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疾患ﾏｰｶｰを特異的に認識するｱﾌﾟﾀﾏｰの開発とｾﾝｼﾝｸﾞへの応用
東京農工大学 大学院工学研究院
生命機能科学部門 教授 池袋一典
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アプタマー :標的分子を認識できる核酸
これまでに報告されたアプタマーの構造
G-quartetHairpin Bulge Pseudoknot
G AA A
G CG
G
G
C
C
C
トロンビン‐トロンビンアプタマー複合体の結晶構造
研究背景
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分子認識素子としての抗体とアプタマーの比較
抗体 アプタマー
結合能 ◎ ○(抗体に匹敵するものもある)
分子選択性 ◎ ○(抗体に匹敵するものもある)
作製コスト 高い 化学的に全合成できるので安価
作製の容易さ 生物を用いて2～3週間かかる 全合成で数時間
安定性 高温にすると失活する 100℃程度なら可逆的に復活
化学修飾 標的位置を修飾するのは困難 容易
複合体作製 困難 容易
目的の機能発現のための設計 困難 容易
最大の特長：アプタマーはin vitroで選択できる
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アプタマーの探索法：SELEXSystematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment
標的分子
DNAライブラリー
DNAと標的分子の結合
結合したDNAの回収
次世代DNAライブラリーの増幅
Tuerk and Gold, Science, 1990Ellington and Szostak,Nature, 1990
通常10サイクル以上繰り返す
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わずか１万分の１のオリゴDNAしか探索されていない
未探索空間に存在する大部分のオリゴDNAの結合能を調べる方法の開発が必須
SELEXの実験上の制限1
SELEXで用いるnmolのDNAﾗｲﾌﾞﾗﾘｰ:1014配列しか存在しない
30-mer のDNAﾗｲﾌﾞﾗﾘｰ: 1018配列を含む
アプタマーの塩基配列空間
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PCR増幅過程において増幅されやすい配列が存在する
安定な二次構造を形成するオリゴDNAは増幅されにくい。
SELEXの実験上の制限2
容器や担体に結合するオリゴDNAが増幅されてしまう
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1. SELEXによるｱﾌﾟﾀﾏｰの探索
2. 進化模倣ｱﾙｺﾞﾘｽﾞﾑによるｱﾌﾟﾀﾏｰの改良
繰り返す
進化模倣ｱﾙｺﾞﾘｽﾞﾑを用いたｱﾌﾟﾀﾏｰの改良
in silicoでの次世代配列の決定
標的分子に結合するｱﾌﾟﾀﾏｰ
in vitroでのｱﾌﾟﾀﾏｰの機能評価
新技術の基となる研究成果・技術
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配列空間
アプタマーの機能 探索が局所解に陥らないように工夫したｱﾙｺﾞﾘｽﾞﾑ
進化模倣ｱﾙｺﾞﾘｽﾞﾑの操作の模式図
交差・ｼｬﾌﾘﾝｸﾞ突然変異
m
が探索されたｱﾌﾟﾀﾏｰ
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2.配列のｼｬﾌﾘﾝｸﾞ
阻害率(%)706050
105
次世代配列の決
mm
m
10 配列の生成
3.突然変異導入
in silico
mm
進化模倣ｱﾙｺﾞﾘｽﾞﾑによるｱﾌﾟﾀﾏｰ探索の例
10 塩基配列
NNNNNNNggNNggNNNggNNggNNNNNNNN
5’領域
ループA
ループB
ループ C
3’領域g
g gg g
g gg
5’3’
ループ A ループ C
ループ B
1. 選択
Synthesis of novel 10 aptamers
次世代配列の合成標的分子：Taq DNA polymerase
10
世代毎のアプタマーの阻害能の変化
Taq: 6.3 nMAptamer: 1250 nM
阻害能
順位世代
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進化模倣ｱﾙｺﾞﾘｽﾞﾑで得られたｱﾌﾟﾀﾏｰの配列
Rank Aptamer Inhibitoryactivity (%) Sequence
1 6-10 83±1 CAAGACG ggCGggTGTggTAgg CGCCCGTG2 4-1 82±1 ACTTGAT ggCGggTGTggTAgg CGCCATCT3 6-8 80±2 ACTTGAT ggCGggTTTggTAgg CGCCGTCG4 6-5 77±1 ACTGGAT ggCGggTTTggTAgg CGCCATCT5 6-4 76±1 ACATGAT ggCGggTGTggTAgg CGTCGTCT6 2-4 75±2 ACATGAT ggCGggTTTggTAgg CGCCGTCT7 5-8 72±1 CAAGACG ggCGggTTTggTAgg CGCCCGAG8 6-1 71±1 CAAGACG ggCGggTTTggGAgg CGCCCGAG9 5-7 64±0 ACTTGAT ggCGggTTTggTAgg CGCCCTCT10 3-3 63±2 CAAGACG ggCGggTTTggTAgg CGCCGTCT11 4-8 61±3 ACTTGAT ggCGggTTTggTAgg CGCCCCAG12 5-4 60±1 ACTTGAT ggTGggTTTggTAgg CGCCGTCT13 5-10 60±0 ACAGACG ggCGggTTTggTAgg CGCCGACT14 4-3 58±3 CCTGACG ggCGggTTTggTAgg CGCCGTCT15 4-7 58±3 ACAGACG ggCGggTTCggTAgg CGCCCTAG
Consensus sequencesTaq: 6.3 nMAptamer: 500 nM
順位阻害率(％) 塩基配列
BBRC, 20066-10のIC50は117 nM:阻害能は10倍向上した
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トロンビン
チミンリンカー
15-mer : 5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’ (Kd=26 nM)
29-mer : 5’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’ (Kd=0.5 nM)
GG
TT
TG
TG
G
GG
GG
TT
5’3’
AG
GC
CT
T
AG
GG
CT
TA
A
GG
G GGG
G
GC
TT T
G
5’ 3’
T
T T TT
アプタマーの連結による結合能の向上
連結アプタマー; Kd=60 pM
Sensors, (2008)
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アプタマーの構造の特徴
反発 ---
負に荷電 負に荷電
Hybridization process takes some time
リン酸骨格の負電荷
二次構造は形成されにくい
標的分子との結合で電荷が相殺される
標的分子とｱﾌﾟﾀﾏｰの結合
標的分子との結合によりｱﾌﾟﾀﾏｰの構造が変化しやすい
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アプタマーを用いたバイオセンシング
抗体の代替 アプタマーの特長を利用
B/F分離を必要としない
構造変化の利用
B/F分離の簡易化‐S
e-
Biosens. Bioelectron. (2005)Anal. Lett., (2004)
Sandwich方式
Anal. Chem. (2006), BBRC (2006),Biotechnol. Lett. (2007, 2008), Biosens. Bioelectron. (2008)
標的分子
5’
5’
3’
3’ 標的分子結合ｱﾌﾟﾀﾏｰ
A5’
5’
3’
3’
A
Capturalbleaptamer
+標的分子
Prion(2008),Biosens. Bioelectron. (2008)
Aptameric Enzyme subunit (AES)
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C-reactive protein
Thyroglobulin
Insulin
Mouse Prion protein
これまでに獲得したアプタマー
Vascular endothelial growth factor (VEGF)
標的分子 Kd 推定される構造
470 pM Hairpin-loopG-quadruplex
150 pM
44 nM
113 nM≒ 100 nM
Hairpin-loop
α-synucleinoligomer
G-quadruplex
≒ 10 nM
Prostate Specific Antigen (PSA)
Hairpin-loop
54 nM
G-quadruplex
PQQGDH
FADGDH
疾病マーカー
検出用酵素 44 nM
32 nM
G-quadruplex
G-quadruplexG-quadruplex
Hairpin-loop
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従来技術とその問題点アプタマーの探索は通常SELEX法により行われるが、
• 実験で扱えるライブラリは1014が上限であり理論値の1万分の1程度• 標的分子との結合に関係なくPCR増幅されやすい配列が回収される
等の問題があり、必ずしもよいアプタマーが得られない。
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新技術の特徴・従来技術との比較
進化模倣アルゴリズムによる配列進化を導入することにより、
• SELEXの問題点であった、ライブラリの多様性の制限を解消した。
• PCR増幅を経ることなく配列進化が可能であるので、標的分子とアプタマーの結合そのものを指標に探索が可能になった。
• SELEXでは不可能な、結合能以外の機能（阻害能等）を指標としたアプタマーの探索が可能になった。
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想定される用途
• 診断において、抗体と全く同じ利用が可能であり、さらに全く新しい原理に基づいた標的分子の検出も可能である。
• 生理活性を阻害するアプタマーは創薬に応用できる。
• 未同定タンパク質に対してもアプタマーは探索でき、その分離精製と特性評価の強力なツールとなる。
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想定される業界
利用者・対象
診断薬・製薬会社における薬剤としての利用
大学・研究所等における基礎研究ツール
市場規模
バイオビジネス市場（2006年→2016年予測）医薬市場：4320 億円→7605 億円診断市場：1472 億円→1864 億円解析試薬・機器市場：844 億円→1036 億円
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実用化に向けた課題
• 現在、方法論についてはほぼ確立した。より効率のよい探索のための進化地形予測法の開発は必要であるが、現在の方法でも十分よいアプタマーは得られる。
• 診断薬・治療薬として用いるためには、特異性・体内動態等についてより詳細な実験データを取得する必要がある
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企業への期待
• 任意の標的分子に対してよいアプタマーを探索する方法論が確立できたので、それぞれの標的分子を熟知したパートナーとの提携が必要。
• 診断におけるプラットホーム検出技術を持つ、企業との共同研究を希望。
• また、具体的な創薬ターゲットを持っており、アプタマー医薬に興味を持つ企業との連携を希望。
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本技術に関する知的財産権
• 発明の名称 ：血管内皮増殖因子結合性アプタマー
• 出願番号 ：特願2007-78642• 出願人 ：東京農工大学
• 発明者 ：池袋一典
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産学連携の経歴
• 2003年-2004年 A社と共同研究実施• 2003年-2006年 B社と共同研究実施• 2006年-2010年 C社と共同研究実施• 2007年-2008年 JST産学共同シーズイノベーション化事業 顕在化ステージに採択
• 2008年-2009年 JST地域イノベーション創出総合支援事業「シーズ発掘試験」に採択
• 2008年-2010年 D社と共同研究実施
