CINETICA ENZIMA DE AMILASA Y PROTEASA 1PEREZ CASTAÑEDA; DANIEL ALEJANDRO, 2YEPES REYES; PABLO ARTURO,

3HERRERA MENDEZ RICARDO

123Universidad La Gran Colombia, Seccional ArmeniaCiudadela del Saber La Santa María, Km 5 Vía La Tebaida. Armenia, Colombia.

RESUMEN: L

PALABRAS CLAVE: E

ABSTRACT: E

KEY WORDS: E

1. INTRODUCCION

Las enzimas son proteínas cuya función es catalizar la transformación química de sustratos a productos específicos, mediante la estabilización de complejos transitorios (Aranda & Salgado, 2008). Un concepto más claro sobre la cinética enzimática se podría decir según (Mañas, 2015) es la que estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc., y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato.

La amiloglucosidasa: AMG (Glucoamilasa o alfa-1,4 glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) es una enzima “GRAS” (Generally Registred As Safe), extracelular producida por los hongos de los géneros Aspergillus, Rhizopus, principalmente, y de Mucor, Candida, Saccharomyces, Schwanniomyces, y de los géneros bacterianos Bacillus, Clostridium, Arthrobacter y una enzima tipo Glucoamilasa de Flavobacterium (SÁNCHEZ H. et al., 2005).

Se intentó llevar a cabo una cinética enzimática de la enzima AMG o alfa glucoamilasa, considerando hacer las pruebas como: determinar azucares reductores DNS, lo cual se mostrara el proceso en la metodología y sus resultados finales en este documento.

La papaína se caracteriza por ser un polvo amorfo, granuloso de color blanco, grisáceo o parduzco; ligeramente higroscópico e insoluble en agua y en la mayoría de solventes orgánicos. Es soluble en alcohol etílico y metílico; esta se obtiene a partir del látex de la fruta verde de la papaya antes que comencé su maduración. (E.Aguirre, 2009)

Con la papaína se pretendió hacer una coagulación de la leche, haciendo una precipitación de la proteína de la leche (caseína), así obteniendo “yogurt”, lo cual se expresara en la metodología los pasos realizados, y los resultados de su eficacia para dicho proceso.

El objetivo de esta práctica es identificar las características de la cinética enzimática, así como los cálculos de los parámetros, que posteriormente se mostrara en este documento.

2. MATERIALES Y METODOLOGIA

S

3. RESULTADOS

3.1 Obtención De Proteasa

La obtención de la Papaína se llevó a cabo durante 2 días, realizando las incisiones correspondientes al fruto para su extracción, en la Tabla 2. Se presentan el peso de las tres Papayas, los gramos de lates seco y su respectivo rendimiento.

Tabla 1. Resultados Obtención Del Látex

Papaya # Peso Papaya Kg Látex g Rendimiento g Látex/Kg Fruto

1 0,525 0,223 0,42

2 0,625 0,259 0,41

3 0,3615 0,221 0,61

Global 1,5115 0,703 0,48

En la Tabla 2. Se presenta el rendimiento del látex con respecto al peso del fruto, siendo la Papaya número 3 con un peso de 0.3615 Kg la que presenta un mayor rendimiento con respecto a la Papaya 1 y 2, este bajo rendimiento de látex en la Papaya 1 y 2 puede estar relacionado con una extracción ineficiente o que a menor peso del fruto mayor rendimiento; pero esto no presenta ninguna base debido a que investigaciones reportan que a mayor tamaño del fruto mayor será el rendimiento del látex (Guerra & Avilés) teniendo en cuenta que a mayor tamaño del fruto mayor será su peso, podemos confirmar que el bajo rendimiento en la Papaya 1 y 2 se debe a una extracción ineficiente del látex. Por otra parte se reportan rendimientos de 0.58 g Látex/Kg de fruto (Aguirre & Castillo, 2009) y 0.82 g Látex/Kg Fruto (Guerra & Avilés) con respecto a lo encontrado por Aguirre y Castillo podemos afirmar que estamos por encima del rendimiento con una diferencia de tan solo 0.003 g Látex/Kg Fruto, si lo comparamos con lo encontrado por Guerra y Avilés tenemos una diferencia del 0.21 g Látex/Kg Fruto, es de tener en cuenta que la cantidad del Látex varia con respecto a la variedad de la Papaya por lo que puede que esta diferencia se deba a este factor.

3.2 Coagulación de leche (Balls and Hoover).

En la Tabla 3. Se presentan los resultados cualitativos de la coagulación de lecher (Balls and Hoover).

Tabla 2. Coagulación De Leche (Balls and Hoover).

1 ml de Leche - 30°C

gr papaina/ml A.Acetico 0,0025 0,005 0,001 0,02

250µL + + + +

100µL + + + +

75µL + + + +

50µL Moderado Moderado Moderada Moderada

Podemos observar de 250 µL a 75 µL de volumen enzima A. Acético en efectivo en la desnaturalización de la proteína de 1 ml de leche (Caseína), a los 50 µL se comienza a presentar una reacción moderada en la desnaturalización de la proteína de la leche, podemos decir que por debajo de 75 µL de papaína con A. Acético no es recomendable utilizar la enzima en un proceso ya que no tendrá la suficiente cantidad para llevar a cabo la reacción.

3.3 Cinética enzimática de alfa gluco amilasa

Para determinar la acción de la enzima sobre el almidón se llevó a cabo la elaboración de la curva patrón correspondiente al método analítico de azucares reductores por la técnica del 3,5 ácido dinitrosalicílico DNS (AOAC, 1990). La curva patrón arrojo la Ecuación 1. La cual se presenta a continuación.

Y=0.1217 X+0.0931Ecuación 1. Curva Patrón.

Teniendo la Ecuación 1. De la curva patrón se realizó el despeje de la variable X y se calculó la concentración de los Azucares Reductores en la reacción con la enzima Alfa glucoamilasa. En la Grafica 2. Se presenta el comportamiento de la reacción de la enzima con el almidón a concentraciones de 0.25 y 0.50 % de v/v de enzima.

0 1 2 3 4 5 6 7 802468

101214161820

% enzima - 0,25%% enzima - 0,5 %

Tiempo (min)

Azu

care

s R

educ

tore

s g/

ml

Grafica 1. Azucares Reductores Vs Tiempo De Reacción.

En la Grafica 2. Podemos observar que a mayor tiempo de reacción menor es el contenido de azucares reductores tanto para el tratamiento (▲) como para el tratamiento (♦). En este caso se presenta un error experimental ya que al transcurso el tiempo, el almidón va desapareciendo, ya que la enzima empieza a romper sus enlaces, modificándolo y haciendo que aumente el almidón hidrolizado o azucares (CASTILLO & MURCIA, 2008). Aunque no se evaluaron las condiciones óptimas correspondientes a la reacción de la glucoamilasa con el almidón, se reportan condiciones óptimas de pH 4.5, Temperatura de 70° C y enzima al 0.0280% (p/p) (Ruiz, Molina, Torrez, &

Sanchez, 2009) nuestro valor de pH en la reacción es del 6.8 lo cual pudo afectar el comportamiento de la enzima en la reacción.

Se construyeron los tres modelos de reacción enzimática de la glucoamilasa (Lineweaver-Burk, Langmuir y Eadie-Hofstee) los datos correspondientes a los valores de Vmax y Km se detallan en la Tabla 4.

Tabla 3. Modelación Cinética Enzimática

Lineweaver-Burk Langmuir Eadie-Hofstee

[] Enzima v/v Vmax=1/b Km=m+Vmax Vmax=1/m Km=b*Vmax Vmax=b Km=-m

0,25% -0,974 7,703 -1,771 15,221 7,0806 6,1370

0,50% -3,220 4,682 -2,740 23,100 -1,7146 -18,9920

En la Tabla 4. Podemos observar que el modelo que presenta mayor afinidad con el sustrato es Lineweaver-Burk a concentraciones de enzima del 0.50% v/v con un Km correspondiente a 4.682 pero presenta una Vmax negativa, esto tal vez se deba a los errores experimentales anteriormente mencionados de la Grafica 2. Por lo cual no presentan datos congruentes para llevar a cabo un correcto análisis.

4. CONCLUSION

5. BIBLIOGRAFIA

Aguirre, E, & Castillo, P. (2009). Extraccion y Estudio Comparativo de las Enzimas Proteolíticas del Fruto Toronche (Carica - Stipulata) y de la Papaya (carica - Papaya) y su Aplicación en la Industria Alimentaria".

AOAC. (1990). OFFICIAL METHODS OF ANALYSIS (KENNETH HELRICH Ed. Vol. 1). ARLINGTON, VIRGINIA: ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS.

Aranda, J. S., & Salgado, E. (2008). Modelación de catálisis enzimática con enzimas alostéricas. Revista mexicana de ingeniería química, 7, 21-27.

CASTILLO, CESAR ANDRES CALA, & MURCIA, JOHANA STEFANY MARTINEZ. (2008). MODIFICACIÓN HIDROLÍTICA DE ALMIDÓN DE YUCA NATIVO CON ENZIMA α-AMILASA BACTERIANA AISLADA DE Bacillus subtilis PARA ELABORACIÓN DE SALSAS. (Ingeniero de Alimentos), UNIVERSIDAD DE LA SALLE, BOGOTA D.C.

E.Aguirre, P.Castillo. (2009). "extraccion y estudio comparativo de las enzimas proteoliticas del fruto toronche (carica-stipulata) y de la papaya (carica-papaya) y aplicacion en la industria alimenticia¨. Facultad de Ingenieria Mecanica y Ciencias de la Producción, 7.

Guerra, Pamela Alejandra Arena, & Avilés, Maria Fernanda Quijano. Extracción, Caracterización y Comparación de Látex Obtenido, en Secado por Aspersión, de tres

Variables de Papaya (Carica papaya L.) (Ingenieria De Alimentos), Escuela Superior Politécnica Del Litoral, Guayaquil - Ecuador.

Mañas, Juan Manuel Gonzales (Producer). (2015, 04 13). Curso de Biomoléculas. Curso de Biomoléculas. Retrieved from http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#e

Ruiz, M I, Molina, D R, Torrez, R G, & Sanchez, C I. (2009). DETERMINACIÓN DE LOS PARAMETROS HIDROLÍTICOS PARA LA PRODUCCIÓN DE JARABES DE GLUCOSA A PARTIR DE ALMIDÓN DE YUCA, 10.

SÁNCHEZ H., Claudia P., MEJÍA G., Carlos E., FIGUEROA M., Carlos, ESQUIVIA M., Mabel, AGUDELO E., Lina M., ZAPATA G., Norela, & GÓMEZ M., Marcela. (2005). ESTUDIO DE CEPAS NATIVAS AMILOLÍTICAS. Vitae, 12, 21-28.