach Transfektion mit den Lysepuffern

unterschiedlicher Salzkonzentration aufgeschlossen. Die Lysate wurden mit dem

gegen ppUL32 gerichteten Maus-Antikörper XP1 oder im Fall der Negativkontrolle

mit dem monoklonalen Anti-IE-Mausantikörper (p63-27) inkubiert und präzipitiert.

Der Nachweis von kopräzipitiertem pUL24 erfolgte mit Anti-pUL24

Kaninchenserum. Das Protein konnte in Gegenwart von allen drei

Salzkonzentrationen nachgewiesen werden (Abb. 9, Spuren 1 bis 3), was darauf

hinweist, dass die Bindung nicht nur auf elektrostatischen Kräften beruht. Die

Negativkontrolle diente dazu, eine unspezifische Präzipitation von pUL24

auszuschließen.

Um zu zeigen, dass die Interaktion nicht nur nach Überexpression nachgewiesen

werden kann, sondern auch bei der Virusinfektion eine Rolle spielt, wurden HFF

mit HCMV TB40E infiziert (MOI=1), Zelllysate 96 hpi geerntet und mit Antiseren

gegen pUL24 (Kaninchen) oder pUL48 (Mensch) präzipitiert. Der Nachweis von

kopräzipitiertem ppUL32 erfolgte mit Hilfe des monoklonalen Maus anti-ppUL32

Antikörpers XP1. Das Protein ppUL32 konnte durch pUL24, aber nicht durch

pUL48, ein weiteres Tegumentprotein, kopräzipitiert werden (Abb. 10 A, Spuren 1

und 2). In den Lysatkontrollen (Abb. 10 B) ist zu sehen, dass ppUL32 Bestandteil

beider Präparationen ist.

In diesem Experiment konnte erstmals gezeigt werden, dass eine physikalische

Interaktion zwischen pUL24 und ppUL32 tatsächlich auch in HCMV-infizierten HFF

stattfindet und demnach auch mit hoher Wahrscheinlichkeit für das Virus bzw. eine

Infektion mit HCMV relevant ist.

Abb. 10: Ko-Immunpräzipitation aus infizierten HFF. (A)

HFF wurden mit einer MOI von 1 mit TB4wt-BAC infiziert und

96 hpi geerntet. Die Immunpräzipitation erfolgte mit anti-UL24

Kaninchenserum (Spur 1) oder einem anti-UL48

Humanserum (Spur 2). Kopräzipitiertes ppUL32 wurde im

Western Blot unter Verwendung des monoklonalen

Mausantikörpers XP1 nachgewiesen. (B) In der Lysatkontrolle

wurde in beiden Präparationen ppUL32 im Western Blot unter

Verwendung des monoklonalen Mausantikörpers XP1

nachgewiesen (Spuren 1 und 2).

Ergebnisse 41

3.2.2 Lokalisation von pUL24 und ppUL32 in transient transfizierten HeLa-Zellen

Um weitere Erkenntnisse bezüglich der Lokalisation von pUL24 und ppUL32 zu

erlangen wurde die transiente Transfektion von HeLa–Zellen als System gewählt.

Diese Zellen lassen sich mit einer relativ hohen Effizienz transfizieren und bieten

dabei aufgrund ihrer Größe im Vergleich zu 293T-Zellen dennoch die Möglichkeit,

eine detaillierte Aussage über die intrazelluläre Lokalisation der nachgewiesenen

Proteine zu treffen. Die Zellen wurden mit eukaryoten Expressionsvektoren für

pUL24, ppUL32 oder pUL69 transfiziert, 48 Stunden nach Transfektion fixiert und

die exprimierten Proteine mit spezifischen Antikörpern durch konfokale

Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen (Abb. 11). Hier konnte bei alleiniger

Expression von pUL24 ein nukleäres Signal (Abb. 11 a) detektiert werden,

wohingegen ppUL32 cytoplasmatisch auftrat (11f und h). Wurden allerdings beide

Proteine koexprimiert, kolokalisierten sie nicht nur, sondern änderten auch beide

den Ort ihres Vorkommens und waren jetzt im Bereich der nukleären Membran

lokalisiert (11 c, g und k). Wurde zur Kontrolle ein anderes HCMV-

Tegumentprotein, pUL69, mit ppUL32 koexprimiert, so wurde die Lokalisation

Abb. 11: Lokalisation von pUL24 und ppUL32 in transient transfizierten HeLa-Zellen. HeLa-Zellen wurden mit

den eukaryoten Expressionsplasmiden pcDNA3-UL24, pCB6-UL32 und pcDNA3-UL69 (separat oder in Kombination)

transfiziert. Die Zellen wurden 48 h nach Transfektion mit 4% Paraformaldehyd fixiert und die angegebenen viralen

Antigene mittels Anti-pUL24 Kaninchenserum, Maus-anti-ppUL32 monoklonalen Antikörper XP1 oder Anti-pUL69

Kaninchenserum nachgewiesen. Die Aufnahmen wurden mit einem konfokalen Lasermikroskop (Leica TCS laser

scanning system; Bensheim) getätigt.

Ergebnisse 42

keines der beiden Proteine beeinflusst (11 d, h und l). Zusammenfassend kann

man sagen, dass in diesem Experiment die vorangegangenen Interaktionsdaten

bestätigt und durch die gemeinsame Lokalisation der beiden Interaktionspartner

gefestigt werden konnten. Der Umstand, dass pUL24 in Gegenwart von ppUL32

nicht mehr seine gewohnte Lokalisation im Zellkern einnimmt, ist ein Hinweis

darauf, dass eine eventuelle Beteiligung von pUL24 an nukleären Prozessen

durch die Interaktion mit ppUL32 beeinträchtigt sein könnte.

3.3 Funktionelle Analyse von pUL24 mittels Luziferaseassay

Es konnte bereits für eine Reihe von Tegumentproteinen gezeigt werden, dass es

sich bei ihnen um virale Transaktivatoren handelt (pUL82, ppUL35, pUL69

[Bresnahan et al., 2000, Liu et al., 2002, Winkler et al., 1994]). Weiterhin ändert

pUL24 in Gegenwart seines Interaktionspartners ppUL32 seine gewohnte,

nukleäre Lokalisation, wodurch eine eventuelle genregulierende Funktion von

pUL24 aufgrund der Interaktion beeinträchtigt sein könnte. Aus diesen Gründen

wurde ein Set an Experimenten durchgeführt, welches einer Beteiligung von

pUL24 an regulatorischen Prozessen nachgeht.

3.3.1 Verwendung verschiedener Promotorkonstrukte

Mit pUL36, pIRS1 und pTRS1 ist für mehrere Mitglieder der US22 Genfamilie eine

transkriptionell transaktivierende Funktion auf den HCMV IE-Promotor

beschrieben [Colberg-Poley et al., 1992, Stasiak et al., 1992]. Da auch das UL24-

Homolog aus HHV6, U3, eine bis zu fünffache Transaktivierung des HIV-1 LTR

bewirkt [Mori et al., 1998], wurde über Luziferase-Reportergenassays eine

mögliche Wirkung von pUL24 auf unterschiedliche Promotoren untersucht. U373-

Zellen wurden mit Konstrukten transfiziert, welche Luziferase unter der Kontrolle

von HIV-1-LTR, SV40- oder HCMV-IE-Promotor exprimieren. Gleichzeitig wurden

die Zellen mit Plasmiden, welche für pUL24 oder ppUL32 kodieren, kotransfiziert.

Bei allen drei verwendeten Promotor-Luziferasekonstrukten konnte in Gegenwart

von pUL24 eine 2-fache Transaktivierung beobachtet werden (Abb. 12, Spuren 1,

5 und 9), wohingegen ppUL32 allein zumindest für den HIV-1 LTR und den

HCMV-IE Promotor eine Repression bewirkte (Abb. 12, Spuren 2 und 9). Der

Ergebnisse 43

SV40-Promoter war davon nicht betroffen (Abb. 12, Spur 6). Bei gleichzeitiger

Expression der beiden Interaktionspartner dominierte der Repressoreffekt von

ppUL32 den transaktivirenden Effekt von pUL24 (Abb. 12, Spuren 3, 7 und 11).

Als Kontrolle wurden die Zellen mit entsprechenden DNA-Mengen der

Leervektoren transfiziert (Abb. 12, Spuren 4, 8 und 12). Hiermit konnte gezeigt

werden, dass pUL24 per se zwar eine transaktivierende Funktion zeigt, diese aber

nicht spezifisch für bestimmte virale Promotoren ist.

Abb. 12: Funktionelle Analyse von pUL24 und ppUL32 in transienten Luziferaseassays. U373-Zellen wurden mit

je 0,5 µg unterschiedlicher Reporterplasmide transfiziert, welche Luziferase unter der Kontrolle von HIV1-LTR, SV40-

E/P oder HCMV-IE Promotor exprimieren. Zusätzlich wurden je 2 µg der eukaryoten Expressionsvektoren pcDNA3-

UL24 und pCB6-UL32, sowie der Leervektoren pcDNA3 und pCB6 einzeln und in Kombination transfiziert. 48 h nach

Transfektion wurde die Promotoraktivität über die Luziferaseexpression gemessen und als x-facher Wert im Vergleich

zur Grundaktivität der Leerkontrolle angegeben.

3.3.2 Untersuchung einer kooperativen Transaktivierung

Für HCMV-ppUL35 konnte vor kurzem in unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden

[Schierling et al., 2004], dass es in Verbindung mit weiteren, interaktierenden

Tegumentproteinen einen kooperativ-transaktivierenden Effekt auf den HCMV

Enhancer/Promotor bewirkt. Weiterhin wurde gezeigt, dass pUL24 in transient

transfizierten 293T-Zellen mit ppUL35 interagiert [Schierling, nicht publiziert]. Im

Folgenden wurde untersucht, ob pUL24 zusammen mit anderen

Tegumentproteinen in Verbindung mit dem HCMV Enhancer/Promotor ebenfalls

Ergebnisse 44

eine kooperativ-transaktivierende Wirkung zeigt. Wie schon im vorangegangenen

Experiment war eine transaktivierende Funktion von pUL24 klar ersichtlich (Abb.

13, Spur 2). Auch eine annähernd 100%ige Verstärkung der Promotoraktivität,

welche bereits durch andere verschiedene Aktivatoren und deren Kombinationen

mit UL24 und untereinander induziert wurde, konnte nachgewiesen werden (Abb.

13, Spuren 6, 7, 8 und 10). Allerdings war hier kein so deutlicher kooperativer

Effekt wie im Fall von ppUL35 zu sehen, bei dem die Transaktivierung mit

Zunahme der Interaktionspartner überproportional anstieg. pUL24 führte in

Kombination mit ppUL35 und ppUL82 zu einer verstärkten Luziferaseaktivität

(Abb. 13, Spuren 9 und 10), die durch ppUL32 wieder auf das Niveau von ppUL35

und ppUL82 allein reduziert wurde (Abb. 13, Spur 12).

Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass pUL24 einen transaktivierenden

Effekt auf den HCMV-IE Enhancer/Promotor ausübt, welcher wiederum durch

ppUL32 egalisiert wird.

Abb. 13: Kooperativer transaktivierender Effekt. U373 Zellen wurden transient mit je 2 µg der eukaryoten

Expressionsplasmiden, welche für die angegebenen viralen Proteine kodieren zusammen mit 0,5 µg des

Reporterplasmids pHM287, das Luziferase unter der Kontrolle des HCMV-IE Enhancer/Promotors exprimiert

kotransfiziert. Die Zelllysate wurden 48 h nach Transfektion auf ihre Luziferaseexpression hin analysiert und die

Aktivierung durch virale Proteine im Vergleich zur Grundaktivität des Promotors dargestellt. Die Standardabweichung

wurde anhand jeweils drei Transfektionen berechnet.

Ergebnisse 45

3.4 Generierung und Charakterisierung einer UL24-Deletionsmutante im Hintergrund des endotheliotropen HCMV-Stammes TB40E

Nachdem für einige Mitglieder der US22-Genfamilie auch eine Rolle für den

Zelltropismus von CMV gezeigt werden konnte und bei vorangegangenen

Experimenten mit einer UL24-Deletionsmutante im an Fibroblasten adaptierten

Laborstamm AD169 bei der Infektion von HFF keinerlei Defekt auftrat (R. Pretsch,

Diplomarbeit), wurde für die Generierung eines UL24-Deletionsvirus das TB4-BAC

gewählt, welchem der hochgradig endotheliotrope HCMV-Stamm TB40E zugrunde

liegt. Der Vorteil der Verwendung diesen BACs ist es, dass von ihm abstammende

rekombinante Viren immer noch über die Fähigkeit verfügen, unterschiedlichste

Zelltypen infizieren zu können.

3.4.1 Deletion und Reinsertion des UL24-ORF in TB4-BAC mittels ET-Klonierung

Die Entfernung des kompletten UL24-Leserahmens aus dem HCMV-Genom

erfolgte mittels der Rec-ET-Rekombination durch homologe Rekombination in E.

coli (Abb. 14). Dazu wurde das UL24-Gen zunächst durch eine

Kanamycinresistenz-Kassette ersetzt. Der Marker wurde in einem anschließenden

Schritt über FLP-vermittelte Rekombination zweier FRT-Sequenzen, welche das

Resistenzgen umgeben, wieder aus dem BAC entfernt, so dass die

Deletionsmutante TB4delUL24-BAC unter Verbleib einer 80 Basenpaare

umfassenden Insertion (eine FRT-Sequenz und zwei Bindestellen für die zur

Amplifikation der Markerkassette verwendeten Oligonukleotide) resultierte. Eine

Revertante wurde durch Wiedereinsetzen von UL24 hergestellt. Hierfür wurde

UL24 zusammen mit dem Kanamycingen aus pSL-FRT-TB4-mycUL24 amplifiziert,

in TB4delUL24 einrekombiniert und der Marker anschließend wieder über FLP-

vermittelte Rekombination entfernt. Das entstandene BAC wurde nachfolgend mit

TB4revUL24-BAC bezeichnet und war vom Wildtyp durch eine in der verbliebenen

FRT-Sequenz vorhandene EcoRI-Schnittstelle zu unterscheiden (Abb. 15 A). Aus

einer vergleichenden Restriktionsanalyse konnte man ersehen, dass es im Verlauf

der Rekombination nicht zu größeren Deletionen im viralen Genom gekommen ist

Ergebnisse 46

Abb

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Ergebnisse 47

(Abb. 15 B). Weiterhin konnten Veränderungen einzelner Banden im

Restriktionsmuster beobachtet werden. Um die veränderten Muster mit der

gewollten Mutation korrelieren zu können, wurde eine Southern Blot Analyse

durchgeführt. Bei der Verwendung einer Probe für UL23 und UL25 konnte gezeigt

werden, dass beim Wildtyp nach EcoRI-Verdau ein Fragment von ca. 9,5 kB

detektierbar ist. TB4delUL24 zeigt hier durch das Einbringen der zusätzlichen

EcoRI-Schnittstelle zwei Fragmente von ungefähr 6,7 und 1,8 kB, während das

größere Fragment bei der Revertante wieder um die 1,1 kB des UL24-Genes auf

7,8 kB verlängert ist (Abb. 15 C). Wurde UL24 als Probe verwendet, konnte im

Wildtypgenom wiederum das Fragment von 9,5 kB und im Fall der Revertante das

verkürzte 7,8 kB Signal nachgewiesen werden. Bei der Deletionsmutante war kein

für UL24 spezifisches Signal detektierbar (Abb. 15 D). Anhand der durchgeführten

Analysen wurden die generierten rekombinanten BACs als integer angesehen und

für die Rekonstitution in HFF eingesetzt.

Abb. 15:Charakterisierung vonTB4delUL24. (A)

Schematische Darstellung

der UL24-Genregion

angegebener

rekombinanter BACs. Die

Orientierung der offenen

Leseraster (Pfeile, UL24

grau hinterlegt) als auch

Restriktionsschnittstellen

(E=EcoRI, B=BglII) sind

angegeben. (B)

Restriktionsanalyse von

BAC-DNA nach EcoRI-

Verdau (0,8%iges

Agarosegel). (C) Southern

Blot Analyse mit einer

32P-markierten Sonde

gegen UL23 und UL25

oder UL24 (D).

Fragmentgrößen sind in

den jeweiligen

Abbildungen angegeben.

Ergebnisse 48

3.4.2 Rekonstitution der Virusmutanten

Die jeweilige BAC-DNA wurde mittels Elektroporation in HFF transfiziert. Ungefähr

zehn bis 14 Tage nach Transfektion waren erste für eine HCMV-Infektion typische

zytopathische Effekte der HFF erkennbar, wobei kein merklicher Unterschied

zwischen den verschiedenen rekombinanten Viren erkennbar war. Nachdem die

Zellkulturen nahezu durchinfiziert waren, wurden die Viren expandiert und

Virusstocklösungen angelegt, welche für die Folgeexperimente verwendet wurden.

3.4.3 Einfluss auf den Endothelzelltropismus des HCMV

Vaskuläre Endothelzellen wurden als Zielzellen des Virus identifiziert, welche an

der Verbreitung des Virus im Blutstrom des Wirtsorganismus beteiligt sind. Aus

diesem Grund sind Virusmutanten, bei denen der Endothelzelltropismus des Virus

beeinträchtigt ist, von besonderem Interesse. In den nachfolgenden Experimenten

wurde untersucht, ob die Absenz des UL24-Genproduktes einen derartigen Effekt

hervorruft. Falls ja, sollte im weiteren Verlauf genauer charakterisiert werden, in

welcher Phase der viralen Replikation der Defekt auftritt.

3.4.3.1 Analyse der Replikationskinetiken von HCMV-Mutanten in HFF und HUVEC

HFF als auch HUVEC wurden mit TB4wtBAC, delUL24 oder revUL24 mit einer

MOI von 1 infiziert. Anschließend wurde das erste Mal Überstand geerntet und

somit der Zeitpunkt t0 gesetzt. Virushaltige Zellkulturüberstände wurden zu den

Zeitpunkten 1, 4, 7, 9 und 12 Tage nach Infektion (days post infection, dpi)

abgenommen und bis zum Zeitpunkt der Analyse bei –80°C gelagert. Die Anzahl

der jeweils vorhandenen infektiösen Einheiten (plaque forming units, pfu) wurde

mittels Virustitration auf HFF bestimmt. Hier konnte gezeigt werden, dass das

UL24-Deletionsvirus (Abb. 16 A, gefüllte Quadrate) in HFF im Vergleich zu Wildtyp

(offener Kreis) und Revertante (offenes Dreieck) keinen detektierbaren

Wachstumsdefekt aufweist. In den Endothelzellen dagegen konnte mehrfach

gezeigt werden, dass die von delUL24 erreichten Virustiter 12 dpi (Abb. 16 B,

schwarze Quadrate) 2-3 Logstufen unter den von WT oder Revertante erreichten

Werten lagen. Somit konnte ein ausgeprägter, zelltypspezifischer

Ergebnisse 49

Wachstumsdefekt des ursprünglich in Endothelzellen replikationskompetenten

HCMV TB4wt-BAC nach Deletion des UL24 ORF nachgewiesen werden.

Abb. 16: Virus Wachstumskurve. HFF und HUVEC wurden mit TB4wt-BAC (Kreis), TB4delUL24 (schwarzes Quadrat)

oder TB4revUL24 (Dreieck) für 1 h infiziert (MOI=1). Zellkulturüberstände wurden zu den angegebenen Zeitpunkten

geerntet und auf HFF titriert (Dreifachbestimmung). Der Virustiter wurde in plaque forming units (pfu) pro ml angegeben.

3.4.3.2 Zeitliche Eingrenzung des Defekts auf initiale Replikationsereignisse

Bisher war die Frage ungeklärt, ob es sich bei dem beobachteten

Wachstumsdefekt um eine Störung des Viruseintritts oder eher der Morphogenese

oder der Ausschleusung handelte. Zunächst wurde die Frage behandelt, zu

welchem Zeitpunkt der viralen Replikation der Defekt in der Virusvermehrung in

Endothelzellen auftritt. Hierfür wurden Immunfluoreszenzanalysen durchgeführt,

bei denen die virale IE-Genexpression untersucht wurde (Abb. 17). HFF oder

HUVEC wurden hierfür mit entweder TB4wtBAC (17 A, a und d), delUL24 (17 A, b

und e) oder revUL24 (17A, c und f) infiziert (MOI=1) und 24 hpi fixiert. Es folgte

der Nachweis von IE-Antigen durch den monoklonalen Mausantikörper E13

(Argene) gefolgt von einem gegen Maus gerichteten, mit Cy3 konjugierten

Antikörper aus der Ziege. Die Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt und die

Ergebnisse 50

Auswertung am Fluoreszenzmikroskop (Axioscop 2; Zeiss, Jena) durchgeführt. In

den infizierten HFF war das Verhältnis von roten, IE-positiven Zellen zur

Gesamtzellzahl (DAPI positiv) der verschiedenen rekombinanten Viren

vergleichbar (Vgl. 17 A, a-c). Betrachtete man allerdings die Infektionsraten in den

infizierten HUVEC (17 A, d-f), so waren bei den mit delUL24 infizierten Zellen

deutlich weniger IE-positive Zellen im Verhältnis zur Gesamtzellzahl detektierbar

als in den Fällen von TB4wtBAC oder revUL24. Eine repräsentative, quantitative

Auswertung bestätigt die Signifikanz der beobachteten Ereignisse (Abb. 17 B). Die

Ergebnisse dieser Experimente weisen auf eine Beteiligung von UL24 bereits an

initialen Replikationsereignissen bei der Infektion von Endothelzellen durch HCMV

hin.

Abb. 17: Immunfluoreszenzanalyse von TB4delUL24. (A) HFF (a-c) oder HUVEC (d-f) wurden mit angegebenen Viren

infiziert (MOI=1), 24 hpi fixiert und IE-Genexpression mit dem anti-IE Mausantikörper E13 (Argene) nachgewiesen. Die

Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt. (B) Quantifizierung der IE-positiven Zellen in % relativ zur ausgewerteten Zellzahl. HFF

(schwarze Balken), HUVEC (weiße Balken). Die Infektionsrate des Wildtyps wurde 100% gesetzt.

Ergebnisse 51

3.5 Charakterisierung der UL24-/UL25-Genregion mittels rapid amplification of cDNA ends (RACE)

Um eine genauere Vorstellung von der UL24-Genregion zu bekommen, wurde

eine detailierte Analyse durchgeführt. Bei Untersuchung dieses Genomabschnittes

wurde festgestellt, dass zwei mögliche TATA-Box-Konsensussequenzen für die

Initiation der Transkription der UL24-mRNA in Frage kommen könnten (Abb. 18

A). Um dies zu klären, wurde der Bereich durch mehrere RACE-Reaktionen

kartiert. Hierbei wurden 5’- oder 3’-Enden der UL23- bis UL25 Transkripte

Abb. 18: Transkriptanalyse der UL24-UL25-Region des HCMV. (A) Anhand einer 5‘-RACE-Analyse wurden die

Transkriptionsstarts von UL24 (hellgrün) und UL25 (hellblau) identifiziert. TATA-Konsensussequenzen wurden gelb

hinterlegt, das UL24-Startkodon ist rot markiert. (B) und (C): 2%ige Agarosegele von 5‘-RACE Amplifikaten des UL24-5‘-

Bereiches (B) bzw. des UL25-5‘-Bereiches (C). Die beiden Banden sind jeweils durch schwarze Pfeile markiert, wobei das

größere Amplifikat jeweils dominant war. Die Produkte wurden im Anschluss kloniert und für die Transkriptkartierung

sequenziert. Spur 1: cDNA, Spur 2: Negativkontrolle (Wasser).

Ergebnisse 52

amplifiziert, teilweise kloniert und anschließend sequenziert. Die

Transkriptionsstarts für UL24 bzw. UL25 liegen bei –57 und +78 (UL24) bzw. bei

+5 und +133 (UL25) jeweils vom UL24-Translationsstart aus gesehen. Es konnte

gezeigt werden, dass beide erwähnten Initiationsstellen genutzt werden und die

längeren, bevorzugten Transkriptformen (Abb. 18 B und C) von UL24 und UL25

überlappen. UL23 verfügt über einen separaten Transkriptionsstart, wobei die

UL24-mRNA koterminal mit dem UL23-Transkript endet. Diese Ergebnisse führen

zu dem Schluss, dass das Entfernen des kompletten UL24-Leserahmens, und

somit auch des UL25-Promoters, das benachbarte Gen funktionell ausschalten

könnte.

3.6 Herstellung und Charakterisierung von Punktmutanten

Durch das Entfernen eines kompletten Leserahmens könnten auch benachbarte

beeinflusst werden. Aus diesem Grund wurden Mutanten von TB4-BAC generiert,

bei denen nicht der komplette UL24-Leserahmen entfernt, sondern nur das erste,

ein potentielles zweites oder beide Startkodons durch Alanine ersetzt wurden.

Hierbei wurde untersucht, ob tatsächlich allein die mangelnde Expression an

pUL24 für die bisher beobachteten Effekte verantwortlich ist.

3.6.1 Herstellung von Punktmutanten

Aus pSL-FRT-TB4-mycUL24 wurde über eine Mutagenese-PCR das Konstrukt

pSL-FRT-TB4-mycUL24-M59A generiert, bei dem das zweite ATG-Kodon (an

Position 59) unter Entstehung einer neue BglII Schnittstelle in ein GCG

umgewandelt wurde. pSL-FRT-TB4-mycUL24 und pSL-FRT-TB4-mycUL24-M59A

wurden anschließend als Matrizen zur Herstellung der für die Rekombination

benötigten PCR-Produkte verwendet (Tabelle 2). Die entstandenen BACs wurden

durch differentiellen Restriktionsverdau und anschließende Southern Blot Analyse

kontrolliert. Die Restriktionsmuster stimmten erwartungsgemäß weitgehend mit

den unter 3.4.1 beschriebenen Mustern des TB4wtBAC überein.

Ergebnisse 53

Tabelle 2: Primer-Template-Kombinationen für UL24-Punktmutanten

Primerkombination: Template: Mutante:

UL24-rev-dATG + UL24-3’-KO pSL-FRT-TB4-mycUL24 mut1. ATG

UL24-rev + UL24-3’-KO pSL-FRT-TB4-mycUL24-M59A mut2. ATG

UL24-rev-dATG + UL24-3’-KO pSL-FRT-TB4-mycUL24-M59A mut1.+2. ATG

Wie man in Abb. 19 sehen kann, war im Fall der M59A Mutation (Spuren 5 und 6)

nach BglII-Verdau bei Hybridisierung mit einer UL24-Probe ein Signal von ca. 0,4

kB durch die zusätzlich eingebrachte Schnittstelle detektierbar. Zuletzt wurden der

relevante Bereich der hergestellten Punktmutanten sequenziert und die

Mutationen der gewünschten Stellen bestätigt (Daten nicht gezeigt). Nachdem die

Integrität der BACs durch oben genannte Analysen getestet war, wurden die

DNAs für die Rekonstitution der Viren in HFF transformiert.

Abb. 19:Charakterisierung derUL24-Punktmutanten. (A) Schematische

Darstellung der UL24-

Genregion angegebener

rekombinanter BACs. Die

Orientierung der offenen

Leseraster (Pfeile, UL24

grau hinterlegt) als auch

Restriktionsschnittstellen

(E=EcoRI, B=BglII) sind

angegeben. (B)

Restriktionsanalyse von

BAC-DNA nach BglII-

Verdau (0,8%iges

Agarosegel). (C)

Southern Blot Analyse mit

einer 32P-markierten

Sonde gegen UL23 und

UL25 oder (D) UL24.

Fragmentgrößen in kb

sind in den jeweiligen

Abbildungen angegeben.

Ergebnisse 54

3.6.2 Charakterisierung der Mutanten

Auch die drei neu generierten Punktmutanten wurden untersucht. Wie bereits

unter 3.5 erwähnt bestand die Möglichkeit, dass durch die Entfernung von UL25-

Promotorsequenzen in delUL24 auch die Expression dieses Proteins

beeinträchtigt sein könnte. Für eine Western Blot Analyse wurden infizierte Zellen

(96 hpi) lysiert und in einer 12%igen SDS-PAGE aufgetrennt, um auf Proteinebene

nach pUL24 und pUL25 Expression zu schauen. Hier lieferte der verwendete

Antikörper ein mit starkem Hintergrund behaftetes Signal (Daten nicht gezeigt).

Aus diesem Grund wurden die von den sechs BACs abstammenden

rekombinanten Viren bezüglich der Expression von UL24, UL25 und UL35 auf

RNA- und Proteinebene hin untersucht (Abb. 20, A und B). Bei Analyse der mRNA

konnten für die UL24-Deletionsmutante keine UL24-Transkripte und nur eine

deutlich geringere Menge an UL25-Transkripten nachgewiesen werden (Abb. 20

A, Spur 2). Der Nachweis von Aktin- oder IE2-cDNA wurde durchgeführt, um zu

dokumentieren, dass in der Reaktion vergleichbare Mengen an mRNA eingesetzt

wurden und auch die Infektionsrate identisch war (Abb. 20 A). Für pUL24 konnte

man im Fall von TB4wtBAC, revBAC und mut2. ATG das erwartete Signal von

Abb. 20: Expressionsanalysen der rekombinanten HCMV. (A) Analyse der Expression viraler und eines zellulären Gens

durch RT-PCR. Die untersuchten Gene sind rechts angegeben. Gesamtzelluläre RNA wurde aus mit angegebenen Viren

infizierten HFF isoliert (96hpi) und in cDNA umgeschrieben. PCR-Amplifikate wurden in einem 2%igen Agarosegel

elektrophoretisch aufgetrennt und durch Färbung mit Ethidiumbromid nachgewiesen. (B) Westernblot Analyse der UL24-

Mutanten: Viruspräparationen wurden lysiert und die Lysate in einer 10%igen SDS-PAGE aufgetrennt. Der Nachweis

erfolgte mit Kaninchen anti-UL24 Serum, bzw. einem Maus-Ascitesüberstand gegen pUL25. Der Nachweis von pUL35 als

Ladekontrolle erfolgte mit dem gegen UL35 gerichtetem Kaninchenserum Bie-1.

Ergebnisse 55

41kDa Größe detektieren (Abb. 20B, Spuren 1, 3, und 5). Sowohl bei delUL24 als

auch bei der Doppelpunktmutante war keine Bande mehr zu sehen (Abb. 20B,

Spuren 2 und 6). Mut1. ATG lieferte ein Signal für ein verkürztes UL24-Protein,

was zeigt, dass das zweite Methionin (M59) alternativ genutzt werden kann (Abb.

20B. Spur 4). Beim Nachweis von pUL25 bestätigte sich der Verdacht bezüglich

der Beeinflussung durch die UL24-Deletion. So wurde pUL25 von allen

rekombinanten Viren mit Ausnahme von delUL24 synthetisiert. ppUL35 war in

allen sechs Präparationen in vergleichbaren Mengen nachweisbar. Es wurde

damit gezeigt, dass es sich bei delUL24 um eine funktionelle UL24/UL25-

Doppelmutante handelte und dass beide Proteine tatsächlich Bestandteile

infektiöser Viruspartikel sind.

Abermals wurde parallel in HFF und HUVEC ein Virus Yield Experiment

durchgeführt, wobei hier das Viruswachstum der Punktmutanten von besonderem

Interesse war (Abb. 21). In HFF verhielten sich alle sechs rekombinanten Viren

gleich (Abb. 21 A). Bei der Parallelinfektion der Endothelzellen zeigten TB4wtBAC,

Tage nach Infektion

Tage nach Infektion

Abb. 21: VirusWachstumskurve. HFF und

HUVEC wurden mit TB4wt-

BAC (Quadrat, gestrichelte

Linie), TB4delUL24

(schwarzes Quadrat),

TB4revUL24 (Dreieck),

TB4mut1.ATG (X),

TB4mut2.ATG (+,

gestrichelte Linie) oder

TB4mut1.+2.ATG (Raute,

gepunktete Linie) für 1 h

infiziert (MOI=1).

Zellkulturüberstände wurden

zu den angegebenen

Zeitpunkten geerntet und auf

HFF titriert

(Dreifachbestimmung) und

der Virustiter in plaque

forming units (pfu) pro ml in

einer logarithmischen Skala

angegeben.

Ergebnisse 56

TB4delUL24 und TB4revUL24 ähnliche Ergebnisse wie schon im

vorangegangenen Experiment (siehe 3.4.3.1). Die Punktmutante des zweiten

Startkodons zeigte ein Viruswachstum wie der Wildtyp. Die Kurve von

TB4mut1.+2.ATG verlief analog derer der Deletionsmutante, womit gezeigt

werden konnte, dass das alleinige Fehlen des UL24-Genprodukts für den

beobachteten Wachstumsdefekt verantwortlich ist (Abb. 21B). Interessanterweise

lieferte TB4mut1.ATG einen intermediären, schwach attenuierten Phänotyp, der

sich zwischen Wildtyp und den pUL24-defizienten Mutanten ansiedelt.

Die IE-Genexpression des kompletten Sets an rekombinanten Viren wurde 24 hpi

von HFF und HUVEC mittels Immunfluoreszenzanalyse entsprechend 3.4.3.2

untersucht (Abb. 22). Auch hier zeigte die Doppelmutante eine im Vergleich zum

Wildtyp-BAC stark verringerte Zahl an IE-positiven Endothelzellen (Vgl. 22 A, g

und l). Der Einsatz vergleichbarer Mengen an infektiösen Partikeln wurde anhand

der Infektion von HFF dokumentiert (22 A, a-f). Um eine quantitative Aussage

treffen zu können, wurde der prozentuale Anteil IE-positiver Zellen an der

Gesamtzellzahl bestimmt und auf eine Infektion mit dem Virus aus dem Wildtyp-

BAC normalisiert (Abb. 22 B). Hierbei erreichte TB4mut1.+2.ATG eine ca. 6%ige

Infektionsrate.

Abb. 22: Immunfluoreszenzanalyse der UL24-Punktmutanten. (A) HFF (a-c) oder HUVEC (d-f) wurden mit

en Viren infiziert (MOI=1), 24 hpi fixiert und IE-Genexpression mit dem Mausantikörper E13 (Argene)

wiesen. Die Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt. (B) Quantifizierung der IE-positiven Zellen in % relativ zu

angegeben

nachge r

Gesamtzellzahl. HFF (schwarze Balken), HUVEC (weiße Balken). Die Infektionsrate des Wildtyps wurde 100% gesetzt.

Ergebnisse 57

3.7 Transkomplementation durch retroviralen Gentransfer

Um mit einem alternativen Ansatz sicherzustellen, dass allein die Absenz des

UL24-Genproduktes für den initial beobachteten Effekt auf den Zelltropismus des

Virus verantwortlich ist, wurde versucht, den Defekt des UL24-Deletionsvirus

TB4delUL24 durch Transkomplementation von GFP oder pUL24 in HFF zu

kompensieren. Da sich die primären Fibroblasten nur mit sehr geringer Effizienz

transfizieren lassen, pUL24 aber in möglichst vielen mit TB4delUL24 infizierten

Zellen vorhanden sein sollte, wurde auf die weitaus effizientere Methode der

retroviralen Transduktion zurückgegriffen. HFF wurden mit rekombinanten

Retroviren transduziert, welche als Kontrolle GFP oder UL24 exprimieren sollten.

48 Stunden später wurden die Zellen mit TB4delUL24 überinfiziert. Die

entsprechenden Überstände wurden wiederum fünf Tage später verwendet, um

parallel HFF und HUVEC zu infizieren. Wie in Abbildung 23 zu sehen, zeigten die

Viren in den Fibroblasten vergleichbare Infektionsraten, womit gewährleistet war,

dass die Virustiter der verwendeten Überstände vergleichbar waren. Durch die in

trans Expression von pUL24 gelang es, den Anteil an IE-positiven HUVEC wieder

auf Wildtyp-Niveau anzuheben (Abb. 23 B, d und f). Die Expression von GFP

zeigte keinerlei Auswirkung auf den ursprünglichen Phänotyp von TB4delUL24 in

Endothelzellen (Abb. 23 B, e).

Um zu demonstrieren, dass die mit dem UL24-Retovirus transduzierten HFF im

Gegensatz zu den Kontrollzellen auch tatsächlich UL24 exprimieren, wurde aus

den Zellen der jeweiligen Ansätze gesamtzelluläre RNA isoliert und cDNA

generiert. In der folgenden PCR wurde gezeigt, dass UL24-spezifische cDNA

nachweisbar war, und zwar nur in den mit UL24-Retrovirus transduzierten Zellen

(Abb. 23 C, Spuren 1 und 2). Eine DNA-Kontamination der RNA-Proben wurde

durch eine Aktin-PCR bei Verwendung von RNA als Template ausgeschlossen

(Abb. 23 C, Spuren 1 und 2). Die erfolgreiche Generierung von vergleichbaren

Mengen an cDNA wurde durch eine Aktin-PCR unter Vorgabe der verschiedenen

präparierten cDNAs gewährleistet (Abb. 23 C, Spuren 1 und 2).

Ergebnisse 58

(D) Nachweis von Aktin bzw. UL24 in mit Retro-GFP (Spur 1) oder Retro-UL24 (Spur 2) transduzierten HFF.

(B) HCMV IE-Genexpression wurde mit dem Mausantikörper E13 (Argene) mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen.

Die Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt. (C) Quantifizierung der IE-positiven Zellen in % relativ zur Gesamtzellzahl. HFF

(schwarze Balken), HUVEC (weiße Balken). Die Infektionsrate des Wildtyps wurde 100% gesetzt.

Abb. 23: Transkomplementation von delUL24 durch retrovirale Transduktion. (A) Schematische Darstellung des

experimentellen Ablaufs: HFF wurden mit rekombinanten Retroviren transduziert, 48 h bei 37°C kultiviert und

anschließend mit HCMV TB4delUL24 (MOI=2) überinfiziert. Weitere fünf Tage später wurden die Überstände geerntet

und damit HFF oder HUVEC infiziert. Die Auswertung erfolgte über IE-Antigennachweis in Immunfluoreszenzanalysen.

Ergebnisse 59

3.8 Einfluss auf Epithelzelltropismus

Nachdem UL24 eine Rolle beim Endothelzeltropismus von HCMV spielt, wurde im

Folgenden untersucht, ob auch die Infektion weiterer Zelltypen durch das Virus

beeinträchtigt wird. Nachdem in kürzlich veröffentlichten Studien [Wang et al.,

2005a] gezeigt wurde, dass das UL131 Gen, welches ebenfalls eine Determinante

für Endothelzelltropismus darstellt, auch für den Epithelzelltropismus des Virus

mitverantwortlich ist, sollte im Rahmen dieser Arbeit ein möglicher Einfluss von

pUL24 auf die Infektion von ekotodermalen Zellen wie Epithelzellen oder Zellen

neuronalen Ursprungs untersucht werden. In beiden Fällen handelt es sich um für

das Virus pathogenetisch relevante Zelltypen: Epithelzellen unterschiedlichster

Gewebe (Muttermilchkanal, Speicheldrüse, Niere usw.) stellen für HCMV

vermutlich eine der Hauptstätten für die Virusproduktion dar [Britt et al., 1996] und

ermöglichen es dem infektiösen Virus somit über Muttermilch, Speichel, Urin usw.

verbreitet zu werden. Zellen mit neuronalem Hintergrund stellen für das HCMV,

wie bei anderen Herpesviren (HSV-1, VZV) möglicherweise einen Ort dar, an dem

es sicher vor Angriffen des Immunsystems im Wirtskörper verweilen kann (Ort der

Latenz).

HeLa-Zellen oder RPE-1-Zellen stellvertretend für Epithelzellen und SK-N-SH oder

MGU373-Zellen als Zellen neuronaler Abstammung wurden mit TB4wt-BAC,

delUL24 oder revUL24 inkubiert und infizierte Zellen 24 hpi mit einem gegen

HCMV IE gerichteten Antikörper in der Immunfluoreszenzanalyse nachgewiesen

(Abb. 24 A). Es wurde gezeigt, dass die Deletion des UL24-Leserasters keine

Auswirkung auf die Fähigkeit des Virus hat, Zellen des zentralen Nervensystems

zu infizieren (Abb. 24 A, i, j). Bei den Epithelzellen waren wie schon bei den

Endothelzellen deutlich weniger IE-positive Zellen im Vergleich zu WT oder

Revertante zu sehen (Abb. 24 A, g, h). Im Rahmen der quantitativen Auswertung

wurden Infektionsraten von ca. 13% (RPE1) bzw. 2% (HeLa) im Vergleich zur

Wildtypinfektion gemessen (Abb. 24 B).

Ergebnisse 60

Abb. 24: Beteiligung von pUL24 am Epithelzelltropiusmus von HCMV. (A) HFF, Epithelzellen (RPE-1 und HeLa)

oder Zellen mit neuronalem Hintergrund (U373MG und SK-N-SH) wurden mit angegebenen Viren infiziert (MOI=1), 24

hpi fixiert und IE-Genexpression mit dem Mausantikörper E13 (Argene) nachgewiesen. Die Zellkerne wurden mit DAPI

gefärbt. (B) Quantifizierung der IE-positiven Zellen in % relativ zur Gesamtzellzahl. Der Anteil an IE-positiven Zellen

nach Infektion mit TB4wtBAC, delUL24 und Revertante ist tabellarisch aufgeführt. Die Infektionsrate des Wildtyps

Ergebnisse 61

3.9 Einfluss auf Makrophagentropismus

Makrophagen als Teil der unspezifischen Immunantwort ein äußerst interessanter

Zelltyp im Bezug auf virale Infektionen. Im Rahmen von Entzündungen oder der

zellulären Immunantwort sind sie häufig stimulierenden oder aktivierenden

Substanzen ausgesetzt, wodurch die Zellen eine Reihe intrinsischer oder

extrinsischer antiviraler Faktoren produzieren. An diese feindliche Umgebung

muss sich das Virus adaptieren.

Verschiedenste Faktoren können am Makrophagentropismus von HCMV beteiligt

sein. Der Grad der Differenzierung von Monozyten bis hin zu aktivierten

Makrophagen beispielsweise kann sich auf die Suszeptibilität der Zellen auswirken

[Soderberg-Naucler et al., 1997] aber auch genetische Faktoren auf Seiten des

Virus spielen eine Rolle. Für das MCMV wurden bereits mehrere Gene

beschrieben, deren Mutation die virale Replikation in Fibroblasten nicht beeinflusst

aber eine deutliche Reduktion des Viruswachstums in Makrophagen bewirkt.

Darunter auch die US22-Gene M36 [Ménard et al., 2003, Skaletskaya et al., 2001]

und M139-M141 [Ménard et al., 2003]. Die HCMV Endothelzelldeterminanten

UL128-UL131 scheinen ebenfalls den Makrophagenzelltropismus zu beeinflussen

[Hahn et al., 2004] und es wird vermutet, dass der Tropismus von HCMV in

Endothelzellen und Makrophagen einem ähnlichen, wenn nicht dem gleichen

Tropismus unterliegt [Sinzger et al., 2006]. Da für pUL24 eine Beteiligung am

Endothelzelltropismus des HCMV gezeigt werden konnte, wurde nun die

Bedeutung des Proteins bezüglich des Makrophagentropismus untersucht.

HFF (Abb. 25, a-c) und humane, aus primären Monozyten differenzierte

Makrophagen (Abb. 25, d-f) wurden mit TB4wt-BAC, delUL24 oder revUL24

infiziert und 24 hpi per Immunfluoreszenzanalyse auf HCMV IE-Genexpression hin

untersucht. Für das UL24-Deletionsvirus konnte bei vergleichbarer Infektiosität in

HFF eine stark verminderte Anzahl an IE-positiven Makrophagen im Vergleich zu

Wildtyp und Revertante detektiert werden (Abb. 25, e).

Ergebnisse 62

Abb. 25: Beteiligungvon pUL24 amMakrophagentropismus von HCMV. HFF (a-c)

oder Makrophagen (d-f)

wurden mit angegebenen

Viren infiziert (MOI=1), 24

hpi fixiert und IE-

Genexpression mit dem

Mausantikörper E13

(Argene) nachgewiesen.

Die Zellkerne wurden mit

DAPI gefärbt.

3.10 Verringerte Infektiösität in Endothelzellen durch Zentrifugation kompensierbar

Es ist beschrieben, dass durch eine niedrigtourige Zentrifugation von HCMV auf

Wirtszellen ein deutlich höherer Grad an Infektion erreicht werden kann [Hudson

et al., 1976, Hudson 1988]. Um zu überprüfen, ob der in Endothelzellen

beobachtete Phänotyp durch eine Inokulation des Virus unter Zentrifugation

beinflusst wird, wurden HFF und HUVEC parallel mit oder ohne

Zentrifugationsschritt infiziert. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die

Infektionsrate von TB4delUL24 oder TB4mut1.+2.ATG in Endothelzellen durch

das Aufzentrifugieren deutlich erhöht werden konnte (Abb. 26, n und t bzw. r und

x). In Fibroblasten blieb die Infektionsrate mit oder ohne Zentrifugation nahezu

gleich (Abb 26, a-l). Im Rahmen dieses Experimentes konnte gezeigt werden,

dass der in der initialen Phase der viralen Replikation auftretende Defekt der

Deletionsmutante zumindest teilweise durch einen niedrigtourigen

Zentrifugationsschritt kompensiert werden kann.

Ergebnisse 63

Abb

. 26:

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Ergebnisse 64

3.11 Beteiligung von pUL24 an Entry-Prozessen des HCMV in Endothelzellen

Die Aufnahme von HCMV erfolgt vermutlich abhängig vom Zelltyp auf

unterschiedlichen Wegen. Der in Fibroblasten überwiegend beschriebene

Mechanismus ist die Fusion des Virus mit der zytoplasmatischen Zellmembran;

aber auch die Aufnahme von Viruspartikeln über Endozytose wird gegenwärtig

besonders in Endothelzellen diskutiert.

3.11.1 Aufnahme von HCMV TB4-BAC in Endothelzellen über Endosomen

Viele Viren, die über Endozytose internalisiert werden, benötigen einen niedrigen

pH-Wert innerhalb der Endosomen, um deren Fusion mit den viralen

Glykoproteinen zu fördern. Lysosomotrope Agenzien wie zum Beispiel NH4Cl oder

Chloroquine verhindern eine Ansäuerung der Endosomen dadurch, dass sie den

endosomalen pH-Wert puffern. Es konnte bereits mehrfach gezeigt werden, dass

diese Substanzen Infektionen von Viren, welche einen niedrigen endosomalen pH-

Wert benötigen, inhibieren. Um zu testen, ob auch HCMV für die Infektion einen

niedrigen endosomalen pH-Wert benötigt, wurden HFF und HUVEC während der

frühen Phase der Infektion durch HCMV TB4-BAC gar nicht, mit NH4Cl oder mit

Chloroquine behandelt (Abb. 27). Als Toxizitätskontrolle wurden die jeweiligen

Substanzen in parallelen Ansätzen erst 4 Stunden nach Infektion, d.h. nach Ablauf

der relevanten Infektionsschritte, zu den Zellen gegeben (Abb. 27 A, i-l). Der Anteil

der IE-positiven Zellen an der Gesamtzellzahl wurde 24 hpi mittels

Immunfluoreszenz bestimmt. Bei den Fibroblasten konnte keine Abhängigkeit von

lysosomotrophen Substanzen festgestellt werden (Abb. 27 A, e und g),

wohingegen die Endothelzellen eine deutliche Reduktion an IE-positiven Zellen

aufwiesen (Abb. 27 A, f und h). Ein zytotoxischer Effekt der verwendeten Drogen

war nicht zu erkennen (Abb. 27 A, i-l). Durch dieses Experiment wurde gezeigt,

dass von HCMV-TB4 zelltypabhängig unterschiedliche Aufnahmewege verwendet

werden und in Endothelzellen der pH-abhängige, endosomale Weg favorisiert

wird. Die quantitative Analyse der Daten ist in Abb. 27 B dargestellt. Insbesondere

der Einsatz von NH4Cl führte in HUVEC zu einer Reduktion der Anzahl IE-positiver

Zellen um mehr als 90%.

Ergebnisse 65

Abb. 27: Eindringen von TB4wtBAC in Endothelzellen über einen pH-abhängigen endosomalen Pfad. (A) HFF oder

HUVEC wurden mit TB4wtBAC in Gegenwart oder Abwesenheit der lysosomotrophen Substanzen NH4Cl (50mM) oder

Chloroquine (100µM) infiziert (MOI=1). Als Toxizitätskontrolle wurden die Substanzen den Zellen 4 hpi zugegeben. 24 hpi

wurden die Zellen auf IE-Genexpression untersucht (Maus-Anti-IE E13, Argene). (B) Quantifizierung der IE-positiven Zellen

in % relativ zur Gesamtzellzahl. Unbehandelt (weiße Balken), mit Inhibitor (schwarze Balken) und Behandlung 4 hpi (graue

Balken). Die Infektionsrate ohne Inhibitor wurde 100% gesetzt.

Ergebnisse 66

3.11.2 Störung der Freissetzung von UL24-Deletionsviren aus endosomalen Vesikeln

Nachdem für TB4-BAC in Endothelzellen die Virusaufnahme über Endozytose

gezeigt wurde, sollte die Beteiligung von pUL24 an diesem Prozess

elektronenmikroskopisch untersucht werden. Endothelzellen wurden unter

Verwendung einer MOI von 100 mit TB4wtBAC oder delUL24 infiziert und 3 hpi

durch die Hochdruckgefriertechnik fixiert. Nach einer langsam ablaufenden

Substitution wurden die Präparate eingebettet, geschnitten und kontrastiert.

Anhand dieser Präparate konnten im Elektronenmikroskop Kapside der

Wildtypvirionen sowohl endosomal als auch frei im Zytoplasma vorkommend

detektiert werden. Wurden die Zellen mit UL24-Deletionsvirus infiziert, so konnten

infektiöse Viruspartikel zwar ebenfalls in endosomalen Vesikeln, jedoch nie in

freier, zytoplasmatischer Form lokalisiert werden (Abb. 28). Außerdem konnte

festgestellt werden, dass sich die infektiösen Viruspartikel selbst und die infizierten

Zellen (Daten nicht gezeigt) phänotypisch nicht von denen des Wildtyps

unterscheiden. Diese Beobachtungen deuten auf eine Rolle von pUL24 bei der

Freisetzung von Viruspartikeln aus endosomalen Vesikeln hin.

Abb. 28: Elektronenmikroskopische Aufnahme infizierter HUVEC. HUVEC wurden bei einer MOI von ca. 100 mit

TB4wt-BAC oder TB4delUL24 infiziert und 3 hpi unter hohem Druck Schockgefroren. Nach Gefriersubstitution und

Einbettung in Plastik wurden ca. 60 nm dicke Schnitte analysiert. Die Partikelmorphologie der Mutante unterschied sich

nicht von der des Wildtypvirions. In Wildtyp-infizierten Zellen konnten endosomale Virionen und im Gegensatz zur

Mutante auch im Zytoplasma freiliegende Kapside beobachtet werden (schwarze Pfeile). M: Mitochondrium, E:

Endosom, ER: Endoplasmatisches Retikulum, Z: Zytoplasma.

Diskussion 67

4 Diskussion

Das Humane Zytomegalievirus besteht wie alle Herpesviren aus einem

Nukleokapsid, welches von der Tegumentschicht umgeben ist und durch die virale

Hüllmembran von der Umwelt nach außen abgegrenzt ist. Das Tegument setzt

sich aus 20-25 Virion-assoziierten Proteinen zusammen [Mocarski und Courcelle,

2001], von denen viele phosphoryliert sind und deren Funktionen gegenwärtig

noch nicht im Detail bekannt sind. Eines der am häufigsten vorkommenden

Tegumentproteine ist ppUL32. Bei letzterem handelt es sich um ein für die

Vermehrung des HCMV essentielles Protein, welches mit seinem Aminoterminus

an das virale Kapsid bindet [Baxter et al., 2001]. Analysen mittels Yeast Two-

Hybrid System in unserer Arbeitsgruppe identifizierten pUL24 als

Interaktionspartner des N-Terminus von ppUL32. Bei pUL24 handelt es sich um

einen Vertreter der US22-Genfamilie, die für Betaherpesviren spezifisch ist.

Andere Vertreter dieser Genfamilie sind wichtig für die Genregulation [Mori et al.,

1998, Romanowski et al., 1997], die Modulation des programmierten Zelltod

(Apoptose) [McCormick et al., 2003, Skaletskaya et al., 2001] und den

Zelltropismus von CMV [Hanson et al., 2001, Ménard et al., 2003, Xiao et al.,

2000]. Aus den oben genannten Gründen sollte die funktionelle Bedeutung von

pUL24 im Rahmen dieser Doktorarbeit geklärt werden.

4.1 Herstellung von Antikörpern und Lokalisation von pUL24

Zunächst wurde ein polyklonales Antiserum gegen prokaryot exprimiertes pUL24

hergestellt. Nachdem erste Expressionsversuche von pUL24 als His6- oder GST-

getaggtes Protein gescheitert waren, wurde das Maltose-Bindeprotein (MBP) als

Fusionspartner gewählt. Das MBP fungiert als eine Art Chaperon, welches die

Löslichkeit des Zielproteins erhöht und aufgrund seiner hohen Affinität zu Maltose

eine Aufreinigung des Fusionsproteins in einer Ein-Schritt-Reaktion ermöglicht [di

Guan et al., 1988, Maina et al., 1988, Kellermann et al., 1982]. Die Fusion aus

Maltose-Bindeprotein und Volllänge-pUL24 konnte in E.coli überexprimiert und für

die Immunisierung von Kaninchen eingesetzt werden. Das gewonnene Serum

zeigte im Gegensatz zum Präimmunserum sowohl in der Immunfluoreszenz-

Diskussion 68

Analyse als auch im Western Blot eine spezifische Reaktion mit pUL24. Für

pUL24 wurde eine Molekularmasse von 40 kDa gemessen, was mit der

berechneten Masse gut übereinstimmt.

Die Lokalisation von pUL24 in transfizierten 293T- und HeLa-Zellen war

überwiegend nukleär, was auf eine Beteiligung von pUL24 an nukleären

Prozessen wie z. B. Genregulation hinweist. Dies steht im Gegensatz zur

veröffentlichten zytoplasmatischen Lokalisation von pUL24 in Fibroblasten [Adair

et al., 2002]. In dieser Publikation wurde allerdings die Lokalisation nach Infektion

der Zellen mit HCMV bestimmt. Möglicherweise kann die unterschiedliche

Lokalisation durch die Mitwirkung weiterer viraler Proteine erklärt werden.

Tatsächlich konnte in Folgeexperimenten eine veränderte Lokalisation durch

Koexpression von ppUL32 beobachtet werden (siehe unten).

4.2 Interaktion von pUL24 und ppUL32

Die initial beobachtete Interaktion zwischen pUL24 und ppUL32 wurde durch Ko-

Immunpräzipitationsexperimente in transient transfizierten Zellen bestätigt. Dies

war ein weiterer Hinweis für eine physische Interaktion zwischen den beiden

Proteinen. Weitere Interaktionen [K. Schierling, Dissertation] konnten in diesem

System bestätigt werden, was zu der Annahme führt, dass pUL24 zusammen mit

ppUL35, ppUL32 und ppUL82 einen Proteinkomplex bildet (Abb. 29). Allerdings

wurden die viralen Proteine in diesem System stark überexprimiert, so dass

möglicherweise Interaktionen detektiert werden, welche nicht die natürliche

Situation wiederspiegeln. Um Gewissheit über eine tatsächliche Interaktion unter

Abb. 29: Schematische Darstellung eines möglichen pUL24/ppUL32-Proteinkomplexes. Rosa Ovale: Tegumentproteine;

rote Linien: direkte, nachgewiesene Interaktionen zwischen den Tegumentproteinen. Blaues Hexagon: Viruskapsid mit viraler

DNA.

Diskussion 69

Infektionsbedingungen zu erlangen, wurden Ko-Immunpräzipitationen aus mit

HCMV TB40E infizierten HFF durchgeführt. Die Interaktion zwischen pUL24 und

ppUL32 konnte auch hier bestätigt werden. Die Kontrollpräzipitation gegen pUL48

zeigte, dass die Interaktion jedoch unabhängig von einem weiteren vor kurzem

identifizierten Proteinkomplex, bestehend aus pUL47, pUL48, pUL69 und pUL86,

dem Haupt-Kapsidprotein (MCP) [Bechtel et al., 2002] zu sein scheint. Viele

Tegumentproteine sind früh im viralen Replikationszyklus im Zellkern anzutreffen

[Bechtel et al., 2002, Hensel et al., 1995, Liu et al., 2002, Winkler et al., 1996] und

werden erst später ins Zytoplasma transportiert, wo sie in Kompartimenten

akkumulieren, welche für die Tegumentierung verantwortlich sind [Sanchez et al.,

2000]. Im Rahmen von Kolokalisationsexperimenten wurde gezeigt, dass pUL24

bei gleichzeitiger Expression von ppUL32 seine ursprünglich nukleäre Lokalisation

in transfizierten HeLa-Zellen ändert. Auch ppUL32, welches normalerweise

cytoplasmatisch vorliegt, ändert in diesem Fall seine Lokalisation dahingehend,

dass beide Proteine in perinukleären Bereichen zu finden waren. Dies zeigt nicht

nur, dass beide Proteine im selben Kompartiment vorliegen, sondern erhärtet auch

die Daten einer funktionellen Interaktion. Weiterhin stimmen diese Ergebnisse mit

veröffentlichten Daten welche pUL24 in infizierten Zellen eine cytoplasmatische

Lokalisation in der Nähe des Zellkerns zuweisen überein.

4.3 Funktionelle Analyse von pUL24

Für verschiedene Tegumentproteine konnte eine transaktivierende Wirkung auf

den HCMV IE-Promoter gezeigt werden [Liu et al., 1992, Schierling et al., 2004,

Winkler et al., 1996]. Darunter auch die Mitglieder der US22-Genfamile IRS1 und

TRS1 [Romanowski et al., 1997]. Es wurde ebenfalls beobachtet, dass das

Positionshomolog von HCMV-UL24, das HHV6-U3-Protein in transienten

Luziferase-Reportergenassys eine Transaktivierung des HIV1 LTR bewirkt [Mori et

al., 1998]. Deshalb wurde in dieser Arbeit der Einfluss von pUL24 auf eine Reihe

verschiedener Promotoren (HCMV IE-Promotor, HIV1-LTR, SV40-Promotor)

getestet. Es konnte eine zweifache Aktivierung in Gegenwart von pUL24 gezeigt

werden, welche allerdings nicht promotorspezifisch war. Interessanterweise

zeigten die Zellen nach Transfektion von ppUL32 eine Repression der

Promotoraktivität, welche auch bei Kotransfektion der beiden Interaktionspartner

Diskussion 70

dominant war. Um zu klären, ob pUL24 im Rahmen des neu identifizierten

Proteinkomplexes einen kooperativen, transaktivierenden Effekt bewirkt, wie es für

ppUL35 und ppUL82 [Liu et al., 2002], ppUL69 und ppUL82 [Winkler et al., 1995]

oder ppUL35, ppUL69 und ppUL82 [Schierling et al., 2004] beschrieben wurde,

wurden pUL24, ppUL32, ppUL35 und ppUL82 in verschiedenen Kombinationen

kotransfiziert. Hierbei konnte eine Zunahme der Promotoraktivität um jeweils den

Faktor 2 durch die Expression von pUL24 beobachtet werden. Allerdings war in

keinem Fall ein überproportionaler Anstieg der Luziferasetranskription zu sehen.

Es lässt sich somit zusammenfassend sagen, dass pUL24 über eine

transaktivierende Wirkung verfügt, welche jedoch promotorunabhängig ist und

keinen kooperativen Effekt aufweist.

4.4 Bedeutung von UL24 für den Endothelzelltropismus

Um mehr über die biologische Funktion von pUL24 in Erfahrung zu bringen, wurde

eine UL24-Deletionsmutante, TB4delUL24, mittels gerichteter, RecET-vermittelter

BAC-Mutagenese [Wagner et al., 2002] generiert. Die Mutationen wurden im

bacterial artificial chromosome (BAC) TB4 durchgeführt, welches auf dem stark

endotheliothropen HCMV-Stamm TB40E [Hahn et al., 2003] basiert. Da in diesem

System alle Rekombinationsschritte in E.coli ablaufen, ist im Verlauf der

Mutagenese klonales Arbeiten und somit die anschließende Verwendung reiner

Viruspopulationen gewährleistet. Auf Grundlage von TB4delUL24 wurde durch

Wiedereinbringen des UL24-Leserahmens mit der gleichen Methode die

Virusrevertante TB4revUL24 generiert.

Bei der Infektion von Fibroblasten zeigte sich TB4delUL24 genauso effizient wie

das vom Wildtyp-BAC abstammende Virus oder die Revertante. Die Deletion hatte

allerdings eine starke Auswirkung auf die Fähigkeit des Virus eine Infektion in

Endothelzellen zu etablieren. Dieser Zelltyp verfügt mit seiner

Schnittstellenfunktion zwischen Blutkreislauf und Organgewebe über das

Potential, durch die Verbreitung von infizierten vaskulären Endothelzellen zur

Entwicklung von HCMV-assoziierten Erkrankungen beizutragen [Digel et al.,

2006]. Wir konnten zeigen, dass der Virustiter von TB4delUL24 2-3 log-Stufen

unter denen von TB4 oder TB4revUL24 lag. Diese Daten stimmen mit

zwischenzeitlich veröffentlichten Studien überein, bei denen komplette

Diskussion 71

Leserahmen von HCMV genomweit deletiert wurden [Dunn et al., 2003]. Allerdings

wurde diese Arbeit im Hintergrund des schwach endotheliotropen Stammes

Towne durchgeführt. Eine Beteiligung von pUL24 am natürlichen Zelltropismus

von HCMV bei einem hoch endotheliotropen Stamm wurde dagegen noch nicht

beschrieben. Das normale Wachstum der Revertante zeigte, dass außer der

Deletion des UL24-Leserahmens keine weiteren, ungewollten Mutationen den

beobachteten Phänotyp hervorgerufen haben.

Im Rahmen einer eingehenden Untersuchung der UL24-Genregion wurde anhand

von RACE-Analysen festgestellt, dass die Transkripte von UL24 und UL25

überlappen. Die komplette Deletion des UL24-ORF führte somit auch zu einer

funktionellen Inaktivierung des benachbarten UL25-Leserasters. So konnte in

Zellen, welche mit TB4delUL24 infiziert waren, nach RT-PCR nur eine deutlich

verminderte Menge an UL25-Transkripten nachgewiesen werden. Betrachtete

man die Expression von UL25 auf Proteinebene, so war im Fall der

Deletionsmutante kein pUL25 nachweisbar.

Offenbar beeinträchtigt die Deletion von UL24 den Promotor von UL25, da mit

dem UL24 Leserahmen auch eine TATA-Box entfernt wird, die vermutlich für das

UL25-Transkript verantwortlich ist. Aufgrund dieser Daten kann man nicht

ausschließen, dass allein die Expression von UL24 für den bei der

Deletionsmutante beobachteten Phänotyp verantwortlich ist. Um diese Frage zu

klären, wurden weitere Mutanten generiert. Hierbei wurden das erste Startkodon,

ein weiteres ATG an Position 59 oder beide ATGs von pUL24 mutiert. Die

Mutation des ersten ATG führte zur Entstehung eines verkürzten UL24-

Genprodukts, wohingegen die Mutation des M59 keinen Effekt zeigte. Allein nach

Umwandlung beider Methionine konnte kein pUL24 mehr nachgewiesen werden.

Bei allen drei Mutanten war die Expression von pUL25 nicht beeinträchtigt. In den

folgenden Virus Yield-Experimenten wurde für die Doppelmutante eine Reduktion

der Virustiter vergleichbar TB4delUL24 beobachtet. Interessanterweise lieferte

TB4mut1.ATG einen intermediären, schwach attenuierten Phänotyp.

Möglicherweise konnte das nicht voll funktionsfähige, verkürzte Protein immer

noch einen Teil seiner Aufgaben bei der Infektion von Endothelzellen erfüllen.

Um die Beteiligung von pUL25 am Zelltropismusdefekt von TB4delUL24 in einem

alternativen Ansatz auszuschließen, wurden HFF mit rekombinanten retroviralen

Vektoren transduziert und somit pUL24 exogen exprimiert. Wurde pUL24 in trans

Diskussion 72

zur Verfügung gestellt, konnte die Anzahl an HCMV-infizierten HUVEC auf

Wildtypniveau angehoben werden. Diese Daten stimmen mit Studien überein, in

denen gezeigt wurde, dass die Entfernung des UL25-Leserahmens keinen

Einfluss auf Endothel- noch Epithelzelltropismus ausübt [Dunn et al., 2003].

4.5 Bedeutung von UL24 für Epithelzell- und Makrophagentropismus

Epithelzellen spielen eine zentrale Rolle bei der Verbreitung und Persistenz im

immungesunden Wirt [Britt et al., 1996]. Zusätzlich wurden bei Patienten mit

geschwächtem Immunsystem zytopathische Effekte, die für eine CMV-infektion

typisch sind, in Epithelzellen unterschiedlichster Gewebe beschrieben [Ho 1991].

Nachdem für HCMV UL131, einer anderen molekularen Determinante des

Endothelzelltropismus von HCMV (HCMV UL128-131 [Hahn et al., 2004]),

berichtet wurde, dass es auch für Epithelzelltropismus benötigt wird [Wang et al.,

2005b], wurden im Rahmen dieser Arbeit Effekte auf die Infektion anderer

Zelltypen durch TB4delUL24 untersucht. In Immunfluoreszenzanalysen konnte wie

schon bei den Experimenten mit Endothelzellen eine deutlich verringerte Anzahl

an IE-positiven Epithelzellen am Beispiel von HeLa oder RPE1 gezeigt werden.

Kürzlich erschienene Studien haben basierend auf Mutationsanalysen des MCMV

sechs Gene identifiziert (M36, M45, M78, M139, M140 und M141 [Ménard et al.,

2003]), welche nach Mutation bzw. Deletion eine effektive Infektion von

Makrophagen nicht mehr ermöglichen. Sie alle verfügen über homologe Gene in

HCMV. Weiterhin ist es bemerkenswert, dass mit M36 und M139-M141 vier dieser

Gene wie auch HCMV-pUL24 der US22-Genfamilie angehören. Bei Infektion von

aus primären Monozyten differenzierten Makrophagen, zeigte TB4delUL24 erneut

den Phänotyp, der schon in Endothel- und Epithelzellen beobachtet werden

konnte. Weitere Experimente, ob es sich hierbei wie im Fall von M36 um einen

anti-apoptotischen Effekt [Ménard et al., 2003] handeln könnte, stehen noch aus.

Es scheint sich allerdings um einen zellübergreifenden Mechanismus zu handeln,

durch den das Tegumentprotein HCMV-pUL24 neben seiner Rolle bei der

Infektion von Endothelzellen auch einen Effekt auf die Infektion von Epithelzellen

und Makrophagen ausübt.

Diskussion 73

4.6 Mechanismus des Endothelzelltropismus

Zum bisherigen Zeitpunkt kann noch keine Aussage darüber getroffen werden,

welche biologischen Mechanismen einen verminderten Endothelzelltropismus

bewirken. Bei Analyse der IE-Genexpression von TB4delUL24 anhand von

Immunfluoreszenzanalysen konnte gezeigt werden, dass sich das Virus bereits in

dieser Phase der viralen Replikation deutlich von TB4 und TB4revUL24

unterschied. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit Veröffentlichungen,

welche sich mit HCMV-Endothelzelltropismus auseinandersetzen [Sinzger et al.,

1999].

Allgemein gibt es bezüglich des Endothelzelltropismus von HCMV deutliche

Hinweise darauf, dass zumindest teilweise genetische Faktoren verantwortlich

sind. So zeigte ein klinisches Isolat, welches über einen längeren Zeitraum auf

Fibroblasten (TB40F) propagiert wurde, einen Verlust seines Endotheltropismus,

während nach Kultivierung auf Endothelzellen (TB40E) sowohl Endothel- als auch

Fibroblastentropismus erhalten blieb [Sinzger et al., 1999]. Weiterhin zeigten diese

unterschiedlich kultivierten Virusstämme Unterschiede bei der

Restriktionsfragment-Analyse ihrer Genome [Sinzger et al., 1999].

In der Region UL128-UL131, welche für eine produktive Infektion von

Endothelzellen unverzichtbar ist [Hahn et al., 2004], wurden häufig Mutationen

gefunden. Vor allem in fibroblastenadaptierten Stämmen wurden Mutationen in

dieser Genregion beobachtet [Dolan et al., 2004]. Bemerkenswerterweise können

bereits drei Passagen eines endothelgängigen Stammes auf Fibroblasten

ausreichen, um eine Mutation in der UL128-131 Region zu induzieren, welche

einen Verlust des Endothelzelltropismus zur Folge hat [Akter et al., 2003]. Eine

vergleichende Analyse der UL24-ORFs von TB40E und TB40F wies keine

Abweichungen voneinander auf (R. Pretsch, Daten nicht gezeigt), sodass eine

Mutation in UL24 nicht für den unterschiedlichen Tropismus dieser beiden

Stämme verantwortlich ist.

Über den zellbiologischen Mechanismus, der dem HCMV-Zelltropismus zugrunde

liegt, gibt es gegenwärtig mehrere Ansichten. Die aktuellen Hypothesen beinhalten

eine differentielle Expression von antiapoptotischen Faktoren [Brune et al., 2001],

die Fähigkeit Mikrofusionen zwischen benachbarten Zellen zu induzieren um eine

Verbreitung von Zelle zu Zellen zu unterstützen [Gerna et al., 2000] oder die

Bildung unterschiedlicher Glykoprotein-Komplexe, wodurch eine Adsorption des

Diskussion 74

Virus an die Zelle erst möglich wird [Wang et al., 2005a]. Auch Unterschiede bei

der Freisetzung viraler Genome erfolgreich eingedrungener Viruspartikel in

Endothelzellen zu initialen Zeitpunkten der viralen Infektion wurden beschrieben.

So gibt es Veröffentlichungen, in denen gezeigt wurde, dass der Transport zum

Kern von Viruskapsiden niedrig endotheliotroper Stämme in EC fast komplett

blockiert ist, während sie in Fibroblasten effizient funktioniert [Sinzger et al., 2000].

Dies könnte daran liegen, dass HCMV bei EC einen alternativen Weg in die Zellen

geht, als die in Fibroblasten übliche Fusion der Viruspartikel mit der

Wirtszellmembran [Compton et al., 1992]. Ultrastrukturelle Untersuchungen haben

gezeigt, dass in EC die Aufnahme der Virionen mittels Endozytose erfolgt und eine

nachfolgende Degradation der Partikel der Grund für die niedrige Infektiosität des

Laborstammes AD169 ist [Bodaghi et al., 1999]. Weiterhin wurde beobachtet,

dass der Eintritt verschiedener endothel- und epithelgängiger HCMV über

Endozytose und anschließende pH-abhängige Fusion der Viruspartikel mit den

Endosomen stattfindet [Ryckman et al., 2006], was im Rahmen dieser Arbeit auch

für das vom Wildtyp-BAC TB4 abstammende Virus bestätigt werden konnte. In

elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnten für TB4 Kapside sowohl in

endosomalen Vesikeln als auch frei im Zytoplasma nachgewiesen werden,

wohingegen TB4delUL24 bisher nur in Endosomen aufzufinden war. Dies führt zu

der Annahme, dass der Verlust von pUL24 möglicherweise einen Defekt bei der

Fusion des Viruspartikels mit der endosomalen Membran bewirkt. Eine neue

Methode, bei denen die Virusmembran mit zwei unterschiedlichen Farbstoffen,

grün- und rot-fluoreszierend, markiert ist, könnte helfen, diesen Aspekt zu klären.

Im markierten Viruspartikel sind die Farbstoffe eng gepackt und die

Grünfluoreszenz ist durch selfquenching und FRET (flourescent resonance energy

transfer) unterdrückt. Das Virus erscheint rot. Durch Fusion des Virus liegen die

Farbstoffe räumlich weniger dicht gepackt vor und es kommt zu einer verstärkten

Grünfluoreszenz (dequenching) [Sakai et al., 2006]. Offensichtlich findet der

Defekt nicht auf der Ebene der Genregulation statt, da die Anzahl der IE-positiven

Zellen bei einer Infektion mit TB4, TB4delUL24 oder TB4revUL24 nach

Zentrifugation des Virus auf die Zellen nahezu übereinstimmt. Um den

Mechanismus, wie genau pUL24 zur Infektion von Endothel- und Epithelzellen

oder Makrophagen beiträgt, detaillierter beschreiben zu können, bedarf es

weiterer Experimente. Aufschlussreich wäre beispielsweise eine biochemische

Diskussion 75

Markierung von Viruspartikeln, um den Weg der Viren in die Wirtszelle per Video-

Mikroskopie zu verfolgen.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass im Rahmen dieser Arbeit das virale

Protein HCMV-pUL24 als Interaktionspartner von HCMV-ppUL32 identifiziert

werden konnte. Die biologische Relevanz des Proteins konnte durch die

Generierung mehrerer Virusmutanten analysiert werden. Hierbei wurde gezeigt,

dass pUL24 am Zelltropismus von HCMV für Endothel-, Epithelzellen als auch

Makrophagen beteiligt ist.

Zusammenfassung 76

5 Zusammenfassung

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine initial beschriebene Interaktion der

Tegumentproteine pUL24 und ppUL32 des Humanen Zytomegalievirus (HCMV) in

transient transfizierten Zellen im Western Blot bestätigt, ihre Salzresistenz

dargestellt und sogar im Kontext infizierter Zellen gezeigt. Die Koexpression von

pUL24 und ppUL32 in transfizierten HeLa-Zellen führte zu einer Relokation beider

Interaktionspartner, sodass die Proteine im Bereich der Kernmembran

kolokalisierten. Da es Hinweise darauf gab, dass der benachbarte ORF UL25

durch eine komplette Deletion von UL24 ebenfalls beeinflusst wird, wurde eine

Transkriptkartierung der UL24 Genregion durchgeführt. Hierbei konnte eine

Überlappung der jeweils hauptverantworlichen Promotorbereiche beschrieben

werden. In transienten Transfektionsexperimenten konnte eine ungefähr

zweifache Transaktivierung verschiedener eukaryoter Promotoren beobachtet

werden.

Für eine effiziente Infektion von Fibroblasten wurde keine Relevanz von pUL24

festgestellt. Durch die Generierung einer HCMV-BAC (bacterial artificial

chromosome) UL24-Deletionsmutante im Hintergrund des endotheliotropen

Virusstammes TB40E und die Durchführung entsprechender

Infektionsexperimente wurde ein Einfluss des Gens auf den Zelltropismus des

Virus bestätigt. Hierzu erfolgten Studien in Endothel- und Epithelzellen. Anhand

von Punktmutanten und eines Transkomplementationsexperiments wurde pUL24

als verantwortliches Protein der Region um UL24 identifiziert. Letztlich wurde

anhand von elektonenmikroskopischer Aufnahmen gezeigt, dass sich die reifen

Viruspartikel der UL24 Deletionsmutante in endosomalen Vesikeln anhäufen und

somit nicht ins Zytoplasma der infizierten Zelle gelangen. Diese Beobachtung

zusammen mit Experimenten, welche zeigen, dass das Wildtyp-Virus bei der

Infektion der Wirtszellen den Weg über die Endosomen stark favorisiert, führen zu

der Hypothese, dass das UL24 Deletionsvirus einen Defekt bei der

Verschmelzung mit der endosomalen Membran hat. Um diese Frage zu klären

sind allerdings noch weiterführende Experimente notwendig, die über den

Rahmen dieser Arbeit hinaus gehen.

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Lebenslauf 85

Danksagung Zuallererst möchte ich Herrn PD Dr. Michael Winkler danken, der mich im Verlauf

meiner Doktorarbeit mit viel Geduld betreut hat und von dessen vielen Ideen ich

profitieren konnte. Herrn Prof. Dr. Thomas Mertens danke ich für viele anregende

Diskussionen während unserer Abteilungsseminare und dafür, dass er auch nach

meiner Diplomarbeit in der Abteilung Virologie Vertrauen in mich gezeigt hat.

Ich möchte mich bei Frau Prof. Dr. Barbara Spellerberg für die Übernahme des

Koreferats meiner Dissertation bedanken. Weiterhin bedanke ich mich bei Dr.

Heike Wilts, Dr. med Lutz von Müller und Dr. Barbara Reinhardt und Prof. Dr.

Detlef Michel für ihre Hilfe in manch kniffligen Fragen. Großer Dank gebührt auch

Anke Lüske und Monika Dürre, die meine Arbeiten tatkräftig unterstützt haben.

Besonders bedanken möchte ich mich bei meinen Mitdoktoranden, speziell bei

Jens Holl, den ich schon im Grundstudium kennen und im Verlauf meines

Studiums immer mehr schätzen gelernt habe.

Nicht vergessen möchte ich die „Fraktion Tischtennis“, Frank, Mike, Steffen, Jan

aus der HIV-AG und seit wenigen Monaten auch Jens von Einem.

Bei organisatorischen Fragen konnte ich mich stets getrost an Ingrid Bennett

wenden, die immer dafür gesorgt hat, das die Bürokratie nicht überhand nahm.

Natürlich bedanke ich mich bei meiner Familie, meinen Eltern und Freunden für

Ihre Unterstützung über mein ganzes Leben hinweg.

Annette, bei Dir bedanke ich mich, dass Du „in guten und in schlechten Zeiten“

immer für mich da warst, bist und auch sein wirst. Zusammen mit unserer Lena,

die dieses Jahr das Licht der Welt erblickt hat.

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Charakterisierung des Tegumentproteins pUL24 des Humanen