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8/14/2019 Cloning, Sequencing, And Characterization of the Gene
Encoding
1/5
V o l . 1 7 5 , N o . 2 2O U R N A L OF B A C r E R I O L O G Y
, N o v . 1 9 9 3 , P . 7 4 9 5 - 7 4 9 90 0 2 1 - 9 1 9 3 / 9 3 /
2 2 7 4 9 5 - 0 5 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t C 1 9 9 3 , A m
e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y
C l o n i n g , S e q u e n c i n g , a n d C h a r a c t e r i
z a t i o n o f t h e GeneE n c o d i n g t h e C l a s s I F r u c
t o s e - 1 , 6 - B i s p h o s p h a t eA l d o l a s e o f S t a
p h y l o c o c c u s carnosusCLAUDIA WITKE AND FRIEDRICH GOTZ*
M i k r o b i e l l e G e n e t i k , U n i v e r s i t a t T u
b i n g e n , W a l d h a u s e r S t r a s s e 7 0 / 8 , 7 2 0 7 6
T u b i n g e n , G e r m a n yR e c e i v e d 2 6 May 1 9 9 3 / A
c c e p t e d 1 3 S e p t e m b e r 1 9 9 3
f d a f r o m S t a p h y l o c o c c u s carnosus T M 3 0 0 , e
n c o d i n g t h e c l a s s I f r u c t o s e - 1 , 6 - b i s p h
o s p h a t e a l d o l a s e , was c l o n e di n E s c h e r i c
h i a c o l i a n d s e q u e n c e d . T h e 8 8 8 - n u c l e o t
i d e open r e a d i n g f r a m e e n c o d i n g a p r o t e i n
w i t h an Mr o f3 2 , 8 5 5 h a d an E . c o l i - l i k e
promoter sequence. P l a s m i d s c o n t a i n i n g f d a c o m
p l e m e n t e d E . c o l i NP315 ( F d a - ) .E x p r e s s i o
n o f f d a i n S . carnosus l e d t o a s i x - t o e i g h t f o
l d i n c r e a s e i n a l d o l a s e p r o d u c t i o n a n d a
c t i v i t y ; l o w l e v e l so f g l u c o s e i n t h e g r o
w t h medium s t i m u l a t e d a c t i v i t y .
F r u c t o s e - 1 , 6 - b i s p h o s p h a t e ( F B P ) a l
d o l a s e ( E C 4 . 1 . 2 . 1 3 ) i s ag l y c o l y t i c e n z
y m e w h i c h c a t a l y z e s t h e r e v e r s i b l e c l e a
v a g e o ff r u c t o s e - 1 , 6 - b i s p h o s p h a t e t o f
o r m d i h y d r o x y a c e t o n e p h o s -p h a t e a n d g l
y c e r a l d e h y d e 3 - p h o s p h a t e . T h e r e a r e t w
o c l a s s e so f FB P a l d o l a s e s . C l a s s I a l d o l a
s e s , t y p i c a l o f h i g h e r e u c a r y o t e ss u c h a
s a n i m a l s a n d p l a n t s , c o n s i s t o f t e t r a m e
r s w i t h a t o t a lm o l e c u l a r w e i g h t o f a b o u t
1 6 0 , 0 0 0 ( 1 6 ) . C l a s s I a l d o l a s e s f o r ma n i
n t e r m e d i a t e w i t h t h e i r s u b s t r a t e t h r o u
g h a S c h i f f b a s e b yc o n d e n s a t i o n o f t h e c a
r b o n y l g r o u p w i t h t h e s - a m i n o g r o u p o fa l
y s y l r e s i d u e i n t h e a c t i v e c e n t e r . T h i s c
o m p l e x c a n b e f i x e d b yr e d u c t i o n w i t h N a B
H 4 , l e a d i n g t o a n i r r e v e r s i b l e i n a c t i v a
t i o no f t h e e n z y m e ( 1 6 ) .I n c o n t r a s t , FB P a
l d o l a s e s o f m o s t b a c t e r i a a r e c l a s s I Ia l
d o l a s e s . T h e y d o n o t f o r m a S c h i f f b a s e i n
t e r m e d i a t e ; t h e yr e q u i r e a d i v a l e n t c a t
i o n , s u c h a s C a 2 + , F e 2 + , o r Z n 2 + , t os t a b i
l i z e t h e c a r b a n i o n i n t e r m e d i a t e o f t h e e
n z y m e - s u b s t r a t ec o m p l e x ( 1 5 ) ; a n d t h e y
c a n b e i n h i b i t e d b y EDTA ( 1 6 ) . S i n c ei t w a s b
e l i e v e d t h a t c l a s s I a l d o l a s e s w e r e r e s t
r i c t e d t o h i g h e re u c a r y o t i c o r g a n i s m s ,
i t w a s a s u r p r i s e t o f i n d t h e m i n P e p t o -c o
c c u s a e r o g e n e s ( 2 0 ) , L a c t o b a c i l l u s c a s
e i ( 2 1 ) , E s c h e r i c h i a c o l i( 3 3 ) , a n d m o s t
s t a p h y l o c o c c a l s p e c i e s ( 1 2 ) .T h e c l a s s
I a l d o l a s e o f S t a p h y l o c o c c u s a u re u s h as b
e e ns t u d i e d i n d e t a i l . T h e e n z y m e i s u n u s
u a l l y h e a t r e s i s t a n t a n de x t r e m e l y a c i d
a n d b a s e s t a b l e ( 1 1 ) . W h i l e t h e r a b b i t m u
s c l ea l d o l a s e i s a c t i v e a s a t e t r a m e r , t h
e 3 3 - k D a S . a u r e u s a l d o l a s ei s a c t i v e a s a
m o n o m e r . T h e k i n e t i c s o f t h e r m a l l y a n d g
u a n i -d i n i u m c h l o r i d e - i n d u c e d u n f o l d i
n g a n d r e f o l d i n g o f t h i s a l d o -l a s e a r e c o
m p l e x a n d c o m p r i s e a t l e a s t o n e f a s t a n d t
w o s l o wr e a c t i o n s ( 2 5 ) . R e c e n t l y i t w a s f
o u n d t h a t t h e c l a s s I a l d o l a s e o ft h e s t a p
h y l o c o c c a l c l o n i n g h o s t S t a p h y l o c o c c u
s c a r n o s u s ( 1 0 ) i sa l s o u n u s u a l l y t e m p e r
a t u r e a n d pH s t a b l e ( 4 , 5 ) . F u r t h e r m o r e ,t
h e S . c a r n o s u s a l d o l a s e r e a c t s w i t h a w i d
e r a n g e o f a l i p h a t i ca l d e h y d e s a n d i s much m
o r e s t a b l e t h a n t h e r a b b i t a l d o l a s e .B e c
a u s e o f i t s s u b s t r a t e r a n g e a n d s t a b i l i t
y , t h e S . c a r n o s u sa l d o l a s e i s t h e e n z y m e
o f c h o i c e f o r l a r g e - s c a l e s y n t h e s i s o fg
l y c o s i d a s e i n h i b i t o r s ( 3 6 ) , 6 - d e s o x y -
f r u c t o s e - 1 - p h o s p h a t e( 3 5 ) , C 8 a n d C g s u
g a r s ( 2 ) , a n d s i m i l a r c o m p o u n d s .From t h e b
i o p h y s i c a l p o i n t o f v i e w , t h e s t a p h y l o c
o c c a l c l a s sI a l d o l a s e c o u l d b e c o m e a m o d
e l e n z y m e t o s t u d y u n f o l d i n ga n d r e f o l d i
n g k i n e t i c s . To c o n t i n u e t h o s e s t u d i e s w
h i c h h a v e
* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .
b e e n a l r e a d y i n i t i a t e d , i t i s n e c e s s a
r y t o know t h e p r o t e i ns e q u e n c e a n d t o h a v e t
h e c l o n e d g e n e a v a i l a b l e t o d e t e r m i n et h
e r e f o l d i n g p a t h w a y b y u s i n g s p e c i f i c m u
t a t i o n s . H e r e wer e p o r t t h e i s o l a t i o n a n d
DNA s e q u e n c e o f t h e c l a s s I a l d o l a s eg e n e f
r o m S . c a r n o s u s a n d i t s e x p r e s s i o n i n t h e
d o n o r s t r a i n .C h r o m o s o m a l l o c a t i o n o f f
d a . T h e a l d o l a s e o f S . c a r n o s u sh a s b e e n p
u r i f i e d ( 5 ) . On t h e b a s i s o f t h e N - t e r m i n
a l s e q u e n c e
A .
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8s ~ ~ K * h
0 0 r j < S 4 0B .
P s t I H i n d I I IC l a I EcoRI
I IEcoRV
C l a lE c o R I P s t lH i n d I l I X b a IP v u I I I I
f d aF I G . 1 . ( A ) H y b r i d i z a t i o n o f A l d o l t
o S . c a r n o s u s TM300 g e n o m i cDNA. A u t o r a d i o g r
a p h o f t h e S o u t h e r n b l o t h y b r i d i z e d w i t h
p u r i f i e da n d 3 2 P - l a b e l e d A l d o l . C h r o m o
s o m a l DNA was d i g e s t e d w i t h t h ef o l l o w i n g r
e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s . L a n e s : 1 , C l
a I ; 2 , C l a I - H i n d I I I ; 3 ,C l a I - P s t I ; 4 , C l
a I - B a m H I ; 5 , H i n d I I I ; 6 , H i n d I I I - P s t I ;
7 , H i n d I I I -B a m H I ; 8 , B a m H I - P s t I ; 9 , H i n
d I I I - C l a I - P s t I ; 1 0 , H i n d I I I - C l a I - E c o
R I ;1 1 , P v u I I ; 1 2 , P v u I I - E c o R I ; 1 3 , P v u I
I - H i n d I I I ; 1 4 , P v u I I - C l a I ; 1 5 ,P v u I I - P
s t I ; 1 6 , P v u I I - X b a I ; 1 7 , C l a I - X b a I ; 1 8 ,
P s t I - X b a I . ( B ) L o c a t i o no f f d a i n t h e g e n
o m e , b a s e d o n h y b r i d i z a t i o n o f A l d o l .
7 4 9 5
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Encoding
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7 4 9 6 NOTES J . B A C T E R I O L .
EcoRV1 A A Q A T A T U A T T T T G T T G A A T A G G T C C T T C
C T T T A A T A C A C G A A A A T A C C A T C C A G T T C T T C C A
G T T T C T T G G A T A C G T C T T C C C C A T T C A A T C C A A C
G C A
101
CACGTCTCCCTGGCTTCCAACAAGGTCTGCGCGGTTGTGAAACTTGTACAGTCGCTCCTCCGATTTGATAGATGTCACCAATATAAACAGAAGTTTCATC201
CATATCAATTACGGAAACATTCTCTCCATTCAACCCTGGTTTAAAATGAACITCCGGATATTCTACTGTCCATTTTTCATAATGCGATTTACTATAAGCA3
01
AATAATGCTTTTTCTGGTCCGCCATGATGTTTTTTCTCCCCGACATCATCACCAACTAAACCTGTTTTCGTTAGTAAAACCGCTTGGTCTGTCGGATTTT
SalI40 1 T A A A C G C T G C T G T C G A C C A T T C T T G T T C
T A A A G G A T T T T C A G C A T T C G G A T C A C C T A C T T T T
T G A A T G C C G C C T C T A A A T A A T T G C T C G A T T T G A C
T C A C-3 5
501
TTGTTCCACCCTCTCTCAAAGCTATTATAACGACTTTTTGACAAATTCTTAAGAGTAAGCGTTTTTTTTAATTTTTTTAAAGTAAAGTAAATC+
1
-1 0 I S.D.6 0 1 AATTATTTT TTT
CCATACAGACATTGAAAGAGAAAAGCAAAATGCGG
AAAGArTCAATAAATGAACCAAGAACAATTTGACAAAATTAAAAATGMN Q B Q F D K I K N
1 170 1 GTAAAGGATTTATCGCAGCATTGGACCAAAGCGGT GGTAGT
ACTCCGAAAGCGCTAAAAGATTATGG CGTTGAAGAAAATGAATACTCTAACGATGAAGAG K G F
I A A L D Q S G G S T P K A L K D Y G V E E N E Y S N D E E 45
80 1
AATGTTCAACCTTGTACACGATATGCGTACTCGTATCATTACTTCACCTGCATTTAACGGAGAAAAAATCTTAGGTGCGATTCTATTCGAACAAACTATGM
F N L V H D M R T R I I T S P A F N G E K I L G A I L F E Q T M
78SalI
901
GACCGTGAAGTTGAGGGCAAATACACAGGTTCATATTTAGCAGATAAAGGTATCGTTCCATTCTTGAAAGTCGACAAAGGTTTGGCTGAAGAAGCTGACGD
R E V E G K Y T G S Y L A D K G I V P F L K V D K G L A E E A D 1 1
1
1001
GCGTTCAATTAATGAAACCTATTCCAGACTTAGATAAATTATTAGATCGTGCGAACGAACGTGGTATCTTCGGTACTAAAATGCGTTCTAACATCTTAGAG
V Q L M K P I P D L D K L L D R A N E R G I F G T K M R S N I L E
145PvuII1101 AAATAATAAAGAAGCAATTGAAAAAGTT GTT AAACAACAATTTGAAGTT
GCAAAAGAAATCATTG CAGCGTCTAGTACCAATTATCGAACCTGAAGTT
N N K E A I E K V V K Q Q F E V A K E I I A A G L V P I I E P E
V 1 78
1 2 0 1
AACATCAATGCTAAAGACAAAGAAGCTATCGAAGCTAACTTAGCTGAAGCAATCAAAGCTGAATTAGATAACTTGAAAAAAGATCAATATGTAATGTTGAN
I N A K D K E A I E A N L A E A I K A E L D N L K K D Q Y V M L 2 1
1
1301
AATTAACTATTCCAACTAAAGTGAATGCTTACAGCGAATTAATTGAACATCCACAAGTAATCCGCGTGGTTGCATTATCTGGTGGTTACAGCCGCGACGAK
L T I P T K V N A Y S E L I E H P Q V I R V V A L S G G Y S R D E
245HindIII EcoRI1 4 0 1 A G C A A A C A A A A T C T T G A A A C A A
A A T G A T G G T T T A A T C G C A = G
CTCACGTGCATTAGTATCTGACTTAAACGCACAACAATCAGATGCA AT
A N K I L K Q N D G L I A S F S R A L V S D L N A Q Q S D A E F
N 278Clal Hindlll HindlIl1 5 0 1 G A A A A A T T A C A A G A A G C
T A T C G A T A C A A T C T T C G A T G C T T C A G T A A A C A A A
G C T A A T C T A A G C T T A A A A T A A T A A C G A G C C C C TTC
TTGAGGGCTE K L Q E A I D T I F D A S V N K A 2 96
1601 C G C T T T T T T G T A T A A T T C C A T A G A T T T T C T
C C G C A A A T T T T C T C A T A C G T A A T A T T T T C A C A A T
A A A A G T T C T T T T C T T T C A C T G T C A T A C A T A A T A A
A A1701 TACAAGAGACTTTCAGAAATAAAGAACTAAGTCGCCAAACTTACAACAGGAT
CTGAACACACATGGCGTCTAATCCTATTCCTCGTT ATTTACAAGATAA1801
GCGCGCAAATTTCCATGAACTATTTTATATTAATATTTGT
ATATGCCTTACAAAAAATTGCGCATGTG CTTTTACATACTGAAAAAATGG CACACTTT
Xb a I1901 CCTAGAF I G . 2 . N u c l e o t i d e s e q u e n c e
o f t h e f d a - c o n t a i n i n g 1 . 9 - k b E c o R V - X b a
I f r a g m e n t o f S . c a r n o s u s T M 3 0 0 . T h e t r a n
s c r i p t i o n a l s t a r t i s m a r k e d w i t h+ 1 . T h e
-3 5 a n d -1 0 r e g i o n s a n d t h e p o t e n t i a l r i b o
s o m e b i n d i n g s e q u e n c e s ( S . D . ) a r e u n d e r
l i n e d . T h e d e t e r m i n e d N - t e r m i n a l p r o t e
i n s e q u e n c e
i s m a r k e d w i t h b o l df a c e l e t t e r s . T h e S c
h i f f b a s e - f o r m i n g l y s i n e r e s i d u e i s m a r
k e d w i t h a n a s t e r i s k . T h e t e r m i n a t o r i s u
n d e r l i n e d w i t h a r r o w s .NQEQFDK ( 1 8 a ) , we s y n
t h e s i z e d ( G e n e A s s e m b l e r P l u s ; C h r o m o s
o m a l DNA f r o m S . c a r n o s u s ( 2 9 ) w a s p r e p a r e
d b y aP h a r m a c i a LKB) t h e w o b b l e o l i g o n u c l e
o t i d e A l d o l : m o d i f i c a t i o n o f t h e c l e a r e
d - l y s a t e m e t h o d ( 2 2 ) . C o l o n i e sAATAAAAA-ATTAT
AA grown on one B p l a t e ( 1 0 g o f c a s e i n h y d r o l y s
a t e 1 4 0 [ G I B C O ,AT CAA G A A CAA E g g e n s t e i n - L e
o p o l d s h a f e n , G e r m a n y ] , 5 g o f y e a s t e x t r
a c tC G G G C C [ D i f c o ] , 5 g o f N a C l , 1 g o f g l u c
o s e , 1 g o f K 2 H P O 4 , a n d 1 2 gT h e o l i g o n u c l e
o t i d e w a s l a b e l e d w i t h [ _ y - 3 2 P ] A T P ( A m e
r s h a m ) o f a g a r [ G I B C O ] p e r l i t e r [ p H 7 . 3 ]
) w e r e r e s u s p e n d e d i n 1 m lw i t h T4 p o l y n u c l
e o t i d e k i n a s e ( S t r a t a g e n e ) ( 2 7 ) . U n i n c
o r p o - o f NT b u f f e r ( 1 0 0 mM N a C l a n d 2 0 mM T r i
s - H C l , pH 7 . 5 ) .r a t e d n u c l e o t i d e s w e r e s e
p a r a t e d f r o m t h e r a d i o l a b e l e d o l i g o - A f
t e r i n c u b a t i o n w i t h 1 4 U o f l y s o s t a p h i n (
S i g m a , D e i s e n -n u c l e o t i d e b y u s i n g t h e
Nuc T r a p P u s h C o l u m n s ( S t r a t a g e n e ) . h o f e
n , G e r m a n y ) f o r 3 0 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r
e , t h e c e l l s
-
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Encoding
3/5
NOTES 7 4 9 7
h u m a n A : 2 15 -h u m a n B : 2 1 5 -h u m a n C : 2 1 4 -d
r o s . m e l . : 212-z e a m a y s : 2 0 9 -
S . a u r e u s :S . c a r n o s u s : 197-
K A L S r H H I Y L E G T L LK A L N IDH H V Y L E G T L L KK A
L N D I H H V Y L Q G T L L KK A L S H H V Y L Q G T L LK A L N E H
H V L L E G T L L RKG L A S E Q D D V - vML KAEL EN L K K D YV
MLK
P N M VP N M VP D M VP N M VP N M VP I N LL T I P
A G- 23 7A G- 23 7P G - 2 3 6A G- 234P G- 23 2D EK V- 219
A .2 . 5
2E
E 1 . 5
g o
0 . 5
F I G . 3 . A l i g n m e n t o f c l a s s I a l d o l a s e s
e q u e n c e s a r o u n d t h e p r o -p o s e d a c t i v e s i
t e . T h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f S . c a r n o s u
s FB Pa l d o l a s e , d e du c e d f r o m t h e f d a n u c l e
o t i d e s e q u e n c e , i s s h o w n a l i g n e dw i t h t h
e c o r r e s p o n d i n g human a l d o l a s e A ( 1 7 ) , human
a l d o l a s e B ( 2 6 ) ,h u m a n a l d o l a s e C ( 2 4 ) , D
. m e l a n o g a s t e r ( d r o s . m e l . ) ( 3 ) , Z . m a y s
( 1 8 ) ,a n d S . a u r e u s ( 9 ) s e q u e n c e s . DNA a n d
p r o t e i n s e q u e n c e s w e r ea n a l y z e d b y u s i n
g t h e c o m p u t e r p r o g r a m s o f M i c r o g e n i e ( B
e c k m a n )a n d P C / G e n e ( I n t e l l i G e n e t i c s ,
I n c . ) . Amino a c i d s i d e n t i c a l t o t h o s e i nt h
e S . c a r n o s u s s e q u e n c e a r e b o x e d .
w e r e l y s e d b y t h e a d d i t i o n o f 1 1 0 , u l o f
c o l d l y s i s b u f f e r ( 5 0 mMT r i s - H C l , 3 0 0 mM
EDTA, 0 . 5 % B r i j 5 8 , 0 . 0 4 % N a - d e s o x y -c h o l a
t e , pH 8 . 0 ) o n i c e f o r a b o u t 1 h . T h e p r o t e i
n s w e r er e m o v e d b y p r o t e i n a s e K d i g e s t i o
n . DNA w a s s e p a r a t e d b yC s C l c e n t r i f u g a t i
o n .E s t a b l i s h e d p r o t o c o l s ( 2 7 ) w e r e f o l
l o w e d f o r m o l e c u l a rb i o l o g i c a l t e c h n i q
u e s u n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d . I s o l a t e d c
h r o m o -s o m a l DNA w a s d i g e s t e d w i t h s e v e r a
l r e s t r i c t i o n e n z y m e s .DNA f r a g m e n t s w e r
e b l o t t e d ( 3 2 ) o n t o n y l o n m e m b r a n e s( P a l
l ; B i o d y n e A , 0 . 2 - , u m p o r e s i z e , u n l o a d e
d ) b y u s i n g av a c u u m b l o t t i n g s y s t e m ( P h a
r m a c i a L K B ) a c c o r d i n g t o t h ei n s t r u c t i o
n s o f t h e m a n u f a c t u r e r . DNA w a s c r o s s - l i n
k e d w i t h aU V - S t r a t a l i n k e r ( S t r a t a g e n e
) . P r e h y b r i d i z a t i o n w a s p e r f o r m e da t 4 2
C f o r a t l e a s t 2 h w i t h 5 0 j i g o f h e p a r i n ( S i
g m a ) p e r m l a sa b l o c k i n g a g e n t . H y b r i d i z
a t i o n w a s p e r f o r m e d w i t h 1 0 p m o l o fl a b e l
e d A l d o l a t 4 2 C f o r a t l e a s t 1 2 h t o i d e n t i f
y f d a -c o n t a i n i n g f r a g m e n t s . To r e m o v e u n
b o u n d o l i g o n u c l e o t i d e s ,f i l t e r s w e r e w
a s h e d f o r 3 0 m i n a t room t e m p e r a t u r e a n d f o
r 1 0m i n a t 5 0 C . N y l o n m e m b r a n e s w e r e e x p o
s e d t o a n RX NIF1 8 x 2 4 f i l m ( F u j i ) a t - 7 0 C w i t
h a n i n t e n s i f y i n g s c r e e n( D u p o n t ) .T h e h y
b r i d i z a t i o n p a t t e r n o f A l d o l ( F i g . 1 A ) a
l l o w e d t h ec o n s t r u c t i o n o f a r e s t r i c t i o
n m ap ( F i g . 1 B ) . T h e s m a l l e s tf r a g m e n t w h i
c h h y b r i d i z e d w i t h t h e p r o b e w a s a 2 . 2 - k b
E c o R I -P v u I I f r a g m e n t .C l o n i n g a n d s e q u e
n c i n g o f f da f r o m S . c a r n o s u s . S i n c e i t w a
sp o s s i b l e t h a t A l d o l h y b r i d i z e d v e r y n e
a r t h e E c o R I o r t h eP v u I I s i t e , w e c l o n e d t
h e l a r g e r e n c o m p a s s i n g 5 . 2 - k b P s t If r a g
m e n t . An e n r i c h e d g e n e l i b r a r y w a s m a d e b
y d i g e s t i n gc h r o m o s o m a l DNA w i t h P s t I . F r
a g m e n t s o f 4 . 5 t o 6 . 5 k b w e r ei s o l a t e d a n d
l i g a t e d i n t o P s t I - d i g e s t e d p B l u e s c r i p
t l l KS+( S t r a t a g e n e ) a n d t r a n s f o r m e d i n t
o E . c o l i SURE ( S t r a t a g e n e ) .On e t h o u s a n d t
r an s f o r ma n t s w i t h i n s e r t s w e r e a n a l y z e d
b yh y b r i d i z a t i o n w i t h A l d o l . Tw o p o s i t i v
e c l o n e s , b o t h h a v i n g t h es u p p o s e d r e s t r
i c t i o n m a p , w e r e f o u n d . T h e p l a s m i d c o n t
a i n i n gt h e 5 . 2 - k b P s t I f r a g m en t w a s d e s i g
n a t e d p B l u e s c r i p t l l - f d a l O .T h e a p p r o x
i m a t e p o s i t i o n o f f d a w a s d e t e r m i n e d b y e
x o n u c l e -a s e I I I d i g e s t i o n a n d s u b c l o n i
n g ( F i g . 1 B ) .T h e i n s e r t w a s s e q u e nc ed b y d
o u b l e - s t r a n d e d DNA s e -q u e n c i n g ( 7 ) b y u s
i n g t h e d i d e o x y p r o c e d u r e ( 2 8 ) , t h e P h a r
-m a c i a A u t o R e a d S e q u e n c i n g k i t , a n d t h e
A . L . F . DNA S e -q u e n c e r f r o m P h a r m a c i a L K B
. E x o n u c l e a s e I I I c l o n e s w e r es e q u e n c e d
w i t h u n i v e r s a l a n d r e v e r s e p r i m e r s o b t a
i n e d w i t ht h e s e q u e n c i n g k i t . O t h e r s e q u
e nc i n g p r i m er s w e r e s y n t h e s i z e db y a s y n t
h e s i z e r ( P h a r m a c i a ) a n d l a b e l e d w i t h f l
u o r e s c e i na m i d i t e .
00 1 2 3 4 5
t ( h )
1 0
0- J0 0
0 . 1
0 . 0 16 7 8
B .4 h 5 h 6 h 7 hA B A B A B A B
8 hA B S k d-7 . 4-6 . 2-5 . 0
- 3 1 . 0-1 . 5-4 . 4
F I G . 4 . ( A ) C o m p a r i s o n o f a l d o l a s e a c t
i v i t y i n S . c a r n o s u s w i l d t y p ea n d f d a c l o
n e . B l a c k s q u a r e s , S . c a r n o s u s T M 3 0 0 ( p R
B 4 7 3 f d a 2 0 ) ; w h i t es q u a r e s , S . c a r n o s u s
T M 3 0 0 ; t r i a n g l e s , g r o w t h c u r v e o f S . c a r
n o s u sTM300 a n d S . c a r n o s u s T M 3 0 0 ( p R B 4 7 3 f
d a 2 0 ) . OD, o p t i c a l d e n s i t y .( B ) C o o m a s s i
e b l u e - s t a i n e d SDS-PAGE. P r o t e i n s o f c e l l e x
t r a c t s o f S .c a r n o s u s TM300 ( l a n e s A ) a n d S .
c a r n o s u s T M 3 0 0 ( p R B 4 7 3 f d a 2 0 )( l a n e s B )
, p r e p a r e d a t t h e i n d i c a t e d t i m e s , w e r e s
e p a r at e d o n a nS D S - 1 2 . 5 % p o l y a c r y l a m i d e
g e l . T h e a l d o l a s e b a n d i s m a r k e d b y a na r r
o w . M o l e c u l a r m a s s s t a n d a r d s w e r e o b t a i
n e d f r o m B i o - R a d .
DNA s e q u e n c i n g o f t h e 1 . 9 - k b E c o R V - X b a
I f r a g m e n t r e -v e a l e d o n e o p e n r e a d i n g f r
a m e o f 8 8 8 n u c l e o t i d e s e n c o d i n g ap r o t e i
n w i t h a n Mr o f 3 2 , 8 5 5 ( F i g . 2 ) . T h e d e d u c e
d N - t e r m i n a la m i n o a c i d s e q u e n c e c o r r e s
p o n d s e x a c t l y w i t h t h a t d e t e r m i n e db y
Edman d e g r a d a t i o n o f t h e p u r i f i e d a l d o l a s
e ( 3 a ) . T h e f d as t o p c o d o n i s f o l l o w e d b y a
n i n v e r t e d r e p e a t s e q u e n c e ( A G =- 2 9 . 2 k c
a l [ c a . - 1 2 2 k J ] ) ( 3 4 ) w h i c h i s i n d i c a t i v
e o f ar h o - i n d e p e n d e n t t r a n s c r i p t i o n t e
r m i n a t o r s e q u e n c e ( F i g . 2 ) .T r a n s c r i p t
i o n a l s t a r t . T h e t r a n s c r i p t i o n a l s t a r t
o f f d a w a sd e t e r m i n e d b y p r i m e r e x t e n s i o
n a n a l y s i s . T o t a l RNA f r o m S .c a r n o s u s w a s
i s o l a t e d b y t h e g u a n i d i n e i s o t h i o c y a n a
t e m e t h o da s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 8 ) w i
t h some m o d i f i c a t i o n s . T h ec u l t u r e w a s i n c
u b a t e d a t 3 7 C i n B b r o t h t o a n A 5 7 8 o f 2 . 2 . T
h e
V O L . 1 7 5 , 1 9 9 3
-
8/14/2019 Cloning, Sequencing, And Characterization of the Gene
Encoding
4/5
7 4 9 8 NOTESc e l l s w e r e h a r v e s t e d a n d d i s r u
p t e d w i t h g l a s s b e a d s ( 0 . 1 - t o0 . 3 - m m d i a
m e t e r ; F l u k a ) a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d (
3 1 ) . T h es u p e r n a t a n t w a s l o a de d o n t o a C s -
t r i f l u o r o a c e t a t e g r a d i e n t ( p= 1 . 5 1 g / m
l ) . T h e RNA w a s p e l l e t e d b y u l t r a c e n t r i f u
g a t i o n .RNA ( 1 0 , u g ) , 0 . 1 p m o l o f 5 ' - e n d - l
a b e l e d o l i g o n u c l e o t i d eA l d o 2 ( 5 ' - C C G C
T r L TGG TCC AAT G CT GCG ATA AATCCT T TA C C - 3 ') ( c o rr e s
p o n di n g t o n u c l e o t i d e p o s i t i o n s 7 3 4t o 6 9
9 i n F i g . 2 ) , a n d 1 0 U o f a v i a n m y e l o b l a s t o
s i s v i r u s r e v e r s et r a n s c r i p t a s e ( S t r a t
a g e n e ) w e r e u s e d f o r t h e p r i m e r e x t e n s i o
ne x p e r i m e n t s . E x t e n s i o n p r o d u c t s o f DNA
s e q u e n c i n g r e a c t i o n sw e r e r e s o l v e d o n a
d e n a t u r i n g 6% p o l y a c r y l a m i d e g e l a n dv i s
u a l i z e d b y a u t o r a d i o g r a p h y . T h e p r o m o t
e r r e g i o n i s s i m i l a rt o E . c o l i p r o m o t e r s
; 4 o f 6 b a s e s o f t h e f d a - 3 5 a n d -1 0r e g i o n s m
a t c h t h e E . c o l i p r o m o t e r c o n s e n s u s s e q u
e n c e .H o m o l o g y w i t h o t h e r c l a s s I FB P a l d o
l a s e s . T h e d e d u c e da m i n o a c i d s e q u e n c e o
f t h e FB P a l d o l a s e o f S . c a r n o s u s w a sc o m p a
r e d w i t h o t h e r c l a s s I a l d o l a s e s e q u e n c e
s , i n t h e M i c r o -g e n i e a n d E M B L - H e i d e l b e
r g d a t a b a n k s . W i t h t h e S . a u r e u sFB P a l d o l
a s e t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e a r o u n d t h e a c
t i v e s i t el y s i n e r e s i d u e w a s d e t e r m i n e d
( 9 ) . T h i s s e q u e n c e i s h i g h l yc o n s e r v e d n
o t o n l y i n t h e S . c a r n o s u s b u t a l s o i n o t h e
r FB Pa l d o l a s e s ( F i g . 3 ) . T h e a m i n o a c i d i d
e n t i t y w a s 3 3 . 5 % w i t hh u m a n a l d o l a s e B ( c
o v e r i n g 1 8 4 a m i n o a c i d s [ a a ] ) , 3 3 . 7 % w i t
hh u m a n a l d o l a s e C ( c o v e r i n g 1 7 5 a a ) , 2 5 .
1 % w i t h D r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ( c o v e r
i n g 2 1 5 a a ) , 25% w i t h Z e a m a y s ( c o v e r i n g1 5
5 a a ) , 2 7 . 5 % w i t h O r y z a s a t i v a ( c o v e r i n g
1 5 3 a a ) , a n d 3 6 . 9 %w i t h P l a s m o d i u m f a l c i
p a r u m ( c o v e r i n g 6 5 a a ) . S . c a r n o s u s FB Pa l
d o l a s e s h o w e d n o h o m o l o g y w i t h t h e c l a s s
I I FB P a l d o l a s e( 1 ) o r t h e 2 - k e t o - 4 - h y d r o
x y g l u t a r a t e a l d o l a s e ( 2 3 ) o f E . c o l i .C o
m p l e m e n t a t i o n o f E . c o l i NP315 ( F d a - ) . Th e
m u t a n t E .c o l i N P 3 1 5 ( F d a - ) , a d e r i v a t i v
e o f s t r a i n K - 1 0 w i t h a t e m p e r -a t u r e - s e n
s i t i v e c l a s s I I FB P a l d o l a s e ( 3 0 , 3 3 ) , w a
s u s e d f o rc o m p l e m e n t a t i o n e x p e r i m e n t s
. E . c o l i N P 3 1 5 ( F d a - ) w a sg r o w n i n M9 m e d i u
m ( 2 7 ) s u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 4 % g l u c o s e ,0
. 0 1 M M g S O 4 , a n d 0 . 2 % ( N H 4 ) 2 S O 4 a t 3 0 C . G r
o w t h onc a r b o h y d r a t e s i s i n h i b i t e d a t i n c
r e a s e d t e m p e r a t u r e s b e c a u s eo f t h e a c c u
m u l a t i o n o f h i g h i n t r a c e l l u l a r l e v e l s o
f F B P . Whent h e p l a s m i d p B l u e s c r i p t I l - f d a
l O , c o n t a i n i n g t h e 5 . 2 - k b P s t If r a g m e n t
( F i g . 1 B ) , w a s t r a n s f o r m e d i n t o E . c o l i N
P 3 1 5( F d a - ) , t h e m u t a n t w a s a b l e t o g r o w a
t 4 0 C i n M 9 - s a l tm e d i u m w i t h g l u c o s e . E . c
o l i N P 3 1 5 ( F d a - ) , c o n t a i n i n g t h ep l a s m i
d p B l u e s c r i p t l I K S + , w a s n o t a b l e t o g r o w
u n d e r t h e s ec o n d i t i o n s . T h i s r e s u l t i n d
i c a t e s t h a t t h e c l a s s I a l d o l a s e g e n eo f S
. c a r n o s u s w a s e x p r e s s e d i n E . c o l i a n d c o
m p l e m e n t e d t h ec l a s s I I m u t a n t .E x p r e s s i
o n o f f d a i n S . c a r n o s u s T M 3 0 0 . T h e 1 . 9 - k b
E c o R V -X b a I f r a g m e n t ( F i g . 1 B ) w a s l i g a t
e d t o t h e s h u t t l e v e c t o rp R B 4 7 3 , a c h l o r a
m p h e n i c o l - r e s i s t a n t d e r i v a t i v e o f p R B
3 7 3( 6 ) , a n d t r a n s f o r m e d i n t o E . c o l i SURE.
E . c o l i SURE w a sg r o w n i n LB b r o t h ( 1 0 g o f B a c
t o T r y p t o n e [ D i f c o ] , 5 g o f y e a s te x t r a c t
, a n d 5 g o f N a C l p e r l i t e r ) a n d t r a n s f o r m e
d b y t h em e t h o d o f H a n a h a n ( 1 4 ) . T h e r e s u l
t i n g p l a s m i d , p R B 4 7 3 f d a 2 O ,w a s i s o l a t e
d f r o m E . c o l i a n d t r a n s f o r m e d i n t o S . c a r
n o s u sTM300 b y p r o t o p l a s t t r a n s f o r m a t i o n
( 1 3 ) . A d i r e c t t r a n s f o r -m a t i o n o f t h e l i
g a t i o n p r o d u c t i n t o S . c a r n o s u s w a s u n s u
c c e s s -f u l . S . c a r n o s u s a n d S . c a r n o s u s (
p R B 4 7 3 f d a 2 O ) w e r e c u l t i v a t e di n B b r o t h
( 1 0 g o f c a s e i n h y d r o l y s a t e 1 4 0 [ G I B C O ] ,
5 g o fy e a s t e x t r a c t [ D i f c o ] , 5 g o f N a C l , 1
g o f g l u c o s e , a n d 1 g o fK 2 H P O 4 p e r l i t e r [ p
H 7 . 3 ] ) . A t t h e i n d i c a t e d t i m e s c e l l e x t r
a c t sw e r e p r e p a r e d a n d a n a l y z e d f o r s p e c
i f i c a l d o l a s e a c t i v i t y ( F i g .4 A ) a n d b y s
o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e
g e l e l e c t r o -p h o r e s i s ( S D S - P A G E ) ( 1 9 ) (
F i g . 4 B ) . S . c a r n o s u s TM300 a n dS . c a r n o s u s
T M 3 0 0 ( p R B 4 7 3 f d a 2 O ) w e r e h a r v e s t e d a t t
h e sameo p t i c a l d e n s i t y a f t e r 4 t o 8 h o f g r o w
t h , a n d a l d o l a s e a c t i v i t y ( i nu n i t s p e r m
i l l i g r a m o f p r o t e i n ) was m e a s u r e d a t 2 5 C b
y ac o u p l e d a s s a y i n s t a n d a r d b u f f e r c o n t
a i n i n g g l y c e r o l - 3 - p h o s -
p h a t e d e h y d r o g e n a s e a n d t r i o s e p h o s p
h a t e i s o m e r a s e a s d e -s c r i b e d b y t h e m a n u
f a c t u r e r ( S i g m a ) .S . c a r n o s u s ( p R B 4 7 3 f
d a 2 O ) h a d a n a l d o l a s e a c t i v i t y s i x - t oe i
g h t f o l d h i g h e r t h a n t h a t o f t h e w i l d t y p e
. T h i s o b s e r v a t i o n i sc o r r o b o r a t e d b y S D
S - P A G E , i n w h i c h a h i g h e r p r o t e i n c o n -c e
n t r a t i o n w a s v i s i b l e a t t h e e x p e c t e d s i z
e o f 3 3 kDa w i t h S .c a r n o s u s T M 3 0 0 ( p R B 4 7 3 f
d a 2 O ) . T h e s p e c i f i c a l d o l a s e a c t i v i t yw
a s n e a r l y c o n s t a n t d u r i n g t h e c o u r s e o f e
x p o n e n t i a l g r o w t h( F i g . 4 A ) .I t w a s s u s p e
c t e d t h a t t h e g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n i n t
h eg r o w t h m e d i u m i n f l u e n c e d a l d o l a s e p r
o d u c t i o n . S . c a r n o s u sa n d S . c a r n o s u s ( p
R B 4 7 3 f d a 2 O ) w e r e t h e r e f o r e a e r o b i c a l l
yg r o w n i n B b r o t h ( w i t h o u t g l u c o s e ) s u p p
l e m e n t e d w i t h 0 . 0 , 0 . 1 ,0 . 4 , 1 , o r 4% g l u c o
s e . A f t e r 6 h , c e l l e x t r a c t s w e r e a s s a y e d
f o rs p e c i f i c a l d o l a s e a c t i v i t y . I n t h e p
r e s e n c e o f 0 . 4 % g l u c o s e , t h es p e c i f i c a l
d o l a s e a c t i v i t y was n e a r l y t w o f o l d h i g h e
r t h a n i n t h ea b s e n c e o f g l u c o s e . W i t h h i g
h e r g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s t h es p e c i f i
c a l d o l a s e a c t i v i t y w a s d e c r e a s e d . A n a e
r o b i c g r o w t hc o n d i t i o n s h a d n o s i g n i f i c
a n t i n f l u e n c e on s p e c i f i c a l d o l a s ea c t i v
i t y i n b o t h t h e w i l d t y p e a n d S . c a r n o s u s (
p R B 4 7 3 f d a 2 O ) .N u c l e o t i d e s e q u e n c e a c c
e s s i o n n u m b e r . T h e s e q u e n c e o f f d ah a s b e
e n s u b m i t t e d t o t h e GenBank d a t a b a s e a n d a s s
i g n e da c c e s s i o n n u m b e r X 7 1 7 2 9 .W e t h a n k M
. R . K u l a a n d H . P . B r o c k a m p ( I n s t i t u t f u r
E n z y m t e c h -n o l o g i e d e r U n i v e r s i t a t D u s
s e l d o r f , F o r s c h u n g s z e n t r u m J u l i c h ) f o
r t h eN - t e r m i n a l a l d o l a s e s e q u e n c e i n f o
r m a t i o n , K a r e n A . B r u n e f o r c r i t i -c a l l y
r e a d i n g t h e m a n u s c r i p t , a n d A r i e l l e F e r
r a n d o n , V e r a A u g s -b u r g e r , a n d E l i s a b e t
h K n o r p p f o r e x p e r t t e c h n i c a l a s s i s t a n c
e .T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m
t h e D e u t s c h e F o r s c h u n g s -g e m e i n s c h a f t
( S F B 3 2 3 ) .
REFERENCES1 . A l e f o u n d e r , P . R . , S . A . B a l d w
i n , R N . P e r h a m , a n d N . J . S h o r t .1 9 8 9 . C l o
n i n g , s e q u e n c e a n a l y s i s a n d o v e r - e x p r e
s s i o n o f t h e g e n ef o r c l a s s I I f r u c t o s e - 1
, 6 - b i s p h o s p h a t e a l d o l a s e o f E s c h e r i c h
i a c o l i .B i o c h e m . J . 2 5 7 : 5 2 9 - 5 3 4 .2 . B e d n
a r s k i , M. D . , E . S . S i m o n , N . B i s c h o f b e r g
e r , W. D . F e s s n e r ,M. J . K i m , W . L e e s , T. S a i t
o , H . W a l d m a n n , a n d G . M. W h i t e -s i d e s . 1 9 8
9 . R a b b i t m u s c l e a l d o l a s e a s a c a t a l y s t i
n o r g a n i cs y n t h e s i s . J . Am . C h e m . S o c . 1 1 1
: 6 2 7 - 6 3 5 .3 . B r e n n e r - H o l z a c h , O . , a n d C
. Z u m s t e g . 1 9 8 2 . F r u c t o s e 1 , 6 - b i s p h o s
-p h a t e a l d o l a s e o f D r o s o p h i l a m e l a n o g a
s t e r : c o m p a r a t i v e s e q u e n c ea n a l y s e s a r
o u n d t h e s u b s t r a t e - b i n d i n g l y s y l r e s i d
u e . A r c h . B i o -c h e m . B i o p h y s . 2 1 4 : 8 9 - 1 0
1 .3 a . B r o c k a m p , H . P . P e r s o n a l c o m m u n i c
a t i o n .4 . B r o c k a m p , H . P . , a n d M. R . K u l a . 1
9 9 0 . S t a p h y l o c o c c u s c a r n o s u sa l d o l a s e
a s c a t a l y s t f o r e n z y m a t i c a l d o l r e a c t i o
n s . T e t r a h e d r o nL e t t . 3 1 : 7 1 2 3 - 7 1 2 6 .5 . B
r o c k a m p , H . P . , a n d M. R . K u l a . 1 9 9 0 . P u r i
f i c a t i o n a n d c h a r a c -t e r i z a t i o n o f a c l a
s s I f r u c t o s e 1 , 6 - b i s p h o s p h a t e a l d o l a s
e f r o mS t a p h y l o c o c c u s c a r n o s u s . A p p l . M
i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . 3 4 : 2 8 7 - 2 9 1 .6 . B
r u c k n e r , R . 1 9 9 2 . A s e r i e s o f n e w s h u t t l e
v e c t o r s f o r B a c i l l u ss u b t i l i s a n d E . c o l
i . G e n e 1 2 2 : 1 8 7 - 1 9 2 .7 . C h e n , E . J . , a n d P
. H . S e e b u r g . 1 9 8 5 . S u p e r c o i l s e q u e n c i n
g : a f a s ta n d s i m p l e m e t h o d f o r s e q u e n c i n
g p l a s m i d DNA. DNA 4 : 1 6 5 -1 7 0 .8 . C h i r g w i n , J
. M . , A . E . P r z y b y l a , R J . M a c D o n a l d , a n d J
. W.R u t t e r . 1 9 7 9 . I s o l a t i o n o f b i o l o g i c a
l l y a c t i v e r i b o n u c l e i c a c i d f r o m
s o u r c e s e n r i c h e d i n r i b o n u c l e a s e . B i
o c h e m i s t r y 2 4 : 5 2 9 4 - 5 2 9 9 .9 . F i s c h e r , S
. , a n d A . T s u g i t a . 1 9 8 2 . A m i n o a c i d s e q u e
n c e a r o u n d t h ea c t i v e s i t e o f t w o c l a s s I f
r u c t o s e - 1 , 6 - b i s p h o s p h a t e a l d o l a s e s f
r o ms t a p h y l o c o c c i . 1 2 8 : 3 4 3 - 3 4 8 .1 0 . G d t
z , F . 1 9 9 0 . S t a p h y l o c o c c u s c a r n o s u s : a
new h o s t o r g a n i s m f o rg e n e c l o n i n g a n d p r o
t e i n p r o d u c t i o n . J . A p p l . B a c t e r i o l . S y
m p .S u p p l . 6 9 : 4 9 - 5 3 .1 1 . G o t z , F . , S . F i s c
h e r , a n d K . H . S c h l e i f e r . 1 9 8 0 . P u r i f i c a
t i o n a n dc h a r a c t e r i s a t i o n o f a n u n u s u a l
l y h e a t - s t a b l e a n d a c i d / b a s e - s t a b l ec l
a s s I f r u c t o s e - 1 , 6 - b i s p h o s p h a t e a l d o l
a s e f r o m S t a p h y l o c o c c u sa u r e u s . E u r . J .
B i o c h e m . 1 0 8 : 2 9 5 - 3 0 1 .
J . B A C T E R I O L .
-
8/14/2019 Cloning, Sequencing, And Characterization of the Gene
Encoding
5/5
NOTES 7 4 9 91 2 . G o t z , F . , E . N u r n b e r g e r , a n
d K . H . S c h l e i f e r . 1 9 7 9 . D i s t r i b u t i o n o
fc l a s s - I a n d c l a s s - I I D - f r u c t o s e - 1 , 6 -
b i s p h o s p h a t e a l d o l a s e s i n v a r i -o u s s t a
p h y l o c o c c i , p e p t o c o c c i a n d m i c r o c o c c i
. FEMS M i c r o b i o l .L e t t . 5 : 2 5 3 - 2 5 7 .1 3 . G o t
z , F . , a n d B . S c h u m a c h e r . 1 9 8 7 . I m p r o v e m
e n t s o f p r o t o p l a s tt r a n s f o r m a t i o n i n S t
a p h y l o c o c c u s c a r n o s u s . FEMS M i c r o b i o l .
L e t t .4 0 : 2 8 5 - 2 8 8 .1 4 . H a n a h a n , D . 1 9 8 3 . S
t u d i e s o n t r an s fo r ma t i o n o f E . c o l i w i t
h
p l a s m i d s . J . M o l . B i o l . 1 6 6 : 5 5 7 .1 5 . H a
r r i s , C . E . , R . D . K o b e s , D . C . T e l l e r , a n d
W. J . R u t t e r . 1 9 6 9 .T h e m o l e c u l a r c h a r a c t
e r i s t i c s o f y e a s t a l d o l a s e . B i o c h e m i s t
r y8 : 2 4 4 2 - 2 4 5 4 .1 6 . H o r e c k e r , B . L . , 0 . T s
o l a s , a n d C . Y . L a i . 1 9 7 2 . A l d o l a s e s .E n z
y m e s 7 : 2 1 3 - 2 5 8 .1 7 . I z z o , P . , P . C o s t a n z
o , A . L u p o , E . R i p p a , A . M. B o r g h e s e , G .P a o
l e l l a , a n d F . S a l v a t o r e . 1 9 8 7 . A new h u m a n
s p e c i e s o f a l d o l a s eA mRNA f r o m f i b r o b l a s t
s . E u r . J . B i o c h e m . 1 6 4 : 9 - 1 3 .1 8 . K e l l e y
, P . M . , a n d D . R . T o l a n . 1 9 8 6 . T h e c o m p l e t
e a m i n o a c i ds e q u e n c e f o r t h e a n a e r o b i c a
l l y i n d u c e d a l d o l a s e f r o m m a i z ed e r i v e d
f r o m cDNA c l o n e s . P l a n t P h y s i o l . 8 2 : 1 0 7 6
- 1 0 8 0 .1 8 a . K u l a , M. R . , a n d H . P . B r o c k a m p
. P e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n .1 9 . L a e m m l i ,
U . K . 1 9 7 0 . C l e a v a g e o f s t r u c t u r a l p r o t e
i n s d u r i n g t h ea s s e m b l y o f t h e h e a d o f b a c
t e r i o p h a g e T 4 . N a t u r e ( L o n d o n )2 2 7 : 6 8 0
- 6 8 5 .2 0 . L e b h e r z , H . G . , a n d W. J . R u t t e r .
1 9 7 3 . A c l a s s I ( S c h i f f b a s e )f r u c t o s e d i
p h o s p h a t e a l d o l a s e o f p r o k a r y o t i c o r i g
i n . J . B i o l . C h e m .2 4 8 : 1 6 5 0 - 1 6 5 9 .2 1 . L o n
d o n , J . , a n d K . K l i n e . 1 9 7 3 . A l d o l a s e o f l
a c t i c a c i d b a c t e r i a : ac a s e h i s t o r y i n t h
e u s e o f a n e n z y m e a s a n e v o l u t i o n a r y m a r k
e r .B a c t e r i o l . R e v. 3 7 :4 5 3- 47 8 .2 2 . N o v i c k
, R . P . , a n d D . B o u a n c h a u d . 1 9 7 1 . E x t r a c h
r o m o s o m a ln at u r e o f d r u g r e s i s t a n c e i n S t
a p h y l o c o c c u s a u r e u s . A n n . N . Y .A c a d . S c
i . 1 8 2 : 2 7 9 - 2 9 4 .2 3 . P a t i l , R . V . , a n d E . E
. D e k k e r . 1 9 9 2 . C l o n i n g , n u c l e o t i d e s e q
u e n c e ,o v e r e x p r e s s i o n , a n d i n a c t i v a t i
o n o f t h e E s c h e r i c h i a c o l i 2 - k e t o - 4 -h y d
r o x y g l u t a r a t e a l d o l a s e g e n e . J . B a c t e r
i o l . 1 7 4 : 1 0 2 - 1 0 7 .2 4 . R o t t m a n n , W. H . , K .
R . D e s e l m s , J . N i c l a s , T . C a m e r a t o , P . S
.H o l m a n , C . J . G r e e n , a n d D . R . T o l a n . 1 9 8
7 . T h e c o m p l e t e a m i n oa c i d s e q u e n c e o f t h
e h u m a n a l d o l a s e C i s o z y m e d e r i v e d f r o
m
g e n o m i c c l o n e s . B i o c h i m i e 6 9 : 1 3 7 - 1 4
5 .2 5 . R u d o l p h , R . , R . S i e b e n d r i t t , a n d T
. K i e f h a b e r . 1 9 9 2 . R e v e r s i b l eu n f o l d i n
g a n d r e f o l d i n g b e h a v i o u r o f a m o n o m e r i c
a l d o l a s e f r o mS t a p h y l o c o c c u s a u r e u s . P
r o t e i n S c i . 1 : 6 5 4 - 6 6 6 .2 6 . S a k a k i b a r a ,
M . , T . M u k a i , H . Y a t s u k i , a n d K . H o r i . 1 9 8
5 . Humana l d o l a s e i s o z y m e g e n e : t h e s t r u c t
u r e o f m u l t i s p e c i e s a l d o l a s e BmRNAs. N u c l e
i c A c i d s R es . 1 3 : 5 05 5 -5 0 6 9 .2 7 . S a m b r o o k ,
J . , E . F . F r i t s c h , a n d T . M a n i a t i s . 1 9 8 9 .
M o l e c u l a rc l o n i n g : a l a b o r a t o r y m a n u a l
, 2 n d e d . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o -r a t o r y
, C o l d S p r i n g H a r b o r , N . Y .2 8 . S a n g e r , F .
, S . N i c k l e n , a n d A . R . C o u l s o n . 1 9 7 7 . DNA s
e q u e n c i n gw i t h c h a i n - t e r m i n a t i n g i n h i
b i t o r s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA7 4 : 5 4 6
3 - 5 4 6 7 .2 9 . S c h l e i f e r , K H . , a n d U . F i s c h
e r . 1 9 8 2 . D e s c r i p t i o n o f a new s p e c i e so f t
h e g e n u s S t a p h y l o c o c c u s : S t a p h y l o c o c c
u s c a r n o s u s . I n t . J . S y s t .B a c t e r i o l . 3 2
: 1 5 3 - 1 5 6 .3 0 . S c h r e y e r , R . , a n d A . B o c k .
1 9 7 3 . P h e n o t y p i c s u p p r e s s i o n o f af r u c t
o s e - 1 , 6 - d i p h o s p h a t e a l d o l a s e m u t a t i o
n i n E s c h e r i c h i a c o l i . J .B a c t e r i o l . 1 1 5
: 2 6 8 - 2 7 6 .3 1 . S i z e m o r e , C . , E . B u c h n e r ,
T . R y g u s , C . W i t k e , F . G o t z , a n d W.H i l l e n .
1 9 9 1 . O r g a n i z a t i o n , p r o m o t e r a n a l y s i s
a n d t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n o f t h e S
t a p h y l o c o c c u s x y l o s u s x y l o s e u t i l i z a t
i o n o p e r o n .M o l . G e n . G e n e t . 2 2 7 : 3 7 7 - 3 8
4 .3 2 . S o u t h e r n , E . M. 1 9 7 5 . D e t e c t i o n o f s
p e c i f i c s e q u e n c e s amongDNA f r a g m e n t s s e p a
r a t e d b y g e l e l e c t r o p h o r e s i s . J . M o l . B i
o l .9 8 : 5 0 3 .3 3 . S t r i b l i n g , D . , a n d R N . P e r
h a m . 1 9 7 3 . P u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r
-i z a t i o n o f t w o f r u c t o s e d i p h o s p h a t e a l
d o l a s e s f r o m E s c h e r i c h i a c o l i( C r o o k e s
' s t r a i n ) . B i o c h e m . J . 1 3 1 : 8 3 3 - 8 4 1 .3 4 .
T i n o k o , I . , J r . , P . N . B o r e r , B . D e n g l e r ,
a n d M. D . L e v i n e . 1 9 7 3 .I m p r o v e d e s t i m a t i
o n o f s e c o n d a r y s t r u c t u r e i n r i b o n u c l e i
c a c i d s .N a t u r e ( L o n d o n ) 2 4 6 : 4 0 - 4 1 .3 5 . W
o n g , C . H . , a n d G . M. W h i t e s i d e s . 1 9 8 3 . S y
n t h e s i s o f s u g a r s b ya l d o l a s e - c a t a l y s e
d c o n d e n s a t i o n r e a c t i o n s . J . O r g . C h e m .
4 8 : 3 1 9 9 -3 2 0 5 .3 6 . Z i e g l e r , T . , A . S t r a u b
, a n d F . E f f e n b e r g e r . 1 9 8 8 . E n z y m - k a t a l
y s i -e r t e S y n t h e s e v o n 1 - D e s o x y n o j i r i m
y c i n , 1 - D e s o x y n o j i r i m y c i n u n d1 , 4 - D i d
e s o x y - 1 , 4 - i m i n o - D - a r a b i n i t o l . A n g e w
. C h e m . 1 0 0 : 7 3 7 - 7 3 8 .
V O L . 1 7 5 , 1 9 9 3
