Cloning, Identification and Isolation a Glucose Oxidase Gene … · 2015. 6. 28. · Glucose oxidase (β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase) catalyzes the oxidation of β-D-glucose

1393، 4، شماره 27جلد ) مجله زيست شناسي ايران(مجله پژوهشهاي سلولي و مولكولي

484

oxidase gene from Talaromyces flavus and characterisation of its role in the biocontrol of Verticillium dahliae. Curr. Genet. 32:367–375.

24. Petruccioli, M., Piccioni, P. and Federici, F. 1997. Glucose oxidase overproduction by the mutant strain M-80.10 of Penicillium variabile in a benchtop fermenter. Enz. Microb. Technol. 21:458– 462.

25. Pulci, V., D' ovidio, R., Petruccioli, M. and Federici, F. 2004. The glucose oxidase of Penicillium variable P16: gene cloning, sequencing and expression. Appl. Microbiol. 38:233–238.

26. Rychlik, W. 2007. OLIGO 7 primer analysis software. Meth. Mol. Biol. 402:35-59.

27. Sambrook, J. and Russell, D. W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual (3nd ed. Vol:1-3.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA.

28. Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. and Kumar, S. 2007. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol. 24:1596–1599.

29. Wholfahrt, G., Witt, S., Handle, J., Schomburg, D., Kalisz, H.M. and Hecht, H.J. 1999. 1.8 and 1.9 a resulation structures of the Penicillium amagasakiense and Aspergillus niger glucose oxidase as a basis for modelling substrate complexes. Acta Crystal. Sect. Dep. 55:969–977.

30. Witt, S., Wohlfahrt, G., Schomburg, D., Hecht, H. and Kalisz, H. 2000. Conserved arginine-516 of Penicillium amagasakiense glucose oxidase is essential for the efficient binding of β-D-glucose. J. Biochem. 347:553–9.

31. Wong, C.M., Wong, K.H. and Chen, X.D. 2008. Glucose oxidase: natural occurrence, function, properties and industrial applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:927–938.

32. Wu, G., Shortt, B.J., Lawrence, E.B., Levine, E.B., Fitzsimmons, K.C. and Shah, D.M. 1995. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H2O2-generating glucose oxidase in transgenic potato plants. Plant Cell. 7:1357–1368.

33. Zhang, Y. 2008. I-TASSER server for protein 3D structure prediction. BMC Bioinformatics. 9:40–26.

Cloning, Identification and Isolation a Glucose Oxidase Gene from Penicillium funiculosum

Esmaeilpour Z., Garoosi Gh.A., Haddad R. and Heidari Japelaghi R.

Agricultural Biotechnology Dept., Imam Khomeini International University, Qazvin, I.R. of Iran

Abstract

Glucose oxidase (β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase) catalyzes the oxidation of β-D-glucose to gluconic acid, by utilizing molecular oxygen as an electron acceptor with simultaneous production of hydrogen peroxide. Glucose oxidase has been purified from a range of different fungal sources, mainly from the genus Aspergillus and Penicillium and has wide applications in chemical, pharmaceutical, food, biotechnology and other industries. In this study, a glucose oxidase (GOX)-encoding gene was isolated from Penicillium funiculosum by polymerase chain reaction (PCR) technique and then was cloned into a pUC19 plasmid. Then, molecular structur, biochemical and phylogenetic characteristics were analyzed. Nucleotide sequence of the gene, called PfGOX, revealed a 1818 bp long, encoding a protein of 605 amino acid residues. The calculated molecular mass and the predicted isoelectric point of the deduced polypeptide were 65.79 kDa and 4.50, respectively. Analysis of secondary and three dimensional structures of the deduced polypeptide sequence for PfGOX was shown that PfGOX is similar to those of previously reported glucose oxidase proteins from other fungi. The deduced protein sequence was indicated a high similarity to glucose oxidases isolated from fungi such as Penicillium amagasakiense, Talaromyces flavus, Talaromyces stipitatus, and Talaromyces variabilis. Phylogenetic study was also demonstrated that PfGOX gene belongs to the subgroup IA of fungous glucose oxidases.

Key words: Cloning, Glucose oxidase, Fungus, Penicillium funiculosum, Three dimensional structure


483

منابعطراحي و ساخت . 1390. ر.و زماني، م. ، مطلبي، م.اصفهاني، ك .1

bgn13.1و chit42هاي هاي بياني گياهي جهت انتقال ژنسازهمجله زيست شناسي . و توامقارچ تريكودرما به صورت منفرد

.894-880: 24. ايران

انتقال ژن بتا گلوكاناز . 1392. و مطلبي، م. ر.، زماني، م.روحي، ل .2)bgnI ( ازTrichoderma virens به گياه كلزا جهت ايجاد

مجله زيست . Sclerotinia sclerotiorumمقاومت عليه قارچ .40-28: 26. شناسي ايران

3. Baker, C.J. and Orlandi, E.W. 1995. Active oxygen in plant pathogenesis. Annu. Rev. Phytopathol. 33:299–321.

4. Bankar, S.B., Bule, M.V., Singhal, R.S. and Ananthanarayan, L. 2009. Glucose oxidase, an overview. Biotechnol. Adv. 27:489–501

5. Briesemeister, S., Rahnenführer, J. and Kohlbacher, O. 2010. Going from where to why. interpretable prediction of protein subcellular localization. Bioinformatics 26:1232–8.

6. Bero, O.F., Crespo, A., Fatehi, J. and Bridge, P.D. 1999. DNA extraction and PCR amplification method suitable for fresh, herbarium-stored, lichenized and other fungi. Pl. Syst. Evol. 216:243–249.

7. Eryomin, A.N., Droshdenyuk, A.P., Zhavnerko, G.K., Semashko, T.V. and Mikhailova, R.V. 2004. Quartz sand as an adsorbent for purification of extracellular glucose oxidase from Penicillium funiculosum 46.1. Appl. Biochem. Microbiol. 40:178–185.

8. Felsenstein, J. 1985. Confidence limit on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evol. 39:783–91.

9. Fravel, D.R. and Roberts, D.P. 1991. In situ evidence for the role of glucose oxidase in the biocontrol of Verticillium wilt by Talaromyces flavus. Biocontrol Sci. Technol. 1:91–99.

10. Frederick, K.R., Tung, J., Emerick, R.S., Masiarz, F.R., Chamberlain, S.H., Vasavada, A. and Rosenberg, S. 1990. Glucose oxidize from Aspergillus niger, cloning, gene sequence, secretion from Saccharomyces cerevisiae and kinetic analysis of a yeast–derived enzyme. J. Biol. Chem. 265: 3793–3802.

11. Gasteiger, E., Hoogland, C., Gattiker, A., Duvaud, S., Wilkins, M. R., Appel, R. D. and Bairoch, A. 2005. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server. In: J. M. Walker (Ed), The proteomics protocols handbook. (pp. 571-607.) Humana Press.

12. Hatzinikolaou, D.G., Hansen, O.C., Macris, B.J., Tingey, A., Kekos, D., Goodenough, P. and et al. 1996. A new glucose oxidase from Aspergillus niger characterization and regulation studies of enzyme and gene. Appl. Microbiol. Biotechnol. 46:371–81.

13. Hecht, H.J., Kalisz, H.M., Hendle, J., Schmid, R.D. and Schomburg, D. 1993. Crystal structure of glucose oxidase from Aspergillus niger refined at 2.3 Å resolution. J. Mol. Biol. 229:153–72.

14. Kalisz, H.M., Hecht, H.J., Schomburg, D. and Schmid, R.D. 1991. Effects of carbohydrate depletion on the structure, stability and activity of glucose oxidase from Aspergillus niger. Biochim. Biophys. Acta. 1080:138–142.

15. Kazan,, K., Murray F.R., Goulter, K.C., Llewellyn, D.J. and Manners, J.M. 1998. Induction of cell death in transgenic plants expressing a fungal glucose oxidase. Phytopathol. Society. 6:555–562.

16. Kiess, M., Hecht, H.J. and Kalisz, H.M. 1998. Glucose oxidase from Penicillium amagasakiense. Primary structure and comparison with other glucose-methanol-choline (GMC) oxidoreductase. Europ. J. Biochem. 252:90–99.

17. Kriechbaum, M., Heilman, H.J., Wientjes, F.J., Hahn, M., Jany, K.D., Gassen, H.G., Sharif, F. and Alaedinoglu, G. 1989. Cloning and DNA sequence analysis of the glucose oxidase gene from Aspergillus niger NRRL-3. Dep. Biological Sci. 1:63–66.

18. Kusai, K., Sekuzu, I., Hagihara, B., Okunuki, K., Yamauchi, S. and Nakai, M. 1960. Crystallization of glucose oxidase from Penicillium amagasakiense. Biochim. Biophys. Acta. 40:555–557.

19. Kyte, J. and Doolittle, R.F. 1982. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157:105–32.

20. Lee, Y.H., Yoon, I.S., Suh, S.C. and Kim, H.I. 2002. Enhanced disease resistance in transgenic cabbage and tobacco expressing a glucose oxidase gene from Aspergillus niger. Plant Cell Rep. 20:857–863.

21. Levine, A., Tenhaken, R., Dixon, R. and Lamb, C. 1994. H2O2 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response. Cell. 79:583–593.

22. Muller, D. 1928. Oxidation von glukose mit extrakten aus Aspegillus niger. Biochem. Z. 199:136–170.

23. Murray, F.R., Llewellyn, D.J., Peacock, W.J. and Dennis, E.S. 1997. Isolation of the glucose


473

از قارچ ) GOX(همسانه سازي، شناسايي و جداسازي يك ژن گلوكز اكسيداز Penicillium funiculosum

جاپلقي حيدري رضا و ، رحيم حداد*زهرا اسماعيل پور، قاسمعلي گروسي بيوتكنولوژي كشاورزي مهندسي، گروه –، دانشكده فني )ره(قزوين، دانشگاه بين المللي امام خميني

23/1/93 :تاريخ پذيرش 9/6/91 :تاريخ دريافت

چكيده

با استفاده از اكسيژن مولكولي به عنوان پذيرنده الكترون، اكسيداسيون ) اكسيدوردوكتاز-1اكسيژن :گلوكز-β-D( گلوكز اكسيدازβ-D-آنزيم در دامنه وسيعي از اين .شودهيدروژن مي گلوكز را به گلوكونيك اسيد كاتاليز نموده و منجر به توليد پراكسيد

در صنايع مختلف از قبيل يكاربردهاي وسيع توليد شده و Penicilliumو Aspergillusختلف، عمدتاً جنسهاي قارچهاي م Penicilliumژن كدكننده گلوكز اكسيداز از قارچ در اين مطالعه، .دارد صنايع غذايي، بيوتكنولوژي و غيرهشيمي، داروسازي،

funiculosum مراز اي پليبا استفاده از تكنيك واكنش زنجيره)PCR ( جداسازي و در ناقلpUC19 و شده سازيهمسانه توالي نوكلئوتيدي اين ژن، تحت عنوان. ويژگيهاي بيوشيميايي و فيلوژنتيكي آن مورد بررسي قرار گرفت ساختار مولكولي،

PfGOX به طول ، bp1818 سبه شده و نقطه وزن مولكولي محا. را رمز مي كند آمينواسيد 605بوده و يك پروتئين بابررسي ساختارهاي دوم و سوم توالي . باشدمي 05/5كيلو دالتون و 78/65بيني شده اين پروتئين به ترتيب برابر ايزوالكتريك پيش

ديگر قارچهايگزارش شده از گلوكز اكسيداز نشان داد كه اين پروتئين از نظر ساختاري مشابه با تواليهاي PfGOXپروتئيني Penicilliumاز قبيل قارچهاساير گلوكز اكسيداز دست آمده شباهت زيادي را با تواليهاي ه الي پروتئيني بتو. باشدمي

amagasakiense ،Talaromyces flavus ،Talaromyces stipitatus وTalaromyces variabilis بررسي . نشان داد .تعلق داردازهاي قارچي گلوكز اكسيد IAفيلوژنتيكي نيز مشخص كرد كه اين ژن به زيرگروه

.بعديساختار سه، Penicillium funiculosumسازي، گلوكز اكسيداز، قارچ، همسانه :كليدي واژه هاي

[email protected] :، پست الكترونيكي0281-8371159: :نويسنده مسئول، تلفن*

مقدمه، اكسيدوردوكتاز-1اكسيژن :گلوكز-β-D(گلوكز اكسيداز

EC 1.1.2.3.4 ( 130- 175فلاووپروتئيني با وزن مولكولي با استفاده از اكسيژن مولكولي به عنوان كيلودالتون است كه

گلوكز را به -β-Dپذيرنده الكترون، اكسيداسيون گلوكونيك اسيد كاتاليز نموده و منجر به توليد پراكسيد

اين آنزيم در دامنه وسيعي . )4( شودمي )H2O2( هيدروژنو Aspergillusمختلف، عمدتاً جنسهاي ي قارچهااز

Penicillium كاربردهاي به دليل و )12و 7( توليد شدهوسيع در صنايع مختلف از قبيل شيمي، داروسازي، صنايع

به تازگي توجه زيادي را به ،غذايي، بيوتكنولوژي و غيره

يكي از كاربردهاي مهم ). 31و 4(خود جلب نموده است ، ز در بخش بيوتكنولوژي كشاورزيگلوكز اكسيداآنزيم عوامل بيماريزاي قارچي و در برابر مقاوم گياهان توليد

عوامل گياهان در برابر حمله . )32و 20، 9( است باكترياييقبيل سازي تعدادي از پاسخهاي دفاعي از فعال اببيماريزا،

(Phytoalexin) هاتقويت ديواره سلولي، سنتز فيتوالكسينآنزيمهاي هيدروليتيك مانند كيتيناز و برخي سازيو فعالبا اين ). 21 و 3 ،1،2(كنند مي محافظت خوداز ،گلوكاناز Reactive Oxygen( هاي اكسيژن فعالگونه توليد وجود،

Species, ROS( جزء اولين ،ويژه پراكسيد هيدروژنه ب


474

عوامل حمله در برابر سلولهاي گياهي دفاعيپاسخهاي به آنها طوري كه ه ب ،است چي و باكترياييبيماريزاي قار

كرده وثانويه عمل هشدار دهندهعنوان يك مولكول ساختآنزيمهاي درگير در استحكام ديواره سلولي و

توليدبنابراين .)32(د نسازها را فعال ميفيتوالكسيني شده با استفاده از يك ژن ورزدست پراكسيد هيدروژن

افزايشروش مفيدي در جهت تواند در گياهان مي قارچيعوامل بيماريزاي قارچي و در برابر ومت گياهان مقا

.)15( باكتريايي باشد

قارچاز )Muler )1928ابتدا توسط گلوكز اكسيداز آنزيم niger Aspergillus اندك زماني پس از و )22( جداسازي

كه توسط باكتريها و قارچهاي متعددي شدمشخص آنژن DNAسازي و تعيين توالي سانههم .شودتوليد مي

اولين بار توسط ،A. niger NRRL-3گلوكز اكسيداز قارچ Kriechbaum و ) 17(شده انجام )1989( و همكاران

تعيين) 1999(و همكاران Wholfahrtساختار آن توسط گلوكز اكسيداز ژن DNAو mRNAمقايسه ). 29(گرديد

نوكلئوتيدي ژن نشان داد كه هيچ اينتروني در توالي ). 17(وجود ندارد A. nigerكدكننده گلوكز اكسيداز قارچ

گلوكز اكسيداز اين موضوع در مورد توالي نوكلئوتيدي ژن Penicillium variable )25( ،Talaromyces flavusقارچ

اولين بار . نيز ثابت شد) 18( P. amagasakiense و )23(Fravel و سپس ) 1991(و همكارانWu همكاران و

اظهار داشتند كه بيان ژن گلوكز اكسيداز در گياهان ) 1995(تواند مقاومت به آلودگي باكتريايي را فراهم كرده و در مي

ه ب ،)32و 9( كاربرد داشته باشد گياهي مهندسي ژنتيكتحت يك پروموتور H2O2افزايش ناگهاني با طوري كه

يجاد نموده را ا واكنش فوق حساسيت مرگ سلول و ،القاييبيماري بادزدگي سيب زميني در برابرگياه و در نتيجه

).20(گردد مي مقاوم

عوامل با توجه به نقش اين آنزيم در ايجاد مقاومت به جداسازي و در گياهان، بيماريزاي قارچي و باكتريايي

براي (GOX)ژن عامل آنزيم گلوكز اكسيداز سازي همسانه Penicillium(ليوم بومي ايران از قارچ پني سي اولين بار

funiculosum PTCC 5301 ( تا زمينه و انجام گرديدمقدمات لازم براي توليد گياهان تراريخت متحمل فراهم

تارهاي خصوصيات بيوشيميايي و ساخ ،همچنين. گرددبا استفاده دست آمدهه بعدي توالي پروتئيني ببعدي و سهدو

بيني شده و با استفاده پيش افزارهاي بيوانفورماتيكياز نرمژنهاي گلوكز از بررسيهاي همولوژي و فيلوژنتيكي با

نشان داده كه ژن همسانه شده به قارچهاساير اكسيداز .تعلق دارد IAزيرگروه

مواد و روشها قارچ: ژنومي DNAكشت قارچ و استخراج

P. funiculosum شماره دسترسي باPTCC 5301 ازمي و صنعتي ايران خريداري و روي سازمان پژوهشهاي عل

كشت داده ) PDA )Potato Dextrose Agarمحيط كشت به صورت آماده از شركت پروتون PDAمحيط كشت .شد

روز در 7هاي قارچي به مدت شيمي، ايران تهيه و نمونهكشت داده شدند و هر ماه گراد درجه سانتي 22دماي

استفاده از ژنومي قارچ با DNA سپس. واكشت گرديدند .)6( استخراج گرديد) 1999(و همكاران Cuberoروش

: )PCR(اي پليمراز طراحي آغازگرها و واكنش زنجيرهو ) Pfu )Fermentasبا استفاده از آنزيم PfGOXتكثير ژن

آغازگرهاي اوليگونوكلئوتيدي طراحي شده بر اساس توالي P. adametziiاز قارچهاي ژن گلوكز اكسيدازنوكلئوتيدي

NCBIموجود در پايگاه ( P. amagasakiense و

GenBank دستيابي هايبا شماره EF137913 و AF012277( افزار با استفاده از نرمOligo انجام 7نسخه

شامل سه نوكلئوتيد آغازگرهاي اختصاصي ). 26( شد 5′در انتهاي SacIاضافي و جايگاه شناسايي آنزيم برشي

. آلمان سنتز شدند Metabion بودند كه توسط شركت) pH 8.8(حاوي µl 50مخلوط واكنش در حجم نهايي

mM Tris-HCl 20 ،mM (NH4)2SO4 10 ،mM KCl 10 ،


475

mM MgSO4 2، Triton X-100 0.1% ،mg/ml BSA 0.1 ،µM 500 از هرdNTP ،pM 50 رفت و (از هر آغازگر

Pfuواحد از آنزيم 1.25الگو و ng 100 DNA، )برگشت

DNA polymerase واكنش . مورد استفاده قرار گرفتPCR دستگاه ترموسايكلر يك با استفاده از)Techne-

TC512چرخه دمايي 35ريزي در قابل برنامه) ، انگلستان: انجام شد كه شرايط دمايي و زماني هر چرخه شامل

گراد به مدت درجه سانتي 94مرحله واسرشتگي در دماي گراد به درجه سانتي 50صال در دماي ثانيه، مرحله ات 30

درجه 72مدت يك دقيقه و مرحله تكثير در دماي همچنين مرحله . دقيقه بود دوسانتيگراد به مدت

5گراد به مدت درجه سانتي 94واسرشتگي اوليه در دماي گراد درجه سانتي 72دقيقه و مرحله تكثير نهايي در دماي

زگرهاي اختصاصي آغا. دقيقه انجام گرفت 10به مدت -'5آغازگر رفت با توالي مورد استفاده شامل

ATAGAGCTCATGGTGTCTGTATTTCTC-3' و-'5آغازگر برگشت با توالي

ATAGAGCTCCTAGGCACTTTTGGCATAG-3' .بود

پس : PfGOXژنومي DNAيابي همسانه سازي و تواليبا اندازه مورد نظر از روي PCRسازي محصول خالص از

GF-1 PCR(اده از كيت استخراج اسيد نوكلئيك ژل با استف

Clean Up Kit-Vivantis( ، ژن مورد نظر و ناقل پلاسميديpUC19 )Fermentas ( توسط آنزيم برشيSacI

)Fermentas (سازي شدندخالص مجدداً و هتيمار گرديد . T4ليگاز DNAسپس واكنش اتصال با استفاده از آنزيم

)Fermentas ( و محلول اتصال به روش شوك انجام گرفته Escherichia(حرارتي به سلولهاي مستعد اشريشياكلي

coli ( سويهDH5αانتقال داده شد ، )انجام آزمون با. )27آبي، تعدادي كلوني به عنوان كلونيهاي نوتركيب - سفيد

روش تحليلبا هاي نوتركيبپلاسميدانتخاب شده و ستفاده از دو تكنيك استخراج گرديده و با ا SDSقليايي با

PCR تر قرار گرفتند و برش آنزيمي مورد بررسي دقيق

پلاسميد نوتركيب با استفاده از DNAيابي توالي ).27(در دو جهت رفت و T7انداز باكتريوفاژ آغازگرهاي راه

.آلمان، انجام شد Seqlabتوسط شركت برگشت

بيني ساختارهاي دوم و سوم پيش بررسي توالي وتوالي نوكلئوتيدي : PfGOXدست آمده از ه ئين بپروت

Translateيابي با استفاده از برنامه توالي حاصل از(http://www.expasy.ch/tools/dna.html) مورد ترجمه

ه ي بآمينواسيدقرار گرفته و خصوصيات بيوشيميايي توالي گريزي و آليفاتيك، آب هايشاخص ، شاملدست آمده، )ProtParam )11هاي اده از برنامهبا استفناپايداري ProtScale

)http://arbl.cvmbs.colostate.edu/molkit/hydropathy/in

dex.html ( وTMHMM )http://www.cbs.dtu.dk

/services/( بيني همچنين پيش .مورد بررسي قرار گرفت YLOCبا استفاده از برنامه PfGOXموقعيت زيرسلولي ژن

با PfGOXاختار دوم توالي پروتئيني س. انجام گرفت) 5() /SOPMA )http://npsa-pbil.ibcp.fr استفاده از برنامه

I-TASSERتعيين گرديده و ساختار سوم توسط برنامه . بيني قرار گرفتمورد پيش) 33(

ي به دست آمده به آمينواسيدتوالي : بررسي فيلوژنتيكيلاعاتي با منظور يافتن پروتئينهاي مشابه در بانكهاي اط

در مركز ملي اطلاعات BLASTpاستفاده از الگوريتم مورد جستجو قرار گرفته و تعدادي )NCBI( بيوتكنولوژي

توالي پروتئيني از منابع مختلف كه بيشترين شباهت را با سازي همرديف. توالي مورد نظر داشتند، انتخاب شدند

مده دست آه تواليهاي بو PfGOXچندگانه توالي پروتئيني به منظور شناسايي نواحي حفظ شده در طي تكامل با

يك درخت . انجام شد ClustalXافزار استفاده از نرمو با استفاده از Neighbor Joiningفيلوژنتيكي به روش

ساخته شده و بررسي ) MEGA4.1 Beta 2 )28افزار نرمBootstrap تكرار به منظور بدست آمدن حدود 1000باشماره دستيابي ). 8( ها نيز انجام گرديدي شاخهاطمينان برا


476

NCBIاطلاعات توالي موجود در پايگاه تواليهاي پروتئينيسازي چندگانه و مورد استفاده جهت بررسيهاي همرديف

.آمده است 1روابط فيلوژنتيكي، در جدول

گانه و ترسيم درخت فيلوژنتيكي به همراه شماره دستيابي موجود سازي چندتواليهاي پروتئيني مورد استفاده براي تهيه همرديفمشخصات - 1جدول ).NCBI GenBank )www.ncbi.nlm.nih.gov در پايگاه اطلاعات توالي

رديف جنس نام علمي نام ژن شماره دستيابيXP_002375824 GAA89731 ACR56326 XP_001727544 XP_001217613

AfGOX AkGOX AnGOX AoGOX AtGOX

Aspergillus flavus Aspergillus kawachii Aspergillus niger Aspergillus oryzae Aspergillus terreus

Aspergillus 1

EJD48758 AdGOX Auricularia delicata Auricularia 2

CAD88590 BfGOX Botryotinia fuckeliana Botryotinia 3

CCF42512 ChGOX Colletotrichum higginsianum Colletotrichum 4

AER13599 GcGOX Glomerella cingulata Glomerella 5

EFZ02033 MaGOX Metarhizium anisopliae Metarhizium 6

AAD01493

XP_002563451

ABN79922

AJ583233

PaGOX

PcGOX

PeGOX

PvGOX

Penicillium amagasakiense

Penicillium chrysogenum

Penicillium expansum

Penicillium variabile

Penicillium 7

CCA75795 PiGOX Piriformospora indica Piriformospora 8

AAB09442

XP_002482295

CAE47418

TfGOX

TsGOX

TvGOX

Talaromyces flavus

Talaromyces stipitatus

Talaromyces variabilis

Talaromyces 9

EIW65340 TveGOX Trametes versicolor Trametes 10

)الف

)ب

PfGOXحاوي ژن pUC19-PfGOXاختار ناقل نوتركيب س) الف. pUC19-PfGOXساختار و الكتروفورز نتيجه برش آنزيمي ناقل نوتركيب -1شكل ومت به و مقا lacZ، ژنهاي )pMB1(برداري ناقل نوتركيب توالي مسئول رونوشت). MCS(سازي در جهت معمولي روي جايگاه چندگانه براي همسانه

و الكتروفورز ژل SacIبا آنزيم برشي pUC19-PfGOXبرش آنزيمي ناقل نوتركيب )ب. اندنشان داده شده ناقل نوتركيبروي ) AmpR(سيلين آمپيو PfGOXفاقد ژن pUC19پلاسميد ) 2و هضم نشده، PfGOXفاقد ژن pUC19پلاسميد حلقوي ) Kb1 ،1نشانگر وزن مولكولي ) M. درصد 1آگاروز

هضم شده با آنزيم برشي pUC19-PfGOXپلاسميد نوتركيب ) 4هضم نشده، pUC19-PfGOXپلاسميد نوتركيب ) SacI ،3هضم شده با آنزيم برشي SacI.


477

نتايج و بحث

و PfGOXژن سازي و بررسي توالي نوكلئوتيديهمسانه ژن: ه دست آمدهبخصوصيات بيوشيميايي پروتئين

قارچ پني از PCRفاده از تكنيك با است PfGOX كدكننده ، جداسازي و در ) P. funiculosum(سيليوم بومي ايران

-سازي شده و نتايج تواليهمسانه pUC19ناقل پلاسميدي

نشان داد كه قطعه همسانه BLASTيابي و بررسي با برنامه گلوكز اكسيدازسازي شده در جهت معمولي، يك ژن

ثبت ، PfGOX وميژن DNA توالي. )1شكل ( باشد ميبا GenBank NCBIپايگاه توالي نوكلئوتيدي شده در

بوده كه با bp 1818به طول ،HQ529689شماره دستيابي خاتمه يافته و يك TAGآغاز شده و با كدون ATGكدون

بررسي ). 2شكل (نمايد را كد مي آمينواسيد 605پروتئين با ا استفاده از دست آمده به خصوصيات بيوشيميايي پروتئين ب

نشان داد كه وزن مولكولي محاسبه شده ProtParamبرنامه

بيني شده توالي پروتئيني ژن و نقطه آيزوالكتريك پيشPfGOX با فرمول مولكولي C2942H4556N782O893S19 به ،

همچنين. باشدمي 05/5كيلودالتون و 78/65ترتيب برابر پروتئين يكآليفاتشاخص كه نشان داد ProtParamبرنامه

PfGOX به عنوان يك عامل مهم به منظور برآورد مقاومت ،كه نشان دهنده بوده 28/86پروتئينها در برابر حرارت،

در برابر حرارت مقاوم بودن پروتئينهاي گلوكز اكسيدازبيان گر ميزان پروتئينهاشاخص ناپايداري . )31( باشدمي

يي با پروتئينهاپايداري آنها در لوله آزمايش مي باشد، و ي پايدار تقسيم بندي پروتئينهاجزء 40شاخص كمتر از

شاخص ناپايداري پروتئين مورد نظر در حدود . مي شوندشاخص ناپايداري آن در علاوهه ب محاسبه گرديد 38/26

در رسته لذا بوده و 38/26لوله آزمايش در حدود ). 4(شود بندي ميپروتئينهاي پايدار تقسيم

درگير در فرآيند Asn آمينواسيدهايو Cysآمينواسيدهاي صورت زيرخط، ه توالي پپتيد راهنما ب .PfGOXتوالي نوكلئوتيدي و پروتئيني ژن -2شكل N-هاي ين شمارههمچن. اندگليكوزيلاسيون به ترتيب با علامت مربع و دايره و آمينواسيدهاي موجود در جايگاه فعال به صورت ضخيم نشان داده شده

.بازها و آمينواسيدها به ترتيب در سمت چپ و راست آورده شده است


478

با استفاده محاسبه شده) Hydropathy(گريزي شاخص آب )Kyte & Doolittle )1982به روش ProtScaleاز برنامه

به ميزان زيادي PfGOX توالي پروتئيني ژننشان داد كه 59ل آمينواسيدها، و از مجموع ك) 19(آب گريز بوده

داشته، در حالي كه ) Asp+Glu(آمينواسيد با بار منفي برابر ) Arg+Lys(تعداد كل آمينواسيدهاي با بار مثبت آن

.باشد مي 44

توالي ي و موتيفهاي ساختاري آمينواسيدبررسي توالي نشان داد آمينواسيديبررسي توالي : PfGOX پروتئيني ژن

طول، يك پروتئين اوليه با bp 1818با PfGOX ژن كهكه مانند آنزيمهاي كيتيناز و كندرا كد مي آمينواسيد 605

تواند در جهت توليد گياهان مقاوم در برابر مي ،گلوكانازمورد استفاده قرار عوامل بيماريزاي قارچي و باكتريايي

همانند ساير ژنهاي گلوكز PfGOX ژن. )3و 2 ،1(بگيرد و) A. niger )10( ،P. amagasakiense )16اكسيداز از

P. variabile )25 ( داراي يك توالي پپتيد راهنما به طول MVSVFLSTLLLSAATVQAبا ترادف آمينواسيد 18

باشد كه پس از جداسازي، يك در انتهاي آميني خود ميرا توليد آمينواسيد 587پروتئين بالغ و فعال به طول

با داشتن يك A. nigerتوالي گلوكز اكسيداز از . كند ميآمينواسيد، داراي يك آمينواسيد 22پپتيد راهنما به طول

باشد كه موجب برش پيوند مي - 1در موقعيت ) Arg(بازي جداسازي و نهايتاً Serو Argپپتيدي بين آمينواسيدهاي

در حالي كه آمينواسيد ). 17(شود توالي پپتيد راهنما مييك آمينواسيد PfGOX در توالي پپتيدي ژن - 1موقعيت

بوده و نشان دهنده سازوكار متفاوت در ) Ala(گريز آب .باشد جداسازي توالي پپتيد راهنما مي

گلوكز ژنهاي توالي پروتئيني مشابه با PfGOXپروتئين بالغ و) A. niger )10( ،P. amagasakiense )16اكسيداز از

P. variabile )25 ( داراي سه آمينواسيدCys وقعيتهاي در مو يك جايگاه فعال Cys525و Cys168 ،Cys210 حفظ شده

، Tyr73 ،Phe418 ،Trp430 ،Arg516 ،Asn518اسيد آمينو 7با

His520 وHis563 باشدمي. Arg516 اسيد ترين آمينومهمگلوكز -β-Dثر آنزيم گلوكز اكسيداز به ؤجهت اتصال م

اين به ميزان كمتري در Asn518باشد، در حالي كه مياسيدهاي آروماتيك آمينو). 30(كند واكنش شركت مي

Tyr73 ،Phe418 وTrp430 گيري صحيح به منظور جهتسوبستراي و نيز جهت اكسيداسيون سريع گلوكز حائز

و His520اسيدهاي همچنين آمينو). 4( باشنداهميت ميHis563 در طي واكنش باOH1 گلوكز پيوندهاي هيدروژني

اسيدي ينومقايسه توالي آم ،همچنين ).4(دهند تشكيل مي ،)A. niger )10گلوكز اكسيداز از با ژنهاي PfGOXژن

P. amagasakiense )16 ( وP. variabile )25(، 4 جايگاهN- گليكوزيلاسيون را در موقعيتهاي حفظ شدهAsn93 ،

Asn165 ،Asn172 وAsn392 در حالي كه در توالي .نشان داد ،)A. niger )13گلوكز اكسيداز از ژنهاي اسيدي آمينو

P. amagasakiense )16 ( جايگاه 5و 6به ترتيبN - . گليكوزيلاسيون شناسايي شده است

استفاده از بيني موقعيت زيرسلولي اين پروتئين با پيشنشان داد كه اين آنزيم همانند ساير YLOCبرنامه

بوده آنزيمهاي گلوكز اكسيداز در مسيرهاي متابوليكي فعال از قبيل محل فعاليت آن خارج از اندامكهاي سلوليو

همچنين بررسيها با . باشدمي ميتوكندري و پراكسيزومبا داشتن يك PfGOXنشان داد كه TMHMMبرنامه

دومين غشايي در انتهاي آمينوي خود، به عنوان يك پروتئين خارج سلولي شناخته شده و قادر به خروج از

و Petruccioliبا نتايج هابينياين پيش. باشدسلول ميطوري كه آنها ه ب. )24(باشد مشابه مي )1997(همكاران

درون طور طبيعي ازه نشان دادند كه آنزيم گلوكز اكسيداز ببه درون محيط كشت ترشح P. variabile سلولهاي قارچي

به هر حال اين فعاليت منحصر به فرد نياز به . كندمي .تري داردقهاي دقيبررسي

: PfGOX بررسي ساختار دوم و سوم توالي پروتئيني ژنبا استفاده PfGOX بررسي ساختار دوم توالي پروتئيني ژن


479

208نشان داد كه اين پروتئين حاوي SOPMAاز برنامه 114، )درصد α )38/34آمينواسيد درگير در مارپيچ

48، )درصد β )84/18آمينواسيد تشكيل دهنده صفحه آمينواسيد 235و ) درصد β )93/7ينواسيد موجود در پيچ آم

شكل (باشد مي) درصد 86/39(درگير در مارپيچ تصادفي هاي پپتيدي ژناين نتايج با ساختار دوم توالي پلي). 3

كه ) PaGOX )P. amagasakienseگلوكز اكسيداز از قبيل βصفحه 99، )درصد α )05/34مارپيچ 206حاوي

12/6( βپيچ 37متصل شده توسط )درصد 36/16(

AnGOX، )درصد 47/43(مارپيچ تصادفي 263و ) درصد)A. niger ( مارپيچ 185باα )58/30 صفحه 110، )درصدβ )18/18 درصد ( پيچ 59متصل شده توسطβ )75/9

PvGOXو ) درصد 49/41(مارپيچ تصادفي 251و ) درصد)P. variabile ( مارپيچ 182شاملα )08/30 102، )درصد

βپيچ 39متصل شده توسط ) درصد β )86/16صفحه ) درصد 61/46(مارپيچ تصادفي 282و ) درصد 45/6(

).3شكل ) (25و 16، 10(تشابه زيادي را نشان داد

ژنهاي گلوكز اكسيداز از قبيل پپتيدي و مقايسه آن با توالي پلي SOPMAبا استفاده از برنامه PfGOXساختار دوم توالي پروتئيني -3شكل PaGOX )P. amagasakiense( ،AnGOX )A. niger ( وPvGOX )P. variabile .( مارپيچهايα صفحات ،β پيچهاي ،β و مارپيچهاي

.اندتصادفي به ترتيب با خطوط آبي، قرمز، سبز و بنفش نشان داده شده PfGOX توالي پروتئيني ژنبعدي ساختار سهبيني پيشمشابه با نشان داد كه اين آنزيم I-TASSERله برنامه بوسي

) PaGOX )P. amagasakienseساختار سه بعدي ژنهاي و βصفحه 15حاوي ) A. niger) (14( AnGOXو ) 29(

نحوه آرايش مارپيچهاي . )4شكل ( باشدمي αمارپيچ 22α و صفحاتβ پروتئينبعدي در ساختار سه PfGOX به و

اي است كه ي گلوكز اكسيداز به گونهطور كلي آنزيمهادر βدر سطح خارجي پروتئين و صفحات αهاي مارپيچ

درگير در Asnآمينواسيدهاي . اندداخل پروتئين قرار گرفتهگليكوزيلاسيون در سطح خارجي پروتئين به -Nفرآيند

اند تا بتوانند با كربوهيدراتهاي غني از قند اي واقع شدهگونه

همچنين، آمينواسيدهاي ). 4(رقرار نمايند مانوز پيوند بموجود در جايگاه فعال طوري در كنار يكديگر آرايش

نوكلئوتيد اند تا بتوانند با كوفاكتور فلاوين آدنين دييافته)FAD ( پيوند غيركووالان برقرار نمايند)الف 4شكل ).29

،Cysو توزيع آمينواسيدهاي PfGOXطرح روباني آنزيم گليكوزيلاسيون و -Nدرگير در فرآيند Asn ايآمينواسيده

. دهدرا نشان مي آمينواسيدهاي موجود در جايگاه فعالطرح گوي و ميله به همراه سطح سطح جامد و نمايش

ب 4به ترتيب در شكلهاي PfGOXواندروالس در پروتئين د موقعيت 4همچنين شكل . اندج نشان داده شده4و


480

.دهدميد در جايگاه فعال را نشان موجوقرارگيري آمينواسيدهاي

، صفحات αهاي مارپيچ. PfGOXتوالي پروتئيني ژن ) Ribbon(بعدي روبان مدل سه) الف. PfGOXبعدي توالي پروتئيني ژن مدلهاي سه -4شكل β مينواسيدهاي آ. باشندبعدي قابل مشاهده ميو نواحي مارپيچ پيچيده به طور مشخص در ساختار سهCys و آمينواسيدهايAsn درگير در فرآيندN -

همچنين آمينواسيدهاي موجود در جايگاه فعال . باشندبه ترتيب با رنگهاي زرد و ارغواني قابل مشاهده مي) Sphere(گليكوزيلاسيون به شكل كروي بعدي مدل سه )ج. با سطح جامد PfGOXتوالي پروتئيني ژن بعديمدل سه )ب. اندقرمز رنگ نشان داده شده) Ball-stick(ميله - به شكل گوي

- آمينواسيدهاي موجود در جايگاه فعال به شكل گوي. درصد 10به همراه سطح واندروالسي PfGOXتوالي پروتئيني ژن ) Ball-stick(ميله -گويبعدي به منظور برقراري پيوند د در جايگاه فعال در فضاي سهنحوه آرايش آمينواسيدهاي موجو )د. اندقرمز رنگ نشان داده شده) Ball-stick(ميله

.FADغيركووالان با كوفاكتور توالي پروتئيني ژن: بررسيهاي همولوژي و فيلوژنتيكي

PfGOX ديگر با ساير ژنهاي گلوكز اكسيداز از قارچهايمورد مقايسه قرار گرفته و مشاهده شد كه بالاترين تشابه را

از P. amagasakiense، TfGOXز اPaGOX ژنهاي با T. flavus ،TsGOX ازT. stipitatus و TvGOX از

T. variabilis درصد 99با ( درصد 99به ترتيب به ميزان

با ( درصد 98، )يكساني درصد 99با ( درصد 99، )يكساني) يكساني درصد 89با ( درصد 94و ) يكساني درصد 96

،Cysآمينواسيدهاي توالي پپتيد راهنما، ). 5شكل (دارد گليكوزيلاسيون و -Nدرگير در فرآيند Asn آمينواسيدهاي

مشخص در به طورآمينواسيدهاي موجود در جايگاه فعال .اندنشان داده شده 5شكل


481

توالي پپتيد راهنما، . ClustalXافزار ديگر با استفاده از نرم با تواليهاي پروتئيني گلوكز اكسيداز از قارچهاي PfGOXسازي چندگانه ژن همرديف -5شكل هاي آبي، زرد، گليكوزيلاسيون و آمينواسيدهاي موجود در جايگاه فعال به ترتيب با كادر-Nدرگير در فرآيند Asn آمينواسيدهاي ،Cysآمينواسيدهاي

آمده 1سازي چندگانه در جدول يهاي پروتئيني مورد استفاده در تهيه همرديفشماره دستيابي توال. اندارغواني رنگ و علامت مثلث نشان داده شده .است


482

MEGA4.1افزار درخت فيلوژنتيكي با استفاده از نرم. با تواليهاي پروتئيني گلوكز اكسيداز از قارچهاي ديگر PfGOXبررسي فيلوژنتيكي ژن -6شكل

Beta 2 به روشNeighbor Joining آمده است 1شماره دستيابي تواليهاي پروتئيني مورد استفاده در ساخت درخت فيلوژنتيكي در جدول . رسم گرديد.

با تواليهاي PfGOXبررسي فيلوژنتيكي توالي پروتئيني با استفاده از ديگر گلوكز اكسيداز از قارچهايپپتيدي پليكه نشان داد Neighbor Joiningبه روش Mega4افزار نرم

IIو Iبه دو گروه اصلي دست آمدهه درخت فيلوژنتيكي بشامل قارچهاي عمدتاً Iگروه . )6شكل ( شودتقسيم مي

Penicillium ،Aspergillus وTalaromyces بوده كه نشاندهنده خويشاوندي نزديك از نظر ژنتيكي و تكامل از يك

IBو IAبه دو زيرگروه Iگروه .باشدجد مشترك مي به همراه PfGOX ژن ، به طوري كهشودبندي ميمتقسي

PvGOXو ) PaGOX )P. amagasakiense) (16ژنهاي )P. variabile( )25 ( در زيرگروهIA در حالي قرار داشته

IBمتعلق به زيرگروه ) AnGOX )A. niger) (10كه ژن IIBو IIAنيز خود شامل دو زيرگروه IIگروه .باشدمي

، Auricalaria ،Botryotiniaهاي است كه شامل قارچ

Colletotrichum ،Glomerella ،Metarhizium وPiriformospora باشدمي.

، تحت عنوان گلوكز اكسيداز ژنيك تحقيقدر اين PfGOXقارچ پني سيليوم بومي ايران ، از

)P. funiculosum PTCC 5301( با استفاده از واكنشPCR ده و ويژگيهاي سازي گرديجداسازي و همسانه

با استفاده از . بيوشيميايي آن مورد بررسي قرار گرفتاز PfGOXبررسيهاي مدلينگ ساختاري نشان داده شد كه

گلوكز نظر ساختارهاي دوم و سوم مشابه با ساير تواليهاي بوده و بررسيهاي همولوژي و ديگر اكسيداز از قارچهاي

يي با تواليهاي فيلوژنتيكي نشان داد كه اين ژن شباهت بالاداشته و به زيرگروه قارچها ساير گلوكز اكسيداز پروتئيني

IA تعلق داردگلوكز اكسيدازهاي قارچي .

Documents

Cloning, Identification and Isolation a Glucose Oxidase Gene … · 2015. 6. 28. · Glucose oxidase (β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase) catalyzes the oxidation of β-D-glucose