Citometria de fluxo

Com material obtido em parte da:

Purdue University Cytometry Laboratories(http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/educate/pptslide.htm)

Agradecimentos:•Dr. Robert Murphy, Carnegie Mellon University, Pittsburgh, PA

•Dr. J. Paul Robinson, Purdue University Cytometry Laboratories

Dr. Carleton Stewart,RPCI Laboratory of Flow Cytometry, Buffalo,NY

•B. H. Davis, William Beaumont Hospital, Royal Oak, Michigan

Faculdade de Medicina da

Universidade Federal da Bahia

O que é a citometria de fluxo:

Avaliação de sub-populações celulares: quadrantes CD4 e CD8.

Log FITC Fluorescence (CD8).1 1 10 100 1000

Lo

g P

E F

luo

resc

ence

(C

D4)

.1

1

10

10

01 2

3 4

45% 2%

26%27%

Avaliação de ativação celular: explosão respiratória.

DCFH-DA

DCFH-DADCFH-DA

DCFHDCFH

DCFDCF

H OH O 2 22 2

Análise de divisão celular.

GG22

MM GG00

GG11

ss

0 200 400 600 800 1000

GG00GG11

ss GG22 MM

DNA AnalysisDNA Analysis

DNA contentDNA content

Count

2N2N 4N4N

Análise de DNA

0 200 400 600 800 1000

PI Fluorescence

Cou

nts

0 7

5 1

50 2

25 3

00

2N2N 4N4N

Influxo de cálcio

Time (Seconds)0 36 72 108 144 180

RA

TIO

[sho

rt/lo

ng]

0 2

00 4

00 6

00 8

0010

00

StimulationStimulation

Análise de reticulócitos

log Thiazole Orange.1 1000 100 10 1

Count

0

15

0

11

2

75

3

7

RMI = 0RMI = 0

log Thiazole Orange.1 1000 100 10 1

Count

0

15

0

11

2

75

3

7

RR11RR22RR33RR44

RMI = 34RMI = 34

RR11RR22RR33RR44

Citômetro de fluxo

Computer SystemDetector &Mechanical Fluidics

Célula de Fluxo

Injector Tip

FluorescenceFluorescencesignalssignals

Focused laserFocused laserbeambeam

Sheath fluid

90 Degree Light Scatter

FALS Sensor

90LS Sensor

Laser

Detectores de fluorescência

Fre

q

Fluorescence

FALS Sensor

Fluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.)

Marcadores fluorescentes

Fluorescein (FITC)

400 nm 600 nm 700 nm

Relat

ive In

tensit

y

Wavelength

500 nm

ExcitationEmission

Cromógenos

EthidiumEthidium

PEPE

cis-Parinaric acidcis-Parinaric acid

Texas RedTexas Red

PE-TR Conj.PE-TR Conj.

PIPI

FITCFITC

600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm

457350 514 610 632488Common Laser Lines

Imunofenotipagem: marcação celular

CD2CD2CD4CD4

CD # = cluster designation number

Imunofenotipagem

Log FITC

1000 100 10 1

11

0

.1

Cou

nt

3

0 7

00

1

50

Light scatter gating

90 Degree Scatter0 200 400 600 800 1000

Forw

ard

Sca

tter

0 2

00 4

00 6

00 8

0010

00

8

15

20

30

40

50

100

200

1000

Lymphocytes

Monocytes

Neutrophils

Side Scatter Projection

Fo

rwa

rd S

catte

r P

roje

ctio

n

Scale

Avaliação de sub-populações celulares: quadrantes CD4 e CD8.

Log FITC Fluorescence (CD8).1 1 10 100 1000

Lo

g P

E F

luo

resc

ence

(C

D4)

.1

1

10

10

01 2

3 4

45% 2%

26%27%