Colorao de Loeffler : a) Com uma lmina limpa e flambada, prepara-se o esfregao; b) Deixar secar ao ar; c) Cobrir o esfregao com o corante azul de metileno alcalino de Loeffler, por 60 segundos; d) Lavar com gua corrente, secar ao ar novamente e observar. Colorao com Safranina : a) Preparar o esfregao e secar ao ar; b) Cobrir com soluo alcolica de Safranina 2%; c) Lavar com gua corrente, em abundncia; d) Secar ao ar e observar. As clulas estaro coloridas de vermelho. Colorao negativa com tinta nanquim : a) Colocar uma gota de tinta nanquim em uma lmina limpa; b) Misturar gota, uma pequena poro da colnia bacteriana; c) Preparar o esfregao pelo uso de duas lminas; d) Secar ao ar e observar. As clulas bacterianas brancas iro contrastar com um fundo marrom-escuro ou negro. Mtodo de Benians : Tambm um mtodo de colorao negativa. a) Colocar no centro da lmina, uma gota da soluo A de Benians; b) Adicionar esta gota, uma gota da suspenso bacteriana ou do macerado de tecido vegetal, homogeneizando bem; c) Preparar o esfregao deixando secar ao ar; d) Com o auxlio de um conta-gotas, molhar o esfregao com a soluo B de Benians. O esfregao ir adquirir colorao azulada; e) Deixar secar ao ar e observar. As clulas bacterianas sero observadas como bastonetes brancos em um fundo azul celeste.

Uso do corante de Maneval : a) Deposite uma gota de Vermelho do Congo 1%, numa lmina; b) Transfira um fragmento da colnia bacteriana desenvolvida em meio slido para a gota; c) Cubra o esfregao com soluo de Maneval por 2 minutos; d) Retire o excesso de corante e lave cuidadosamente com um filete d'gua; e) Seque ao ar; f) Fazer a observao. As clulas colorem-se de vermelho, o fundo de azul e a cpsula ficar incolor. Mtodo de Hiss : a) Prepare o esfregao misturando na lmina uma gota de soro sangneo e um fragmento da colnia bacteriana obtido de cultura de meio slido; b) Secar ao ar e fixar rapidamente pelo calor; c) Cobrir o esfregao com Cristal Violeta 0,1% e aquecer a lmina at a formao de vapor; d) Lavar o excesso de corante com soluo de CuSO4 . 5 H2O a 20%;

e) Secar cuidadosamente com papel de filtro; f) Terminar de secar ao ar e observar com objetiva de imerso; A clula bacteriana ser observada com colorao azul-escura e a cpsula com colorao azul-clara.

Mtodo de Blenden & Goldberg : a) Cubra o esfregao com soluo mordente por 2 a 4 minutos e lave com gua corrente; b) Adicione o reagente de prata amoniacal (pH = 10) por 30 segundos e lave imediatamente em gua corrente; c) Seque ao ar e faa a observao em microscpio. Tanto as clulas bacterianas, quanto os flagelos se apresentaro com colorao marromescura ou negra. Mtodo de Leifson : a) Prepare o esfregao, de culturas com 24 a 48 horas de incubao, pela tcnica de difuso; b) Cubra o esfregao com o corante por 10 minutos; c) Lave cuidadosamente com gua de torneira; d) Cubra o esfregao com o corante de contraste, por 5-10 minutos; e) Lave a lmina com gua de torneira, deixe secar ao ar e faa a observao.

Mtodo de Dorner : a) Prepare o esfregao por espalhamento e fixe rapidamente pelo calor; b) Recorte um retngulo de papel de filtro exatamente do tamanho da lmina, cobrindo-a; c) Embeba o papel com soluo de fucsina carblica; d) Aquea a lmina, mantendo-a suspensa sobre a chama ou sobre uma chapa quente, mantendo-a por 5-10 minutos aps haver desprendimento de vapor, adicionando mais fucsina sempre que necessrio; e) Remova o papel de filtro e faa a descolorao do esfregao com lcool cido por 1 minuto; f) Seque o esfregao, cuidadosamente com papel de filtro e depois ao ar; g) Cubra o esfregao com soluo de nigrosina e seque ao ar; h) Observe ao microscpio. As clulas vegetativas estaro incolores, j os endsporos se apresentaro vermelhos contrastando com o fundo negro na lmina. Mtodo de Schaeffer-Fulton : a) Prepare por espalhamento o esfregao a partir de uma colnia bacteriana, desenvolvida em meio slido, com 4 a 10 dias de idade; b) Cubra o esfregao com verde de malaquita 5%, por 10 minutos; c) Lave com abundncia em gua de torneira; d) Seque ao ar; e) Faa o contraste com safranina 0,5% por 15 segundos; f) Lave novamente e seque ao ar; g) Observe ao microscpio. As clulas estaro coloridas de vermelho e os esporos de verde.

Colorao de Gram : utilizada para diferenciar bactrias Gram-positivas e Gram-negativas. a) Prepara-se o esfregao de uma cultura de 24-48 horas de idade; b) Cobre-se o esfregao com soluo de Cristal-Violeta por 1 minuto; c) Lava-se rapidamente com gua; d) Cobre-se o esfregao com Lugol por 1 minuto, lavando em seguida com gua corrente; e) Faz-se a descolorao com lcool Etlico absoluto por 30 segundos; f) Lava-se com gua corrente; g) Colorir com Safranina e lavar com gua; h) Secar ao ar e observar As bactrias Gram-positivas sero visualizadas com colorao prpura ou azul-escuro, j as Gram-negativas sero coradas pela Safranina, com colorao rsea-clara.

Bactria Gram-positiva

Bactria Gram-negativa

Acmulo de Poli - b - hidroxi - butirato (PbHB) : utilizado para verificar se a bactria acumula grnulos de PbHB. Para este teste a colnia bacteriana dever se desenvolver em meio Sacarose - Peptona - Agar. a) Prepare um esfregao homogneo e delgado, por espalhamento, a partir de uma cultura desenvolvida em meio slido; b) Colocar nas duas extremidades da lmina esfregaos de bactrias sabidamente com resultado positivo e negativo; c) Secar ao ar, fixar pelo calor, passando rapidamente o verso da lmina pela chama de uma lamparina; d) Cobrir o esfregao com gotas da soluo de Sudan Black B, por 15 minutos; e) Escorrer o excesso de corante e secar ao ar; f) Descolorir com gua e secar novamente ao ar. Nesta fase o esfregao controle negativo dever descolorir totalmente e o positivo manter a cor escura; g) Contrastar com Safranina (soluo aquosa a 0,5%), por 5 - 10 segundos; h) Lavar novamente, secar ao ar e observar. As incluses lipdicas se colorem de azul-escuro ou azul-acinzentado, nos plos da clula bacteriana. O restante da clula se colore de rosa-claro.

Soluo Cristal Violeta/Oxalato de Amnio : Soluo A : Cristal Violeta - 2,0 g lcool Etlico 95% - 20 ml Soluo B : Oxalato de Amnio - 0,8 g gua destilada - 80 ml Aps o preparo, misturar as duas solues.

Lugol : Iodo - 1,0 g Iodeto de Potssio - 2,0 g H2O destilada - 300 ml Dissolver o iodeto em um pouco de gua, adicionar o iodo e completar o volume. Acondicionar em frasco mbar, ao abrigo da luz.

Soluo de Safranina ou Fucsina : Safranina ou Fucsina em soluo alcolica 2,5% - 10 ml gua destilada - 90 ml

Soluo de Sudan Black B : Sudan Black B - 0,30 g Etanol 70% - 100 ml

Azul de Metileno Alcalino de Loeffler : Soluo A : Azul de Metileno - 0,3 g lcool Etlico 95% - 30 ml Soluo B : KOH - 0,01 g H2O destilada - 100 ml Aps o preparo, misturar as duas solues.

Soluo de Benians : Soluo A : Vermelho do Congo - 2 g HgCl2 - 0,1 g H2O destilada - 100 ml Soluo B : lcool Etlico - 95 ml HCl concentrado - 5 ml Usar as solues separadamente no momento do uso. No misturar !

Soluo de Vermelho do Congo : Vermelho do Congo - 1,0 g H2O destilada - 100 ml

Soluo de Maneval : Fenol 5% - 30 ml cido Actico Glacial 20% - 10 ml FeCl3 30% - 4 ml Fucsina cida 1% - 2 ml

Reagente de Prata Amoniacal: Preparar 100 ml do AgNO3 2 %, separando 10 ml para uso posterior. Adicionar aos 90 ml de AgNO3 2%, aos poucos, uma soluo de NH4OH, at que se verifique a formao de um precipitado ntido. Continuar adicionando o NH 4OH at que se observe a dissoluo do precipitado. Adicionar lentamente AgNO3 2% at aparecer uma leve turbidez. Ajustar o pH para 10 com NH4OH ou AgNO3. O reagente deve ser usado imediatamente aps o preparo, no durando mais de 4 horas.

Para o mtodo de Leifson : Soluo I : NaCl - 1,5 g H2O destilada - 100 ml Soluo II : cido Tnico - 6 g H2O destilada - 100 ml Soluo III : Fucsina Bsica - 1,2 g lcool Etlico 95% - 100 ml Soluo IV (corante de contraste): Azul de Metileno - 1,0 g H2O destilada - 100 ml Para o preparo do corante, misturar partes iguais das solues I, II e III no momento do uso e filtrar a mistura.

Soluo de Fucsina Carblica : Fucsina Bsica - 0,3 g Etanol - 10 ml Fenol (cristais aquecidos) - 5 ml H2O destilada - 95 ml

Soluo de Nigrosina : Preparar uma soluo aquosa de Nigrosina 10%, em H 2O destilada. Imergir um tubo com a soluo em gua fervendo por 30 minutos. Aps esfriar, acrescentar 0,5 ml de formalina para cada 100 ml da soluo e filtrar.