Upload
others
View
6
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Sara I. Stanković
Citotoksični efekat zaslađivača na bazi stevije
na ćelije kostne srži pacova soja Wistar
Master rad
Niš, 2016.
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Citotoksični efekat zaslađivača na bazi stevije
na ćelije kostne srži pacova soja Wistar
Master rad
Kandidat Mentor
Sara Stanković 147 prof. dr Perica Vasiljević
Niš,
Oktobar, 2016.
UNIVERSITY OF NIŠ
FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS
DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
The cytotoxic effect of the Stevia sweeteners on
bone marrow cells of Wistar rats
Master thesis
Candidate Mentor
Sara Stanković 147 prof. dr Perica Vasiljević
Niš,
October, 2016.
BIOGRAFIJA KANDIDATA
Sara Stanković je rođena 22. 02. 1992. godine. Osnovnu školu „Radoje
Domanović“ je završila 2006. godine u Nišu. Gimnaziju „Bora Stanković“,
prirodno-matematički smer, završila je 2010. godine takođe u Nišu.
Iste godine upisala je osnovne-akademske studije Prirodno-matematičkog
fakulteta u Nišu, na departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne studije je
završila 2014. godine i upisala master studije na istom fakultetu, smer biologija.
Zvanje „master biolog“ dobija 2016. godine.
Niš,
Oktobar, 2016.
ZAHVALNICA
Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru, prof. dr Perici Vasiljević na
razumevanju, strpljenju, nesebičnoj pomoći i savetima koje mi je pružio tokom
izrade master rada.
Zahvaljujem se i stručnom-saradniku Andrei Žabar, kao i asistentu
Mileni Aleksić, koje su uložile veliki deo svog vremena i pružile mi pomoć u
toku izvođenja eksperimentalnog dela rada.
Na kraju, svoju neizmernu zahvanost dugujem dragim ljudima oko sebe,
bez kojih ne bih mogla da ostvarim svoje zamisli, a posebno mojoj majci koja
mi je omogućila školovanje i motivisala me tokom istog, i bratu bez čije ljubavi
i razumevanja ne bih istrajala do kraja...
Hvala...
Ovaj rad posvećujem svojim voljenima, s’ljubavlju
SAŽETAK
Stevia rebaudiana (Bertoni) je biljka koja potiče iz Južne Amerike, a pripada familiji
Asteraceae. Lišće ove biljke se koristi već stotinama godina kao zaslađivač. Aktivne
supstance u lišću su steviol-glikozidi (najzastupjeniji su steviozid i rebaudiozid (Reb A)),
koje su više od 200 puta slađe od šećera. Postupkom ekstrakcije navedeni se sastojci
izdvajaju i koriste za dobijanje različitih zaslađivača. Cilj ovog rada bilo je ispitivanje uticaja
različitih koncentracija rastvora zaslađivača na bazi stevije, na vijabilnost ćelija kostne srži i
osmotsku rezistenciju eritocita periferne krvi pacova soja Wistar. Finalne koncentracije
ispitivanog rastvora zaslađivača bile su 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml i 100 mg/ml. Uticaj
na vijabilnost ćelija kostne srži rađena je Tripan plavim testom na temperaturi od 37 °C.
Procenat hemolize eritrocita utvrđen je merenjem absorbance na spektrofotometru, na
talasnoj dužini od 540 nm, posle inkubacije rastvora sa eritrocitima na temperaturi od 37 °C.
Dobijeni rezultati pokazuju da ispitivane koncentracije poseduju značajni citotoksični
potencijal. Najveća vijabilnost ćelija kostne srži je pri najmanjoj koncentraciji ispitivanog
rastvora zaslađivača, dok je pri najvećoj koncentraciji vijabilnost ćelija najmanja. Takođe,
povećana koncentracija ispitivanog rastvora zaslađivača veoma utiče na procenat hemolize,
pa koncentracije veće od 75 mg/ml izazivaju preko 90 % hemolize.
Ključne reči: Stevia rebaudiana, citotoksična aktivnost, ćelije kostne srži, Tripan plavo test,
eritrociti, hemoliza
ABSTRACT
Stevia rebaudiana (Bertoni) is a plant that is native to South America and belongs to
the family Asteraceae. The leaves of this plant has been used for hundreds of years as a
sweetener. Active substances in the leaves are steviol glycosides (mainly stevioside and
rebaudioside (Reb A)), which are more than 200 times sweeter than sugar. Specified
ingredients can be extracted by extraction method and used to produce a variety of
sweeteners. The aim of this work was to investigate the effect of Stevia sweeteners on the
viability of bone marrow cells of Wistar rats. Final concentration of the test solution of the
sweetener were 25mg/ml, 50mg/ml, 75mg/ml and 100mg/ml. The impact on the viability of
the cells of the bone marrow was performed up the Trypan blue test at a temperature of 37°C.
The percentage of hemolysis of red blood cells was determined by measuring absorbance on
a spectrophotometer, at a wavelength of 540 nm, after incubation the solution with red blood
cells at a temperature of 37°C.
The results show that the tested concentrations have significant cytotoxic potential.
Maximum viability of bone marrow cells is at a minimum concentration of the test sweetener
solution, while at the highest concentration cell viability is the smallest. Also, the increased
concentration of the test sweetener solution greatly affects the percentage of hemolysis, so
concentrations greater than 75mg/ml caused 90% hemolysis.
Keywords: Stevia rebaudiana, cytotoxic activity, bone marrow cells, Trypan blue test,
erythrocytes, hemolysis
SADRŽAJ
1. UVOD ................................................................................................................................. 1
1.1. Stevia rebaudiana (Bert.) - biološke karakteristike .................................................... 1
1.2. Rasprostranjenje .......................................................................................................... 1
1.3. Stevija kroz istoriju ..................................................................................................... 2
1.4. Primena stevije ............................................................................................................ 3
1.5. Hemijski sastav ........................................................................................................... 3
1.5.1. Steviol-glikozidi ................................................................................................... 3
1.5.2. Sinteza steviol-glikozida ...................................................................................... 6
1.5.3. Ostala jedinjenja................................................................................................... 8
1.6. Fizičke i hemijske karakteristike stevije ................................................................... 12
1.7. Biološke aktivnosti stevije ........................................................................................ 13
2. CILJ RADA ...................................................................................................................... 16
3. MATERIJAL I METODE ................................................................................................ 17
3.1. MATERIJAL ............................................................................................................. 17
3.2. METODE .................................................................................................................. 17
3.2.1. Priprema štok i radnih rastvora .......................................................................... 17
3.2.2. Izolovanje kostne srži iz femura i tibije pacova................................................. 18
3.2.3. Postupak za dobijanje ćelijskih elemenata kostne srži ...................................... 18
3.2.4. Protokol za podešavanje željene gustine ćelija .................................................. 19
3.2.5. Tripan plavo (Trypan blue) metod isključivanja ............................................... 20
3.2.6. Postupak za dobijanje eritrocita ......................................................................... 21
3.2.7. Cijanmethemoglobinska metoda (CH metoda) .................................................. 21
3.3. Obrada rezultata ........................................................................................................ 22
4. REZULTATI I DISKUSIJA ............................................................................................. 23
4.1. Uticaj zaslađivača na vijabilnost ćelija kostne srži ................................................... 23
4.2. Uticaj zaslađivača na osmotsku rezistentnost eritrocita ............................................ 24
5. ZAKLJUČAK ................................................................................................................... 26
6. LITERATURA ................................................................................................................. 27
1
1. UVOD
1.1. Stevia rebaudiana (Bert.) - biološke karakteristike
Rod Stevia (famiija
Asteraceae) čini oko 240 vrsta i među
njima najslađi ukus i najširu primenu
ima Stevia rebaudiana (Bertoni)
(Segura-Campos i sar., 2014). To je
višegodišnja, zeljasta, grmolika biljka
visine od 65-180 cm (Ahmed i sar.,
2011). Stevija ima razgranat koren i
jajolike do eliptične, sivozelene,
nazubljene listove, duge 3-4 cm
(Lemus-Mondaca i sar., 2012). To je
biljka kratkog dana koja cveta od
januara do marta na južnoj hemisferi, a cvetovi su joj beli i sitni (Gupta i sar., 2013). Steviji
pogoduju peskovite podloge i dobra osunčanost terena na kome raste (Ahmed i sar., 2011).
Rasprostranjena je u subtropskim regijama, na 200-500 m nadmorske visine, sa prosečnom
godišnjom temperaturom od oko 23 °C (Kobus-Moryson i Gramza-Michałowska, 2015).
1.2. Rasprostranjenje
Pretežno raste na planinskom lancu Amambay (Yadav i sar., 2010) i u dolini Rio
Monday, koji se nalaze u severo-istočnom Paragvaju i južnom Brazilu (Brandle i sar., 1998).
Tu su je još pre 1500 godina otkrili Guarani Indijanci, koji su je nazivali Ka’a He’e, što znači
“listovi slatki poput meda”, a koristili su je kao lekovitu biljku i kao zaslađivač gorkih
lekova, napitaka i tradicionalnog mate čaja (Ahmed i sar., 2011). U današnje vreme stevija se
komercijalno uzgaja i u Urugvaju, srednjoj Americi, Izraelu, Tajlandu, Australiji, Koreji i
Kini. (Gupta i sar., 2014).
Slika 1. Stevia rebaudiana (Bert.)
(http://www.stevia1.com)
2
1.3. Stevija kroz istoriju
Stevija je u Južnoj Americi poznata vekovima (Bhutia i Sharangi, 2016). Dolaskom
španskih konkvistadora, steviju po prvi put upoznaju ljudi van plemena Guarani. Biljka je
prvi out opisana u 16. veku od strane španskog botaničara i lekara Petrusa Jakoba Stevusa
(Pedro Jaime Esteve 1500–1556), od koga i potiče njen latinski naziv. Detaljnija naučna
istraživanja biljke prvi put se sprovode 1887. godine od strane švajcarskog botaničara
Moisesa Santijaga Bertona koji je emigrirao u Paragvaj (Giuffré i sar., 2013). Slatke
karakteristike listova stevije i mogućnosti za njenu primenu publikovao je u časopisu
‘’Revista de Agronomia’’ 1899. godine (Kobus-moryson I Gramza-michałowska, 2015).
Nakon toga, dr Rebaudi
1900. godine objavljuje kompletnu
studiju o listovima stevije. Pošto se
glas o njenoj primeni uspešno širio
od 1908. godine počeo je aktivan
uzgoj ove biljke u njenoj regiji
porekla. Nakon toga, francuski
hemičari, Bridel i La Vielle, 1931.
godine izolovali su komponentu
koja biljci daje sladak ukus.
Izolovani glikozidi su dobili naziv steviozid i rebaudiozid (Kumari i Chandra, 2014). Tokom
Drugog svetskog rata, za vreme obustave isporuke šećerne trske sa Kariba, Engleska počinje
da istražuje mogućnost eksploatacije stevije. Sedamdesetih godina 20. veka, Japanci počinju
sa kultivacijom stevije i ekstrahovanjem različitih oblika steviozida koji bi mogli da se
koriste umesto šećera (Lemus-Mondaca i sar., 2012). Status dozvoljenog zaslađivača u
Japanu stevija dobija 1977. godine. Danas je Japan najveći potrošač stevije na svetu, s
godišnjom potrošnjom od oko 50 tona. Američka administracija za hranu i lekove (FDA)
odobrila je 1995. godine upotrebu stevije i steviozida kao dijetetskog suplementa (Ahmed i
sar., 2011).
Slika 2. Listovi biljke stevije
(http://globalsteviainstitute.com/health-
professionals/food-science/)
3
1.4. Primena stevije
Stevija ima široki spektar primene, kako u industriji hrane tako i u medicinske svrhe.
Zbog prisustva aktivnih supstanci koje su i do 200 puta slađe od saharoze, lišće ove biljke se
već godinama koristi kao zaslađivač. Kako nema kalorije, ugljene hidrate, ni glikemijski
indeks pogodna je za dijabetičare. U Paragvaju su Guarani Indijanci koristili sok dobijen iz
stevije za brže zarastanje rana. Jedna od interesantnih osobina mu je da pomaže u
sprečavanju dobijanja ožiljaka, a koristi se još i protiv dermatitisa. Zbog uticaja na
regenraciju kože koristi se i u kozmetičke svrhe. Ima antioksidativna svojstva a sadrži i neke
minerale poput Mg, Cu, Mn, Fe i Zn, Ca ( Abou-arab i sar., 2010), kao i vitamine C, B2, B6,
folnu kiselinu, niacin i tiamin (Gupta i sar., 2013).
Dosadašnja istraživanja pokazala su da stevija ima anti-virusno, anti-mikrobno, anti-
fungalno, anti-hipertenzivno, anti-hiperglikemično i anti-inflamatorno dejstvo. Prema
toksikološkim istraživanjima njeni sekundarni metaboliti nemaju teratogeni, mutageni,
kancerogeni, ni alergijski efekat (Abou-Arab i sar., 2010). Pokazano je i da sprečava nastanak
zubnog karijesa (Singh i Rao, 2005) i da smanjuje dentalni plak (de Slavutzky, 2010).
Kontroliše nivo šećera u krvi, te pomaže u radu slezine i jetre, a kod ljudi obolelih od
dijabetesa 2 primećeno je i smanjenje zavisnosti od insulina i korigovanje njegovog nivoa u
organizmu. Takođe pomaže u regulisanju visokog krvnog pritiska. Čaj od stevije efektivno
reguliše varenje i pomaže kod stomačnih oboljenja (Gupta i sar., 2013).
1.5. Hemijski sastav
1.5.1. Steviol-glikozidi
Glikozidi su jedinjenja koja sadrže glukozu i ne-šećernu komponentu nazvanu
aglikon. Lišće stevije sadrži steviol-glikozide, koji su od 250-400 puta slađi od šećera.
Karbohidratne jedinice, ugavnom glukoza, vezani su za steviol u različitim konfiguracijama i
tako formiraju širok spektar ovih slatkih jedinjenja. (Bhutia i Sharangi, 2016). Steviol-
gikozidi prisutni u listu stevije su steviozid (5-10 %), steviobiozid, rebaudiozid A (2-4 %),
rebaudiozid B, rebaudiozid C (1-2 %), rebaudiozid D, rebaudiozid E i dulkozid A (0,4-0,7
%) (Ahmed i sar., 2011). Steviozida najviše ima u listovima, nešto manje u izdancima, zatim
korenu, a najmanje su zastupljeni u cvetovima biljke (Yadav i sar., 2011). Receptori za ukus,
4
na jeziku reaguju na glukozu u glikozidu, pa tako rebaudiozidi koji sadrže vise glukoze od
steviozida imaju slađi ukus. Receptori za gorak ukus sa druge strane reaguju na aglikone.
(Bhutia i Sharangi, 2016).
Steviol-glikozidi se slabo apsorbuju u organizmu i prolaze intaktni kroz digestivni
trakt. Kada stignu do kolona, bakterije hidrolizuju steviol-glikozide do steviola, odsecanjem
njihovih glukoznih jedinica. Steviol portnom venom stiže do jetre, koja ga metaboliše do
steviol-glukoronida, koji se urinom izlučuju iz organizma. Glukoza koja se oslobađa u ovom
procesu, se ne apsorbuje već je koriste bakterije kolona. Istraživanja pokazuju da ne dolazi do
akumulacije stevije u organizmu, prilikom njenog metabolizma. To je rezultat slabe
apsorpcije, što doprinosi činjenici da stevija nema kalorije i ne povećava nivo glukoze i
insulina prilikom konzumacije. U digestivnom traktu rebaudiozidi se metabolišu do steviozida,
koji se sekvencijalno razlažu na glukozu i steviol (Bhutia i Sharangi, 2016).
Slika 4. Metabolizam steviozida
(https://www.researchgate.net/publication/6597691_Metabolism_of_stevioside_by_health
y_subjects)
Slika 3. Strukturne formule, steviola, steviozida i rebaudiozida A (Ahmed i sar., 2011).
5
R1 R2
Steviol H H
Steviobiozid H β-Glc - β-Glc (2→1)
Steviozid β-Glc β-Glc - β-Glc (2→1)
Rebaudiozid A β-Glc
β-Glc - β-Glc (2→1)
|
β-Glc (3→1)
Rebaudiozid B H
β-Glc - β-Glc (2→1)
|
β-Glc (3→1)
Rebaudiozid C β-Glc
β-Glc - α-Rha (2→1)
|
β-Glc (3→1)
Rebaudiozid D β-Glc- β-Glc (2→1)
β-Glc - β-Glc (2→1)
|
β-Glc (3→1)
Rebaudiozid E β-Glc- β-Glc (2→1) β-Glc - β-Glc (2→1)
Rebaudiozid F β-Glc
β-Glc - β-Xyl (2→1)
|
β-Glc (3→1)
Dulkozid A β-Glc β-Glc - α-Rha (2→1)
Tabela 1. Struktura glavnih steviol-glikozida u listu S.rebaudiana (Bert). Glc, Xyl,
Rha su oznake za glukozu, ksilozu i ramnozu, respektivno (Lemus-Mondaca i sar.,
2012).
6
1.5.2. Sinteza steviol-glikozida
Steviol-glikozidi nastaju u mevalonat-zavisnom putu. To je fundamentalni
metabolički put, prisutan kod svih viših eukariota i mnogih bakterija, za dobijanje dimetilalil
pirofosfata (DMAPP) i izopentenil pirofosfata (IPP), koji služi kao biosintetička polazna
tačka za sintezu svih izoprenoidnih jedinjenja (terpenoida), sintezu hormona, proteinsku
prenilaciju, N-glikozidaciju, održavanje ćelijske membrane, a takođe je deo steroidne
biosinteze (Brandle i sar., 1998).
Biosinteza steviola je prvi put proučavana pre 30 godina. Pokazano je da su početni
koraci koji vode do sinteze steviol-glikozida od početnog jedinjenja, geranilgeranil
pirofosfata (GGPP), identični onima u biosintezi giberelina. (Brandle i sar., 1998).
Proces počinje konvertovanjem GGPP u ent-kopalil pirofosfat (CPP) pomoću ent-
kopalil pirofosfat sintaze (CPP-sintaza), a zatim se pomoću ent-kauren sintaze sintetiše ent-
kauren. Sledi sekvencijalna oksidacija ent-kaurena na C-19 poziciji pomoću enzima ent-
kauren 19-oksidaze, i preko ent-kaurenola, i ent-kaurenala, nastaje ent-kaurenoična kiselina.
Nakon toga putevi za sintezu stiviol-glikozida i giberelina divergiraju. Steviol nastaje
hidroksilacijom ent-kaurenoične kiseline na C-13 poziciji, pomoću enzima ent-kaurenoična
kiselina 13-hidroksilaze (KAH).
Kako steviol na C-13 atomu ima vezanu OH grupu, a na C-19 atomu karboksilnu
grupu, to omogućava vezivanje bočnih lanaca ugljenih hidrata, i sintezu razičitih glikozida.
Ovi bočni lanci obično sadrže glukozu kao rezidulanu jedinicu, ali mogu sadržati i ramnozu
ili ksilozu. Identifikovane su najmanje 3 zasebne aktivnosti glikozil-transferaze, a dve su i
opisane (Brandle i sar., 1998). Glikozidaciju aglikona steviola katalizuje nekoliko glikozil
transferaza u citoplazmi. Glikozidacija počinje na C-13 atomu pomoću UGT85C2 enzima,
što dovodi do nastanka steviolmonozida. Nakon toga njegovom glikozidacijom nastaje
steviolbiozid. UGT ovog koraka još uvek nije identifikovan. Na kraju glikozidacijom na C-19
atomu pomoću UGT74G1 nastaje steviozid. Glikozidacijom steviozida na C-13 poziciji,
UGT 76G1 enzimom nastaje rebaudiozid A (Kumari i Chandra, 2014).
7
Slika 5. Sinteza steviol-glikozida
(https://www.researchgate.net/publication/51036914_UDP-
dependent_glycosyltransferases_involved_in_the_biosynthesis_of_steviol_glycosides)
8
1.5.3. Ostala jedinjenja
List stevije sadrži i 80-85 % vode, ugljene hidrate, proteine i amino kiseline, lipide,
esencijalna ulja, β karoten, vitamin C, riboflavin, tiamin, giberelinsku kiselinu, indol-3-
acetonitril, izokvercetin, kampferol, stigmasterol, ksantofile, umbeliferon, hlorogenu kiselinu,
kofeinsku kiselinu, Cr, Co, Mg, Fe, K i P i elemente u tragovima (Gupta i sar., 2013).
Hemijskim analizama je utvrđeno da listovi stevije sušeni na suncu, na temepraturi od
25-30°C, tokom 24-48 h, sadrže u suvoj lisnoj masi 5,37 % vlage, 11,41 % proteina, 15,52 %
sirovih vlakana, 3,73 % masti, 7,4 % pepela i 61,93 % ugljenih hidrata. Takođe suva lisna
masa sadrži i 5,88 % redukujućih šećera, 9,77 % neredukujućih šećera i 16,65 % solubilnih
ugljenih hidrata (Abou-Arab i sar., 2010). Ovi podaci ukazuju na to da je lišće stevije dobar
izvor ugljenih hidrata, proteina i sirovih vlakana (Gasmalla i sar., 2014).
Stevija u svom sastavu sadrži 6 masnih kiselina (palmitinsku, pamitoleinsku,
stearinsku, oleinsku, linolnu i linoleinsku kiselinu) i ukupno 17 aminokiselina, esencijalnih i
ne-esencijalnih, koje su prikazane u tabeli. (Abou-Arab i sar., 2010).
Esencijalne amino kiseline Ne-esencijalne aminokiseline
Aminokiselina (g/100g suve lisne
mase) Aminokiselina (g/100g suve lisne
mase ) Arginin 0.45 Aspartat 0.37
Lizin 0.70 Serin 0.46
Histidin 1.13 Glutaminska kiselina 0.43
Fenil alanin 0.77 Prolin 0.17
Leucin 0.98 Glicin 0.25
Metionin 1.45 Alanin 0.56
Valin 0.64 Cistein 0.40
Treonin 1.13 Tirozin 1.08
Izoleucin 0.42
Ukupno 7.67 3.72
Tabela 2. Esencijalne i ne-esencijalne aminokiseline izolovane iz listova stevije
(Abou-Arab i sar., 2010).
9
Ugljeni hidrati imaju brojne esencijalne uloge u organizmu. Monosaharidi su glavni
izvori energije u metabolizmu, dok polisaharidi služe kao depoi energije i za izgradnju
strukturnih ćelijskih komponenti. Polimeri molekula fruktoze se nazivaju fruktani. Fruktani
sa kratkim lancima su poznati kao fruktooligosaharidi, dok se oni sa dugim lancima nazivaju
inulini (sastoje se pretežno od β fruktozil-
fruktozo veza). Koren i listovi stevije sadrže
inuline, nesvarljive ugljene hidrate koji imaju
važna probiotska svojstva jer utiču na
kompoziciju mikroflore kolona. Zbog
specifične hemijske strukture, β fruktozil-
fruktozo veze ne mogu biti hidrolizovane
humanim digestivnim enzimima, pa tako
prolazi koz digestivni trakt intaktan. Nakon
dospevanja u kolon metabolišu ga intestinalne
bakterije. Svoje dejstvo ostvaruju selektivnim
stimulisanjem rasta i aktivnosti nepatogenih
bakterija (bifidobakterija i laktobacila) (Sokić i
sar., 2009). Takođe ima ulogu u metabolizmu
lipida i kontroli dijabetesa. (Lemus-Mondaca i sar., 2012). Istraživanja su pokazala da inulini
mogu da modifikuju imuni odgovor domaćina i na taj način ga štite od infektivnih bolesti,
redukuju incidenciju karcinoma i povećavaju apsorpciju minerala (Ca, Mg i Fe). Stepen
polimerizacije inulina značajno utiče na njegova svojstva. Do skoro se smatralo da je inulin
linearni molekul, ali je utvrđeno da ipak postoji mali stepen grananja (Sokić i sar., 2009).
Od makroelemenata u suvoj lisnoj masi (u 100 g) najviše ima kalijuma (21,15 mg),
zatim kalcijuma (17,70 mg), natrijuma (14,93 mg) i magnezijuma (3,26 mg). Od
mikroelemenata prisutni su bakar (0,73 mg), mangan (2,89 mg), gvožđe (5,89 mg) i cink
(1,26 mg). Ovi podaci ukazuju na to da je stevija bogata mineralima koji regulišu veliki broj
metaboličkih procesa u organizmu. Cink i mangan se smatraju antioksidansima, njihovo
prisustvo ubrzava imuni sistem i deluju kao preventiva bolesti izazvanih slobodnim
radikalima. Gvožđe je neophodno za sintezu hemoglobina, pa tako stevija ima ulogu i u
regulisanju količine hemoglobina u krvi. Zbog ove osobine stevija se može koristiti za izradu
preparata za lečenje anemija. Iz svežih kao i suvih listova stevije izolovani su hlorofil A i B
kao i karotenoidi (Abou-Arab i sar., 2010).
Slika 6. Struktura inulina
(http://wildflowerfinder.org.uk/Flowers/E/El
ecampane/Elecampane.htm)
10
Terpenoidi su jedinjenja koja su izgrađena od izoprena (5 C atoma), i upravo zbog
toga se često nazivaju i izoprenoidi. Na osnovu broja izoprenskih jedinica, odnosno broja
ugljenikovih atoma koji ih izgrađuju, terpenoidi se mogu podeliti na monoterpenoide (10 C
atoma, dve izoprenske jedinice), seskviterpenoide (15 C atoma, tri izoprenske jedinice),
diterpenoide (20 C atoma, četiri izoprenske jedinice), triterpenoide (30 C atoma, šest
izoprenskih jedinica), tetraterpenoide (40 C atoma, osam izoprenskih jedinica) i
politerpenoide ( više od 40 C atoma i 8 izoprenskih jedinica). Terpenoidi su jedinjenja koja su
odgovorna za karakteristični miris biljka, pri čemu se u isparljive terpenoide svrstavaju
monoterpenoidi i seskviterpenoidi (Mahmoud i Croteau, 2002).
Monoterpenoidi su glavne komponente etarskih ulja velikog broja aromatičnih biljnih
vrsta (Buckinghman, 1994). Seskviterpenoidi su jedinjenja izgrađena od tri izoprenske
jedinice i predstavljaju veoma raznoliku grupu terpenoida. U biljkama imaju ulogu feromona
i juvenilnih hormona. Mogu biti aciklični, monocikični i biciklični (Graβmann, 2005).
Aciklični predstavnici seskviterpenoida se često nazivaju i farnezani, pošto nastaju od
farnesola. Na osnovu veličine prstena razlikujemo monociklične (bisaboleni, germakreni,
elemenini, humuleni i drugi) i policiklične seskviterpene (kariofileni, eudezmani, akorani,
kamferani, kedrani, drimani, kadinani, oplopani, gvajani) (Aharoni i sar., 2005). Diterpenoidi
su velika grupa strukturno veoma različitih jedinjenja, i u prirodi se najčešće javljaju kao
diciklična, triciklična i tetraciklična jedinjenja. Diterpenoidi u biljkama imaju važne ekološke
i fiziološke funkcije: fitol je strukturni segment hlorofila, a fitoaleksini predstavljaju prirodni
odbrambeni mehanizam biljaka u zaštiti od patogenih mikroorganizama i predatora (Dewick,
2002). Triterpenoidi se sastoje iz dve farnezanske jedinice povezane po principu glava-rep.
Glavne grupe ovih jedinjenja koje se javljaju u prirodi su saponini, glikozidi, fitosteroli,
steroidi (Sawai i Saito, 2011).
Osim slatkih diterpenoidnih glikozida, još nekoliko diterpena je izolovano iz stevije.
Prvo su okarakterisani jhanol, austroinulin i 6-O-acetilaustroinulin. Takođe, detektovani su i
neki triterpenoidi poput β-amirin acetata, 3 estra lupeola i sterol, stigmasterol i β-sitosterol.
Jhanol, austroinulin, 6-O-acetilaustroinulin i 7-O-acetilaustroinulin zajedno sa steviozidom i
rebaudiozidom A, su detektovani u cvetovima stevije. Dodatnih osam diterpenoida, nazvanih
sterebini A-H, izolovani su iz listova i identifikovani (Brandle i sar., 1998).
11
Iz esencijalnog ulja izolovani su seskviterpeni, i to β-kariofilen, trans-β-farnesen, α-
humulen, δ-kadinen, kariofilen oksid i nerolidol, kao i monoterpeni linalool, terpinen-4-ol, α-
terpineol (Brandle i sar., 1998).
Fenolna jedinjenja čine najrasprostranjeniju grupu sekundarnih metabolita. Zbog
svojih antioksidativnih osobina upotrebljavaju se u medicini, farmaceutskoj, kozmetičkoj i
prehrambenoj industriji (Martin i Appel, 2010). Fenolna jedinjenja u svom sastavu imaju bar
jedan aromatični prsten sa jednom ili više hidroksilnih grupa (Stalikas, 2007). Jedna od
najčešće pominjanih i najčešće ispitivanih osobina fenolnih jedinjenja je njihova
antioksidativna aktivnost (Zayova i sar., 2013). Smatra se da je izražena antioksidativna
aktivnost fenolnih jedinjenja rezultat sposobnosti fenolnih jedinjenja da budu donori
vodonikovih atoma i da pri tome uklanjaju slobodne radikale, uz formiranje manje reaktivnih
fenoksil radikala (Pietta, 2000). Pomoću svojih hidroksilnih grupa sakupljaju slobodne
radikale i vrše helaciju metalnih jona (Gaweł-Bęben i sar., 2015). Klasifikacija fenolnih
jedinjenja može se izvršiti na osnovu broja ugljenikovih atoma koji izgrađuju osnovni skelet
fenola. Prema ovoj podeli postoje: prosti fenoli, fenolne kiseline, cimetne kiseline,
naftohinoni, ksantoni, stilbeni, flavonoidi i lignini (Boros i sar., 2010).
Flavonoidi su sekundarni metaboliti biljaka, koji se uopšteno sastoje od ugljenikovog
skeleta koga čine dva pirolova prstena povezana preko pirana. Nekada su ih nazivali vitamin
P. Najveća im je koncentracija u fotosintetičkim delovima biljaka, a poznati su po svojim
antioksidativnim svojstvima koja omogućava hidroksilna grupa flavonoida. Slično
steviozidima, slabo se rastvaraju u vodi i apsorbuju, što otežava njihovu terapeutsku primenu.
(Nijveldt i sar., 2001). Ipak pokazana je njihova antibakterijska i antiviralna aktivnost a ima i
podataka o pozitivnom dejstvu u slučajevima kancera i kardiovaskularnih oboljenja
(Middleton, 1998).
U metanlono-vodenom ekstraktu lišća stevije je detektovano 7 flavonoidnih glikozida:
apigenin-4’-O glukozid, luteolin-7-O glukozid, kampferol-3-O ramnozid, kvircitrin,
kvercetin-3-O glukozid i kvercetin-3-O arabinozid i 5, 7, 3’-trihidroksi-3, 6, 4’-
trimetoksiflavon (Brandle i sar., 1998).
12
1.6. Fizičke i hemijske karakteristike stevije
Svaka komponenta stevije je slađa od saharoze: rebaudiozid A (250-400 puta),
rebaudiozid B (300-350 puta), rebaudiozid C (50-120 puta), rebaudiozid D (250-450 puta),
rebaudiozid E (150 do 300 puta), dulkozid A (50-120 puta) i steviobiozid (100-125 puta)
(Ahmed i sar., 2011). Ipak zbog prisustva seskviterpenskih laktona, nestabilnih aromatičnih i
esencijalnih ulja, tanina i flavonoida, pored slatkog, stevija ima i blago neprijatan gorak ukus
(Abou-Arab i sar., 2010).
Steviozidi su slabo rastvorljivi u vodi i imaju visoku tačku topljenja. Stabilnost
pokazuju na različitim vrednostima pH sredine i temperature. Inkubirani na povišenim
temperaturama 1h, pokazuju dobru stabilnost i do 120 °C. Na 140 °C počinje njihova
dekompozicija, a na 200 °C dekompozicija je potpuna. Izlaganje temperaturi od 60 °C u
rasponu pH od 1-10, tokom 2h gotovo da ne dovodi do degradacije, a pri temperaturi od 80
°C i pH 2 i 10, dolazi do 5 % degradacije. U jako kiselim sredinama (pH=1) i nakon
inkubacije 2 h na 80°C dolazi do dekompozicije steviozida (Abou-Arab i sar., 2010). Fizičke
i hemijske karakteristike steviozida, njihova stabilnost na različitim temperaturama i pH
vrednostima, kao i organoleptička svojstva ukazuju na to da se stevija može primenjivati kao
zamena za šećer (Abou-Arab i sar., 2010).
Komponenta Tačka topljenja
(°C)
Specifična
rotacija [α] D25
Molekulska
težina
Rastvorljivost u
vodi (%)
Steviozid 196-198 -39.3 804 0.13
Rebaudiozid A 242-244 -20.8 966 0.80
Rebaudiozid B 193-195 -45.4 804 0.10
Rebaudiozid C 215-217 -29.9 958 0.21
Rebaudiozid D 283-286 -22.7 1128 1.00
Rebaudiozid E 205-207 -34.2 966 1.70
Steviolbiozid 188-192 -34.5 642 0.03
Dulkozid A 193-195 -50.2 788 0.58
Tabela 3. Fizičke i hemijske karakteristike steviol-glikozida prisutnih u listu stevije
(Kinghorn, 2002).
).
13
1.7. Biološke aktivnosti stevije
Antihiperglikemična aktivnost
Neki metabolički poremećaji, poput dijabetesa, koji je uzrokovan nedovoljnim
stvaranjem insulina ili rezistencijom na insulin, kao i disfunkcijom β-ćelija pankreasa, su sve
češći problem u svetu. U Južnoj Americi ekstrakti stevije se uveliko koriste za lečenje
dijabetesa (Ahmed i sar., 2011). Ispitivanjem uticaja vodenog ekstrakta lista stevije na nivo
glukoze u krvi uočeno je da nakon ingestije vodenog ekstrakta dolazi do značajnog smanjenja
glukoze u plazmi (Curi i sar., 1986). Stevija ima revitalizujući efekat na β-ćelije pankreasa, a
takođe smanjuje rezistenciju na insulin i poboljšava njegovu produkciju. Chen i saradnici su
2005. otkrili da steviozidi mogu da regulišu nivo glukoze u krvi ne samo poboljšavajući
sekreciju insulina, već i njegovo iskorišćavanje kod pacova sa insulinskim deficijentom.
Takođe sprovedeno je nekoliko istraživanja na zdravim ljudima koji su konzumirali ekstrakte
lišća stevije, i uočeno je da dolazi do povećanja tolerancije na glukozu. (Chen i sar., 2005).
Potvrđeno je da ekstrakti stevije povećavaju toleranciju na glukozu i kod zečeva kojima je
izazvan dijabetes aloksanom (von Schmeling i sar., 1977).
Ekstrakti stevije koji sadrže 50 % steviozida davani su pacovima oralno 56 dana, 1g
dnevno, i osim bago smanjene aktivnosti jetrene laktat dehidrogenaze, nisu uočene druge
biohemijske ili patološke promene (Lee i sar., 1979). U drugom istraživanju ekstrakti stevije
sa 75 % steviozida i 16 % rebaudiozida A davani su pacovima 24 meseca u dozama 550
mg/kg/danu. Jedini uočen efekat je blagi poremećaj rasta (Yamada i sar., 1985).
Antihipertenzivno dejstvo
Fiziološki i farmakološki eksperimenti povrdili su da steviozidi imaju ulogu
sistemskih vazodilatatora. Ekstrakti stevije smanjuju broj otkucaja srca i krvni pritisak.
Vodeni ekstrakt davan pacovima od 40-60 dana, izazvao je hipotenziju, pad krvnog pritiska
sa 110 mm Hg na 90 mm Hg (Melis, 1995). Eksperimenti na ljudima ukazuju na pozitivne
uloge kod hipertenzivnih stanja. Potvrđeno je da 750-1500 mg dnevno steviozida smanjuje
sistolni pritisak za 10-11 mm Hg i dijastolni pritisak za 6-14 mm Hg, nakon jedne nedelje
tretmana. Steviozidi uzrokuju vazodilataciju inhibicijom ulaska Ca2+
jona u krvne sudove
(Bhutia i Sharangi, 2016).
14
Efekat na rad bubrega
Oralno davani ekstrakti stevije pacovima 40-60 dana, dva puta dnevno, izazivaju
pojačanu diurezu i izlučivanje natrijuma, kao i povećan renalni protok plazme što ukazuje na
vazodilataciju. Ipak glomerulna filtracija ostaje nepromenjena (Melis, 1995).
Antioksidativna svojstva
Antioksidansi detektovani u ekstraktima biljke Stevia rebaudiana su mnogi. Medju
njima ima opigenina, kampferola, kueritrina koji inhibiraju oštećenja DNK lanca. Izosteviol,
derivat steviozida inhibira angiotenzin II-indukovanu ćelijsku proliferaciju i sekreciju
endotelina i oslabljuje reaktivne vrste kiseonika (eng. Reactive oxygen species- ROS)
(Ghanta i sar., 2007 i Stoyanova i sar., 2011). Zato može biti koristan u lečenju raznih bolesti,
poput kancera, reproduktivnih problema i poremećaja u razvoju (Bhutia i Sharangi, 2016).
Anti-kancerogeni efekat
Iako ima malo dokaza, u svom radu iz 2006. Yukasava i saradnici tvrde da 4 izolata
steviol-gikozida (steviozid, rebaudiozid A i C i dulkozid A) iz stevije imaju jak inhibitorni
efekat na 12-0-tetradekanoilforbol-13-acetat (TPA)-indukovanu infalamaciju kod miševa što
ukazuje na njihova antikancerogena svojstva (Raskovic i sar., 2004 i Yasukawa, 2002).
Izosteviol inhibira DNK polimerazu i humanu DNK topoizomerazu II, ćelijske ‘’mete’’ u
terapiji kancera i upalnih oboljenja. Osim toga, izosteviol takođe inhibira rast 3 različita tipa
kancerskih ćelija i umanjuje TPA-indukovane inflamacije (Kumari i Chandra, 2014).
Antimikrobna aktivnost
Svojstvo stevije da inhibira rast i reprodukciju bakterija i drugih infektivnih
organizama je važna sa dva aspekta. Prvo, može smanjiti učestalost prehlada i gripa (Bhutia i
Sharangi, 2016). Sa druge strane pokazano je da Streptococcus mutans, Pseudomonas
aeruginsa i Proteus vulgaris i ostali mikrobi ne opstaju u prisustvu konstituenata stevije.
(Tadhani i sar., 2007). Ove činjenice, kao i sam sladak ukus biljke, čine je pogodnom za
izradu sredstava za ispiranje usta i zubnih pasti. Istraživanja su pokazala i to da stevija
smanjuje učestalost stvaranja zubnog karijesa. Takođe, postoje dokazi i o tome da derivati
15
dobijeni iz izolata stevije, koji uključuju okta-acetilombuozid, ombuin i retuzin, imaju
antimikrobnu aktivnost protiv G+ bakterija (Tomita i sar., 1997). Ova antimikrobna i
antitkancerogena svojstva različitih ekstakata lišća stevije čine je potencijalnim inovativnim
medikamentom (Bhutia i Sharangi, 2016). Ekstrakti stevije, koncentracije 100 μg/ml,
pokazuju antibakterijsku aktivnost kod bakterija Serratia marcescens, Klebsiella
pneumoniae, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Alcaligens denitificans i Salmonela
typhimurium. Najefektivnija zona inhibicije je pokazana kod Bacillus cereus i iznosi 12 mm.
Ekstrakti lišća stevije pokazuju i antifungalnu aktivnost kod patogenih gljiva Alternaria
solani, Heliminthosporium solani, Aspergillus niger i Penicillium chrysogenium, i kod nekih
patogenih bakterija Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis i
Staphylococcus aureus (Kumari i Chandra, 2014).
Anti-inflamatorni i imuno-modulatorni efekat
Anti-inflamatorni lekovi čine gotovo polovinu analgetika koji umanjuju bol
redukovanjem upalnog procesa, za razliku od opijata koji utiču na centralni nervni sistem.
Uočeno je da stevija umanjuje sintezu inflamatornih medijatora u lipopolisaharidno
stimulisanim THP 1 ćeijama, tako što interferira sa I kapa B kinazom (IKKB) i stoga kapa B
signani put ima anti-inflamatorni i imuno-modulatorni efekat. (Bookaewan i sar., 2006).
Letalna doza
Jedna studija je pokazala da je letalna doza (LD50) kod pacova, za vodeni etanolni rastvor
koji sadrži 50% steviozida, 3400 mg/kg (Lee i sar., 1979), a kod miševa 17 g/kg. (Akashi i
Yokoyama, 1975).
16
2. CILJ RADA
Cilj ovog rada bilo je ispitivanje uticaja različitih koncentracija rastvora zaslađivača
na bazi stevije, na vijabilnost ćelija kostne srži i osmotsku rezistenciju eritocita periferne krvi
pacova soja Wistar.
17
3. MATERIJAL I METODE
3.1. MATERIJAL
U eksperimentu je korišćen sledeći materijal:
- Eksperimentalne životinje, pacovi soja Wistar, težine oko 300g
- Kostna srž femura i tibije pacova Wistar
- Eritrociti pacova Wistar
- Zaslađivač na bazi stevije
3.2. METODE
- Priprema štok i radnih rastvora
- Izolovanje kostne srži iz femura i tibije pacova
- Postupak za dobijanje ćelijskih elemenata kostne srži
- Protokol za podešavanje željene gustine ćelija
- Tripan plavo (Trypan blue) metod isključivanja
- Postupak za dobijanje eritrocita
- Cijanmethemoglobinska metoda (CH metoda)
- Obrada rezultata
3.2.1. Priprema štok i radnih rastvora
PBS (eng. phosphate buffer solution – fosfatni pufer) se najčešće koristi u biološkim
istraživanjima za održavanje PH sredine. Nije toksičan za ćelije pa zbog toga ima mnogo
namena. U ovom radu, PBS je korišćen kao rastvarač pri pravljenju štok i radnih rastvora.
Koncentrovan rastvor koji se u različitim razblaženjima koristi u laboratoriji je štok
rastvor. Razblaženja štok rastvora su radni rastvori. Štok rastvor je dobijen rastvaranjem 10 g
zaslađivača na bazi stevije u 50 ml puferovanog fiziološkog rastvora (PBS). Na taj način je
dobijen štok koncentracije 200 mg/ml rastvora zaslađivača na bazi stevije. Pre izvođenja
eksperimenta napravljeni su radni rastvori koncentracija 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml i 100
mg/ml. Radni rastvori dobijeni su razblaživanjem štoka u puferovanom fiziološkom rastvoru
18
(PBS-u), tako da su se konačne koncentracije radnog rastvora zaslađivača nalazile u 0,9%
PBS-u.
3.2.2. Izolovanje kostne srži iz femura i tibije pacova
Pacovi se žrtvuju, a potom se dezinfikuju 70 % etanolom. Femuri i tibije obe noge se
oštrim makazama i skalpelom izoluju i očiste od mukulature i vezivnog tkiva, a zatim im se
odseku epifize. U sterilni špric je uvučeno 2 ml PBS-a. Kratka gumena cevčica se jednim
krajem navuče na vrh šprica, a drugim na kost. Istiskivanjem fiziološkog rastvora iz šprica u
epruvetu, koja se nalazi na ledu, izduvana je kostna srž svake kosti, istovremenim
pridržavanjem cevčice kako ne bi spala zbog pritiska. Nakon toga se ćelije kostne srži
resuspenduju Pasterovom pipetom kako bi se razbili ćelijski agregati.
Slika 7. Šematski prikaz izolacije kostne srži iz femura i tibije pacova
(http://synapse.koreamed.org/DOIx.php?id=10.4111/kju.2008.49.5.432&vmode=PUBREAD
ER)
3.2.3. Postupak za dobijanje ćelijskih elemenata kostne srži
Resuspendovana ćelijska suspenzija centrifugira se 10 min., na 1100 obrtaja/min pri
temperaturi od 4 °C. Po završenom centrifugiranju, Pasterovom pipetom je izvučen
supernatant i talogu ćelija koji ostaje na dnu epruvete dodaje se 4 ml PBS-a. Ćelije su zatim
resuspendovane u PBS-u i na taj način je dobijen ćelijski štok.
19
3.2.4. Protokol za podešavanje željene gustine ćelija
Ovaj protokol se koristi za određivanje
vijabilnosti ćelija, prinosa vijabilnih ćelija i
podešavanje željene gustine ćelija (1.0 x 106
ćelija/ml). Najpre, u čistu ependorficu treba
dodati 350 µl PBS-a, 50 µl 0.4 % Tripan plavo
rastvora, a zatim i 100 µl ćelijskog štoka. Time se
pravi finalni rastvor ćelije:štok u odnosu 1:5. U
formuli koja sledi, ovo se odnosi na “faktor
razblaženja”.
Brojanje ćelija vrši se u hemocitometarskim
komoricama, od kojih je Neubauerova najčešće
korišćena. Neubauerova hemocitometarska komorica
predstavlja debelu predmetnu pločicu u koju su urezana
4 uzdužna žljeba. Između 2 unutrašnja žljeba, se nalazi
poprečni žljeb koji deli srednje polje na 2 jednaka dela.
U oba dela srednjeg polja su urezane mrežice za brojanje
ćelija. Površina mrežice je 9 mm2 i čini je 9 kvadrata
površine 1 mm2. Svaki od ovih kvadrata podejen je na
16 manjih, jednakih kvadrata čija je površina 1/16mm2.
Centralni kvadrat podeljen je na 25 manjih kvadrata, od
kojih je svaki podeljen na još 16 jednakih kvadratića čija
je površina 0.0025 mm2.
Pipetmanom iz ependorfice uzorkujemo 20 μl obojene ćelijske suspenzije i prenesemo
je u Neubauer-ovu hemocitometarsku komoricu. Ćelije su brojane u 4 periferna kvadrata
površine 1 mm2.
Ćelijsku vijabilnost određujemo koristeći formulu:
Broj živih ćelija / Ukupan broj ćelija = Vijabilnost (%)
Nakon toga ukupan prinos vijabilnih ćelija određujemo pomoću sledeće formule:
Broj vijabilnih ćelija / Prebrojani kvadranti x Faktor razblaženja x Hemocitometarski faktor
x Trenutni volumen (ml) = Prinos vijabilnih ćelija
Slika 8. Neubauer-ova komorica za
brojanje ćeija
(http://laboratoryinfo.com/manual-cell-
counting-neubauer-chamber/)
Slika 9. Mrežica
hemocitometarske komorice
(Louis i Siegel, 2011).
20
Koristeći naredne formule odredili smo volumen medijuma (PBS-a) koji treba dodati našem
trenutnom ćelijskom štoku da bi dobili željenu ćelijsku gustinu (1.0 x 106
ćelija/ml).
Prinos vijabilnih ćelija / Željena gustina ćelija = Ukupan potrebni volumen
Ukupan potrebni volumen - Trenutni volumen = Volumen koji se dodaje ćelijskom štoku
3.2.5. Tripan plavo (Trypan blue) metod isključivanja
Tripan plavo (eng. Trypan blue) je vitalna boja proizvedena iz toulidina, odnosno
nekoliko izomernih baza derivata toulena. Naziv boje potiče od njene sposodnosti da ubija
parazite koji izazivaju bolest spavanja, Tripanozome. Poznata je još i pod nazivima Nijagara
plavo i diamin plavo.
Tripan plavo metoda, kojom se određuje
vijabilnost ćelija, zasnovana je na negativnom
naelektrisanju boje, što joj omogućava da kroz
selektivno propustljivu membranu ćelija prolazi samo
u slučaju ako je došlo do oštećenja membrane. Žive
ćelije, čiji je integritet membrane očuvan, ne
propuštaju boju i posmatranjem pod mikroskopom se
vide kao svetlo-žute. Mrtve ćelije, kod kojih je došlo
do oštećenja membrane, primaju tripan plavo boju, pa
se pod mikroskopom vide kao plave. Ovom metodom
se ne mogu međusobno razlikovati mrtve i nekrotične
ćelije (Louis i Siegel, 2011).
Nakon podešavanja željene gustine ćelija, obeležene su nove, čiste epruvete u koje je
pipetmanom prebačeno po 500 μl ćelijske suspenzije i 500 μl radnog rastvora zaslađivača na
bazi stevije, triplet od svake koncentracije. U kontroli je, umesto radnog rastvora, dodato 500
μl PBS-a. Epruvete su inkubirane u vodenom kupatilu 1h, na temperaturi od 37 °C.
Nakon završetka inkubacije, sadržaj epruveta ponovo se centrifugira 10 min, na 1100
obraja/min na 4 °C kako bi se ćelije istaložile na dnu epruvete. Po završetku centrifugiranja,
pažljivo se pipetmanom izvuče 900 μl supernatanta i doda se ista količina tripsina. Tripsin
ima ulogu da odvoji ćelije međusobno, kao i od dna i zidova epruvete, za koje su adherirale u
toku centrifugiranja. Rastvor je stajao u frižideru 10 min. Nakon toga po 50 μl suspenzije iz
Slika 10. Vijabine i nevijabilne
ćelije (tripan plavo metoda)
(http://forum.cellprofiler.org/t/tryp
an-blue-exclusion-pipeline/1715)
21
svake epruvete je prebačeno u novu, obeleženu ependorficu, gde je dodato i 50 μl Tripan
plavo boje.
Iz svake ependorfice je uzeto po 20 μl obojene ćelijske suspenzije, i prebačeno na
Neubauer-ovu komoricu na kojoj su brojane žive i mrtve ćelije odvojeno. Na osnovu odnosa
živih i mrtvih ćelija za svaku koncentraciju je izračunat procenat vijabilnosti, srednja
vrednost svakog tripleta kao i standardna greška.
3.2.6. Postupak za dobijanje eritrocita
Eritrociti za ispitivanje osmotske otpornosti su dobijeni iz krvi pacova, koji je
anesteziran sa 0,4 ml ketamidora (Ketamidor 10%, Ritcher Pharma, Austrija). Eritrociti pune
krvi su dobijeni punkcijom leve komore srca špricem sa sterilnom iglom. Špric i igla su
prethodno heparinizovani kako bi se onemogućila koagulacija krvi. Zatim je izvučeno 10 ml
krvi sa povremenim zaustavljanjem kako bi se srce napunilo. Krv iz šprica je prebačena u
epruvetu laganim ispuštanjem niz zid epruvete, kako se ne bi oštetile ćelije.
3.2.7. Cijanmethemoglobinska metoda (CH metoda)
CH metoda se zasniva na tome da se hemoglobin krvi, tretirane kalijum cijanidom i
kalijum fericijanidom, pretvori u stabilni kompleks cijanmethemoglobin (HbCN).
Koncentracija oslobođenog hemoglobina iz eritrocita se određuje spektrofotometrijski na
talasnoj dužini od 540 nm. Drabkinov reagens se dobija mešanjem 1000 mg natrijum
bikarbonata, 50 mg kalijum cijanida, 200 mg kalijum fericijanida i vode do 1000 ml (Rusov,
1984).
Dobijena puna krv se centrifugira 3 puta. Posle svakog centrifugiranja se odliva
supernatant, a na talog eritrocita se dodaje 0,9 % PBS-a u istoj količini kolika je bila
zapremina krvi na početku. Nakon centrifugiranja talog eritrocita koji u ovom slučaju iznosi 5
ml se razblaži PBS-om, po sledećoj formuli:
5 ml:10% = x ml:90%
Od suspenzije eritrocita (50 ml) uzima se po 3 ml, u koji se dodaje po po 3 ml
radnog rastvora zaslađivača do željne finalne koncentracije. To se inkubira 3h na temperaturi
od 37 °C.
22
Po inkubaciji epruvete se centrifugiraju 5 min na 2000 obrtaja. U svaku epruvetu se
dodaje po 3 ml Drabkinovog reagesa i 200 μl cenrifugiranog ekstrakta i krvi. Kao negativna
kontrola u eksperimentu je korišćen je 0,9 % NaCl, a kao pozitivna kontrola (standard)
destiovana voda. Tako pripremljeni uzorci su odlivani u kivete spektrofotometra i merene su
absorbance na talasnoj dužini od 540 nm, kao nula korišćen je Drabkinov reagens. Na kraju
eksperimenta, određivanjem koncentracije hemoglobina spektrofotometrijski, utvrđen je
procent hemolize merenjem absorbance uzorka, kontrole i standarda na spektrofotometru.
Formula za izračunavanje procenta hemolize je sledeća:
Ab uzorka – Ab negativne kontrole / Ab dH2O x 100 %
Ispitivanje svake koncentracije rađeno je u triplikatu.
3.3. Obrada rezultata
Za statističku obradu dobijenih rezultata korišćen je program Microsoft Office Excel.
23
4. REZULTATI I DISKUSIJA
4.1. Uticaj zaslađivača na vijabilnost ćelija kostne srži
Ćelije kostne srži inkubirane su sa rastvorima zaslađivača na bazi stevije (Stevia
rebaudiana), koncentracija 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml i 100 mg/ml, 1 h u vodenom
kupatilu na temperaturi od 37 °C. Kontrola je inkubirana u PBS-u.
Rezultati inkubacije različitih koncetracija zaslađivača prikazani su na Grafiku 1. Vijabilnost
ćelija kostne srži je najveća u kontrolnoj grupi i iznosi 83,90 ± 2,62 %. Sa rastom finalne
koncentracije zaslađivača vijabilnost linearno opada pa tako pri koncentraciji od 25 mg/ml
ona iznosi 76,65 ± 5,14 %, koncentracija 50 mg/ml ima vijabilnost 61,94 ±1,89 %,
koncentracija 75mg/ml ima vijabilnost 55,95 ± 6.35 %, dok najveća ispitivana koncentracija
od 100 mg/ml ima vijabilnost ćelija 42,78 ± 2,98 %.
83,90
76,65
61,94
55,95
42,78
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
% v
ijab
iln
ost
i će
lija
Koncentracije rastvora zaslađivača (mg/ml)
Vijabilnost ćelija
25 mg/ml 50 mg/ml 75 mg/ml 100 mg/ml kontrola
Grafik 1. Procenat vijabilnih ćelija kostne srži, nakon tretiranja ćelija razičitim
koncentracijama zaslađivača na bazi stevije i inkubacije na temperaturi od 37°C.
24
4.2. Uticaj zaslađivača na osmotsku rezistentnost eritrocita
U drugom eksperimentu je ispitivano u kom procentu različite koncentracije zaslađivača
izazivaju hemolizu eritrocita. Rezulati uticaja na osmotsku rezistencju eritocita periferne krvi
pacova prikazani su na Grafiku 2.
Grafik 2. Procenat hemolize eritocita tretiranih koncentracijama zaslađivača na bazi stevije
(25-100 mg/ml) posle inkubacije na temperaturi od 37 °C.
Na Grafiku 2. se jasno uočava da povećana koncentracija ispitivanog zaslađivača veoma
utiče na procenat hemolize, tako da koncentracije veće od 75 mg/ml izazivaju preko 90 %
hemolize.
Naši rezulati ispitivanja potencijalne citoksičnosti zaslađivača na bazi stevije na ćelijama
kostne srži pokazuju da postoji linearna zavisnost između povećanja koncentracije i
smanjenja procenta vijabilnosti. Ovi rezulati se mogu tumačiti u svetlu do sada obajvljenih
rezulta pojedinih autora kao što su Gaweł-Bęben i saradnici (Gaweł-Bęben i sar., 2015).
Gaweł-Bęben i saradnici su ispitivali citotoksičnost 3 različita ekstrakta suvog lišća stevije
dobijena turbo-ekstrakcijom. Za dobijanje prvog ekstrakta je korišćena destilovana voda, za
60%
75%
91% 92%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
25 50 75 100
% h
emoli
ze
Koncentracije (mg/ml)
25
dobijanje drugog 96 % etanol, a za pripremu trećeg ekstrakta korišćen je rastvor propilen
glikol:voda u odnosu 4:1. Iako se vodeni i etanolni ekstrakt najčešće koriste, ovde je prvi put
upotrebljen rastvor propilen glikol:voda koji se često koristi u kozmetičkoj industriji.
Rezultati su pokazali da količina fenola i flavonoida najveća u ekstraktu dobijenom pomoću
rastvora propilen glikol:voda. Visoka koncentracija fenola ukazuje na postojanje
citotoksičnog potencijala ali istovremeno velika količina flavonoida utiče na značajne
antioksidativne sposobnosti ekstrakata stevije(Gaweł-Bęben i sar., 2015).
Akutna toksičnost steviozida i steviola (produkta enzimske hidrolize steviozida) je
ispitivana oralnim tretiranjem miševa, pacova i hrčaka. Broj uginulih životinja je zabeležen
14 dana nakon primanja doza. Doza steviozida od 15 g/kg telesne mase nije bila letalna ni za
jednu grupu životinja. Hrčci su bili osetljiviji na steviol od miševa. LD50 za steviol kod
hrčaka je bila 5,20 g/kg i 6,10 g/kg, za mužjake i ženke, respektivno. Za miševe i pacove,
LD50 vrednosti su bile veće od 15 g/kg, za oba pola. Histopatološki pregled bubrega hrčaka
koji su primali doze steviola pokazali su degeneraciju proksimalnih tubula. Ove strukturne
promene su u korelaciji sa povećanjem krvnog urea nitrata i kreatinina u serumu. To ukazuje
da je mogući uzrok smrti životinja, usled tretiranja steviolom, akutno otkazivanje bubrega
(Toskulkac i sar., 1997).
U istraživanjima Wasuntarawat-a i sarnika ispitivana je toksičnost steviola kod hrčaka.
Trudne ženke su intubirane dozama steviola od 0 g/kg, 0,25 g/kg, 0,5 g/kg, 0,75 g/kg i 1 g/kg
telesne mase dnevno, 6 do 10 dana. Doze steviola od 0,75 g/kg i 1 g/kg su pokazale veliku
toksičnosti i za ženke i za fetuse hrčaka. Na to ukazuju smanjena težina ženki tretiranih ovim
dozama, i povećan se broj uginulih, a takođe i smanjenje broja živih hrčaka po leglu kao i
smanjenje težine fetusa. Na fetusu jedne ženke, koja je primala dozu od 0,75 g/kg je uočena
kranijalna meningocela. Životinje tretirane dozom od 0,5 g/kg pokazuju manje znakova
toksičnosti. Doza od 0.25 g/kg nije pokazala toksični potencijal. Ove doze steviola su
izvedene iz doze steviozida od 625 mg/kg telesne mase dnevno, što je otprilike 80 puta veća
vrednost od dozvoljenog dnevnog unosa (koji iznosi 7.938 mg/kg telesne mase za čoveka)
(Wasuntarawat i sar., 1998).
26
5. ZAKLJUČAK
Postoji linearna zavisnost citoksičnog potencijala zaslađivača na bazi stevije i
smanjenja vijabilnosti ćelija kostne srži. Koncentracija od 100 mg/ml pokazuje
smanjenje na oko 50 % vijabilnosti ćelija.
Povećana koncentracija ispitivanog zaslađivača veoma utiče na procenat hemolize, pa
tako koncentracije veće od 75 mg/ml izazivaju preko 90 % hemolize eritrocita u
perifernoj krvi.
Dobijeni rezultati predstavjaju preliminana istraživanja i mogu biti dobra osnova za
buduća detaljnija ispitivanja efekata zaslađivača na bazi biljke Stevia rebaudiana
(Bert.)
27
6. LITERATURA
Abou-Arab, A.E., et al. 2010. Physico-chemical assessment of natural sweeteners steviosides
produced from Stevia rebaudiana Bertoni plant. African Journal of Food Science, 4(5),
pp.269- 281.
Aharoni, A., et al., 2005. Volatile science? Metabolic engineering of terpenoids in plants.
Trends in Plant Science, 10(12), pp.594-602.
Ahmed, B. et al., 2011. A review on natural sweetener plant – stevia having medicinal and
commercial importance. Agronomski glasnik, 1(2), pp.75–92.
Akashi, H. & Yokoyama, Y., 1975. Safety of dried-lief extracts of Stevia rebaudiana.
Shokuhin Kogyo, 18(20), pp.34-43.
Bhutia, P.H. & Sharangi, A.B., 2016. Stevia: Medicinal Miracles and Therapeutic Magic.
International Journal of Crop Science and Technology, 2(2), pp.45–59.
Bookaewan, C. et al., 2006. Anti inflammatory and immunomodulatory activities of
stevioside and its metabolite steviol on THP-1 cells. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 54(3), pp.758-789.
Boros, B. et al., 2010. Determination of polyphenolic compounds by liquid chromatography-
mass spectrometry in Thymus species. Journal of chromatography A, 1217(51), pp.7972-
7980.
Brandle, J.E. et al., 1998. Stevia rebaudiana: Its agricultural, biological, and chemical
properties. Canadian Journal of Plant Science, 78(4), pp.527-536.
Buckinghman, J. (1994). Dictionary of natural products. Champan and Hall, London.
Chen, T. et al., 2005. Mechanism of the hypoglycemic effect of stevioside , a glycoside of
Stevia rebaudiana. Plant Medicine, 71(2), pp.108-213.
28
Curi, R. et al., 1986. Effect of Stevia rebaudianaon glucose tolerance in normal adult humans.
Brazilian Journal of Medical and Biological Research , 19(6), pp.771-774.
de Slavutzky, S.M.B., 2010. Stevia and sucrose effect on plaque formation. Journal für
Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, 5(2), pp.213-216.
Dewick, P.M. (2002). Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach. John Wiley &
Sons, England.
Gasmalla, M.A.A. et al., 2014. Nutritional Composition of Stevia rebaudiana Bertoni Leaf:
Effect of Drying Method. Tropica Journal of Pharmaceutical Research, 13(1), pp.61–65.
Gaweł-Bęben, K. et al., 2015. Stevia rebaudiana Bert. leaf extracts as a multifunctional
source of natural antioxidants. Molecules, 20(4), pp.5468–5486.
Ghanta, S. et al., 2007. Oxidative DNK damage preventive activity and antioxidant potential
of Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertoni: A natural sweetener. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 55(26), pp.10962-10967.
Giuffré, L. et al., 2013. Stevia, ka’a he'e, wild sweet herb from South America - An
overview. Emirates Journal of Food and Agriculture, 25(10), pp.746-750.
Graβmann, J., 2005. Terpenoids as plant antioxidants. Vitamins and Hormones, 72: 505-535.
Gupta, E. et al., 2013. Nutritional and therapeutic values of Stevia rebaudiana: A review.
Journal of Medicinal Plants Research, 7(46), pp.3343–3353.
Gupta, R. et al., 2014. A rewiew on importance of natural sweetener, a zero calorie plant-
stevia- having medical and commercial importance. Internatonal Journal of Food and
Natural Sciences, 3(3), pp.90-94.
Kinghorn, A. 2002. Stevia: The genus Stevia. Taylor & Francis, London, UK, 2002.
Kobus-Moryson, M. & Gramza-michałowska, A., 2015. Directions on the use of stevia leaves
(Stevia rebauidana), Acta Sci. Pol. Technol. Aliment, 14(1), pp.5–13.
29
Kumari, M. & Chandra, S., 2014. Stevia rebaudiana: Beyond sweetness. Handbook of
Medicinal Plants and their Bioactive Compounds, 661(2), pp.11–26.
Lee, S.J. et al., 1979. A study on the safety of stevioside as a new sweetening source. Korean
Journal of Food Science and Technology, 11, pp.224-231.
Lemus-Mondaca, R. et al., 2012. Stevia rebaudiana Bertoni, source of a high-potency natural
sweetener: A comprehensive review on the biochemical, nutritional and functional aspects.
Food Chemistry, 132(3), pp.1121–1132.
Louis, K.S. & Siegel, A.C., 2011. Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and
Automated Methods. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 740, pp.7-12.
Mahmoud, S.S. & Croteau, R.B., 2002. Strategies for transgenic manipulation of
monoterpene biosynthesis in plants. Trends in Plant Science, 7(8), pp.366-373.
Martin, K.R. & Appel, C.L., 2010. Polyphenols as dietary supplements: A double-edged
sword. Nutrition and Dietary Supplements, 2, pp.1-12.
Megeji, N.W. et al., 2002. Introducing Stevia rebaudiana, a natural zero-calorie sweetener.
Current science, 88(5), pp.801–804.
Melis, M.S., 1995. Chronic administration of aqueous extract of Stevia rebaudiana in rats:
rennal effects. Journal of Ethnopharmacology, 47(3), pp.129-134.
Middleton, E. & Kandaswami, C., 1998. Effect of Plant Flavonoids on Immune and
Inflammatory Cell Function. Biochemical Pharmacology, 43(6), pp.1167-1169.
Nijveldt, J.R. et al., 2001. Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and
potential applications1,2,3. American Society for Clinical Nutrition,74(4), pp.418-425.
Pietta, P.G., 2000. Flavonoids as antioxidants. Journal of Natural Products, 63(7), pp.1035-
1042.
30
Raskovic, A. et al., 2004. Joint effect of commercial preparations of Stevia rebaudiana
Bertoni and sodium monoketocholate on glycemia on mice. European Journal of Drug
Metabolism and Pharmacokinetics, 29(2), pp.83-86.
Rusov Č. (1984). Osnovi hematologije životinja. Beograd: Naučna knjiga.
Sai, V. et al., 2011. Diterpene Glycosides from Stevia rebaudiana. Molecules, 16(5),
pp.3552-3562.
Sawai, S. & Saito, K., 2011. Triterpenoid biosynthesis and engineering in plants. Fronties in
Plant Science, 2(25), pp.1-8.
Segura-Campos, M. et al., 2014. Comparison of Chemical and Functional Properties of Stevia
rebaudiana (Bertoni) Varieties Cultivated in Mexican Southeast. American Journal of Plant
Sciences. 5(3), pp.286–293.
Singh, S.D. & Rao, G.P., 2005. Stevia: The herbal sugar of 21st century. Sugar Tech, 7(1),
pp.17-24.
Sokić, B.Z. et al., 2009. Inulin.potencijalni prebiotik.Med. pregl., 62(3-4), pp.153-156.
Stalikas, C.D., 2007. Extraction, separation, and detection methods for phenolic acids and
flavonoids. Journal of Separation Science. 30(18), pp.3268-3295.
Stoyanova, S. et al., 2011.The food additives inulin and stevioside counteract oxidative stress.
Internacional Journal of Food Science and Nutrition, 62(3), pp.207-214.
Tadhani, M.B. et al., 2007. In vitro antioxidant activity of Stevia rebaudiana leaves and
callus. Journal of Food Composition and Analysis. 20(3-4), pp.323–329.
Tomita, T. et al., 1997. Bactericidal activity of a fermented hot-water extract from Stevia
rebaudiana Bertoni towards enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 and other food-
borne pathogenic bacteria. Microbiology and Immunology. 41(12), pp.1005-1009.
31
Toskulkac, C. et al., 1997. Acute Toxicity of Stevioside, A Natural Sweetener, and its
Metabolite, Steviol, in Several Animal Species. Drug and Chemical Toxicology, 20(1-2),
pp.31-44.
von Schmeling, G.A. et al., 1977. Stevia rebaudiana Bertoni. Evaluation of the hypoglycemic
effect in alloxanized rabbits. Ciencia e Cultura (Sao Paolo). 29(5), 599-601.
Wasuntarawat, C. et al., 1998. Developmental Toxicity of Steviol, a Metabolite of Stevioside,
in the Hamster. Drug and Chemical Toxicology, 21(2), pp.207-222.
Yadav, A.K. et al., 2011. A review on the improvement of stevia [Stevia rebaudiana
(Bertoni)]. Canadian Journal of Plant Science. 91(1), pp.1-27.
Yamada, A. et al., 1985. Chronic toxicity study of dietary stevia extracts in F344 rats.
Journal of Food and Hygenic science of Japan. 26(2), pp.169-183.
Yasukawa, K. 2002. Inhibitory effectof stevioside on tumor promotion by 12-0-
tetradecanoilphorbol-13-acetate in two stage carcinogens in mouse skin. Biological &
Pharmaceutical Bulletin, 25(11), pp.1488-1490.
Zayova, E. et al., 2013. Antioxidant activity of in vitro propagated Stevia rebaudiana Bertoni
plants of different origins. Turkish Journal of Biology. 37(1), pp.106–113.
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO: Identification number, INO:
Document type, DT: monograph
Type of record, TR: textual / graphic
Contents code, CC: Master thesis
Author, AU: Sara Stanković
Mentor, MN: Perica Vasiljević
Title, TI: The cytotoxic effect of the Stevia sweeteners on bone marrow cells of Wistar rats
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: English
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Republic of Serbia
Publication year, PY: 2016
Publisher, PB: author’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.
Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)
6 chapters/ 31 pages/ 51 references/ 10 pictures/ 2 graphics
Scientific field, SF: Biology
Scientific discipline, SD: cell biology, cell physiology
Subject/Key words, S/KW: Stevia rebaudiana, cytotoxic activity, bone marrow cells, Trypan blue test, erythrocytes, hemolysis
UC 615.9:664.162.81]:599.323.45+616.71-018.46
Holding data, HD: library
Note, N:
Abstract, AB: Stevia rebaudiana (Bertoni) is a plant that is native to South America and belongs to the family Asteraceae. The leaves of this plant has been used for hundreds of years as a sweetener. Active substances in the leaves are steviol glycosides (mainly stevioside and rebaudioside (Reb A)), which are more than 200 times sweeter than sugar. Specified ingredients can be extracted by extraction method and used to produce a variety of sweeteners. The aim of this work was to investigate the effect of Stevia sweeteners on the viability of bone marrow cells of Wistar rats. Final concentration of the test solution of the sweetener were 25mg/ml, 50mg/ml, 75mg/ml and 100mg/ml. The impact on the viability of the cells of the bone marrow was performed up the Trypan blue test at a temperature of 37 °C. The percentage of hemolysis of red blood cells was determined by measuring absorbance on a spectrophotometer, at a wavelength of 540 nm, after incubation the solution with red blood cells at a temperature of 37 °C. The results show that the tested concentrations have significant cytotoxic potential. Maximum viability of bone marrow cells is at a minimum concentration of the test sweetener solution, while at the highest concentration cell viability is the smallest. Also, the increased concentration of the test sweetener solution greatly affects the percentage of hemolysis, so concentrations greater than 75 mg/ml caused 90 % hemolysis.
Accepted by the Scientific Board on, ASB:
Defended on, DE:
Defended Board, DB: President: prof. dr Ljubiša Đorđević
Member: prof. dr Marina Jušković
Member, Mentor: prof. dr Perica Vasiljević
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР:
Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: монографска
Тип записа, ТЗ: текстуални / графички
Врста рада, ВР: Мастер рад
Аутор, АУ: Сара Станковић
Ментор, МН: Перица Васиљевић
Наслов рада, НР: Цитотоксични ефекат заслађивача на бази стевије на
ћелије костне сржи пацова соја Wistar
Језик публикације, ЈП: српски
Језик извода, ЈИ: енглески
Земља публиковања, ЗП: Р. Србија
Уже географско подручје, УГП: Р. Србија
Година, ГО: 2016.
Издавач, ИЗ: ауторски репринт
Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.
Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)
6 поглавља/ 31 стр./ 51 citat/ 10 слика/ 2 графика
Научна област, НО: биологија
Научна дисциплина, НД: биологија ћелије, ћелијска физиологија
Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Stevia rebaudiana, цитотоксична активност, ћелије костне
сржи, Трипан плаво тест, еритроцити, хемолиза
УДК 615.9:664.162.81]:599.323.45+616.71-018.46
Чува се, ЧУ: библиотека
Важна напомена, ВН:
Извод, ИЗ: Stevia rebaudiana (Бертони) је биљка која потиче из Јужне Америке, а припада фамилији Asteraceae. Лишће
ове биљке се користи већ стотинама година као заслађивач. Активне супстанце у лишћу су стевиол-гликозиди
(најзаступјенији су стевиозид и ребаудиозид (Реб А)), које су више од 200 пута слађе од шећера. Поступком
екстракције наведени се састојци издвајају и користе за добијање различитих заслађивача. Циљ овог рада
било је испитивање утицаја различитих концентрација раствора заслађивача на бази стевије, на вијабилност
ћелија костне сржи и осмотску резистенцију еритоцита периферне крви пацова соја Њистар. Финалне
концентрације испитиваног раствора заслађивача биле су 25 мг/мл, 50 мг/мл, 75 мг/мл и 100 мг/мл. Утицај на
вијабилност ћелија костне сржи рађена је Трипан плавим тестом на температури од 37 °Ц. Проценат
хемолизе еритроцита утврђен је мерењем абсорбанце на спектрофотометру, на таласној дужини од 540 нм,
после инкубације раствора са еритроцитима на температури од 37 °Ц. Добијени резултати показују да
испитиване концентрације поседују значајни цитотоксични потенцијал. Највећа вијабилност ћелија костне
сржи је при најмањој концентрацији испитиваног раствора заслађивача, док је при највећој концентрацији
вијабилност ћелија најмања. Такође, повећана концентрација испитиваног раствора заслађивача веома утиче
на проценат хемолизе, па концентрације веће од 75 мг/мл изазивају преко 90 % хемолизе.
Датум прихватања теме, ДП:
Датум одбране, ДО:
Чланови комисије, КО: Председник: проф. др Љубиша Ђорђевић
Члан: проф. др Марина Јушковић
Члан, ментор: проф. др Перица Васиљевић