Chimeric Cytochromes P450 Engineered by Domain Swapping and Random Mutagenesis for Producing Human Metabolites of Drug

Ji-Yoen Kang et al.

Julia Majer

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• Enzymfamilie der Cytochrom P450 (CYPs)

• Hämproteine = Häme, als prosthetische Gruppe & Eisen-Ion als Zentralatom

• Ubiquitäres Vorkommen

• 57 verschiedene CYPs beim Menschen

• Lokalisation v.a. in der Leber (Inneren ER)

• Beteiligung an ca. 75 % aller metabolischen Reaktionen der auf dem Markt vorhandenen Arzneistoffe (Substanz → aktiven Metabolit → Wirkung)

• Substarte = körpereigene (Fett-, Gallensäure, Steroide) oder körperfremde Stoffe (Arzneimittel)

• Klasse: Oxidoreduktasen , genauer Monooxygenasen

→ wichtigste Reaktion: Hydroxylierung

Übertragen Sauerstoffatom des Sauerstoffmoleküls auf ein Substrat

→ R–H + O2 + NADPH + H+ → R–OH + H2O + NADP+

→ Reduktionsmittel: NADH/NADPH, Flavin/Flavoproteine oder Ferredoxin

Einleitung

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•P450 BM3 (CYP102A1)

• Bacillus megaterium

• 1982 von Fulco‘s Group UCLA identifiziert

• Nicht membrangebunden

• Identisch zur eukaryotischen CYP4A Familie (hydroxylieren

Fettsäuren)

• Natürliche Substrate: langkettige Fettsäuren (C12 bis C20)

• Besteht aus Häm(-Oxygenase)domäne (HämD)

• sowie den beiden C-terminalen Flavinadenindinukleotid- und

Flavinmononukleotid-Domänen mit der NADPH - P450 Reduktase

(ReduktaseD)

• Höchste katalytische Aktivität bei P450 Monooxygenasen

Einleitung

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P450 BM3 Struktur

3D Struktur

AW Munro et al., P450 BM3: the very model of a modern flavocytochromenull, Volume 27, Issue 5, 2002, 250–257 , http://dx.doi.org/10.1016/S0968-0004(02)02086-8

Bedeutung der FMN Domäne - Transportiert Flavin Cofaktor von

FAD zur P450 Häme Domäne- Transportiert durch NADPH

Oxidation hergestellte Elektronen- Erleichterte Bewegung (10 Ᾰ) durch

Linkerregion

Hydroxylierung am Eisen-Ion mittels Sauerstoff

Einleitung

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•Ziel der Studie: Mögliche Rolle der ReduktaseD in Bezug auf die katalytische Aktivität der HämD

• „Domain Swapping“ der ReduktaseD von zwei CYP102A1 Mutanten:

1.) katalytisch hoch aktiven CYP102A1 HämD Mutanten (M13, M15,

M16 und M17), zeigen hohe Aktivitäten gegenüber Lovastatin, 7-EC

und Phenacetin

2.) CYP102A1.2 (=V2) natürliche Variante mit 20 Mutationen in der

ReduktaseD, d.h. hohe Aktivität gegenüber Reduktase Substarten

(z.B. Ferricyanide und Cytochrome C)

• Herstellung Mutanten durch direkte Evolution und Rationales Design

• Expression in E. coli DH5αF‘-IQ Zellen

Vorgehensweise

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CYP102A1.2 (V2) mit 20 Mutationen in der ReduktaseD

Hoch aktive CYP102A1 Mutanten (*HämD) • Durch die Kombination der beiden Domänen

wurden Chimäras erzeugt → „Domain Swapping“

• Mittels Aktivität Assays gegenüber verschiedenen humanen P450 Substarten wurden Chimäras ausgewählt CYP102A1 Chimära

(M13V2, M15V2, M16V2 & M17V2)

CYP102A1 chimäre Mutanten von M16V2

• Anlegen von Bibliotheken der Chimäras• Random Mutagenesis mittels Error-Prone

PCR an der HämD→ Klonierung der amplifizierten Fragmente in Vektor → Transformation in E. coli DH5αF‘-IQ Zellen

→ 5,6 Mutationen pro 1.290 bp → Größe der Mutanten Bibliothek: 1,4 x

Vorgehensweise

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CYP102A1 chimäre Mutanten von M16V2

Whole-cell Assay→High Throughput Screening

• E. coli Zellen durchlaufen mehrere Wasch- und Inkubationsschritte in 96-Wellplatten

• Zugabe von p-Nitrophenol als Substrat & NADPH Regenerierungssytem

• Signal wird als Änderung der Farbintensität bei 510 nm gemessen (Microplate Reader)

→Selektion von 19 Mutanten höchster Aktivität

Katalytische Aktivität Assays→ HPLC

→Selektion der Mutanten höchster Aktivität

1. Typische humane P450 Substrate & Statine

2. HMG-CoA Reduktase Inhibitionsassay 3. Fettsäure Hydroxylierung

Vorgehensweise

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1a. Katalytische Aktivität Assays mit humanen P450 Substraten

• Katalytische Aktivität/Total Turnover Number (TTN): Wie schnell kann ein Enzym ein Edukt zum Produkt umsetzten?

• WT zeigte keine katalytische Aktivität gegenüber den Substarten (<0,1 )

Ergebnisse

• Acetaminophen (O-Deethylierung)

• 2-fach höhere Aktivität der M16V2 Mutanten

• 7-Hydroxy-4-FC (O-Deethylierung)

• HämD Mutanten und Chimäras identisch (0,07 - 4,5 )

• D12 zeigt 70-fache Erhöhung

• 6β-OH Chlorzoxazon (Hydroxylierung)

• B10 höchste Aktivität • HämD Mutanten und Chimäras <

1.1

• p-Nitrocatechol (Hydroxylierung)

• Fast alle Aktivität von ca. 140

Schmerzbehandlung & Fiebersenkung

Fluorogenes Substrat

Muskelkrämpfen

Intermediat in der Synthese von Paracetamol

*7-EFC = 7-Ethoxy-4-Trifluoromethylcoumarin

*

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1b. Katalytische Aktivität Assays mittels Statine

• Zur Behandlung von Hyperlipidämie, genauer Hypercholesterinämie eingesetzt• Sinken Cholesterinspiegel im Blut: Statin3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzym A (HMG CoA) Mevalonsäure Cholesterin

• werden von humanen CYP3A4 oxidiert

HMG CoA-Reduktase

Simvastatin

Lovastatin

Fluvastatin

Atorvastatin

Ergebnisse

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1b. Katalytische Aktivität Assays mittels Statine

• Identisch • 6‘β-OH Statine• Chimäre Mutanten zeigen alle

hohe Aktivitäten• Vgl.: beim humanen CYP3A4

liegt TTN von Simvastatin bei 8,3/min

• 2 Hauptmetabolite• 5-OH: D12 (23,2 )• 6-OH: G1 (13,2 )

• 4-OH Atorvastatin• G1 und M17V2 höchste

Aktivität • Viele zeigen kaum Aktivität

Ergebnisse

• WT zeigt keine Aktivität

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1b. Bestimmung kinetischer Parameter mittels Statine

Ergebnisse

Substrat Enzyme () (µM) ()

Simvastatin

M16 10 33 0.30

G1 126 332 0.380Lovastatin M16 9.2 16 0.58

G1 196 839 0.234Fluvastatin M16 5.8 258 0.022

G1 25 724 0.035Atorvastatin

M16 0.13 167 0.0008

G1 1.1 422 0.0026

→ Mittels TTN und Michaeliskonstante wurde die katalytische Effizienz der Enzyme bestimmt

→ G1 zeigt die höchste katalytische Aktivität (), aber auch die niedrigste Affinität vom Enzym zum Substrat ()→ Nur minimal höhere katalytische Effizienz als M16→ Ausnahme: Bei Lovastatin hat M16 die höhere Effizienz

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2. HMG CoA-Reduktase Inhibitionsassay

• Statine hemmen die HMG CoA-Reduktase

• Hydroxylierte Metabolite zeigen vergleichbare inhibitorische Wirkung

Simvastatin

6‘ß-OH Lovastatin 6‘ß-OH Fluvastatin 5-/6-OH Atorvastatin 4-OH

Konzentration

6 µM 6 µM 6 µM 6 µM 6 µM 6 µM 1 µM 1 µM

Reduktase Aktivität

75 % 50 % 55 % 50 % 50 % 55 % 15 % 50 %

Ergebnisse

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3. Fettsäure Hydroxylierung (GC)

• Hydroxylierung von CYP102A1 am ω-1, ω-2 und ω-3 Kohlenstoff

→ M15V2 höchsten Hydroxylierungs

Aktivitäten bei Laurinsäure

→ M13V2 höchsten Hydroxylierungs

Aktivitäten bei Myristin- und Palmitinsäure

→ Alle M16V2 Mutanten zeigten im

Vergleich zum Wildtyp niedrige Aktivitäten

Ergebnisse

• Laurinsäure (Dodecansäure) Kokosfett, Lorbeerfrucht

• Myristinsäure (Tetradecansäure) Muskatnussbutter,

tierischen Fetten

• Palmitinsäure (Hexadecansäure) Palmöl, Rindertalg

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• Domain Swapping war in einigen Fällen nützlich, um erhöhte Enzymaktivitäten hervorzurufe

• ReduktaseD ist essentiell für die katalytische Aktivität der CYP102A1 HämD

• WT zeigte kaum katalytische Aktivitäten

• G1 und H1 zeigten von den 19 chimären Mutanten die höchsten Enzymaktivitäten

Mögliche Perspektiven der veränderten Cytochrome P450 Enzyme:

• Einsatz als industrielle Biokatalysatoren zur Produktion von Arzneistoffen & Metaboliten

• Statin Metabolite zur Behandlung von Störungen des Lipoproteinstoffwechsels

Zusammenfassung

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• Fura A. 2006. Role of pharmacologically active metabolites in drug discovery and development. Drug Discov Today 11:133–142.

• Guengerich FP. 2002. Cytochrome P450 enzymes in the generation of commercial products. Nat Rev Drug Discov 1:359–366.

• Guengerich FP. 2006. Cytochrome P450s and other enzymes in drug metabolism and toxicity. AAPS J 8:E101–E111.

• Guengerich FP. 2009. Introduction: Human metabolites in safety testing (MIST) issue. Chem Res Toxicol 22:237–238.

• Kang JY, Kim SY, KimD, Kim DH, Shin SM, Park SH, Kim KH, Jung HC, PanJG, Joung YH, Chi YT, Chae HZ, Ahn T, Yun CH. 2011. Characterization of diverse natural variants of CYP102A1 found within a species of Bacillus megaterium. AMB Express 1:1

• Landwehr M, Carbone M, Otey CR, Li Y, Arnold FH. 2007. Diversification of catalytic function in a synthetic family of chimeric cytochrome P450s. Chem Biol 14:269–278.

• Munro AW, Leys DG, McLean KJ, Marshall KR, Ost TW, Daff S, Miles CS, Chapman SK, Lysek DA, Moser CC, Page CC, Dutton PL. 2002. P450 BM3: The very model of a modern flavocytochrome. Trends Biochem Sci 27:250–257.

• Otey CR, Landwehr M, Endelman JB, Hiraga K, Bloom JD, Arnold FH. 2006. Structure-guided recombination creates an artificial family of cytochromes P450. PLoS Biol 4:e112.