Upload
others
View
9
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Ciklodextrinek alkalmazásafolyadékkromatográfiás módszerekben
Dr. Szemán JuliannaCyclolab Ciklodextrin Kutató-Fejlesztő Laboratórium Kft.
1097. Budapest, Illatos u. 7. [email protected]
� Befolyásolja a szelektivitást
� Királis felismerőképesség
� Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben
� Ciklodextrin tartalmú folyadékkromatográfiás állófázisok
A ciklodextrinek szerepe
Statisztikusan szubsztituált származékok
� A homológok/izomerek száma rendkívül nagy
� Jellemzők: szubsztitució fok (DS) és a szubsztituensek eloszlása
� A batch-to-batch reprodukálhatóság rendkívül fontos.
Batch 1
0
5000
10000
15000
20000
25000
5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25
Group A
Group B
Group C
1
2
3
4
Batch 2
0
5000
10000
15000
20000
25000
5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25
1
2
3
4
5
Group A
Group BGroup C
Batch 3
0
5000
10000
15000
20000
25000
5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25
Group A
Group B
Group C1
2
3
4
5
CMBCD batch-to-batch reprodukálhatósága
A ciklodextrin kiválasztása
� Oldhatóság – alap CD-nél probléma
� Elválasztandó anyag – molekulaméret, funkciós csoportokSingle isomer vagy statisztikusanszubsztituált
� Ár
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben
�Fordított fázisú töltet, vizes eluens
�Függ az elválasztandó anyagtól
� k: 10-15 MeOH-víz < 50%
�RP állófázisok: C18, C8, C4, CN
�Töltet típustól is függ (C tartalom, end-cap)
J. Szemán et al. J. Chromatogr. A 728 (1996) 423
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensbenAz állófázis kiválasztása
P. Zarzycki et al. J. Chromatogr. A 955 (2002) 71-78
Szerves oldószer hatásaMeOH, EtOH, IPA, ACN, (THF)
� a komplex stabilitási állandóra� solute - állófázis kölcsönhatásra
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensbenAz eluens összetételének szerepe
Norgestrel elválasztás, szelektivitás változás a szennyezőkre is!M. Gazdag et al. J. Chromatogr. 450 (1988) 145
Puffer hatása
� pH
� ionerösség
� puffer kation-anion
� ionpárképzés éskomplexképzés
0
2
4
6
8
10
12
0 2.5 5 10 20
CMBCD [mg/ml]
k, R
s
Rs
k
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensbenCD koncentráció hatása
Aminoetil-benzodioxán származék elválasztása karboximetil-BCD-vel
Aminoetil-benzodioxán származék elválasztása karboximetil-BCD-vel
J. Szemán et al. J. Chromatogr. A 728 (1996) 423
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensbenA szubsztitúciós fok hatása
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
0 2 4 6 8 10
DS
Rs
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10
DS
k
Rs k
Különbözőőőő szelektivitású CD származékok együttes használata (CE-ben elterjedt)
�HPLC: barbiturát enantiomerek elválasztásaαCD és permetilezett-BCD(TRIMEB) keverékkel
�TRIMEB szerepe az állófázis módosítása:csökken a retenció, kevesebb oldószer kell, ezért jobb az enantiomer elválasztás
R. Nowakovski et al. J. Chromatogr. A, 782, 1-11, 1997
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensbenCD keverékek használata
Szelektivitás növelése nem királis anyagoknál
6.853
22.974
10.313
8.406
11.65217 mg/ml HPGCD
15.821
50.175
51.110
24.351
22.909
FLN: Flunisolide
BRFLN: Bromoflunisolide
FLNAL: Flunisolide alcohol
DS: Desonide
CLDS: Chlorodesonide
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben
5 mg/ml DIMEB
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensbenGyógyszerkönyvi példa
Pharmeuropa 20.1 (2008. január)
Iloprost, Polar related substances
Mobile phase:mix 330 ml of acetonitrile R1 and 670 ml of a 12 g/lsolution of β-cyclodextrin R adjusted to pH 2.0 with phosphoric acid R.
Opálos eluens, kiválás
Előőőőnyök• A szelektor minősége és koncentrációja könnyen változtatható• Olcsó oszlopok ill. olcsó adalékok használhatók
Hátrányok• A szelektor zavarhatja a detektálást (UV, MS)• A szelektor igény viszonylag nagy• (A szelektor minősége változó lehet)
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben
Ciklodextrin tartalm ú állófázisok
Ciklodextrin tartalm ú állófázisok • a kereskedelemben • az irodalomban leírt
Ajánlott irodalom:
• Chiral Separations, Methods and Protocols; G. Gübitz és M.G. Schmid
• CYCLOBOND handbookhttp://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/hplc/columns/chiral/cyclobond.html
• www.cyclodextrin.net (Armstrong cikkek)
Fordított fázisú elválasztás- ugyanazok az optimálási paraméterek érvényesek, mint az eluensben használt (oldószer, puffer , pH, ionerősség, hőmérséklet)
Polar-organikus mód- Acetonitril/metanol/ecetsav/trietilamin mozgófázis
Normál fázisú elválasztás- Hexan/Ipa, EtOH
Ciklodextrin tartalm ú állófázisok
Az állófázis előőőőállítás szempontjai- a szelektor minőőőősége- a szilikagélhez kötés módja - a szilikagél minőőőősége- a szabad szilanolok mennyisége
Mono-szubsztituált CD-származék immobilizálásának előnyei:
A jól definiált, izomertiszta származékolószerrel- homogén felület- monomer borítottság (víz kizárásával történik) érhető el
Saját fejlesztésűűűű királis állófázisok(Natursep)
Az állófázis előőőőállítása
• A CD származék reakciója trietoxi-szilil-propil-izocianát• Vizmentes közegben kötés a szilikagélhez• Szabad szilanolok: trimetil szilil endcap• Az állófázis minőségének ellenőrzése (NMR)
Metanol : TEAPbuffer (pH3) = 35:65 ill *54,5% MeOH
A szilikagél minőőőőségének hatása – Királis teszt - warfarin
min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5
mAU
0
10
20
30
40
DAD1 A, Sig=200,4 Ref=360,100 (L:\HPLC3\HPLC3 2008\ENANTIOMER\ENA0226\2008-02-26 2\WRF2.D)
min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20
mAU
-20
0
20
40
60
80
DAD1 A, Sig=200,4 Ref=550,100 (L:\HPLC3\HPLC3 2008\ENANTIOMER\ENA0909\2008-09-09 4\WRF2.D)
min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20
mAU
0
2.5
5
7.5
10
12.5
15
17.5
DAD1 A, Sig=205,4 Ref=550,100 (D:\DOC\KIRÁLI~1\HPLC3_~2\ENANTI~1\ENA0326\WRF5.D)
min0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
10
20
30
40
50
60
DA D1 A, Sig=205,4 Ref=550,100 (D:\DOC\KIRÁLI~1\HPLC3_~1\ENA NTI~1\ENA1215\WRFE11.D)
MN
Fuji – kis boritottság!!ExsilHypersil
15,7*
15,2
17,8
9,2
tR
11 0001,151,7Macherey-N.
28 0001,061,3Fuji
21 0001,142,4Exsil
30 0001,193,7Hypersil
NαRs
Warfarin 0.1% R szennyezés
Analitikai elválasztások PMMBCD oszlopon
Clopidogrel0.5% R szennyezés
Permetrinsav NaproxenO
CH3
CH3
O
OH
CH3CH3
ClClO
OH
Rs: 1R-cis/1S-cis: 2.21S-cis/1R-trans: 2.41R-trans/1S-trans: 4.4
1S-trans
1R-trans1S-cis1R-cisRs:
1R-cis/1S-cis: 2.21S-cis/1R-trans: 2.41R-trans/1S-trans: 4.4
1S-trans
1R-trans1S-cis1R-cis
N
Cl
S
O
O
CH3
O
OH
O
CH3
O
min0 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
120
DAD1 A, Sig=200,4 Ref=360,100 (O:\ENA1103\TRP2.D)
Permetilezett BCD oszlop
Hidroxipropilezett BCD oszlopRs: 4,93
Rs: 2,06
DAD1 A, Sig=200,4 Ref=360,100 (Z:\DATA\ENA1103\TROPASAV_ELU011.D)
OH
O
OH
Tropa sav
Permetilezett és hidroxipropilezett BCD-sállófázisok összehasonlítása
0.1 % TEA-foszfát puffer, pH: 3,5 – metanol, 0,7 ml/perc, 25 ºC
KK üüllöönbnböözzőőőőőőőő CDCD--s s áállll óóffáázisok elvzisok elváálasztlasztóókkéépesspessééggéének nek öösszehasonlsszehasonlííttáásasa
KUMARINOKKUMARINOK
Anyag BCD HPBCD PMBCD CMBCD
Acenokumarol 0.75 0.83 2.14 0.62
Fenprokumon 1.13 1.04 0.78 1.61
Warfarin 0.46 1.47 2.94 0.50
O
OH
O
O
CH3
N
O
O
O
OH
O
CH3
O
OH
O
O
CH3
0.1 % TEA-foszfát puffer, pH: 3,5 – metanol, 0,7 ml/perc, 25 ºC
KK üüllöönbnböözzőőőőőőőő CDCD--s s áállll óóffáázisok elvzisok elváálasztlasztóókkéépesspessééggéének nek öösszehasonlsszehasonlííttáásasa
Anyag Képlet BCD HPBCD PMBCD CMBCD
Fenoprop 0.00 0.00 2.37 0.00
2,4-DP 0.87 0.63 0.50 0.00
Mecoprop 1.09 0.48 1.40 0.00
O
CH3
O
OH
Cl
Cl
Cl
O
CH3
O
OH
Cl
CH3
O
CH3
O
OH
Cl
Cl
0.1 % TEA-foszfát puffer, pH: 3,5 – metanol, 0,7 ml/perc, 25 ºC
KK üüllöönbnböözzőőőőőőőő CDCD--s s áállll óóffáázisok elvzisok elváálasztlasztóókkéépesspessééggéének nek öösszehasonlsszehasonlííttáásasa
Anyag Képlet BCD HPBCD PMBCD CMBCD
Cisz-permetrinsav 0.00 1.21 2.33 0.00
Transz-permetrinsav 1.21 0.76 4.66 0.00
Tropasav 0.61 4.18 2.06 n.a.
Terbutalin 1.78 2.54 0.00 1.90
Fluoxetin 1.39 1.80 2.33 n.a.
CH3CH3
ClClO
OH
OH
O
OH
OH
OH NH
OHCH3
CH3CH3
FF
F
O NHCH3
Phenprocoumon enantiomerek (R>S) forditott elúciója BCD és PMBCD oszlopokon, UV és polarimetriás detektálással.
O
OH
O
CH3
KK üüllöönbnböözzőőőőőőőő CDCD--s s áállll óóffáázisok elvzisok elváálasztlasztóókkéépesspessééggéének nek öösszehasonlsszehasonlííttáásasa
Szemipreparativ elválasztásWarfarin 1 mg
-0.02
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0 10 20 30 40 50 60
Time (min)
WR
F (
mg/
ml)
1R : 0.52 mg Purity: 95.2%1S : 0.42 mg Purity: 95.2%