Técnicas: ELISA y Western Blot

Aspectos prácticos…

Prof. Diana OrtizCátedra Inmunología

EJMV-UCVdprincz@gmail.com

Técnica de ELISA

Fundamento:

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: Ensayo por InmunoadsorciónLigado a Enzimas.

Inmunoensayo: detección Antígeno – Anticuerpo unido a una enzima y cuantificado por espectofotometría

Ventajas:� Es una prueba de alta sensibilidad y especificidad.� Es cuantitativa.� Es relativamente económica.� Se pueden procesar hasta96 muestras por placa.� Reactivos de granestabilidad.

Limitaciones:� Positividad Vs. Infecciónactiva: depende del tipo deanticuerpo evaluado. Amenos que se evalúepresencia de antígenos en lamuestra problema.� Dificultad de detección deAcs en pacientes con algunainmunodeficiencia, en períodode ventana o infectados porcepas desconocidas.

Técnica de ELISA

Tipos de ELISA:

Técnica de ELISA

Fases:

1. Unión del antígeno o anticuerpo primario a los pocillos de la placa (soporte sólido (polímero): poliestireno, polivinilo)

2. Lavado3. Bloqueo4. Muestra (antígeno o anticuerpo)5. Lavado6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima

(sensibilidad)7. Lavado8. Sustrato de la enzima9. Cuantificación (lector de ELISA)

Técnica de ELISA

Técnica de ELISA

Aspectos a considerar:

�Adecuado uso de controles positivos y negativos (control de calidad).

�Adecuado diseño de la técnica (Ag-Ac, Enzima sustrato).

� Concentración/ dilución de antígenos y anticuerpos.

�Reactivos en buen estado.

�Cuidado de la cadena de frío.

Sensibilidad: Capacidad que tiene la prueba de detectar como positivos loscasos de pacientes enfermos (verdaderos positivos).Especificidad: Capacidad que tiene la prueba de reportar como negativoslos casos sanos (verdaderos negativos).

Técnica de ELISA

Evaluación de anticuerpos ELISA

Estuches comerciales:

Detección de anticuerpos IgM, IgG, IgE, IgA.

Kit Pyloriset EIA-G (Orion Diagnostic): Títulos ≥ 20 positivos

1.- IgA secretora anti H. pylori en saliva: (ELISA)

Sensibilización: 2,5µg/pozo Ag Hp toda la noche a 4°C o 2h a 37°C

Lavado: 3 veces con 200 µl de PBS-Tween

Bloqueo: PBS-BSA 1% x 2h a 37°C

Muestras de saliva 1/10 x 1h a 37°C

Lavado: 3 veces con 200 µl de PBS-Tween

Anticuerpo secundario conjugado: con peroxidasa 1/1000 x 1h a 37°C

Revelado: OPD (o-phenylenediamine) + Peróxido de hidrógeno

Se detiene la reacción con H2SO4

Valores: UDO > 0,300 positivos

(Ortiz y col., 2000)

2.- IgA secretora total en saliva: (ELISA)

Monoclonal IgA (Sigma) (Ortiz y col., 2000)

Técnica de ELISA

Elisa estandarizada en laboratorio

Técnica de ELISA

Enzimas más utilizadas:� Peroxidasa�Fosfatasa alcalina�β-galactosidasa� Tetra-metil-benzidina

Interpretación de resultados:

Técnica de ELISA

¿Qué es un valor cut off?

Títulos de anticuerpos

Valores reportados en unidades de Densidad óptica

Algunas Aplicaciones de la ELISA

Determinación de hormonas: progesterona, estrógenos, cortisol, insulina, HGC, etc.

Proteínas

Agentes infecciosos (virales, bacterianos, parásitos, hongos)

Marcadores de drogas

Control de calidad de vacunas

Screening de recién nacido

Investigación clínica

Anticuerpos: Acs antinuclearesAntígenos tumorales: alfa-feto-proteína, Ag postático, carcinoembrionario, etc.Autoanticuerpos

Técnica de ELISA

Elispot

Mide el número de células productoras de anticuerpos. Elantígeno se une al fondo de un pocillo, se añaden las célulasproductoras de anticuerpos en un medio semisólido y losanticuerpos que se han secretado y unido se detectanmediante un anticuerpo anti-Ig ligado a una enzima como enun ELISA.

Una variante de la ELISA

Inmunohistoquímica

Western Blot

Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, técnica analíticaaltamente específica utilizada para identificar proteínas específicasen una mezcla compleja de proteínas, presente en extractoscelulares o de tejidos.

Etapas:1. Preparación de la muestra

2. Separación de la muestra por tamaño (Electroforesis en gel depoliacrilamida)

3. Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa )

4. Visualización mediante marcaje de proteínas con el uso deanticuerpos primarios o secundarios apropiados.

Western Blot

Preparación del gel de poliacrilamida SDS-PAGEy corrida electroforética.

Western Blot

Tinción del gel con azul de Coomassie

Western Blot

TransferenciaSe transfieren las bandas deproteínas o desde el gel haciauna membrana denitrocelulosa (flechas azules).

Western Blot

Western Blot

Western Blot

Revelado

Western Blot

Western Blot

Wang, Mol Vis 2012; 18:1115-1122. http://www.molvis.org/molvis/v18/a118

CORTES X, GARCIA Z, TORRES L, TAYLOR L. Patrones Indeterminados de Western Blot en sueros reactivos por anticuerpos contra los virus linfotrópicos de células T tipo I/II (HTLV I/II) en donantes de sangre en Costa Rica. Rev. costarric. cienc. méd [online]. 2007, vol.28, n.1-2 [cited 2017-02-15], pp. 11-20 .

Western Blot

Western blot

Western blot

Aplicaciones:

� Investigación: Es una de las técnicas más usadas en el estudio de la biología molecular Permite identificar antígenos inmuno-dominates para vacunas.Estudiar perfil de citocinas.Presencia o ausencia de una proteína y sus niveles en una muestra.Factores de crecimientoNiveles de fosforilación, modificaciones post traduccionales, etc

�Diagnóstico:Prueba confirmatoria de VIH

Prueba de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmente llamada“enfermedaddelasvacaslocas”

Enfermedad de Lyme.

Western Blot

ELISA Vs. Western Blot…

Ensayo de unión a múltiples antígenos: MABA

� Péptidos 20µµµµg/ml diluidos en buffer carbonato pH 9.6 (1 h)

� Bloqueo: leche descremada al 5% en PBST pH 7.2 (2 h)

� Muestras: Suero 1/100 en PBST (1 ½ h) Saliva 1/10

� Anti IgG o IgA peroxidasa 1/30.000 , 1/6000 (1 ½ h)

� Revelado quimioluminescente

� Identificación de reconocimiento a epitopes sintéticos

Muestras: Sueros y salivas

MABA

(Noya o y col, 1998)

Fig. 24: Reactividad de sueros (IgG) frente a péptidos sintéticos de H. pylori utilizando MABA.En vertical se muestran las tiras correspondientes a cada paciente: tira 1: conjugado, tiras 2-28 sueros de pacientes. Enhorizontal están los péptidos sintéticos que fueron sensiblizados en el papel de nitrocelulosa, del 2- 4: péptidos de UreB, 5: poolde Ure, 6: pool de flagelina, 7-14: péptidos de VacA, 15: pool de VacA, 16-26: péptidos de Cag, 27: pool de Cag, 1 y 28:Antígeno de H. pylori.

MABA

(Ortiz-Princz D, 2015)

https://www.youtube.com/watch?v=GE8JlP0PBEM

https://www.youtube.com/watch?v=_8r5XVmKfOc

Videos Western blot:

https://www.youtube.com/watch?v=VgAuZ6dBOfshttps://www.youtube.com/watch?v=RWQWy0HODJchttps://www.youtube.com/watch?v=iKV6l0B9Ak0https://www.youtube.com/watch?v=_8xftsCIwYo

Videos ELISA: