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3

COMISIÓN DIRECTIVA DE LA SBBM

Presidente Estela Castillo castillo@fcien.edu.uy

Secretaria Andrea Medeiros amedeiro@fmed.edu.uy

Tesorero José Manuel Verdes jmverdes@fvet.edu.uy

Vocales

Miriam Barros mbarros@fq.edu.uy

Patricia Berasain pberasai@higiene.edu.uy

Uruguaysito Benavides ubenavides@fvet.edu.uy

Martin Breijo mbreijo@fmed.edu.uy

Laura Castro lcastro@fmed.edu.uy

Álvaro Díaz adiaz@fq.edu.uy

Gustavo Folle folle@iibce.edu.uy

Gabriela Irazoqui mgidrv@fq.edu.uy

Pilar Irisarri irisarri@fagro.edu.uy

Alejandra Kun kun@iibce.edu.uy

Silvia Olivera bravos@iibce.edu.uy

Pablo Opezzo poppezzo@pasteur.edu.uy

German Pérez gerrez@gmail.com

Analía Richeri aricheri@iibce.edu.uy

Andrés Trostchansky trocha@fmed.edu.uy

COMISIÓN ORGANIZADORA DE LAS 6as JORNADAS

Presidenta E. Castillo

Secretaria A. Medeiros

Tesorero J. Verdes

Vocales M. Barros, P. Berasain, L. Castro, A. Díaz, G. Irazoqui, A. Kun,

S. Olivera, G. Perez, A. Richeri, A. Trostchansky

Apoyo Secretaria M. Bresque

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PROGRAMA COMPLETO 6as JORNADAS SBBM

RESUMEN

PROGRAMA DESGLOSADO

LUNES 9 DE NOVIEMBRE DE 2009

08:45 – 09:35: ACREDITACIONES

09:35 – 09:45: APERTURA DE LAS JORNADAS

09:45- 10:35: CONFERENCIA I. Salón de Actos-Facultad de Ciencias

BRAIN MITOCHONDRIAL BIOENERGETICS DISRUPTION IN INHERITED DISORDERS OF INTERMEDIARY METABOLISM: INSIGHTS FROM ANIMAL AND HUMAN STUDIES. Dr. Moacir Wajner (UFRGS, Brasil).

10:45- 12:45 SIMPOSIOS I, II Y III

SIMPOSIO I: ESTRUCTURA Y DINÁMICA DE MACROMOLÉCULAS.

Moderadores: A. Buschiazzo; S. Pantano

Salón de Seminarios I –Facultad de Ciencias SIMPOSIO II: PARASITOLOGIA MOLECULAR. Moderadores: C. Fernández; M. Comini

Horario Lunes 9 Horario Martes 10

8:45 a 9:35 Acreditaciones 9:00 a 11 Simposios VII, VIII y IX

9:35 a 9:45 Apertura de las Jornadas 11:00 a 11:30 Pausa Café

9:45 a 10:35 Conferencia 1: Dr. Moacir Wajner 11:30 a 12:30 P. orales 1, 2, 3 y 4

10:45 a 12:45 Simposios I, II y III 12:30 a 13:30 Tiempo libre

12:45 a 13:45 Tiempo libre 13:30 a 15:30 Posters II

13:45 a 15:45 Posters I 15:30 a 17:30 Simposios X, XI y XII

15:45 a 18:15 Simposios IV, V y VI 17:30 a 18:00 Pausa Café

18:15 a 18:45 Pausa Café 18:00 a 18:45 P. orales 5, 6 y 7

18:45 a 19:35 Conferencia 2: Dr. Rodney Colina 18:45 a 19:35 Conferencia 3: Dr. Jean Bénard

19:35 Cierre y Entrega de Premios

19:45 Brindis

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Salón de Actos -Instituto Pasteur SIMPOSIO III: BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE MICROORGANISMOS. Moderadores: P. Zunino; P. Aguilar; J. Cristina Salón de Actos –Facultad de Ciencias 12:45- 13:45 ALMUERZO 13:45- 15:45 SESIÓN DE POSTERS 1 15:45- 18:15 SIMPOSIOS IV, V Y VI SIMPOSIO IV: PEQUEÑOS RNA REGULADORES EN BIOLOGÍA. Moderadores: A. Cayota; J. Tort Salón de Actos –Instituto Pasteur

SIMPOSIO V: FUNCIONALIDAD DE PROTEÍNAS Moderadores: A. Denicola – O. Pristch Salón de Actos –Facultad de Ciencias SIMPOSIO VI: NEUROBIOLOGÍA Moderadores: J.R. Sotelo – S .Olivera Salón de Seminarios I–Facultad de Ciencias 18:15- 18:45 PAUSA CAFÉ 18:45- 19:35 CONFERENCIA II. Salón de Actos-Facultad de Ciencias: REGULACION TRADUCCIONAL DE LA RESPUESTA INMUNE INNATA. Dr. Rodney Colina (FCiencias-UdelaR).

MARTES 10 DE NOVIEMBRE DE 2009 09:00- 11:00 SIMPOSIOS VII, VIII Y IX SIMPOSIO VII: BIOTECNOLOGÍA 1. Moderadores: L. Franco Fraguas; M. Marín Salón de Actos –Instituto Pasteur SIMPOSIO VIII: INMUNOLOGÍA. Moderadores: A. Díaz; P. Oppezzo Salón de Actos –Facultad de Ciencias SIMPOSIO IX: BIOLOGÍA VEGETAL. Moderadores: S. Vidal; O. Borsani Salón de Seminarios I –Facultad de Ciencias 11:00- 11:30 PAUSA CAFÉ

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11:30- 12:30 PRESENTACIONES ORALES SELECCIONADAS

Moderadores: Estela Castillo y Andrea Medeiros. Salón de actos-Facultad de Ciencias 12:30- 13:30 ALMUERZO 13:30- 15:30 SESIÓN DE POSTERS 2 15:30- 17:30 SIMPOSIOS X, XI Y XII SIMPOSIO X: BIOTECNOLOGÍA 2 Moderadores: G. Grompone; P. Esperón Salón de Actos –Instituto Pasteur SIMPOSIO XI: RADICALES LIBRES Moderadores: Thomson L.; Souza J.M. Salón de Actos –Facultad de Ciencias SIMPOSIO XII: MICROSCOPIA: UNA VENTANA AL MICROMUNDO Moderadores: Radmilovich M.; Negreira C. Salón de Seminarios I–Facultad de Ciencias 17:30- 18:00 PAUSA CAFÉ 18:00- 18:45 PRESENTACIONES ORALES SELECCIONADAS Moderadores: Laura Castro y José Manuel Verdes. Salón de actos-Facultad de Ciencias 18:45- 19:35 CONFERENCIA III. Salón de Actos-Facultad de Ciencias: IMPACT OF TUMOR GENETICS IN THE CLINICAL MANAGEMENT OF NEUROBLASTOMA. Dr. Jean Bénard 19:35 CIERRE Y ENTREGA DE PREMIOS 19:45 BRINDIS

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SIMPOSIOS

LUNES 09-11-09

SIMPOSIO I: ESTRUCTURA Y DINÁMICA DE MACROMOLÉCULAS.

Moderadores: A. Buschiazzo; S. Pantano

Salón de Seminarios I –Facultad de Ciencias

ESTUDIOS ESTRUCTURALES Y FUNCIONALES DE UNA PEROXIRREDOXINA DE TRYPANOSOMA CRUZI. Piñeyro, M. D.

ESTUDIO ESTRUCTURAL DEL TERMOSENSOR DESK DE BACILLUS SUBTILIS. Trajtenberg, F.

ESTUDIOS ESTRUCTURALES DE FORMAS NITRADAS DEL CITOCROMO C. Tórtora, V.

ANALISIS DE MICROHETEROGENEIDAD ESTRUCTURAL DE POLISACARIDO CAPSULAR DE STREPTOCCOCUS PNEUMONIAE SEROTIPO 14. González, H.

DESARROLLO DE UN MODELO SIMPLIFICADO PARA SIMULACIÓN DE ADN. Zeida, A.

CARACTERIZACION FISICOQUIMICA DE FARMACOS ANTI-CANCERIGENOS DEPT(IV) Y METABOLITOS PRINCIPALES. Pittini, A.

SIMPOSIO II: PARASITOLOGIA MOLECULAR.

Moderadores: C. Fernández; M. Comini

Salón de Actos -Instituto Pasteur

PROLIFERACIÓN CELULAR DURANTE EL DESARROLLO DE MESOCESTOIDES CORTI (CESTODA). Koziol, U.

PROTEÍNAS S100 DE FAGOCITOS EN LA RESPUESTA INFLAMATORIA EN LA HIDATIDOSIS. Basika, T.

EVOLUCIÓN CONVERGENTE DEL SITIO ACTIVO DE LAS CISTEÍNA PROTEASAS DE LA FAMILIA C1A CON ACTIVIDAD COLAGENASA. Corvo, I.

ANÁLISIS RIBONÓMICO DE LA PROTEÍNA TCRBP19 DE T. CRUZI. Pérez-Díaz, L.

ESTUDIO DE LA O-GLICOSILACIÓN EN TRYPANOSOMA CRUZI. Chiribao, M.L.

EL ADN COMO PROBABLE BLANCO DE ACCIÓN DE COMPUESTOS DE PALADIO Y PLATINO CON ACTIVIDAD ANTI-TRYPANOSOMA CRUZI. Vieites, M.

SIMPOSIO III: BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE MICROORGANISMOS.

Moderadores: P. Zunino; P. Aguilar; J. Cristina

Salón de Actos –Facultad de Ciencias

LEVADURAS PROVENIENTES DE LA ANTÁRTIDA COMO CONTROLADORES BIOLÓGICOS DE P. EXPANSUM, EN MANZANA. González, B.

EXPRESION DE PROTEINAS ACTIVAS A BAJA TEMPERATURA. Martínez-Rosales, C.

EISOSOMAS Y COMPARTIMENTALIZACIÓN DE LA SEÑALIZACIÓN POR MEDIO DE KINASAS. Olivera, M.A.

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AVANCES EN LA CARACTERIZACIÓN DE LA INTERACCIÓN RALSTONIA SOLANACEARUM- SOLANUM TUBEROSUM. Sanabria, A.

ANÁLISIS DE CUASIESPECIES EN CEPAS URUGUAYAS DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD INFECCIOSA DE LA BURSA. Benítez, M.J.

EVIDENCIA DE DIVERSIFICACION DE DENV3 GENOTIPO III EN LA REGIÓN SUDAMERICANA. Recarey, R.

SIMPOSIO IV: PEQUEÑOS RNA REGULADORES EN BIOLOGÍA.

Moderadores: A. Cayota; J. Tort

Salón de Actos –Instituto Pasteur

BIOLOGÍA DE PEQUEÑOS ARN Y SU RELEVANCIA EN BIOMEDICINA. Cayota, A.

PROPIEDADES ESTRUCTURALES Y BIOLÓGICAS DE PROTEINAS ARGONAUTA. Tosar, J.P.

INTERFERENCIA DE ARN Y MECANISMOS RELACIONADOS EN PROTISTAS: LOS TRIPANOSOMÁTIDOS. Comini, M.

SILENCIAMIENTO GÉNICO MEDIADO POR PEQUEÑOS RNA EN PLANTAS. Borsani, O.

ARN PEQUEÑOS EN HELMINTOS: NUEVAS HERRAMIENTAS E INTERROGANTES. Tort, J.

HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS Y PREDICCIÓN DE MRNA BLANCOS DE MICRORNAS. Pena, A.

MIR-155 REGULATES THE IMMUNE SYSTEM. Vigorito, E.

SIMPOSIO V: FUNCIONALIDAD DE PROTEÍNAS

Moderadores: A. Denicola – O. Pristch

Salón de Actos –Facultad de Ciencias

UTILIZANDO LA FLUORESCENCIA INTRÍNSECA EN ESTUDIOS FUNCIONALES DE PROTEÍNAS: EL EJEMPLO DE LA PEROXIRREDOXINA DE UNA CISTEÍNA DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS. Hugo, M.

LA TIORREDOXINA-GLUTATIÓN REDUCTASA: UN PAQUETE ENZIMÁTICO EN EL CENTRO DEL METABOLISMO REDOX DE PLATELMINTOS. Bonilla, M.

REGULACIÓN DEL METABOLISMO DEL GLUTAMATO POR SER/THR QUINASAS EN MICOBACTERIAS. Durán R.

DIVERSIDAD FUNCIONAL DE UNA FAMILIA DE INHIBIDORES KUNITZ. Flo, M.

CARACTERIZACIÓN BIOFÍSICA Y ESTRUCTURAL DE LA PROTEÍNA DE CÁPSIDE DEL VIRUS DE LA LEUCEMIA BOVINA. Obal, G.

UNA ISOFORMA DE MARCKS ESPECÍFICA DE NEUROBLASTOS: ESTUDIO DE LA REGIÓN FOSFORILADA POR CDK5. Zolessi, F.

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SIMPOSIO VI: NEUROBIOLOGÍA

Moderadores: J.R. Sotelo – S .Olivera

Salón de Seminarios I–Facultad de Ciencias

FOSFORILACIÓN DE MARCKS DURANTE LA DIFERENCIACIÓN NEURONAL EN LA RETINA. Toledo, A.

DESARROLLO POSTNATAL DE UNA RED SENSORIO-MOTORA. Castelló, M.

CARACTERIZACIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA DE LA DEGENERACIÓN CORTICAL CEREBELOSA OCASIONADA POR INGESTIÓN DE SOLANUM BONARIENSE EN BOVINOS. Verdes, J.M.

PAPEL DE LOS ASTROCITOS EN LAS ENFERMEDADES NEUROMETABÓLICAS. Olivera, S.

ALTERACIONES MITOCONDRIALES EN MODELOS DE ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRÓFICA Cassina, P.

ROL DE LA HORMONA CONCENTRADORA DE MELANINA (MCH) EN EL SUEÑO REM Y LA DEPRESIÓN. Lagos, P.

EL ÓXIDO NÍTRICO (NO) GENERADO POR FIBRAS PROMOTORAS DELGADAS ES EFECTIVO COMO NEUROMODULADOR ANTERÓGRADO Fernández Alvarez, A.

SIMPOSIO VII: BIOTECNOLOGÍA 1.

Moderadores: L. Franco Fraguas; M. Marín

Salón de Actos –Instituto Pasteur

DESARROLLO DE UN SISTEMA PARA LA DETERMINACIÓN DE CARGA VIRAL PLASMÁTICA DE HIV1 POR PCR EN TIEMPO REAL. Cota, G.

BIOTECNOLOGÍA APLICADA AL DESARROLLO DE PRODUCTOS DERIVADOS DE LA MIEL. Vero, S.

BÚSQUEDA, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ENZIMAS HIDROLÍTICAS EN LA MICROBIOTA INTESTINAL DE TERMITAS NATIVAS. Senatore, D.

ESTUDIO DE GENEALOGÍA MEDIANTE EL ANÁLISIS DE STR EN OVINOS. Peraza, P.

SIMPOSIO VIII: INMUNOLOGÍA.

Moderadores: A. Díaz; P. Oppezzo

Salón de Actos –Facultad de Ciencias

REGULACION DEL SISTEMA INMUNE POR MICROARN-155. Vigorito, E.

SOBREEXPRESIÓN DE AID ASOCIADA A UN PROCESO ACTIVO DE CAMBIO DE CLASE MARCA A LA SUBPOBLACIÓN PROLIFERANTE EN LA LEUCEMIA LINFOIDE CRÓNICA (LCC). Palacios, F.

IL-17A JUGA UN ROL CENTRAL EN LA PROTECCIÓN A LARGO PLAZO FRENTE A LA INFECCIÓN AGUDA POR STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE. Rial, A.

ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE BACTERIAS DEL ÁCIDO LÁCTICO SOBRE CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS. Bollatti, M.

EL ANTÍGENO TN DIRIGIDO AL RECEPTOR LECTINA TIPO C MGL EN CÉLULAS DENDRÍTICAS DERMALES INDUCE UNA RESPUESTA TH2 Y GENERA ALTOS TÍTULOS DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS. Freire, T.

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SIMPOSIO IX: BIOLOGÍA VEGETAL.

Moderadores: S. Vidal; O. Borsani

Salón de Seminarios I –Facultad de Ciencias

ROL DEL FACTOR TRANSCRIPCIONAL ATBZIP53 EN LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DURANTE LA MADURACIÓN DE LA SEMILLA. Alonso, R.

EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE GENES DE PHYSCOMITRELLA PATENS EN RESPUESTA A ELICITORES DE ERWINIA CAROTOVORA. Alvarez, A.

UTILIZACIÓN DE PHYSCOMITRELLA PATENS PARA EL ESTUDIO DE LA FUNCIÓN DE LAS OXILIPINAS EN PLANTAS. Machado, A.L.

FLUJO DE TRANSGENES EN MAÍZ ASOCIADO A LA INTERPOLINIZACIÓN ENTRE CULTIVOS COMERCIALES. Galeano, P.

UTILIZACIÓN DE UN MODELO VEGETAL RESISTENTE A LA DEGRADACIÓN PARA LA CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE GENES DE RESPUESTA AL ESTRÉS ABIÓTICO EN PLANTAS. Ruibal, C.

SIMPOSIO X: BIOTECNOLOGÍA 2

Moderadores: G. Grompone; P. Esperón

Salón de Actos –Instituto Pasteur

APLICACIÓN DE MICROARRAYS Y MACROARRAYS DE EXPRESIÓN PARA EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE. Marqués, M.

DIAGNÓSTICO DE CBCVD Y CVD-OS (POSPIVIROIDAE) EN PLANTACIONES CITRÍCOLAS MEDIANTE HIBRIDACIÓN MOLECULAR NO-ISOTÓPICA. Umaña, R.

RELEVAMIENTO DE DIFERENTES PERFILES GENICOS DE BACILLUS LICHENIFORMIS AISLADOS DE POLVOS LÁCTEOS. González, M.

NF-KB (NUCLEAR FACTOR KAPPA-B): GENERACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA LÍNEA REPORTERA DE ORIGEN HUMANO. Tiscornia, I.

INGENIERÍA Y DESARROLLO DE PROTEÍNAS MODULARES RECOMBINANTES, UN NUEVO ENFOQUE EN TERAPIA GÉNICA. Ganz, J.

SIMPOSIO XI: RADICALES LIBRES

Moderadores: Thomson L.; Souza J.M.

Salón de Actos –Facultad de Ciencias

ÁCIDO NITROARAQUIDÓNICO: EL PRIMER INHIBIDOR DE LA ACTIVIDAD PEROXIDASA EN PROSTAGLANDINA ENDOPERÓXIDO H SINTASA 1 Y 2. Bonilla, L.

PROPIEDADES Y REACTIVIDAD DEL ÁCIDO SULFÉNICO EN LA ALBÚMINA SÉRICA HUMANA. Turell, L.

QUERCETINA: PROTECCIÓN NEURONAL FRENTE AL ESTRÉS OXIDATIVO POR MECANISMOS ANTIOXIDANTES INDIRECTOS. Arredondo, F.

FORMACIÓN INTRAFAGOSOMAL DE PEROXINITRITO COMO MECANISMO CITOTÓXICO CONTRA T.CRUZI. Álvarez, M.N.

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SIMPOSIO XII: MICROSCOPIA: UNA VENTANA AL MICROMUNDO

Moderadores: Radmilovich M.; Negreira C.

Salón de Seminarios I–Facultad de Ciencias

APORTES DE LA MET A LA INVESTIGACIÓN Y PROGRESO DE LA BIOLOGÍA. Casanova, G.

LA MICROSCOPÍA CONFOCAL Y ELECTRÓNICA APLICADAS AL ESTUDIO DEL VÍNCULO NEUROGLIAL EN EL SISTEMA NERVIOSO PERIFÉRICO. Kun, A.

NEUROGÉNESIS POSTNATAL EN PECES AUSTROLEBIAS: VENTAJAS DE LA MICROSCOPÍA CONFOCAL FRENTE A LA MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA. Rosillo, J.C.

APLICACIÓN DE LA MICROSCOPÍA CONFOCAL AL ESTUDIO DE LA LIBERACIÓN DE CALCIO EN EL MÚSCULO ESQUELÉTICO. Brum, G.

APORTES DE LA MICROSCOPÍA DE FUERZA ATÓMICA A LA INVESTIGACIÓN EN BIOLOGÍA, Rosso, G.

MICROSCOPÍA Y RECONSTRUCCIÓN 3D: UN ABORDAJE MULTIDISCIPLINARIO PARA EL ESTUDIO DE ESTRUCTURAS COMPLEJAS, Iribarne, L.

ANÁLISIS DE LA POBLACIÓN DE CÉLULAS ESTRIATALES EN UN MODELO DE ACIDEMIA GLUTÁRICA I, Jiménez, M.

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PRESENTACIONES ORALES SELECCIONADAS

LUNES 09-11-09

11:30- 12:30 Moderadores: Estela Castillo y Andrea Medeiros.

Salón de actos-Facultad de Ciencias

LA CARACTERIZACIÓN DE BBS7 REVELA UN VÍNCULO ENTRE LA FUNCIÓN CILIAR/CUERPO BASAL Y LA REGULACIÓN GÉNICA. Gascue, C.

INHIBICIÓN DE LA NADPH OXIDASA POR ÁCIDO NITROARAQUIDÓNICO EN MACRÓFAGOS ACTIVADOS. González, L.I.

CARACTERIZACIÓN DE LAS HISTONAS H1 DE PHYSCOMITRELLA PATENS. Abreu, C.

ENTEROTOXINA LTB DE E. COLI ALTERA LA FUNCION CARDIACA EN CORAZON AISLADO DE COBAYO. Costa, C.

MARTES 10-11-09

18:00- 18:45 Moderadores: Laura Castro y José Manuel Verdes.

Salón de actos-Facultad de Ciencias

ESTUDIO DE LA FUNCIÓN DE UN MODIFICADOR DEL SÍNDROME DE BARDET-BIEDL EN LA VÍA DE

SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR MTOR. Cárdenas-Rodríguez, M.

GENOTIPO, FENOTIPO Y NEUROPATOLOGIA EN RATONES TREMBLER-J. Puig, N.

VALOR PRONOSTICO Y DIAGNOSTICO DE ANTICUERPOS ANTI NITROTIROSINA EN ARTRITIS

REUMATOIDEA. Keushkerian, M.

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POSTERS

AREAS TEMÁTICAS

1 BIOLOGÍA CELULAR P1-P8

2 BIOLOGÍA MOLECULAR P9-P29

3 BIOTECNOLOGÍA P30-P40

4 GENÉTICA, GENÓMICA Y BIOINFORMÁTICA P41-P55

5 NEUROCIENCIA Y NEUROBIOLOGÍA P56-P70

6 OTRAS AREAS P71-P75

7 PARASITOLOGÍA P76-P83

8 BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE LOS MICROORGANISMOS P84-P102

9 INMUNOLOGÍA P103-P108

10 BIOQUÍMICA, BIOFÍSICA Y BIOLOGÍA ESTRUCTURAL P109-P134

14

BIOLOGÍA CELULAR P1-P8

P1) LA CARACTERIZACIÓN DE BBS7 REVELA UN VÍNCULO ENTRE LA

FUNCIÓN CILIAR/CUERPO BASAL Y LA REGULACIÓN GÉNICA

GASCUE C, CÁRDENAS-RODRÍGUEZ M, BADANO JL

Laboratorio de Genética Molecular y Humana, Institut Pasteur de Montevideo

Las cilias primarias son organelos especializados que actúan como mecano- y quimio-sensores y son necesarias para la transducción de un número de vías de señalización importantes para el desarrollo y mantenimiento de tejidos y órganos. Por lo tanto no es sorprendente que defectos en la formación, mantenimiento y función de las cilias puedan resultar en un amplio rango de fenotipos que caracterizan distintas enfermedades humanas: las ciliopatías. Un ejemplo es el síndrome de Bardet-Biedl (BBS), un desorden pleiotrópico, genéticamente heterogéneo, para el cual se han identificado 14 genes hasta el momento. Sin embargo, a pesar de la disponibilidad de distintas proteínas BBS, se posee muy poca información acerca de su rol biológico ya sea en el contexto de las cilias como fuera de ellas. En este trabajo nos enfocamos en la caracterización de BBS7, demostrando que esta proteína presenta un patrón de localización celular dinámico, encontrándose en centrosomas, cuerpos basales y axonema ciliar, pero a su vez siendo capaz de ingresar al núcleo. En este contexto, resulta interesante que distintas mutaciones en BBS7 presentes en pacientes afectarían esta capacidad de la proteína de entrar al núcleo celular. A su vez, mostramos que BBS7 es capaz de interactuar físicamente con RNF2, una proteína nuclear miembro del grupo Polycomb (PcG), con función en la remodelación de la cromatina y regulación de la expresión génica. Nuestros datos indican que BBS7 afectaría los niveles proteicos de RNF2 y en consecuencia la expresión de los genes que RNF2 regula. Por último, mostramos que BBS7 se uniría físicamente al ADN. Los datos aquí presentados mostrarían que BBS7, y posiblemente otras proteínas de BBS, podrían estar actuando como un vínculo directo entre las cilias, las distintas vías de señalización que dependen de ellas, y la regulación génica, efector fundamental en la transducción de señales.

15

P2) ONDA RÁPIDA DE CALCIO EN HERIDAS DE ENDOTELIO DE CÓRNEA

EN CULTIVO

JUSTET C.1, HERNÁNDEZ J. A.2, CHIFFLET S.1

1Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, 2Sección Biofísica, Facultad

de Ciencias, UdelaR

En diversos epitelios se ha encontrado que una onda rápida de calcio citosólico

(OC) se desarrolla desde el borde de la herida inmediatamente después de

producida. En el presente trabajo se estudia el mecanismo de generación y

propagación de la OC en endotelio de córnea de bovino en cultivo (BCE).

Las modificaciones intracelulares de la concentración de calcio fueron

determinadas mediante Fluo4-AM. Se utilizaron inhibidores para la liberación de

calcio del retículo endoplásmico (ácido ciclopiazónico, CPA), receptores

purinérgicos (suramina, desensibilización con ATP), uniones gap (heptanol,

octanol) y hemicanales (LaCl3, carbenoxolona). Para evitar la entrada de calcio del

medio extracelular se utilizó una solución libre de calcio con EGTA.

Nuestros resultados muestran que la generación de la OC depende

mayoritariamente del calcio extracelular mientras que su propagación, de la

liberación a partir del retículo endoplásmico. La inhibición de los receptores

purinérgicos inhibe la propagación de la OC pero no su generación. La inhibición de

las uniones gap con heptanol y octanol, y hemicanales de conexinas con LaCl3

causa una disminución en la duración de la OC pero no altera significativamente la

generación y propagación. La incubación con carbenoxolona (CBX), inhibidor

inespecífico de conexinas y panexinas en hemicanales libres o en uniones gap,

causa la abolición de la propagación de la OC.

En conjunto, estos resultados indican que la propagación de la OC depende de la

liberación de ATP al medio extracelular para su unión parácrina o autócrina a

receptores purinérgicos. Además, sugieren que en la OC en BCE no hay

participación de las uniones gap pero sí de hemicanales libres posiblemente

formados por panexinas.

16

P3) ROL DE LA LAMINA BASAL EN LA CICATRIZACION DE HERIDAS EN

EPITELIOS

CABO, F; EVANS, F. Y CHIFFLET, S.

Depto. de Bioquímica, Facultad de Medicina, UdelaR

El rol de la lámina basal (LB) en la proliferación, diferenciación y migración

epitelial es bien conocido. En un trabajo previo (Grasso et al., Am.J.Phys.

293:C1327, 2007) encontramos que en células de endotelio de córnea de bovino

(BCE), la modalidad de cicatrización adoptada (cordón de actina o migración

lamelipódica) depende de la presencia o ausencia de LB. Aquí estudiamos si la LB

sintetizada por células BCE es también capaz de determinar el modo de

cicatrización de otros tres epitelios en cultivo: endotelio de aorta de bovino

(BAEC), epitelio de córnea de conejo (RCEp) y células MDCK.

La LB se obtuvo mediante dos procedimientos diferentes (tratamiento con Tritón

X-100 0,01% o amoníaco 0,02N). Ambos se evaluaron determinando la presencia de

laminina (IIF) y actina (Faloidina-FITC). La detección de actina en el preparado

indica remoción celular incompleta. En todos los tipos celulares se realizaron tajos

preservando o removiendo la matriz. Luego de una incubación de 4 horas en estufa

de cultivo los preparados se procesaron para la observación de actina.

De los dos procedimientos utilizados para obtener la LB, el amoníaco preserva una

mayor cantidad de laminina y extrae las células más eficientemente. Sin embargo,

esta diferencia no afectó el comportamiento cicatricial de ninguno de los epitelios

estudiados. En todos los casos la modalidad de cicatrización dependió, al igual que

reportáramos para células BCE, de la presencia o ausencia de LB. Es así que las

heridas realizadas en presencia de LB cicatrizaron por reptación lamelipódica,

mientras que las realizadas en su ausencia lo hicieron por cordón de actina. Entre

otros, estos resultados podrían contribuir al diseño de estrategias terapéuticas

para modular las modalidades de cicatrización.

17

P4) DETECCION HISTOQUIMICA DE ROS EN HOJAS DE CEBADA

INFESTADAS CON Cochiobolus sativus

SILVA P1, RODRIGUEZ S1, TORRES C1, GAMBA F2, PRITSCH C1

1Depto. de Biología Vegetal, 2Departamento de Protección Vegetal, Facultad de

Agronomía, Universidad de la República

La mancha borrosa (MB) causada por Cochliobolus sativus es una importante

enfermedad foliar de la cebada (Hordeum vulgare). C. sativus es un hongo

hemibiotrófico desarrollando en el huésped cebada una fase biotrófica seguida de

una necrotrófica. La generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) como el

H2O2 es una respuesta temprana a la infección que muestra regulación espacio

temporal. Durante la fase biotrófica, la acumulación de H2O2 se localiza en el

apoplasto en zonas limitadas al sitio de contacto con el tubo germinativo y el

apresorio. En la fase necrotrófica, (etapas post penetración), la acumulación de

H2O2 se observa en citoplasma de células epidérmicas, citoplasma de células del

mesófilo y en cloroplastos de células del mesófilo. En contraposición a los

biotrofos, se ha reportado para C. sativus una correlación positiva entre el nivel de

susceptibilidad a MB y la cantidad del ROS H2O2 acumulado en lesiones necróticas

de hojas Parte del H2O2 producido en el apoplasto deriva de la conversión del O2-

por reacción espontánea o via SOD. Esto último sugiere que tanto H2O2 como O2-

juegan un papel importante durante distintas etapas de la infección fúngica. El

objetivo del presente trabajo es comparar el patrón de reacción oxidativa en

respuesta a la infección de C. sativus de genotipos de cebada resistente y

susceptible a MB.. mediante detección histoquímica de la acumulación de O2- y

H2O2. Hojas infectadas con C. sativus y muestreadas a diferentes tiempos (6hpi a 4

dpi) fueron pre-tratadas con 3,3-diaminobenzidina (DAB) para la detección de

H2O2 y azul de nitrotetrazolio (NBT) para la detección de O2-. Las hifas fueron

visualizadas por tinción con Calcofluor. Los resultados preliminares indican que a

las 18 hdi se encontraron evidencias de acumulación de H2O2 y O2-. Diferentes

genotipos de cebada manifestaron diferentes patrones de acumulación de ROS.

18

P5) EVIDENCIA DE APOPTOSIS EN TESTÍCULOS DE RATAS NEONATAS

TRATADAS “IN UTERO” CON BETAMETASONA

PEDRANA, G1; CASANOVA, G2; MÖLLER, R3; VIOTTI, H1; SOUZA, E1; BIELLI, A1.

1. Área de Histología – Departamento de Morfología y Desarrollo – Instituto de

Biociencias, Facultad de Veterinaria, Lasplaces 1550 C.P. 11600.

2. Sección Biología Celular y Unidad de Microscopía Electrónica de Transmisión

(MET), Facultad de Ciencias, Iguá 4225 C.P. 11400

3. Área de Anatomía – Departamento de Morfología y Desarrollo – Instituto de

Biociencias Facultad de Veterinaria, Lasplaces 1550 C.P. 11600.

elisousad@hotmail.com

RESUMEN

La administración prenatal de glucocorticoides produce resultados tanto

beneficiosos como adversos. Su administración a mujeres gestantes con riesgo de

parto prematuro induce la maduración tisular, pero también la reducción del peso

corporal al nacer y aparición de patologías a largo plazo. En ratas adultas induce

apoptosis en células de Leydig. El presente trabajo estudió la acción de los

glucocorticoides sobre las células testiculares (Leydig, Sertoli y gonocitos) de ratas

neonatas, cuyas madres fueron inyectadas hacia el final de la gestación (días 17,

18, 19 y 20), con betametasona (dosis: 1 mg/kg). Las crías macho de 1 dpn (grupo

control n= 3; grupo tratado n=3), fueron anestesiadas y perfundidas con

paraformaldehido 4% en buffer fosfato (BF), pH 7.2, y sus testículos disecados y

postfijados con glutaraldehido 2.5% (1hora); y tetróxido de osmio 1% (30 minutos),

siguiéndose el protocolo de rutina para microscopía electrónica de transmisión.

Las secciones semi y ultrafinas, se analizaron mediante microscopía óptica y MET

(JEOL JEM 1010) a 80kV. En los testículos tratados, se observaron células de Sertoli

en apoptosis, con núcleo pequeño y picnótico. Se identificaron gonocitos y células

de Leydig con retracción celular, bordes irregulares, pérdida de morfología

redondeada en núcleo y citoplasma, y mitocondrias agrandadas. Las células de

Leydig presentaron citoplasma electrón lúcido con aspecto lítico con vesículas

densas y organelos distorsionados, con presencia de leucocitos alrededor de las

células apoptóticas. En suma: únicamente se observaron señales de apoptosis en

células de Leydig, Sertoli y gonocitos de aquellos animales tratados "in utero" con

betametasona. Estos resultados sugieren que el tratamiento prenatal con

glucocorticoides promueve la apoptosis a nivel del testículo neonatal, a las dosis

utilizadas.

Palabras clave: apoptosis, testículo, betametasona

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P6) ESTUDIO DE LA FUNCIÓN DE UN MODIFICADOR DEL SÍNDROME DE BARDET-BIEDL EN LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR mTOR CÁRDENAS-RODRÍGUEZ M, NOVAS R, GASCUE C Y BADANO JL. Laboratorio de Genética Molecular y Humana; Institut Pasteur de Montevideo El síndrome de Bardet-Biedl (BBS) es un desorden caracterizado por polidactilia, obesidad, retinitis, retardo mental y malformaciones renales. 14 genes causales así como modificadores secundarios han sido identificados y el análisis de las proteínas codificadas indica que cumplirían roles estructurales y/o funcionales en las cilias. Este trabajo se centra en la caracterización de MGC1203, una proteína de función desconocida que interactúa y co-localiza con las proteínas BBS en los cuerpos basales y centrosomas. Nuestros datos indican que MGC1203 interactúa y colocaliza con SIN1, miembro del complejo 2 de mTOR (mTORC2), una vía importante en la regulación del crecimiento y la proliferación celular. A su vez, hemos determinado que MGC1203 interactúa con Rictor, otro miembro de mTORC2, pero no co-inmunoprecipita con Raptor (miembro de mTORC1) por lo que MGC1203 podría ser específico de mTORC2. Para entender el significado funcional de esta interacción, estudiamos la actividad quinasa de mTORC2 frente a cambios en los niveles de MGC1203 midiendo la fosforilación de Akt en Ser473. Nuestros resultados indican que MGC1203 se comporta como una agonista de esta vía afectando tanto los niveles de AKT fosforilado como otros marcadores downstream. Para entender el rol de MGC1203 en mTORC2 estamos estudiando si existen cambios a nivel de los ARN y/o de las proteínas del complejo, así como posibles alteraciones en la conformación del complejo cuando se sobre-expresa o se inhibe MGC1203. Interesantemente nuestros resultados preliminares indican que una disminución de MGC1203 sensibiliza el complejo hacia tratamientos con la droga Rapamicina, sugiriendo quizás un vínculo estructural entre MGC1203 y mTORC2. Estos resultados expanden la complejidad de funciones de las cilias en la transducción de señales e implican a la vía de mTOR en la patogénesis de BBS brindando información relevante para entender la base celular de los distintos fenotipos que caracterizan a este síndrome.

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P7) AKT INHIBE LA FUNCIÓN REPARADORA DEL ADN DE BRCA1 EN LÍNEAS CELULARES DERIVADAS DE CÁNCER MAMARIO SAIDJ R1,2, ARTAGAVEYTIA N3, DE DECKER E1,2 Y CALVO F1,2

1 INSERM U716, Institut de génétique moléculaire y 2 Université Paris7, Denis Diderot, Paris, Francia;3 Departamento Básico de Medicina, Hospital de Clínicas, Facultad de Medicina, Montevideo, Uruguay

La proteína AKT también conocida como proteína-kinasa B, tiene un rol

preponderante en la vía de señalización mediada por PI3K. Una de las proteínas

blanco de esta vía es BRCA1, fosfoproteína nuclear implicada en el proceso de

reparación del ADN por recombinación homóloga. Estudiamos la implicancia de la

activación de AKT en la función de BRCA1 observando la formación de focos

nucleares de BRCA1 por inmunofluorescencia. Se utilizaron las líneas celulares

MCF-7 (sobrexpresión de AKT activada) y MDA-MB-231 (expresión leve de AKT).

Luego de irradiación (6Gy) se observó la formación de focos nucleares de BRCA1

en las células MDA-MB-231 mientras que la inducción fue muy leve en MCF-7. La

activación de AKT luego de tratamiento de MDA-MB-231 con EGF (20ng/ml)

determinó la pérdida de formación de focos nucleares de BRCA1, la cual fue

revertida luego de tratamiento con un inhibidor de AKT (trifluoroacetate, TFA,

20 M). Por el contrario, el tratamiento de MCF-7 con TFA o LY (inhibidor de PI3K,

30 microM) indujo un aumento de la formación de focos nucleares de BRCA1.

También demostramos que la inhibición de AKT indujo una pérdida rápida de los

focos de gama-H2AX radio-inducidos, evidenciando la habilidad de reparación del

ADN de doble-hebra (efecto máximo luego de 24 hrs de irradiación, 1 Gy). Estos

resultados fueron confirmados en un modelo experimental de rotura doble-hebra

de ADN, observando una mayor eficiencia de reparación por recombinación-

homóloga con la inhibición de AKT. Estos datos sugieren que la activación de

BRCA1 mediada por AKT determina la pérdida de su función de reparación.

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P8) PROTECCIÓN FRENTE AL ESTRÉS OXIDATIVO EN POBLACIONES ESTACIONARIAS CANDREVA EC, BRACESCO N, BLANC L, NUNES E. Lab. Radiobiología. Dpto Biofísica. Fac. Medicina. Distintos tipos de agentes físicos y químicos generadores de estrés oxidativo actúan a nivel celular y molecular (ej.: membrana mitocondrial, ADN y componentes de transducción) determinando acumulación de daños propios del envejecimiento celular. En eucariotas se ha demostrado la importancia de sensores del daño genómico, transductores y efectores de reparación de ADN y de control del ciclo celular que modulan eventos potencialmente letales, mutagénicos, carcinogénicos y de envejecimiento celular. Hipótesis: Componentes fenólicos provenientes de productos naturales actúan sobre elementos de la red reguladora de estabilidad genómica: Mec1/ATR y Rad50 disminuyendo el envejecimiento celular por daño oxidativo. Se utilizó el modelo Saccharomyces cerevisiae, en fase estacionaria (compartimientos proliferativos decrecientes) y el radiomimético bleomicina (B), productor de roturas dobles de ADN (DSB). Muestras aleatorias de las poblaciones de distintas edades se expusieron a bleomicina en presencia o ausencia del polifenol rutina (R) o de la infusión de Ilex paraguariensis (Ip). Se estimaron probabilidades de sobrevida (S), de mutagénesis ( M) y de producción de DSB. Se verificó protección decreciente frente a B en función de la edad de los cultivos por R, medida por S y M. Ip produjo una protección significativamente mayor frente a B con aumento de S y disminución de M independientemente de la edad. DSB disminuyó significativamente en presencia de Ip. Este efecto fue menor o ausente para B + R. Los resultados se interpretan en base a un modelo en red estudiado previamente. La activación de Mec 1 por R determinaría una inducción de recombinación homóloga en compartimientos proliferativos. La presencia en Ip de cafeína (inhibidor de Mec1), de otros componentes fenólicos y cofactores de reparación activarían el complejo MRX/hMRN y proteínas Ku teloméricas y de unión no homóloga (NHEJ). Además se producen interrupciones diferenciales de cascadas redox y activación de elementos SIR de desacetilación de la cromatina.

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BIOLOGÍA MOLECULAR P9-P29

P9) EXPRESION GENICA EN HIGADO DE VACAS DE CARNE SUPLEMENTADAS EN EL POSPARTO ASTESSIANO A. L1, QUINTANS G.2, PEREZ-CLARIGET R1, CARRIQUIRY M1

1Facultad de Agronomía, UdelaR. 2 INIA, Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria. La suplementación energética, práctica común en sistemas de cría, mejora las funciones reproductivas, siendo escasa la información sobre su impacto en el metabolismo hepático. Se realizó un experimento con el objetivo de estudiar el efecto de la suplementación de corto plazo (aumento de la disponibilidad y calidad de nutrientes y energía) durante el posparto sobre la expresión hepática de genes asociados al eje somatotrófico (factor de crecimiento similar a la insulina tipo I; IGF-I, y sus proteínas de unión -2 y -3; BP2 y BP3) en vacas de carne primíparas con ternero al pie. Se utilizaron 10 vacas de primera parición (Aberdeen Angus, Hereford y sus cruzas) divididas en bloques según fecha de parto y condición corporal al parto. A los 48 días posparto las vacas se asignaron al azar a dos tratamientos nutricionales: control (campo nativo) y suplementadas (campo nativo mejorado con Lotus subbiflorous cv Rincón) durante 23 días. Se tomaron muestras de hígado mediante biopsias hepáticas, se extrajo el ARN total y se determinó la abundancia de ARNm mediante SYBR-Green RT-PCR en tiempo real, usando la expresión del gen hipoxantina fosforibosiltransferasa (HPRT) como control endógeno. La expresión (número de moléculas) de los genes de interés en relación a la expresión de HPRT se analizó usando el PROC MIXED de SAS. La abundancia de ARNm de HPRT fue similar (P=0.14) entre tratamientos. La expresión hepática de IGF-I y BP2 no fue afectada (P>0.022) por los tratamientos. Sin embargo, la expresión de BP3 fue mayor (P=0.03) en las vacas que pastoreaban campo natural. Los resultados muestran que la suplementación posparto sin manejo del amamantamiento, modificó la expresión de genes del eje GH-IGF-I, el cual es determinante en la partición de nutrientes entre la producción de leche y las funciones reproductivas. Palabras clave: expresión génica, eje GH-IGF-I, vacas primíparas.

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P10) PURIFICACIÓN DE TRANSGLUTAMINASA TISULAR DE GLÓBULOS ROJOS HUMANOS. MUÑOZ, F., DEL RÍO, N Y HERNÁNDEZ, ANA. Cátedra de Inmunología. Facultad de Ciencias. UDELAR. La Transglutaminasa tisular (TG2) es una enzima ubicua implicada en múltiples funciones biológicas. Además, la TG2 está implicada en la patogenia de la Enfermedad celíaca y es el autoantígeno específico de esta enfermedad autoinmune; la detección de anticuerpos específicos anti-TG2 mediante la metodología de ELISA es un método ampliamente utilizado en el screening diagnóstico. Se han utilizado varias fuentes de Transglutaminasa tisular para el diseño de los kits comerciales de diagnóstico, entre ellos los glóbulos rojos humanos que expresan constitutivamente TG2 en el citoplasma y otra proteína de la familia de Transglutaminasas en la membrana plasmática (Banda 4.2). En el presente trabajo, se diseñó un método rápido de purificación de TG2 basado en la interacción de la misma con la Fibronectina de plasma humano; en contraste con los métodos previamente descritos, es posible obviar el paso de eliminación de la hemoglobina. Se lisaron glóbulos rojos humanos mediante shock hipotónico en presencia de un cocktail de inhibidores de proteasas y se incubó la solución resultante luego de la centrifugación con Fibronectina plasmática humana previamente purificada

inmovilizada en placas de plástico de cultivo celular (10 g/ml), posteriormente bloqueadas y formoladas. La fracción del lisado de eritrocitos retenida fue eluída con solución de Urea 8M; el análisis por SDS-PAGE y tinción con plata reveló bandas consistentes con la TG2. Se confirmó la reactividad inmunológica específica con la fracción obtenida mediante un ELISA de captura diseñado con la combinación de un anticuerpo anti-TG2 policlonal de captura y un monoclonal (CUB7402) para la detección, utilizando TG2 comercial de cobayo como control. En suma, el método reportado permitiría disponer de cantidades suficientes para ensayos de inmunoblot utilizados en el laboratorio mediante un procedimiento sencillo y económico.

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P11) EVALUACIÓN DE LA O-GLICOSILTRANSFERASA ppGalNAc-T11 COMO MARCADOR MOLECULAR DE LEUCEMIA LINFOIDE CRÓNICA LIBISCH G1, CASÁS M1, CAYOTA A2, OSINAGA E3, ROBELLO C1,4.

1Unidad de Biología Molecular, 2 Laboratorio de Genómica Funcional, 3Laboratorio de Glicobiología e Inmunología Tumoral, Instituto Pasteur de Montevideo. 4 Depto. de Bioquímica, Facultad de Medicina La Leucemia Linfoide Crónica (LLC) es un desorden propio de los linfocitos B y T, si bien el 95% es del subtipo B. Se caracteriza por una acumulación progresiva de linfocitos B monoclonales morfológicamente maduros pero incompetentes funcionalmente. Dentro de las alteraciones moleculares más notorias de las células cancerosas, se encuentra la expresión de antígenos producidos por O-glicosilación incompleta. Las enzimas que participan en el primer paso de O-glicosilación son las ppGalNAc-Ts (polypeptide-N-acetil-α-galactosaminiltransferasas). Dado que existe evidencia importante de la alteración de la expresión de las ppGalNAc-Ts en diferentes tipos de cáncer, estas enzimas han sido de gran valor ya que se han utilizado como herramientas diagnósticas y/o pronósticas. En este trabajo se analizó la expresión a nivel de ARN (mediante RT-PCR y Real TimePCR) de todas las isoenzimas pertenecientes a la familia de las ppGalNAcTs conocidas hasta la fecha (15 isoenzimas), tanto en células leucémicas como normales. Dado que no es posible el cultivo de células de LLC, se estudio también la expresión de las ppGalNAcTs en líneas tumorales humanas de linfocitos B (Daudi), y T (Jurkat). Como resultado hemos encontrado una sobreexpresión de la ppGalNAc-T11 en los linfocitos B leucémicos en relación a células B normales. La enzima también se expresa en linfocitos T y células Jurkat, mientras que su expresión es mucho menor en células Daudi. Mediante el uso de un anticuerpo anti ppGalNAc-T11, y mediante la técnica de Western Blot, se encontraron los mismos resultados a nivel de expresión proteica. Finalmente se produjo una línea estable Daudi capaz de sobreexpresar T11 al ser inducida con tetraciclina, con el fin de observar cambios en los patrones de glicosilación debidos a la sobreexpresión de T11. Los resultados obtenidos hasta el momento muestran a la enzima ppGalNAc-T11 cómo un posible marcador molecular de LLC.

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P12) EXPRESIÓN GÉNICA MUSCULAR EN TERNEROS: ¿DEPENDE DE LA ALIMENTACIÓN DE SUS MADRES DURANTE LA GESTACIÓN? LAPORTA J.1, ASTESSIANO A. L.1, PEREYRA, F1, SCARSI A.1, PEREZ-CLARIGET R1., QUINTANS G.2, CARRIQ.UIRY M.1

1Facultad de Agronomía, UdelaR. 2 Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria, INIA. La suplementación de la vaca durante la gestación podría comprometer el crecimiento potencial del ternero a través de un efecto directo durante la etapa fetal o indirecto durante la lactancia. Uno de los principales factores mediadores entre nutrición y crecimiento es el eje hormona de crecimiento-factor de crecimiento similar a la insulina (GH-IGF). Se evaluó el efecto de la suplementación de vacas multíparas, durante el último mes preparto, sobre la expresión muscular en los terneros de genes asociados al crecimiento. Las madres fueron asignadas a dos tratamientos: control (pastoreo de campo nativo) y suplementación (campo nativo + 1% del PV de afrechillo de arroz). Al destete se hicieron biopsias del músculo semitendinoso de 10 terneros machos (n=5 por tratamiento) cruza (Angus-Hereford). La expresión génica se midió por RT-PCR en tiempo real usando el gen hipoxantina fosforibosiltransferasa (HPRT) como control endógeno. La expresión de los genes, en relación a la expresión de HPRT, se analizó usando el PROC MIXED de SAS. La abundancia de ARNm de HPRT fue similar (P=0,26) en los dos tratamientos. Terneros hijos de madres no suplementadas presentaron mayor expresión(P<0,001) de ARNm del receptor de la GH y de la proteína de unión de IGF-3. Sin embargo, el nivel de IGF-I no se vió afectada por los tratamientos (P>0,99). Estos resultados muestran que la suplementación de vacas multíparas de carne en momentos de subnutrición durante la gestación, modifica la expresión de genes asociados al crecimiento en sus terneros al destete. Palabras clave: suplementación preparto, expresión génica, eje somatotrófico

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P13) ANÁLISIS MOLECULAR DEL SÍNDROME DE ESTRÉS PORCINO EN CERDOS DE RAZAS COMERCIALES EN URUGUAY (PCR-RFLP). MONTENEGRO,M1; ARTIGAS, R1; CASTRO, G2; GAGLIARDI, M1, MARTÍNEZ, M1; LLAMBÍ, S1. 1Área Genética-Departamento de Genética y Mejora Animal-Instituto de Producción Animal. Facultad de Veterinaria-UdelaR. 2 Área Suinos. Instituto de Producción Animal. Facultad de Veterinaria-UdelaR. tesissuinos@gmail.com El Síndrome de Estrés Porcino (PSS) es una enfermedad hereditaria causada por

una mutación puntual C→T en el gen Ryr1. Esto provoca una sustitución

aminoacídica (arginina→cisteína) en la proteína receptora de la rianodina, la cual funciona como canal de calcio en el retículo sarcoplásmico. El PSS provoca la muerte súbita de los animales así como una disminución en la calidad de la carne, generando importantes pérdidas económicas en la industria porcina. En este trabajo se presenta la determinación del genotipo para el PSS mediante la técnica de PCR-RFLP, en 11 cerdos de razas comerciales (1 Large White, 1 Duroc, 2 híbridos y 7 Landrace) de nuestro País. Se llevó a cabo extracción de ADN a partir de sangre periférica mediante el uso de un kit de extracción. Para la técnica de PCR se emplearon un par de cebadores específicos: F-Ryr1 5‟-TCC AGT TTG CCA CAG GTC CTA CCA-3‟ y R-Ryr2 3‟-ATT CAC CGG AGT GGA GTC TCT GAG-5‟. Para el análisis por RFLP se utilizaron 10U de la endonucleasa de restricción Alw21I en 10 μL de producto amplificado, incubándose 3 h/37ºC. Para la inactivación de la enzima se realizó una incubación de 20 minutos/65ºC, y posteriormente se realizo un tratamiento con proteinasa K durante 1h/37ºC para la desnaturalización de la enzima. Los productos obtenidos se observan en geles de agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio y en minigeles de acrilamida al 6% teñidos con nitrato de plata. El 63.6% de los animales estudiados presentaron genotipo heterocigota Nn (portadores), 27.3% de los animales presentaron genotipo homocigota recesivo nn (afectados) y un 9.0% genotipo homocigota dominante NN (normales). Se concluye la factibilidad de analizar este polimorfismo mediante la técnica de PCR-RFLP. De destaca que estos son los primeros diagnósticos de esta patología mediante técnicas moleculares en nuestro País.

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P14) EXPRESION GENICA EN OVIDUCTO DE OVEJAS: EFECTO DE LA ESTACION, NUTRICION Y MELATONINA TALMÓN,M1; VAZQUEZ,MI2; FERREIRA,A1; ABECIA,JA2; FOCADA,F2; CARRIQUIRY, M3, MEIKLE A1.

1Laboratorio de Técnicas Nucleares, Facultad de Veterinaria, Uruguay. 2Producción Animal, Universidad de Zaragoza, España. 3Facultad de Agronomía, Uruguay.

En este trabajo se determinó la expresión de los transcriptos de los receptores de estrógeno-α (ERα), progesterona (PR), y del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina tipo-1 (IGF-R1) en oviducto por RT-PCR tiempo real, en ovejas en anestro y estación reproductiva (n=31) asignadas al azar uno de los cuatro tratamientos de un arreglo factorial de nutrición (1,5 M vs 0,5 M) y melatonina (con y sin tratamiento). La expresión de ARNmERα en oviducto fue menor (P=0,003) en estación reproductiva que en anestro. La interacción entre la estación, la nutrición y el tratamiento con melatonina afecto la expresión de ARNmERα (P=0,014). Mientras que en el anestro no hubo efecto de la subnutrición ni de melatonina en la expresión de ARNmERα; mientras que en estación reproductiva, la subnutrición incrementó (P=0,018) la abundancia de ARNmERα. La melatonina redujo la expresión de ARNmERα en las ovejas sunutridas (P=0,006), pero no en las controles. La abundancia de ARNmPR no fue afectada por la estación, la nutrición ni el tratamiento con melatonina, pero si por la interacción entre nutrición y melatonina (P=0,035). La subnutricion redujo la expresión del ARNmPR (P=0,019), y la melatonina tendió a revertir esta situación en animales en anestro (P=0.08). La melatonina redujo la expresión de ARNmPR (P=0,014) en los animales control. La expresión de ARNmIGF-1R fue mayor (P<0,004) en anestro que en estación reproductiva, y en ovejas subnutridas que en ovejas alimentadas a mantenimiento. En este trabajo se demuestra que la expresión génica oviductal esta afectada por la subnutricion durante la fase luteal temprana (Día 5) y que este efecto esta modulado por la estación del año (reproductiva vs anestro). La respuesta oviductal – en términos de expresión génica- al tratamiento con melatonina es específica para cada variable y esta afectada por la estación del año y el estado nutricional.

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P15) IDENTIFICACIÓN DE LAS ISOFORMAS DEL RECEPTOR DE ESTRÓGENOS BETA (RE- RIO. INTERACCIÓN CON LAS VÍAS DE PROLIFERACIÓN ENDÓCRINA Y PARÁCRINA 2MANRIQUE G, 2ROMÁN E,1HEINZEN S, 2CANCELA P,3ALONSO I,2,4 GARÓFALO E Y

1,2ARTAGAVEYTIA N (*) 1Depto. Básico de Medicina y 2Laboratorio de Oncología Básica y Biología Molecular, Facultad de Medicina; 3Servicio de Curieterapia, Hospital Pereira Rossell; 4Depto. Bioquímica, Facultad de Veterinaria En los últimos años se han identificado variantes de “splicing” del gen RE-determinan isoformas de la proteína denominadas RE- -1,2,3,4,5, correspondiendo la primera a la proteína nativa. El objetivo de este estudio fue identificar los ARNm de las isoformas de RE-analizar su expresión y relación con las vías hormonal y parácrina ErbBs/ERK/AKT. Los ARNm-RE- -isoformas se analizaron por RT-PCR a partir de tejido tumoral congelado. La presencia y fosforilación de las proteínas ErbBs,ERK y AKT se analizaron por western blot. En estudios previos detectamos la presencia del ARNm-RE-tumores analizados. En 39 de estos tumores analizamos los ARNm-RE- -isoformas identificando RE- - - -respectivamente. Se encontró una asociación directa entre RE- - -1 (p=0,018, n=31), pero no hubo asociación con las variantes 2,4 y 5. Cuando se consideraron los fenotipos tumorales RE/RP se observó que la presencia de RE-fue mayor en ausencia de uno o ambos receptores (p=0,002,n=95), en particular en niveles bajos o ausencia de RP (p=0,026). Asimismo, esa relación inversa con RP fue más evidente en los tumores REGF+ (p=0,002,n=29) que en los REGF-negativos (p=NS, n=64). Las isoformas no se asociaron con RE/RP ni REGF. En los tumores RE-

lización ERK. En conclusión, se identificaron las variantes del RE-estando expresadas en la mayoría de los casos independientemente del status del receptor nativo. Estos resultados sugieren que RE-parácrina mediada por REGF/ERK. Financiación: CHLCC, CSIC

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P16) CARACTERIZACION DE LA PROTEINA FAPB1b DE Danio rerio: ESTUDIOS DE UNIÓN A LIGANDOS PUIG N*, LUCÍA CANCLINI*#, Y ADRIANA ESTEVES*. * Facultad de Ciencias, Montevideo, Uruguay; # Instituto de Investigaciones Biologicas Clemente Estable, Montevideo Uruguay. aesteves@fcien.edu.uy La grasa de la dieta constituye la mayor fuente de lípidos y esta constituida mayoritariamente por triglicéridos que deben ser hidrolizados antes de su absorción. Los ácidos grasos liberados son absorbidos por el enterocito. Una vez dentro de la célula, los ácidos grasos son unidos reversiblemente por transportadores, entre ellos las proteínas de unión a ácidos grasos (FABPs). Las FABPs pertenecen a una familia multigénica de proteínas, de distribución filogenética amplia, y que transportan ligandos hidrofóbicos (1). Los peces son modelos animales muy útiles para el estudio del metabolismo lipídico de los vertebrados ya que, al igual que en mamíferos, el tercio proximal del intestino es el mayor sitio de absorción de grasas (2). En el intestino de Danio rerio se pueden encontrar los ARNm de FABP1b y FABP2, cuyos patrones de expresión son diferentes sugiriendo diferencias funcionales. A pesar de los datos relevados hasta el momento nada se sabe acerca del destino de las proteínas codificadas por estos ARNm dentro del enterocito de Danio rerio. Se ha propuesto que si bien las distintas proteínas de la familia poseen estructura tridimensional semejante, cumplirían funciones distintas radicando su especificidad funcional en el tipo de ligando transportado o los mecanismos de regulación de su expresión, entre otros posibles factores. Nos hemos propuesto estudiar el comportamiento cinético frente a los posibles ligandos de las proteínas en estudio. Para ello hemos clonado ambos genes en vectores de expresión adecuados, expresado y purificado las proteínas correspondientes. Comenzando por FABP1b, hemos iniciado estudios de unión a diferentes ligandos hidrofóbicos por espectrofluorimetría, determinando las constantes de disociación y preferencias por distintos ácidos grasos. Estos análisis nos permitirán contribuir a identificar elementos que permitan diferenciar entre los posibles roles biológicos de FABP1b y FABP2 en la absorción lipídica, el metabolismo celular, las rutas de transporte y los mecanismos de adquisición de los ácidos grasos, como una aproximación tendiente a descifrar los caminos metabólicos de los ácidos grasos dentro del enterocito.

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P17) ANÁLISIS HIGH RESOLUTION MELT PARA EL GENOTIPADO DE POLIMORFISMOS DE UNA SOLA BASE GRIGNOLA, P; TRUJILLO, A; PANDULLI, I; NICOLINI, P Y CARRIQUIRY, M. Laboratorio de Técnicas Nucleares, Facultad de Veterinaria y Laboratorio de Biología Molecular y Endocrinología Metabólica, Facultad de Agronomía, UDELAR El análisis de las curvas de disociación del ADN obtenidas con instrumentos de alta resolución (HRM) es un método post-PCR simple, rápido y efectivo, recientemente desarrollado para el genotipado de SNPs. Este método permite, mediante el uso de un colorante fluorescente, diferenciar, por sus Tm, tanto las variantes alélicas homocigotas como las heterocigotas, las cuales a su vez se diferencian de las homocigotas por la forma de la curva de disociación. Se desarrolló la técnica para dos SNPs (SNP1 G/A y SNP2 C/T) localizados en 2 genes con productos amplificados de 90 y 142 bp y Tm de 81 y 84 ºC, respectivamente. Muestras de ADN genómico extraídas de sangre (n = 117 y n= 71 para SNP1 y SNP2, respectivamente) con concentraciones entre 20-30 ng/ul fueron analizadas para cada SNP en corridas independientes junto con una curva estándar y los tres genotipos controles en duplicado (previamente secuenciados). La reacción de PCR-HRM (Rotor Gene™ 6000, Corbett) utilizada incluyó colorante SYBR® Green. Se obtuvieron eficiencias de amplificación > a 0.90, los controles se comportaron de acuerdo a lo esperado dado el tipo de cambio de base involucrado y la concentración del producto amplificado fue similar entre las muestras y los controles; siendo estas condiciones necesarias para el correcto análisis de los datos. Los 3 genotipos de cada SNP (homocigotos GG, AA y TT, CC y heterocigotos GA y TC) fueron claramente identificados con niveles de confianza (asignados por el software) superiores a 90%. Muestras que mostraron un nivel de confianza inferior y/o en las que el perfil de la curva fue diferente a los controles, fueron repetidas (12%). El método fue exitoso en detectar cambios de bases G/A y C/T en los dos SNP estudiados resultando un método muy atractivo para el genotipado de alto número de muestras. Palabras claves: HRM, genotipado, SNP

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P18) CARACTERIZACIÓN DE LAS HISTONAS H1 DE PHYSCOMITRELLA PATENS ABREU C.A, VIDAL S.B, RAMÓN A.A

aSección Bioquímica, Facultad de Ciencias. bLaboratorio de Biología Molecular Vegetal, Facultad de Ciencias.

La histona H1, que interactúa con el ADN inter-nucleosomal, ha mostrado tener un

papel importante en la estructura superior de la cromatina. Sin embargo, el rol de

H1 no parece limitarse a una regulación general de la cromatina sino que puede

funcionar de manera específica en la activación o represión de ciertos genes. Por

otra parte, las distintas variantes de H1 parecen tener funciones específicas,

expresándose en forma diferencial durante el desarrollo o frente a determinadas

condiciones de estrés. En plantas superiores, el estudio de las histonas H1

mediante knock-out o silenciamiento ha arrojado resultados diversos, en parte

debido al mecanismo de compensación llevado a cabo por las diferentes variantes.

En este trabajo nos propusimos caracterizar y estudiar la función de las histonas

H1 en P. patens. Este musgo es un modelo vegetal sencillo cuyo genoma

secuenciado codifica un número elevado de genes con homología de secuencia con

genes de plantas superiores. Análisis bioinformáticos revelan en P. patens una

secuencia de ARNm, que codifica una proteína (PpH1) que presenta todas las

características de una histona de tipo H1. Empleando una fusión con la proteína

verde fluorescente se confirmó la localización nuclear de PpH1. Mediante Northern

blot se evaluó el nivel de transcripto en condiciones de estrés abiótico y en

presencia de hormonas, observándose diferencias bajo estrés térmico. Con el

objetivo de estudiar la función de este gen se utilizó una estrategia de

silenciamiento por ARN de interferencia. La línea transformante obtenida, en la

cuál el nivel de PpH1 se redujo un 30%, es más sensible al estrés salino y osmótico

pero no muestra diferencias con el control bajo estrés térmico. También se evaluó

en el espaciamiento nucleosomal, no observándose diferencias. Dado que no fue

posible obtener un alto nivel de silenciamiento del gen PpH1 se generó una

construcción para obtener un transformante knock-out de dicho gen.

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P19) DESARROLLO DE MÉTODOS MOLECULARES PARA LA

IDENTIFICACIÓN DE SUBESPECIES DE Eucalyptus globulus

RICHERO M., BARRACO VEGA M., CERDEIRAS M. P. Y CECCHETTO G.

Laboratorio de Microbiología, IQB, Facultad de Ciencias - Facultad de Química

Las subespecies de Eucalyptus presentan diferentes características a nivel de rendimiento y calidad de su madera. Por este motivo es importante saber qué especies se eligen para procesar, tanto desde el punto de vista de los costos de producción como de la conservación de recursos forestales. La subespecie E.globulus ssp globulus, una de las más utilizadas, no puede distinguirse por propiedades fenotípicas en etapas tempranas del crecimiento de la ssp maidenii.

Se plantea entonces el desarrollo de un método de identificación basado en marcadores moleculares: RAPD, que detecta sitios polimórficos distribuidos por todo el genoma sin necesidad de conocimiento a nivel de secuencia y SCAR, que se basa en la amplificación de sitios de secuencia conocida con primers específicos.

Se analizaron 47 iniciadores RAPD obteniendo perfiles complejos que no permiten identificar de forma sencilla las subespecies de interés debido a la alta variabilidad intra-subespecie. A partir de estos perfiles RAPD se analizaron y diseñaron primers para 12 bandas (potenciales marcadores SCAR) que se mantenían en una u otra subespecie y 4 bandas presentes en ambas subespecies (marcadores generales) que serán usados como controles internos en la reacción de amplificación. Estos marcadores potenciales fueron enfrentados a ADN extraído de 22 accesiones de la ssp globulus y 24 accesiones de la spp maidenii. Se descartaron 10 bandas por mostrar reacción cruzada entre subespecies. Dos bandas, G5EG1 de la ssp globulus y G5EM1 de la spp maidenii, no muestran reactividad cruzada y son específicos de la subespecie para la que fueron diseñados. Además estos dos marcadores presentan una buena amplificación cuando se ensayan conjuntamente con marcadores generales.

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P20) EXPRESIÓN DE LA HORMONA FOLÍCULO ESTIMULANTE HUMANA

EN LA PLANTA Physcomitrella patens

RUÉTALO N., COTA G., MARÍN M., VIDAL S., SEÑORALE M.

Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias.

La glicoproteína hipofisaria Hormona Folículoestimulante Humana (hFSH) promueve el

crecimiento y maduración de los folículos ováricos y la espermatogénesis, por lo que

tiene gran importancia clínica, siendo utilizada para tratamientos de infertilidad y

procedimientos de fertilización in Vitro. En la clínica se utiliza FSH derivada de orina

de mujeres postmenopáusicas y actualmente también se produce recombinante en

células CHO (Chinese Hamster Ovary).

La FSH presenta una estructura tridimensional compleja. Es un heterodímero con 11

puentes disulfuro y 4 N-glicosilaciones. Estas modificaciones postraduccionales -

indispensables para su función-, inviabilizan su producción en sistemas de expresión

procariotas. Physcomitrella patens es una planta briofita, que se utiliza como

organismo modelo de estudio, que ha sido propuesto hace poco tiempo como sistema

de expresión de proteínas recombinantes. Representa una alternativa muy atrayente

para producción de proteínas recombinantes debido a la sencillez de su manipulación,

y a que permitiría sintetizar complejos multiproteicos con modificaciones

postraduccionales, a bajo costo y sin patógenos humanos.

Nuestro objetivo es crear una cepa de P.patens que sintetice hFSH y poner a punto el

cultivo líquido de Physcomitrella como sistema de producción de proteínas complejas.

La estrategia experimental se divide en cuatro etapas: construcción de unidades

transcripcionales con promotores vegetales que codifiquen α-FSH y β FSH, inserción

dirigida de éstas a sitios específicos del genoma de P.patens, puesta a punto de

cultivos en medios líquidos y análisis de los productos obtenidos.

Utilizando PCR se generaron fusiones traduccionales de las secuencias codificantes de α-FSH y β-FSH con un péptido señal de una proteína propia de P. patens, y se clonaron bajo el control de promotores vegetales, flanqueados por secuencias para realizar recombinación homóloga en el genoma del musgo. Posteriormente se va a transformar protoplastos de P. patens con las construcciones ya generadas, seleccionar transformantes que expresen la proteína y caracterizar los productos obtenidos.

34

P21) BÚSQUEDA DE SEÑALES TRANSCRIPCIONALES EN TRITRYPS

SMIRCICH P.1, CERQUEIRA G.2, FORTEZA D.1, EL-SAYED N.2, GARAT B.1

1 Laboratorio de Interacciones Moleculares. Facultad de Ciencias. UdelaR. 2 Host-Pathogen Genomics Laboratory. Maryland University. Maryland. EEUU.

Los „„Tritryps‟‟ son tres protozoarios relacionados causantes de patologías de alta

prevalencia en humanos. Estos organismos presentan características excepcionales

entre las que se encuentran los mecanismos de expresión génica. En particular, las

ARN polimerasas (ARNP) poseen características exclusivas. La búsqueda de regiones

de inicio transcripcional de los genes codificantes de proteínas ha sido infructuosa.

Dada la organización en policistrones, las regiones de cambio de hebra han sido

implicadas en el inicio transcripcional. Por otra parte, la ARNPI en Trypanosoma

brucei sintetiza los preARNm que codifican para las proteínas VSG y PARP. En

eucariotas, los promotores de ARNPI se caracterizan por presentar elementos

conformacionales conservados aunque no de elementos de secuencia.

Nos proponemos determinar las características estructurales de las regiones de inicio de las ARNP en tripanosomátidos y establecer un sistema predictivo para estos sitios de unión. Asimismo planteamos una aproximación experimental en la que proponemos determinar las secuencias transcritas en exclusividad por cada ARNP. En este sentido hemos recopilado las secuencias correspondientes a los sitios de inicio de la ARNPI de aproximadamente 25 eucariotoas (incluyendo las conocidas de tritryps) y las secuencias correspondientes a todas las regiones de cambio de hebra de los tritryps. Con estas se construyeron bases de datos de sus características conformacionales. Los resultados obtenidos están siendo utilizados para el establecimiento del sistema predictivo que esperamos permita clasificar regiones del genoma de los parásitos como posibles sitios de unión para estas polimerasas. Experimentalmente, estamos llevando a cabo ensayos de run-on en presencia de -amanitina para establecer el transcriptoma de cada polimerasa. Hemos realizado

estos experimentos en formas prociclicas de T. brucei. El análisis por qRT-PCR de la sub-población de ARNs obtenida, estableció que la metodología consigue separar ARNs sintetizados de novo aunque las condiciones de inhibición de las ARNP deben ser ajustadas.

35

P22) LA PROTEÍNA SRSP1 (SPATS1), ES EXPRESADA

DIFERENCIALMENTE DURANTE EL DESARROLLO TESTICULAR DE LA

RATA

CAPOANO CA1, KUN A2, GEISINGER A1,3.

Departamentos de Biología Molecular1 y Proteínas y Ácidos Nucleicos (Unidad

Asociada a Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias)2, IIBCE

Sección Bioquímica/Biología Molecular, Facultad de Ciencias3

El gen Srsp1 fue identificado en nuestro laboratorio, como un gen codificante para

la primera proteína específica de testículo portadora de un largo tramo de serinas.

Aquí se describe el patrón de expresión del gen Srsp1, durante el desarrollo

embrionario y posnatal del testículo de rata, mediante Western blots e

inmunolocalización al microscopio confocal de fluorescencia. Srsp1 se detecta por

primera vez en el embrión a los 18 días post-coito, coincidiendo con el momento en

que los gonocitos adquieren un estado quiescente. La expresión aumenta luego del

nacimiento, alcanzando su máximo nivel a los 21 días pp durante la primera división

meiótica, principalmente en los espermatocitos paquiténicos (profase meiótica

media), y decayendo dramáticamente luego de la primera meiosis, hasta niveles

muy basales en el adulto (40 días), donde no se detectó señal en espermátidas en

elongación ni espermatozoides. Srsp1 se localiza mayormente en el citoplasma,

aunque en los espermatocitos paquiténicos se mapeó también en el interior de los

núcleos. La proteína contiene además una probable señal de localización nuclear de

tipo bipartito.

Tratamientos con fosfatasa alcalina nos permitieron comprobar que la proteína se

fosforila extensivamente (de manera todo o nada), y hemos propuesto que la

función de la misma involucraría la fosforilación del tramo de serinas. Asimismo,

hemos demostrado que la proteína está altamente conservada a lo largo de la

evolución, desde los mamíferos hasta algunos invertebrados, lo que es indicio de

una función importante.

Nuestros resultados sugieren que Srsp1 desempeñaría un importante rol en la

preparación de los cordones seminíferos para la primera onda espermatogénica, y en

el establecimiento y/o avance de la primera división meiótica.

36

P23) EVALUACIÓN DEL PAPEL DE LAS PROTEÍNAS MRE11 Y RAD50 EN

CÁNCER DE MAMA

ECHARTE L1, RODRÍGUEZ CUEVAS S2, HIDALGO A3, QUINTANAR V3, LÓPEZ-CAMARILLO

C1*

1Universidad Autónoma de la Ciudad de México, Posgrado en Ciencias Genómicas,

México DF. 2Instituto de Enfermedades de la Mama, FUCAM, México DF. 3 Instituto

Nacional de Medicina Genómica, México DF. * Autor corresponsable.

Las proteínas MRE11, RAD50 y NBS1 forman el complejo MRN, actor central en la

reparación de rupturas doble cadena del DNA (DSB), que al no ser reparadas pueden

causar muerte celular o variedad de alteraciones genéticas. Si bien el complejo MRN

es critico para mantener la integridad genómica y la supresión de tumores, aún

queda determinar el impacto que provoca su déficit en la predisposición al cáncer

de mama (CM) y su potencial valor clínico. En este trabajo analizamos la expresión

de MRE11 y RAD50 en biopsias de pacientes con CM, mediante inmunohistoquímicas

en microarreglos de tejidos, observándose una reducción del 24% en MRE11 y 14%

para RAD50.

Debido a la importante disminución de MRE11 en el tejido tumoral de las pacientes,

posteriormente analizamos si la disminución de la expresión de MRE11 inducida

mediante silenciamiento del gen en una línea celular de CM podría aumentar la

respuesta al tratamiento con un agente inductor de DSB. Primero, analizamos la

expresión de MRE11, RAD50 y NBS1 en las líneas celulares de CM (MCF-7, ZR-75-1 y

MDA-MB-231) mediante western blot, observando que presentan un patrón de

expresión diferencial. Posteriormente, silenciamos la expresión del gen MRE11 en

las células MDA-MB-231 mediante la transfección de 2 vectores con diferentes

secuencias blanco dirigidas contra MRE11 (pSilencer-mre11.1 y mre11.2)

advirtiéndose que la viabilidad de las células transfectadas con pSilencer-mre11.2

fue menor (79% vs 63%). Esta diferencia puede deberse al mayor grado de

silenciamiento logrado con pSilencer.mre11.2 (99 vs 51%). Finalmente, evaluamos el

efecto del cisplatino sobre las células transfectadas, no encontrando un aumento en

la sensibilidad al quimioterapéutico. Estos resultados sugieren que MRE11 y RAD50

desempeñan un papel crucial en la patogénesis del CM y que se requieren más

estudios en diversas líneas celulares para establecer si el déficit de MRE11 puede

potenciar el daño inducido por cisplatino.

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P24) DELECIÓN Y SIGUIMIENTO SUBCELULAR DE UreA, EL TRANSPORTADOR DE UREA DE Aspergillus nidulans SANGUINETTI, M, RAMÓN, A. Sección Bioquımica, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay

La urea es uno de los muchos compuestos que Aspergillus nidulans puede utilizar

como fuente de nitrógeno. Este compuesto nitrogenado es uno de los productos de

la degradación de las purinas pero también puede ser incorporado desde el medio

hacia el interior de la célula. Este ingreso puede darse por dos vías diferentes: a

través de un transporte activo mediado por una permeasa específica denominada

UreA, codificada por el gen ureA, que actúa cuando la concentración extracelular de

urea es baja, o mediante un fenómeno de difusión facilitada o pasiva cuando las

concentraciones extracelulares son altas. La transcripción del gen ureA es reprimida

ante la presencia de amonio o L-glutamina (fuentes de nitrógeno preferenciales) en

el medio de cultivo y es activada por el factor AreA ante la ausencia de estas

fuentes preferenciales de nitrógeno.

A partir de una técnica rápida y eficiente asistida por PCR conocida como “Double-Joint” PCR (DJ-PCR) se construyó un “cassette” génico de reemplazo con el cual pudimos deletar éxitosamente el gen ureA. Por otra parte, utilizando la misma técnica, fusionamos el gen ureA a la proteína verde fluorescente (GFP) con el objetivo de estudiar la localización subcelular de UreA.

Los resultados muestran que en condiciones de inducción de la expresión del gen ureA, la permeasa se localiza en la membrana de la hifa así como en los septos. En condiciones de represión, la permeasa es internalizada en lo que parecen ser vacuolas, revelando la existencia de algún tipo de mecanismo de regulación a nivel post-traduccional. Mediante ensayos con cicloheximida se reveló que, para la internalización de la permeasa, es necesaria la síntesis proteíca. Queriendo ahondar más en el proceso de internalización se realizaron experimentos con sacarosa (inhibidor de clatrina), donde se observó que la internalización se estaría dando a través de vesículas revestidas de clatrina.

38

P25) PRODUCCIÓN DE DECTINA-1 RECOMBINANTE PARA LA DETECCIÓN DE β-GLUCANOS.

TABARES.S, ROSSOTTI.M, GONZÁLEZ-SAPIENZA.G. Cátedra de Inmunología, Instituto de Higiene, Facultad de Química. La Dectina-1 es un receptor de la familia de las lectinas del tipo C, que se identifico inicialmente como un receptor de las células dendríticas que se unía a un ligando presente en células T; y posteriormente como el principal receptor para los β-glucanos. Dichos glucanos son los componentes principales de la pared celular de organismos del reino fungi y constituyen el principal tipo de “pathogen-associated molecular patterns” (PAMPs) que han sido identificados en estos organismos. Por su carácter de PAMPs, los β-glucanos poseen la capacidad de modular el sistema inmune, mostrando actividades anti-infectivas y anti-tumorales in vivo. Siendo la Dectina-1 el principal receptor de estos carbohidratos, la misma es responsable de mediar muchas de las respuestas inducidas por los β-glucanos, y por tanto tiene un rol central en la inmunidad antifúngica, reconociendo un gran número de especies de este reino. Dado su rol en el inicio de la inmunidad innata y por tratarse de un receptor endocítico, la Dectina-1 ha sido promovida como blanco de inmunización, mediante la conjugación del antígeno de interés a anticuerpos anti-Dectina-1 En el presente trabajo se clonó el ectodominio de la Dectina-1 en un vector procariota de expresión y posteriormente se optimizaron las condiciones de purificación de la Dectina-1 recombinante. Sorteando las dificultades vinculadas a la tendencia a la precipitación de la proteína renaturalizada, se logró establecer un protocolo de purificación que permite obtener importantes cantidades de la proteína recombinante soluble (1 mg a partir de 250 ml de cultivo). Con la Dectina-1 producida se montó un ensayo de ELISA sándwich para la detección de β-glucanos, que puede tener aplicaciones en el proceso de purificación de estos carbohidratos, y con el cual se estimó la concentración de β-glucanos presentes en diferentes extractos de hongos locales.

39

P26) EFECTO DE LA HIPOXIA PERINATAL SEVERA EN LOS NIVELES DE

ARNm Y PROTEÍNAS ESPECÍFICOS

FERNÁNDEZ, C.1, BLASINA F.2,3, SILVERA, F.3, TELLECHEA, S.2,3, VAAMONDE, L.2,3,

BOLIOLI, P.3 , MAÑANA, G.4, GODOY, C.2, DAJAS, F.2, MARTELL, M.3 Y BEDÓ, G.1

1Secc.Genética Evolutiva, Facultad de Ciencias, Montevideo, Uruguay.

2Depto de Neuroquímica, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable,

Montevideo, Uruguay.

3Depto de Neonatología, Área Básica y 4Depto de Anatomía Patológica,

Neuropatología, Hospital de Clínicas, Montevideo, Uruguay.

La asfixia perinatal conlleva generalmente daño hipóxico-isquémico cerebral,

determinando trastornos neurológicos crónicos e incluso la muerte. Por ello es

fundamental contar con un modelo para desarrollar estrategias neuroprotectoras

eficaces. En un modelo de asfixia perinatal, en cerdos recién nacidos, en los que se

han evaluado los cambios hemodinámicos, metabólicos e histológicos a diferentes

tiempos de sobrevida, nos proponemos contribuir con la caracterización molecular.

Hemos constatado previamente que el perfil de proteínas totales obtenido de

muestras de tejido cerebral presenta un patrón similar en animales sometidos a

hipoxia con respecto a los controles. Por otro lado, el ADN genómico y el ARN total

evidenciaron mayor “labilidad” con distinto grado de degradación, entre las 2 y 8

horas tras la hipoxia, mientras que en muestras extraídas a las 12 horas se observó

un patrón indistinguible con respecto a los controles.

En base a estos antecedentes hemos analizado los niveles de expresión de genes

específicos, para definir el perfil de los cambios que ocurren durante esta ventana

temporal, y en un futuro, evaluar los efectos de terapias neuroprotectoras.

Analizamos por PCR en tiempo real los niveles de ARNm. Inicialmente buscamos un

gen que no sea afectado por el tratamiento. El análisis de beta actina, la proteína

ribosomal RPL4 y el ARN 18S indicó que solo el primero evidencia niveles

relativamente estables y fue seleccionado como referencia. Los niveles de

expresión del gen HIG-1 (hipoxia-induced gene) no presentaron cambios

significativos a las diferentes horas, mientras que los del gen HIF-1 (hipoxia-induced

factor) sugieren una inducción a las 4 Hrs. de realizada la hipoxia.

Las proteínas específicas se analizaron en ensayos de western blot. Algunas

proteínas como GFAP y HIG1 no mostraron variaciones significativas. Otras, en

cambio, como la tubulina, se vieron afectadas en sus niveles o en la presencia de

productos de proteólisis.

40

P27) ESTUDIO DEL GEN PRNP (SCRAPIE) EN OVINOS SUFFOLK Y

CORRIEDALE DEL URUGUAY

PERAZA, P 1; RUBIAL, F 1; NEGRIN, N 2; SEGREDO, P 2; PERDOMO, E 3*; EHRLICH, R 1;

MARTÍNEZ DEBAT, C 1

1 UdelaR, Facultad de Ciencias, Sección Bioquímica 2 Sociedad de Criadores Suffolk del Uruguay 3 UdelaR, Facultad de Veterinaria * Fallecido durante la realización del presente trabajo

El Scrapie es una enfermedad de etiología priónica que afecta a ovinos y caprinos

siendo clasificada como una de las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles

(EET). Es una enfermedad neurodegenerativa y fatal que afecta el sistema nervioso

central. Su control no es sencillo debido a que el período de incubación es

extremadamente largo (entre 2 y 5 años) sin una sintomatología que la evidencie. A

posteriori comienzan los signos clínicos hasta una eventual muerte del animal en

pocos meses. Estos se caracterizan por ataxia, temblequera, pérdida de peso, pelo y

lana, etc. Para nuestro país, permanece aún como una enfermedad exótica. En el

presente trabajo se realizó el análisis mediante la secuenciación nucleotídica de una

región del gen prnp en 58 ovinos de razas Corriedale y Suffolk. Se partió de muestras

de sangre para obtener un fragmento del exón 2 del gen prnp (cromosoma 13),

mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores específicos. Se

secuenciaron los fragmentos amplificados y se realizó un análisis mediante la

utilización de programas bioinformáticos y estadísticos. Esto permitió analizar los

codones más importantes descritos en la literatura para la determinación de la

enfermedad. Se estudiaron los polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) que dan

características de susceptibilidad o resistencia a esta enfermedad. Estos son el 136,

154, 171, y el 141(Nor98). Los resultados muestran un alto porcentaje (89.5%) de

marcadores de riesgo frecuente y moderado, un 6.9% de riesgo muy bajo y un 3.6%

de alto riesgo. Aunque este tipo de análisis no forma parte de las evaluaciones

genéticas a nivel nacional, nuestros resultados sugieren que se ameritaría un estudio

a mayor escala para conocer el perfil genético de muestras representativas de las

majadas uruguayas.

Este trabajo fue financiado en parte por I.NA.C. (Proyecto “Desarrollo de

Herramientas Moleculares Preventivas de las Encefalopatías Espongiformes

Transmisibles”).

41

P28) ESTUDIO DEL SIALO-TRANSCRIPTOMA DE Haematobia irritans

irritans.

1PASTRO L., 1CURTO M., 2BREIJO M., 3BOLATTO C. Y 4FERNÁNDEZ C.

1Laboratorio de Interacciones Moleculares (Facultad de Ciencias), 2Unidad de

Reactivos y Biomodelos de Experimentación (Facultad de Medicina), 3Departamento

de Histología y Embriología (Facultad de Medicina) y 4Cátedra de Inmunología

(Facultad de Química)

La mosca de los cuernos (Haematobia irritans irritans) es un parásito hematófago de

distribución mundial que afecta principalmente al ganado bovino. En condiciones de

altas cargas parasitarias causa importantes pérdidas económicas (producción de

carne y leche) constituyéndose también en un vector para la transmisión de diversas

enfermedades. Actualmente, el control de las infecciones por H. irritans está

basado en el uso de insecticidas los cuales, además de ser nocivos para el medio

ambiente, generan rápidamente resistencia por parte del parásito.

A través del estudio del sialo-transcriptoma de H. irritans se busca identificar

polipéptidos secretados en la saliva capaces de interferir con la hemostasis y los

mecanismos inflamatorios del vertebrado parasitado. Se espera que esta

información permita diseñar y ensayar herramientas para el control inmunológico de

las cargas parasitarias.

A partir de ARNm extraído de glándulas salivales de moscas adultas, se preparó una

biblioteca de ADNc utilizando una metodología de oligo-capping, que permite clonar

copias de transcriptos completos. Los primeros resultados, derivados de unas 80

ESTs generadas a partir de clonas elegidas al azar, indican que el sialo-

transcriptoma de H. irritans presenta una baja complejidad; en términos generales,

se identificaron secuencias codificantes para todas las clases de proteínas

identificadas recientemente en un estudio proteómico de la saliva de Stomoxis

calcitrans (Wang et al, 2009). Se seleccionaron dos proteínas para su expresión en E.

coli. Estas moléculas poseen alta similitud con presuntos ortólogos de S. calcitrans:

un miembro de la familia HYP16 y el Antígeno 5. Actualmente, se está optimizando

la producción de las correspondientes recombinantes maduras (clonadas sin la

secuencia del péptido señal) expresadas con una extensión de poli-histidina; con

ellas, se realizarán próximamente ensayos de vacunación con la finalidad de ensayar

in vivo su potencial como moléculas inmunoprotectoras.

42

P29) MUTACIONES SINÓNIMAS AFECTAN LA ACTIVIDAD Y

LOCALIZACIÓN CELULAR DEL RECEPTOR DE ESTRÓGENOS ALFA

HUMANO.

FERNÁNDEZ T.1, HORJALES S.1, ALBERTI A.2, ASTRADA S.2, BOLLATI M.2, MARÍN M.1

1 Sección bioquímica de la Facultad de Ciencias UDELAR. 2 Institut Pasteur de Montevideo.

El conocimiento de los mecanismos que determinan cual es la conformación de las

proteínas in vivo es aun limitado. En la célula, el plegamiento de proteínas es un

proceso fundamentalmente co-traduccional y por tanto, cambios en los

componentes de la maquinaria de traducción podrían afectar la conformación de la

misma que está siendo sintetizada. Nuestro objetivo es comprender cómo influye la

cinética de traducción en el plegamiento de proteínas y cuál es el efecto de codones

sinónimos en su secuencia codificante. Tomamos como modelo al receptor de

estrógenos alfa humano (ERα), un factor de transcripción inducible por ligando que

media la actividad de los estrógenos. Cambios en la conformación de ésta proteína

han sido propuestos como reguladores de su actividad biológica.

Resultados previos de nuestro grupo realizados mediante traducción in vitro y

proteólisis limitada, sugieren que los componentes de la maquinaria de traducción

celular pueden modificar las vías de plegamiento del ERα y la abundancia relativa de

diferentes conformaciones del receptor.

En este trabajo, estudiamos la funcionalidad del ERα en células humanas

transfectadas. Se comparó la actividad del receptor sintetizado a partir de la

secuencia salvaje y algunas mutaciones sinónimas ubicadas en la región amino

terminal (mutantes llamados 3P, 5PL y 2PL). Cuando se emplearon células HepG2, la

expresión de los mutantes 5PL y 2PL mostraron menor actividad de transactivación,

a pesar que los niveles de expresión fueron comparables al ERα wt. Por

inmunofluorescencia se analizó la localización subcelular del ERα wt y de sus formas

mutantes y se observaron diferencias en la distribución celular de los mutantes al

salvaje. Nuestros resultados sugieren que el uso de codones sinónimos en células

humanas, puede afectar la funcionalidad de las proteínas, eventualmente alterando

su localización subcelular, y/o su conformación tridimensional.

Financiado por CHLCC, FCE y ANII, Uruguay

43

BIOTECNOLOGÍA P30-P40

P30) DESARROLLO DE BIOCATALIZADORES MODIFICADOS

GENETICAMENTE PARA LA CONVERSION DEL GLICEROL EN 1,2-

PROPANODIOL.

IGLESIAS, C., A SIERRA, W., B MENÉNDEZ, P. B Y RODRÍGUEZ, S. A, B

aCátedra de Microbiología, DEPBIO, y bLab. de Biocatálisis y Biotransformaciones,

DEPBIO-DQO, Facultad de Química, Gral. Flores 2124, 11800 Montevideo, Uruguay.

En el ultimo siglo se ha dado un auge en la búsqueda de energías alternativas, en Uruguay en particular se la ha dado importancia a la producción de biocombustibles, biodiesel y etanol. El proceso productivo de biodiesel genera como subproducto Glicerol (1,2,3-propanotriol) en una proporción aproximada a 9:1 medido en peso (Biodiesel:Glicerol). Nuestro grupo se ha planteado desarrollar biocatalizadores de utilidad en la

conversión del glicerol a 1,2-propanodiol El 1,2-propanodiol o sus derivados, son

material fundamental en la industria farmacéutica donde la síntesis de drogas en su

forma ópticamente pura es un requisito actualmente indiscutible un ejemplo es (S)-

Propilen carbonato que es un producto de acción antiviral

Nuestra estrategia se basó en el desarrollo de cepas de S. cerevisiae modificadas

genéticamente para la producción del 1,2-propanodiol. Los sistemas de sobre

expresión enzimática han sido diseñados utilizando como microorganismo receptor

la cepa S. cerevisiae YPH500 ura3–52 lys2–801amber ade2–101ochre trp1–Δ63 his3–

Δ200 leu2–Δ1 transformada con el vector de expresión construido a partir del

plásmido pESC-TRP, este vector esta diseñado para la expresión y el análisis

funcional de dos genes eucariotas en la levadura S. cerevisiae ya que contienen los

promotores GAL1 y GAL10 en orientación contraria lo que da la posibilidad de clonar

y coexpresar dos genes en la misma cepa. Se utilizó este sistema para la expresión

de los genes GRE2 e YPR1 que producen una metilglioxal reductasa y una aldehído

reductasa, con las cuales se propone realizar una ruta metabólica modificada (Fig

1).

OH OH

OH

O

O

HO

OH

Glicerol Metilglioxal Lactaldehído 1,2-Propanodiol

NAD(P)H + H+ NAD(P) +

Ypr1pGre2p

NAD(P)H + H+ NAD(P) +

O

OH

La realización de este trabajo ha implicado amplificación de los genes por PCR y su

clonado en el vector pCR 2.1-TOPO. Se verificó la secuencia de ambos genes,

subclonándolos luego en el vector pESC-TRP con el cual se trasformo la cepa de

expresión.

44

P31) ESTUDIO MOLECULAR DE CITRULINEMIA PARA DIAGNOSTICO

DIFERENCIAL EN UNA TERNERA HOLANDO CON SINTOMATOLOGIA

NERVIOSA.

TRENCHI G¹; KELLY L¹; RIVERO² R; PERAZA P¹.

1-Unidad de Biotecnología Animal INIA Las Brujas.

Ruta 48 Km 10, Rincón del Colorado.

2-DILAVE-Paysandú. Laboratorio Regional Noroeste.

Ruta 3 Km 369.

La citrulinemia bovina es una enfermedad autosómica recesiva observada en la raza

Holstein-Friesian. Afecta al ciclo de la urea debido a la deficiencia de la enzima ASS

(argininosuccinate-synthetase). Provoca un cuadro neurológico letal en terneros a

los pocos días de nacer por la acumulación de amoníaco en el organismo por la falta

de detoxificación del mismo.

Se recibe una muestra de hígado en formaldehído al 10% de una ternera Holando con

signos nerviosos en el la Unidad de Biotecnología Animal de INIA Las Brujas para el

diagnóstico de citrulinemia mediante la técnica de PCR.

Es remitida por DILAVE-Paysandú para realizar parte de un diagnóstico diferencial

que incluye enfermedades infecciosas, tóxicas y hereditarias.

Para la extracción de ADN a partir del tejido fijado en formaldehído se desarrolla

una nueva técnica ya que existe poca información bibliográfica disponible. Se utiliza

un patrón del ISAG diagnosticado como portador de citrulinemia y ADN extraído de

muestras de sangre de vacas Holando del tambo La Estanzuela como controles.

De acuerdo al método descrito por Grupe et al.1996 se logra amplificar un

fragmento de 185 pb que detecta la mutación en el gen que codifica la ASS.

Los fragmentos obtenidos son sometidos a la acción de la enzima de restricción Eco

47I (RFLP) para su digestión y evaluados por electroforesis en gel de agarosa al 4%.

Se obtienen 3 bandas (185-103-82 pb) a partir del control del ISAG confirmando que

es portador del gen mutante y 2 bandas (103-82 pb) en el resto de las muestras

analizadas. En ninguno de los casos se observa un solo fragmento sin cortar de 185

pb (homocigoto y afectado de citrulinemia).

Se concluye que la citrulinemia no es la causa del cuadro nervioso ya que la ternera

no presentaba ninguna alteración en el gen que codifica a la enzima.

45

P32) EXTRACCION DE ADN PARA PCR A PARTIR DE UN TEJIDO FIJADO

EN FORMALDEHIDO

TRENCHI G¹; KELLY L¹; RIVERO R²; PERAZA P¹.

1-Unidad de Biotecnología Animal INIA Las Brujas.

Ruta 48 Km 10, Rincón del Colorado.

2-DILAVE-Paysandú. Laboratorio Regional Noroeste.

Ruta 3 Km 369.

Se decide probar un nuevo protocolo para la extracción de ADN a partir de una

muestra de hígado fijada en formaldehído al 10% debido a la escasa bibliografía

encontrada sobre el tema. El ADN obtenido es utilizado para realizar un diagnóstico

diferencial de citrulinemia mediante la técnica de PCR.

De acuerdo a la publicación de P. García et al 2006 se demostró que el formaldehído

produce entrecruzamientos (cross-linkange) entre los ácidos nucleicos y las

proteínas e hidroliza puentes fosfodiester provocando problemas para obtener ADN

de buena calidad. Además disminuye el rendimiento de la amplificación por PCR

dependiendo del tiempo y temperatura de la fijación. Para la experiencia se

tomaron 0.100 gramos del hígado que se cortaron en pequeños fragmentos.

Posteriormente se lavaron con agua MQ para retirar la mayor cantidad de

formaldehído posible.

Al material se le agregaron 5 ml de buffer de lisis y 25 l de proteinasa K (20 mg/ml)

y se dejó incubando a 37 ºc por 7 días agitando suavemente.

Para mejorar la calidad del ADN extraído y aumentar la eficiencia de amplificación

se utilizó el kit de extracción DNA SORPOclean™ Genomic DNA Extraction Module

(SORPO). Se adicionaron 2 l de RNAsa a la suspensión obtenida para una mejor

digestión proteica.

Al ser evaluado en un gel de agarosa al 0.8% el ADN aparece degradado, en el

nanadrop se obtienen los siguientes valores 357.72 ng/l, 1.69 (260/280), 1.40

(260/230). Se desconoce el tipo de formaldehído utilizado para la fijación. Esto hace

muy difícil determinar el grado de degradación provocado, especialmente si este no

es tamponado.

Se realiza el PCR consiguiéndose el fragmento esperado de 185 pb que detecta la

mutación en el gen que codifica la ASS.

Se concluye que el método de extracción utilizado es adecuado ya que se logró ADN

suficiente para el diagnóstico.

46

P33) ESTUDIO DE LA PRODUCCIÓN DE POLIHIDROXIBUTIRATO POR

Herbaspirillum seropedicae EMPLEANDO DIFERENTES FUENTES DE

CARBONO

MALAN, A.K., CATALÁN, A.I., Y BATISTA, S.

Unidad de Microbiología Molecular-Laboratorio de Ecología Microbiana, Instituto de

Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE)

El polihidroxibutirato (PHB) es un homopolímero de 3-hidroxibutirato producido

como material de reserva por una amplia variedad de microorganismos. Se

sintetizan en condiciones desbalanceadas de crecimiento y exceso de fuente de

carbono. Estos biopolímeros provienen de fuentes renovables, son termoplásticos y

biodegradables, constituyendo un material alternativo a los plásticos petroquímicos.

Sin embargo, su aplicación industrial está limitada por los altos costos de

producción, siendo la fuente de carbono el rubro que contribuye más

significativamente.

Existen varios residuos o subproductos agroindustriales que pueden ser empleados

como sustrato carbonado para la producción de PHAs. La hemicelulosa, uno de los

residuos agroindustriales más abundantes, está compuesta principalmente por

azúcares de 5 carbonos como la xilosa, arabinosa, y en menor proporción de

glucosa.

Herbaspirillum seropedicae es una bacteria diazótrofa, endófita de diversas plantas incluyendo caña de azúcar, maíz, banana y arroz. Es capaz de crecer y acumular PHAs en presencia de diversos carbohidratos (glucosa, arabinosa, xilosa) (Catalán et al., 2007). El objetivo de este trabajo es estudiar la producción de PHB por H. seropedicae Z69 cultivado en presencia de glucosa, xilosa y arabinosa y/o mezcla de las mismas como únicas fuentes de carbono. En presencia de glucosa, con una relación molar C/N de 25 mol.mol-1, la bacteria acumula un 60% de PHB. Al utilizar la mezcla de xilosa-glucosa-arabinosa, en una proporción porcentual similar a la de la hemicelulosa de bagazo de caña, produce 8,7 g/l de biomasa con un contenido del 56% de PHB. Estos resultados son comparables a los descritos en la bibliografía para otros microorganismos (Silva et al., 2004) Como perspectivas futuras se plantean estudiar la producción de PHB empleando hidrolizados de hemicelulosa como sustrato carbonado y la optimización de la misma mediante el análisis de flujos metabólicos asociado a técnicas de ingeniería genética y posterior ajuste de las condiciones de fermentación.

Catalán et al., 2007 Enzyme and Microbial Technology 40: 1352-1357

Silva et al., 2004 J. Ind. Microbiol. Biotechnol 31: 245-254

47

P34) RECEPTOR DE OXITOCINA EN EL EPITELIO DEL CERVIX CRANEAL

OVINO DURANTE EL CICLO ESTRAL.

GONZALEZ, M. R. Y RODRÍGUEZ PIÑÓN, M.

Área Bioquímica, Departamento de Biología Molecular y Celular, Facultad de Veterinaria, Montevideo, Uruguay

Se estudió la distribución del Receptor de Oxitocina (ROx) en el epitelio luminal

apical de los pliegues del cervix craneal ovino durante el ciclo estral. Ovejas

Corriedale adultas fueron sacrificadas a los días 1 (n=4), 6 (n=4) o 13 (n=4) del estro

sincronizado (día=0). El ROx se detectó por inmunohistoquímica utilizando un

anticuerpo monoclonal contra hROx (ROTHO PHARMACEUTICAL CO., LTD.). En

campos (40X) de la porción apical de los pliegues del cervix craneal de cada oveja se

tomaron 10 imágenes que fueron procesadas para obtener solamente el epitelio

luminal (Photo Shop 10.0) y segmentadas utilizando dos tonalidades diferentes de

positividad: intensa y leve. Se midió el porcentaje de área ocupada por cada una de

las tonalidades (%intensa y %leve) y su suma (%total) en función del área de epitelio

(Image Pro Express). Los datos fueron analizados por ANOVA y Test de t. El %intensa

fue menor al día 1 respecto al día 13, mientras que el %leve fue mayor al día 1

respecto a los días 6 y 13 (Figura). No se obtuvo diferencia en el %total a lo largo del

ciclo estral (Figura). Independientemente del día del ciclo estral, el %intensa fue

menor que el %leve (21.0 ± 5.1 vs. 34.5 ± 5.5), (p<0.0001). Los resultados muestran

que la distribución de la inmunoseñal del ROx en el epitelio luminal apical de los

pliegues del cervix craneal

ovino varía a lo largo del ciclo

estral.

Figura: Porcentaje de área positiva (intensa, leve y total) al ROx (media±sem) en el epitelio luminal apical de los pliegues del cervix craneal de ovejas a los días 1, 6 o 13 (n=4 en cada grupo) de la detección del estro (día=0). Columnas de la misma serie con diferentes letras difieren

significativamente (P<0.05).

Financiación: CIDEC-Facultad de Veterinaria; ANII-Proyecto FCE_487.

Agradecimientos: Isabel Sartore y Alejandro Bielli.

48

P35) BIOTECNOLOGÍA DE PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS

DÍAZ DELLAVALLE, P.A, DALLA RIZZA, M.A, CABRERA, A.A, ALTIER, N.B, FERREIRA, F.C

A Laboratorio de Proteínas, Unidad de Biotecnología, INIA Las Brujas, Uruguay; B Protección Vegetal, INIA Las Brujas, Uruguay; cLaboratorio de Carbohidratos y Glicoconjugados, Instituto de Higiene, Uruguay. En la era post-genómica e inicio de la proteómica, el hombre busca nuevas

alternativas al uso de pesticidas para el control de fitopatógenos. Dentro de estas

estrategias se incluye el estudio de los sistemas de defensa propios de los

organismos. La inmunidad innata constituye la rama evolutivamente más antigua de

los mecanismos de defensa, ya que se ha observado en organismos diferentes

mecanismos moleculares similares para responder a patógenos. Entre los diversos

componentes de la inmunidad innata, que comprende barreras estructurales y

bioquímicas, en la actualidad ha cobrado gran importancia el estudio de los

Péptidos AntiMicrobianos (PAMs). Hasta la fecha, se han descrito más de 800

posibles tipos de PAMs distribuidos en plantas, invertebrados, vertebrados, hongos y

procariotas, sugiriendo una gran relevancia biológica. Tanto los animales como las

plantas usan estos péptidos para defenderse contra un amplio espectro de

patógenos.

A pesar de los progresos considerables en el estudio de péptidos contenidos en

plantas, se conoce muy poco acerca de PAMs de especies de la flora nativa. El

objetivo del presente estudio es purificar y caracterizar péptidos con actividad

antimicrobiana contenidos en semillas de Amaranthus quitensis, maleza presente en

nuestro país.

El trabajo se está realizando en dos fases: 1) purificación del péptido

antimicrobiano, así como su caracterización bioquímica y elucidación estructural, y,

2) determinación del mecanismo de acción.

Se han realizado etapas de purificación que incluyen técnicas bioquímicas y

cromatográficas. Las diferentes fracciones peptídicas obtenidas han sido evaluadas

mediante bioensayos contra fitopatógenos de relevancia agronómica. Las fracciones

que presentaron porcentajes de inhibición mayor a 50%, están siendo caracterizadas

por espectrometría de masas. Mediante estudios posteriores se espera determinar la

estructura mínima responsable de la actividad antimicrobiana, así como su

mecanismo de acción. Esto permitirá caracterizar nuevas biomoléculas,

constituyendo una alternativa de control de fitopatógenos, área emergente en

nuestro país.

Este trabajo de Tesis de Doctorado en Química se está realizando gracias al apoyo financiero otorgado por el PEDECIBA Química, Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII), e Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria (INIA, Proyecto BT_04).

49

P36) PROPIEDADES Y APLICACIONES DE LA -GALACTOSIDASA DE

Bacillus circulans INMOVILIZADA EN SOPORTES ACRÍLICOS

TORRES, P. Y BATISTA-VIERA, F.

Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de Química,

Universidad de la República, General Flores 2124, Montevideo, Uruguay.

La -galactosidasa de Bacillus circulans presenta una termoestabilidad superior a las

lactasas de levaduras, posee un pH óptimo de 6.0, coincidente con el pH del

lactosuero, y no requiere cofactores metálicos para su actividad. La inmovilización

de la enzima ofrece ventajas en su aplicación biotecnológica, permite su reuso, y la

separación del catalizador y los productos de reacción.

Los soportes acrílicos epoxi-activados son esferas de polímero acrílico con grupos

epóxido ligados, los cuales participan en la unión covalente de enzimas y otras

proteínas. Este tipo de soportes son muy estables desde el punto de vista químico y

mecánico.

En el presente trabajo se estudiaron algunas de las propiedades y aplicaciones de la

-galactosidasa de B. circulans inmovilizada covalentemente en tres tipos de resinas

acrílicas epoxi-activadas: Eupergit C, Sepabeads EC-EP y Sepabeads EC-HFA. Los

derivados resultaron muy estables en el rango de pH 5.5-7.5. Se determinaron a su

vez las estabilidades térmicas de derivados obtenidos a distinta carga aplicada y a

distintos tiempos de inmovilización para el caso de los tres soportes. La pérdida de

eficiencia catalítica a baja carga y la estabilidad térmica excepcional resultante

podría sugerir unión multipuntual. Para reforzar esta hipótesis, se determinaron las

eficiencias catalíticas y estabilidades térmicas de derivados obtenidos a cargas baja,

media y alta por inmovilización en Eupergit C y posterior tratamiento alcalino post-

inmovilización, buscando favorecer la unión multipuntual. Los derivados con mayor

termoestabilidad fueron aquellos sometidos a tratamiento alcalino durante más

tiempo, y se observa una reducción concomitante de eficiencias catalíticas.

Los derivados se aplicaron a la hidrólisis de lactosa en batch usando lactosa 4.6% en

buffer y lactosueros ajustados a pH 6.0 como sustrato. Los mayores niveles de

conversión se obtuvieron cuando se utilizaron lactosueros de queso Mozzarella y

derivados enzimáticos en Eupergit C y Sepabeads HFA.

50

P37) DETECCION Y CONFIRMACION DE LOS VIROIDES CITRICOS

PRESENTES EN URUGUAY A PARTIR DE MUESTRAS EXTRAIDAS DE

CAMPO

PAGLIANO, G1, UMAÑA, R1 Y PRITSCH C1.

1 Laboratorio de Biotecnología, Facultad de Agronomía, UdelaR.

Los viroides presentes en las plantaciones citrícolas de Uruguay son CEVd (Citrus

Exocortis Viroids), CBLVd (Citrus Bent Leaf Viroids), HSVd (Hop Stunt Viroids) y

CDVd (Citrus Darwarfing Viroid). En el año 2000 éstos viroides han sido detectados y

caracterizados mediante sPAGE seguido de Northern y/o Dot o Slot blot, mediante

hibridación molecular con sondas específicas marcadas con digoxigenina a partir de

muestras de tejido de planta indicadora Cidro Etrog 861.

En la actualidad se dispone de una nueva metodología desarrollada por Murcia N.,

2008. Con el uso de ésta metodología adaptada a nuestras condiciones se ha podido

confirmar la presencia de los viroides previamente descriptos presentes en nuestro

país (CEVd, CBLVd, HSVd y CDVd) a partir de cortezas de rama de árboles a campo.

La metodología consiste en extracción de ARN (Semancik,1975), PAGE seguido de

Northern, fijación de la membrana con cross linking, hibridación con sondas

marcadas con digoxigenina y autorradiografía con sustrato CSPD. La metodología ha

sido ensayada con éxito para todas las variedades de citrus y en cualquier época del

año y aún a partir de tejidos congelados.

Los resultados reflejan alta especificidad, sensibilidad y rapidez, evitando la etapa

de indexing de plantas indicadoras, donde la expresión de síntomas requiere de 1 a

3 meses bajo condiciones controladas. El límite de detección obtenido se encuentra

entre 4-8mg de tejido infectado. Se confirma que en nuestras plantaciones citrícolas

los viroides presentes antes mencionados aparecen en combinaciones de dos o más

viroides, detectados inicialmente con las técnicas previamente empleadas.

Hoy la ciencia demanda y es una necesidad disponer de métodos moleculares

sensibles, específicos, sencillos, de bajo costo y rápidos para la incorporación en el

Programa de Certificación, Sistemas Cuarentenarios y en el control de los bancos de

germoplasma existentes en nuestro país.

Palabras claves: detección, viroides cítricos, PAGE-Northern, Uruguay.

51

P38) EFECTO DE LA CO-INOCULACION RIZOBIO-Delftia EN EL

DESARROLLO DE TREBOL

BRAÑA,VICTORIA1; MOREL, MARIA1; CASTRO-SOWINSKI, SUSANA1,2.

1 Unidad de Microbiología Molecular, IIBCE. 2Sección Bioquímica, Facultad de

Ciencias.

Las PGPR son un grupo de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal, entre

las cuáles se encuentran los rizobios (fijadores simbióticos de nitrógeno). Varios

estudios han demostrado que la co-inoculación de leguminosas con rizobios y otras

PGPRs incrementa la velocidad de nodulación, el número de nódulos por raíz y la

fijación de nitrógeno, y por lo tanto, el desarrollo de la planta.

En nuestro laboratorio, se aislaron tres microorganismos del género Delftia, uno de

los cuales (JD2) promueve la infectividad del rizobio comercial Sinorhizobium

meliloti U143 en alfalfa, promoviendo la simbiosis.

El objetivo de este trabajo fue analizar los mecanismos de promoción de

crecimiento vegetal en los 3 aislamientos de Delftia y la capacidad de JD2 para

promover el crecimiento de plantas de trébol, en ensayos de co-inoculación con el

rizobio comercial Rhizobium trifolii U204.

Se evaluó la capacidad de los aislamientos de producir fitohormonas, sideróforos y

proteasas, solubilizar fosfatos, y fijar nitrógeno en vida libre También se evaluó la

capacidad de promoción de crecimiento vegetal de plantas de trébol en ensayos de

inoculación con JD2 y co-inoculación U204- JD2, en condiciones gnotobioticas.

Se encontró que los tres aislamientos son incapaces de solubilizar fosfatos, pero

producen sideróforos, exoproteasas, elevadas cantidades de ácido indol-acético y

crecen en medio Nfb (libre de nitrógeno). JD2 fue capaz de fijar nitrógeno según

ensayos de reducción de acetileno y mostró un efecto promotor de la infectividad de

U204 en trébol (aumento de biomasa aérea y de cinética de nodulación)

Los estudios futuros se focalizarán en la búsqueda de la mejor relación U204-Delftia capaz de dar el mayor rendimiento vegetal en trébol, con el fin de obtener un inoculante mixto.

52

P39) LOS ENSAYOS DE EMBRIOTOXICIDAD EN PEZ CEBRA DETECTAN

UNA VARIEDAD DE EFECTOS TERATOGÉNICOS DEL GLIFOSATO

BORTAGARAY, V., CRUCES ARAMBURU, R., DEL PUERTO, G., BARRIOS, L., OJEDA, P.,

SARAVIA, A., RODRÍGUEZ-ITHURRALDE, D.

Laboratorio de Neurociencia Molecular y Núcleo de Biotecnología y Marcadores

Moleculares, Instituto Clemente Estable (IIBCE). E-mail: drit@iibce.edu.uy

Creciente evidencia internacional sugiere que los herbicidas a base de glifosato, los

más usados mundialmente, presentan alta toxicidad para formas inmaduras de

anfibios y peces, representando una potencial amenaza para la biodiversidad, la

pesca y la piscicultura, que debe ser detectada y monitoreada. Con ese fin hemos

desarrollado en Danio rerio, tests multiparamétricos de embriotoxicidad en placas

de ELISA de 24 y 96 pocillos, que permiten cientos o incluso miles de ensayos

simultáneos (Ojeda et al. 2007). Expuestos al compuesto a partir de 1-1.5 horas

post-fecundación (1hpf), los embriones experimentaron una mortalidad dependiente

de dosis y tiempo de exposición. A una concentración final (ccf) de glifosato de 12.5

g/ml, no hubo diferencias significativas de mortalidad con controles; fue

significativa a partir de 25 g/ml (23% a 24hpf; 27% a 48hpf; 31.2% a 72hpf). A

24hpf, a ccf de 50 g/ml la mortalidad es 35.4%, a 75 g/ml es 74% y a 150 g/ml

82%. El porcentaje de embriones que eclosionaron a 72 hpf estuvo

significativamente aumentado a ccf de 12,5 g/ml, liberándose al medio, en

consecuencia, formas más inmaduras que los controles. La frecuencia cardíaca

(48hpf) estuvo significativamente disminuida a partir de ccf de 25 g/ml,

verificándose un enlentecimiento circulatorio a 75g/ml. A 50 g/ml apareció

edema cardíaco y retardo en la separación del saco vitelino. A 75g/ml, 100 % de los

embriones presentaron alteraciones del desarrollo tales como: edemas de somites

con disminución de movimientos de flexión, malformación del saco vitelino, edema

cardio-pericárdico, gibas o divisiones de la cola y groseras malformaciones

incompatibles con la sobrevida. En conclusión, es un test de embriotoxicidad rápido,

sensible, reproducible y de bajo costo, que demuestra teratogénesis a rangos de

concentración de glifosato que se reportaban como atóxicos y que se han verificado

en estudios de campo.

Apoyado por PEDECIBA (BIOLOGÍA)

53

P40) OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO PARA

PRODUCCION DE LEVADURA PARA BIOCONTROL EN MANZANAS

LABADIE, V.; VERO, S.

Cátedra de Microbiología. Departamento de Biociencias. Facultad de Química. Gral

Flores 2124. Montevideo. Uruguay. E-mail: vanessalabadie@gmail.com

Las enfermedades de postcosecha constituyen una importante causa de pérdidas de

fruta, siendo Penicillium expansum y Botrytis cinerea los principales patógenos

postcosecha de manzana. Como alternativa a la utilización de fungicidas químicos se

han planteado estrategias de control biológico. Se han aislado, identificado y

seleccionado 2 cepas de levaduras antagonistas capaces de biocontrolar

enfermedades poscosecha de manzana lográndose niveles de protección de hasta

90%.

El objetivo del presente trabajo es optimizar las condiciones de producción de los

antagonistas seleccionados a mayor escala en medio líquido.

En primer lugar se determinó temperatura y pH óptimo de crecimiento de cada

biocontrolador. Se estudió mediante auxanograma los sustratos carbonados y

nitrogenados que dichas levaduras asimilan. Para los ajustes de composición del

medio líquido se utilizó glucosa como fuente de carbono y cloruro de amonio como

fuente de nitrógeno y las concentraciones utilizadas son las que se desprenden de la

relación estequeometrica según la composición molecular de la biomasa,

considerando que los microorganismos utilizan un 50 % de la glucosa para energía y

50% para formación de biomasa. Se variaron también las concertaciones de glucosa

manteniendo la proporción estequiometrica determinándose la concentración

mínima inhibitoria. Se probó el agregado de extracto de levadura en diferentes

concentraciones para determinar la incidencia de vitaminas en el crecimiento. A su

vez se estudió la influencia de la agitación en el rendimiento final. Los resultados

mostraron que las fuentes de C y N estaban en exceso, y que el oxígeno disuelto era

el reactivo limitante.

54

GENÉTICA, GENÓMICA Y BIOINFORMÁTICA P41-P55

P41) COMPARACIÓN DE DOS TÉCNICAS MOLECULARES (RT-PCR VS.

PCR-RFLP) PARA DETERMINACIÓN DE ESPECIES DE CÁNIDOS

GONZÁLEZ 1 S., CARLOZZI1 A., COSSE1 M., DUARTE2 J.M. B. & MALDONADO J. E. 3

1 Genética de la Conservación-IIBCE -UA Facultad de Ciencias Av. Italia 3318 11600

Montevideo-Uruguay 2 Núcleo de Pesquisa e Conservação de Cervídeos-Departamento de Zootecnia /

Universidade Estadual Paulista Via de Acesso Paulo Donato Castellane, s/n 14884-

900, Jaboticabal – SP,Brasil. 3 Center for Conservation and Evolutionary Genetics, National Zoological Park/,

Smithsonian Institution. 3001 Connecticut Ave. NW., Washington, DC 20008 USA

Las técnicas de diagnóstico de especies basadas en marcadores moleculares han

tenido un especial desarrollo en las últimas décadas, permitiendo utilizar ADN

extraído de materiales antiguos y fecas. El número de especies de cánidos es un

indicador ampliamente utilizado para analizar el estado de conservación de las

áreas naturales. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un marcador molecular

eficiente para determinar la presencia y distribución de las especies de cánidos

Neotropicales en el Uruguay. Para ello amplificamos con primers universales, un

fragmento de la región de control mitocondrial (460 pb) en 45 ejemplares de

cánidos de nuestro banco de ADN de referencia. Analizamos los patrones de

variabilidad inter e intraespecífico y diseñamos un juego de primers específico que

amplifica 232 pb, para efectuar PCR-RFLP y discriminar entre las especies de

zorros presentes en el Uruguay. Este fragmento tiene un sitio de corte para la

enzima de restricción Spe I presente sólo en el zorro de monte Cerdocyon thous.

La técnica consiste en: 1) extracción de ADN de fecas; 2) amplificación del

fragmento de ADNmt por PCR; 3) digestión del producto amplificado con la enzima

Spe I; y 4) electroforesis en un gel de agarosa al 3% con la cual se determina la

especie en función del patrón de bandas observado: una banda de 232 pb

corresponde al zorro gris Pseudalopex gymnocercus y dos bandas de 68 y 164 pb en

Cerdocyon thous. El mismo marcador fue empleado utilizando RT-PCR en el canal

de “High Resolution Melting”, utilizando el fluorocromo Eva Green (Qiagen®

HRM™). Esta técnica permitió discriminar amplicones polimórficos teniendo un

nivel de resolución de una mutación. El análisis de las curvas de desnaturalización

(melting) mostró que es posible discriminar entre las especies. Esta última técnica

presenta mayor eficiencia, rapidez y confiabilidad en el diagnóstico taxonómico.

55

P42) POLIMORFISMOS GENETICOS RELACIONADOS CON INSULINO-

RESISTENCIA. ESTUDIO PRELIMINAR

REYES AL1, SOUTO J1, ACOSTA M2, AIRAUDO C2, FERRERO R3, SIMONELLI B2, SOTO

E3, VITARELLA G4, FERNANDEZ J2, JAVIEL G2,4. MIMBACAS A1

1. Grupo de Genética Humana, Dpto. Genética, IIBCE

2. Policlínica de Endocrinología Hospital Pasteur MSP

3. Policlínica descentralizada del CASMU

4. Servicio de Diabetología del CASMU

El individuo en quien se desarrolla la insulino-resistencia compensa la disminución

de los efectos sobre el metabolismo de la glucosa, aumentando la secreción de

insulina en grado suficiente para regresar el metabolismo de la glucosa a la

normalidad. Este estado de hiperinsulinemia compensada, establece una

interacción crónica con la contribución genética subyacente del individuo. Esta

interacción es la que determina la respuesta fenotípica y los efectos clínicos de la

resistencia a la insulina y la hiperinsulinemia. La insulino-resistencia interactúa

con factores genéticos de cada individuo determinando cuales de los componentes

del síndrome de insulino-resistencia se habrá de manifestar, cuan grave va a ser su

curso y hasta que punto van a acelerarse complicaciones asociadas. En base a

esto, se están estudiando dos de los principales SNP

(Pro/Ala) y IRS-1 (Gly-Arg) relacionados no solo con el desarrollo de este síndrome

sino también con la respuesta a drogas hipoglucemiantes. El objetivo de este

estudio preliminar fue establecer las frecuencias genotípicas de estos

polimorfismos mediante las técnicas de PCR a tiempo final y PCR a tiempo real.

IRS-1 encontrándose las siguientes frecuencias genotípicas: PP 0.85% ; PA 0.15% y

GG 0,53% y GA 0,47% respectivamente.

Estos resultados nos permitirán en una segunda etapa de la investigación

establecer la relación con la historia clínica de cada paciente y la asociación con la

respuesta a drogas hipoglucemiantes y de esa manera contribuir al tratamiento

adecuado para cada pacientes.

56

P43) FRECUENCIAS ALELICAS DE POLIMORFISMOS ASOCIADOS A EFICIENCIA ALIMENTICIA EN BOVINOS DE CARNE

TRUJILLO, A. I; GRIGNOLA, P; PANDULLI, I; NICOLINI, P; ESPASANDÍN, A;

PEÑAGARICANO, F; CARRIQUIRY, M.

Laboratorio de Técnicas Nucleares, Facultad de Veterinaria y Laboratorio de

Biología Molecular y Endocrinología Metabólica, Facultad de Agronomía, UDELAR.

Los genes NPY y LEPTINA están involucrados en la regulación neuroendócrina del consumo y en el control del balance energético. Por sus roles fisiológicos, son considerados genes candidatos para estudiar la eficiencia del animal en el uso del alimento (eficiencia de alimentación, EA). El objetivo fue estudiar las frecuencias alélicas de SNPs de los genes NPY y LEPTINA (asociados con EA en ganado cruza en Canadá) para planificar estudios de asociación entre estos SNPs y EA en la raza Angus en Uruguay. Se genotiparon 134 terneras, provenientes de 5 cabañas con una importante contribución génica a la población Angus nacional, para las variantes A/G del gen NPY (AY491054-666, intrón 2) y las variante C/T del gen LEPTINA, AF 120500-73 exón2). El ADN genómico fue extraído de sangre entera por procedimiento “salting out” y la identificación de las variantes alélicas fue realizada por el método PCR-HRM (High Resolution Melt). Las frecuencias genotípicas observadas para NPY fueron 62% de homocigotos AA, 28% de heterocigotos y 10% de homocigotos GG. Para LEPTINA, las frecuencias fueron 20 % de homocigotos CC, 53% de heterocigotos y 27% de homocigotos TT. Las distribución de las frecuencias genotípicas fue similar para las diferentes cabañas (P= 0.31 y P=0.24, NPY y LEPTINA, prueba de 2). Las frecuencias alélicas de A y G fueron 76 y 24% y las de C y T, 46 y 54%, respectivamente La frecuencia de animales GG fue inferior a la reportada en ganado cruza en Canadá mientras que la frecuencia de los CC resultó similar. Estos animales fueron más eficientes bajo alimentación en confinamiento. Por lo tanto, existirían posibilidades ciertas de mejorar EA en el Angus nacional. Estudios de asociaciones entre estos SNPs y medidas de EA en nuestras condiciones pastoriles son fundamentales si se desea implementar selección asistida por información molecular.

Palabras claves: SNP, NPY, LEPTINA, eficiencia alimenticia, bovinos Angus

57

P44) ESTUDIO IN SILICO DE LOS GENES Y PROTEÍNAS MARCKS DE

VERTEBRADOS

Prieto D, Toledo A, Zolessi FR, Arruti C

Sección Biología Celular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

MARCKS y MRP (MARCKS Related Protein) son proteínas intrínsecamente

desplegadas que modulan la dinámica de actina cortical. El bloqueo de su

expresión causa severos defectos, especialmente en el desarrollo del sistema

nervioso. Ambas son de distribución ubicua, y su expresión está regulada durante

el desarrollo. La estructura de sus genes ha sido estudiada principalmente en el

humano y el ratón, donde se han identificado motivos de regulación de la

expresión en la región upstream del gen, y de sobrevida del mensajero en su 3‟-

UTR. Las dos proteínas poseen tres regiones conservadas: un dominio amino

terminal de miristilación; una región “MH2”, coincidente con el sitio de splicing

del ARN; y el “dominio efector” o ED, donde se concentran la mayor parte de las

interacciones conocidas.

En este trabajo presentamos un estudio comparativo de las secuencias genómicas y

proteicas de un amplio grupo de vertebrados, así como un análisis de posibles

secuencias regulatorias. En la región upstream de los genes que codifican para

MARCKS encontramos la ausencia de cajas TATA y la presencia de cajas CCAAT,

mientras que en los de MRP encontramos ambas secuencias consenso. En el pez

cebra existen dos genes para cada una de estas proteínas, que presentaron algunas

divergencias tanto en las secuencias reguladoras como en el número de intrones.

Las regiones 3‟-UTR de la mayor parte de los mensajeros presentaron algún tipo de

señales ARE de degradación, aunque con una gran variación en cantidad y

localización. Además, analizamos las secuencias proteicas, realizando

alineamientos de las conocidas hasta el momento y encontrando una enorme

divergencia evolutiva en todas las regiones, excluyendo los tres dominios

conservados. Finalmente, utilizamos varios predictores de desorden en secuencias

proteicas (como FoldIndex, DisEMBL y JUFO) para demostrar que en todas las

proteínas predomina la falta de estructura secundaria.

58

P45) ANALISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA DE POBLACIONES DE

HUEMUL Hippocamelus bisulcus.

GREGORINI E.1, REPETTO L1., VILA A2., & GONZÁLEZ S1.

1 Genética de la Conservación – IIBCE-U. A. Facultad de Ciencias, Av. Italia 3318

Montevideo 11.600 Uruguay 2 Wildlife Conservation Society (WCS) - Jauretche 4763, (8400) Bariloche, Río

Negro, Argentina

El Huemul (Hippocamelus bisulcus, Molina, 1782) es un cérvido endémico de

Argentina y Chile, que habita los bosques andino-patagónicos. La especie ha

sufrido una importante declinación poblacional y ha sido declarada en peligro de

extinción. Para analizar la viabilidad de las poblaciones de esta especie y estimar

el grado de flujo génico es fundamental caracterizarlas con marcadores

moleculares. El objetivo general de este trabajo es analizar la variabilidad

genética de ejemplares de H. bisulcus, utilizando como marcador molecular la

región D-loop del ADN mitocondrial. Se colectaron 41 muestras correspondientes a

tejidos y fecas en tres Parques Nacionales de la región patagónica de Argentina

(Los Alerces, Los Glaciares y Nahuel Huapi) y tres localidades de la Provincia de

Chubut. Los resultados obtenidos al comparar las secuencias génicas de la región

D-loop, evidencian un total de 6 haplotipos para los individuos estudiados. De las 7

secuencias analizadas se encontraron 3 haplotipos (1 del Parque Nacional Los

Glaciares, 1 de Los Alerces y 1 de Chubut). Además se incluyeron en el análisis los

haplotipos de la región de Chillán (Provincia de Ñuble, Chile) y Cochrane

(Provincia de Capitán Prat, Chile). Los resultados preliminares obtenidos con el

número limitado de ejemplares analizados, revelan una subestructuración

poblacional de las poblaciones de Chile y Argentina sugiriendo que no existiría

flujo génico entre ellas.

59

P46) DETECCIÓN DE MUTACIONES ASHKENAZI EN LOS GENES BRCA1 Y

BRCA2 MEDIANTE SECUENCIACIÓN DIRECTA.

GROTIUZ, G.1, SARUTE, N.1, LENS, D.1 Y DELGADO, L.2

1. Laboratorio de Biología Molecular y Citometría de Flujo. Departamento Básico de Medicina. Facultad de Medicina. UDELAR. 2. Servicio de Oncología Clínica. Hospital de Clínicas. Facultad de Medicina. UDELAR.

En Uruguay el cáncer de mama es la enfermedad neoplásica de mayor incidencia y

con mayor mortalidad en la mujer. 5-10 % de los casos se desarrollan en el

contexto de una predisposición hereditaria de tipo monogénica y transmisión

autosómica dominante debido a mutaciones de línea germinal en los genes BRCA1

y BRCA2. El riesgo acumulado de desarrollar cáncer de mama/ovario en las

portadoras es muy superior al de la población general, variando entre el 40 y el

85% para cáncer de mama.

BRCA1 y BRCA2 son proteínas nucleares que interactúan con un gran número de

proteínas reguladoras y están involucradas en múltiples procesos celulares

fundamentales, en especial los relacionados con la detección y reparación de

mutaciones.

La detección de mutaciones en estos genes es muy laboriosa y costosa debido a su

gran tamaño y porque se han descrito cientos de mutaciones en cada uno.

Los individuos que tienen un origen judío Ashkenazi tienen mayor riesgo de ser

portadores de mutaciones de línea germinal en BRCA1/2. Se han reportado 3

mutaciones fundadoras que explican la mayoría de los cánceres de mama

desarrollados en un contexto hereditario en este grupo étnico. Dos de estas han

sido detectadas en BRCA1 (185delAG y 5382insC) y una en BRCA2 (6174delT). El

2.5% de las mujeres Ashkenazi son portadoras de una de estas mutaciones.

Este estudio incluyó 8 mujeres de origen judío Ashkenazi con historia familiar de

cáncer de mama/ovario. Se realizó extracción de ADN a partir de linfocitos

obtenidos de sangre periférica. Los exones que pueden contener las mutaciones

heterocigotas 185delAG y 5382insC en BRCA1 y 6174delT en BRCA2 fueron

amplificados por PCR y analizados por secuenciación directa encontrándose una

paciente portadora de la mutación heterocigota 185delAG en BRCA1.

El análisis genético de la predisposición hereditaria al cáncer de mama/ovario en

este grupo étnico es mucho más factible debido al restringido número de

mutaciones encontradas y es mucho más rápido y económico que la búsqueda

exhaustiva en los genes completos.

60

P47) USO DE CODONES EN ENTEROBACTERIACEAE: HACIA LA

DETECCIÓN DE LOS TRIPLETES ÓPTIMOS ANCESTRALES

BARAIBAR JD, IRIARTE A, ROMERO H, MUSTO H

Laboratorio de Organización y Evolución del Genoma. Depto. de Biología Celular y

Molecular; Facultad de Ciencias.

Una aspecto a destacar en algunas especies procariotas es el sesgo en el uso de

determinados codones, particularmente en genes de alta expresión (GAE). Debido

a que estos tripletes se correlacionan con el ARNt isoaceptor más abundante, el

uso de codones se ha propuesto como la consecuencia de la selección natural

actuando a nivel de la traducción. Estudios comparativos demostraron que los

codones preferidos no son siempre los mismos para diferentes grupos de especies.

La disponibilidad de genomas completamente secuenciados nos brinda la

oportunidad de “rastrear” la influencia de la selección natural en la historia de

determinados grupos y mapear la aparición y desaparición de los tripletes óptimos

en el linaje. Este trabajo intenta desarrollar esta aproximación a partir de: 1)

reconstrucción filogenética en base a genes ortólogos de la familia

Enterobacteriaceae; 2) reconstrucción de codones óptimos en nodos ancestrales.

Se utilizaron métodos bayesianos y máxima parsimonia. Establecimos tres

condiciones para determinar un efecto significativo de la selección sobre la

traducción: (i) las diferencias de expresión en el genoma deben ser el principal

factor determinante de la variabilidad observada a partir del análisis de

correspondencias; (ii) codones óptimos “universales” deben ser significativamente

más abundantes en los GAE que en el resto de los genes; (iii) debe existir una

correlación negativa entre expresión y divergencia sinónima. De acuerdo a

nuestros resultados, la selección natural actuando a nivel de la traducción es al

menos una de las fuerzas evolutivas determinantes del uso de codones en

Enterobacteriaceae. Proponemos 16 codones óptimos en el ancestro común del

grupo: GCU, CGU, AAC, GAC, GGU, GAA, CAC, AUC, CUG, AAA, UUC, UCC, UCU,

ACU, UAC, GUU. El apareamiento perfecto de la mayoría de los codones mayores

con su ARNt isoaceptor (11 de 16), ha sido también explicado como producto del

efecto de la selección natural.

61

P48) IDENTIFICACIÓN Y ORIGEN DE LAS MUTACIONES DE BETA

TALASEMIAS Y HBS EN LA POBLACIÓN URUGUAYA.

DA LUZ J, AVILA A, SANS M.

Departamento de Genética, Facultad de Medicina, UdelaR

La anemia falciforme y las beta-talasemias son anemias producidas por mutaciones

en el gen de la beta globina, las cuales presentan elevadas frecuencias en las

poblaciones europeas y africanas que formaron la actual población del Uruguay.

Actualmente se conocen más de 200 mutaciones distintas de beta talasemias, con

distintas consecuencias clínicas y distintos orígenes geográficos permitiendo inferir

el origen de estas mutaciones en el Uruguay. Aunque la anemia falciforme es

producida por una única mutación, esta se observa principalmente asociada a

cinco haplotipos distintos denominados: Bantú, Benín, Senegal, Camerún y Árabe-

Indio los cuales indican el lugar geográfico donde se encontraron estos

cromosomas y nos permite inferir el origen de estos en nuestra población. En este

trabajo determinamos las mutaciones de beta talasemias en 48 pacientes no

relacionados que presentaban un diagnóstico clínico de beta talasemias,

confirmamos molecularmente la presencia de la mutación de la anemia falciforme

(HbS) en 30 individuos y determinamos por PCR-RFLP los polimorfismos que

determinan los haplotipos asociados a la HbS y a las beta talasemias. Aunque

identificamos siete mutaciones distintas de beta- 0 Codón 39 (C-T) y + IVS-I-110 (G-A) son el 81% del total, 66,7% y 14,5% respectivamente. La

presencia de estas dos mutaciones muestra un origen principalmente europeo

mediterráneo de las beta talasemias en nuestra población, aunque la presencia a

baja frecuencia de otras mutaciones puede indicar un aporte de mutaciones del

Norte de África y Cercano Oriente. El 66,7% de los cromosomas con HbS presentan

el haplotipo Bantú, 23,3% el haplotipo Benín y el 10%, haplotipos atípicos

indicando un origen principalmente centro-africano de la mutación de HbS. La

elevada frecuencia de haplotipos atípicos, no observado en otras poblaciones, abre

perspectivas de investigar los efectos combinados de mezcla racial y

recombinación en la generación de estos nuevos haplotipos.

62

P49) ESTUDIO DE ASOCIACIÓN ENTRE ANCESTRALIDAD Y MELANOMA:

MC1R COMO POSIBLE GEN CANDIDATO

HOCHMANN J1, CAPPETTA M1, PEREZ J, NICOLETTI S 2, LARRE BORGES A 2, ROCHE

L1, DELGADO L3 MARTÍNEZ M 2 BERTONI B1.

1 Departamento de Genética, Facultad de Medicina- UDELAR, Montevideo-

Uruguay. 2 Cátedra de Dermatología; Hospital de Clínicas, Montevideo-Uruguay. 3 Departamento Básico de Medicina, Hospital de Clínicas, Montevideo-Uruguay.

El melanoma es una neoplasia potencialmente letal con una incidencia importante

en las poblaciones europeas siendo considerablemente menor en poblaciones

africanas o amerindias. La población uruguaya tiene una estructura genética

trihíbrida, con aporte europeo, africano y amerindio. Esta característica la

convierte en un blanco adecuado para aplicar metodologías que se basan en

detectar genes de susceptibilidad tomando ventaja del desequilibrio de ligamiento

generado por el mestizaje.

En este trabajo se plantea analizar la asociación de regiones cromosómicas con la

presencia de melanoma esporádico a partir de la detección de un exceso de alelos

de una población ancestral en la muestra de individuos afectados. Por otro lado,

se estudian los factores ambientales involucrados en esta patología y el fototipo

de los individuos afectados.

Se estudió una serie de marcadores informativos de ancestralidad (MIAs)

autosómicos en una muestra de 65 pacientes con melanoma esporádico y se

comparó los resultados con una muestra control de 68 individuos de similares

características de edad y lugar de nacimiento.

De los 5 MIAs analizados, PV92 mostró una asociación significativa con la presencia

de melanoma esporádico. Este marcador se ubica en la región cromosómica

16q23.3, adyacente al locus donde se encuentra el gen MC1R (16q24.3), descripto

como un gen candidato para el desarrollo de la enfermedad. Para confirmar los

resultados, se analizaron 3 posibles mutaciones del gen MC1R, asociadas a

melanoma esporádico, pero ninguna de las tres mostró una asociación con dicha

enfermedad.

Estos resultados indican que la estrategia utilizada, estudios de asociación por

desequilibrio de ligamiento generado por mestizaje, es aplicable a la población

uruguaya.

63

P50) CAENORHABDITIS ELEGANS COMO MODELO DE ESTUDIO DE LA

INCORPORACIÓN DE SELENIO

OTERO L1, MIRANDA-VIZUETE A2, SALINAS G1

1Cátedra de Inmunología, Facultad de Química, Universidad de la República,

Uruguay 2Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, Universidad Pablo de Olavide, España

La incorporación de selenocisteína (Sec) a la síntesis ribosomal de proteínas ocurre

por un mecanismo no canónico, donde algunos aspectos de la misma aún no han

sido completamente elucidados en eucariotas. Procuramos entender estos

aspectos utilizando Ceanorhabditis elegans como modelo, ya que dispone de la

maquinaria de incorporación de Sec para la expresión de una única selenoproteína

(tiorredoxina reductasa, TRXR-1) y, a diferencia de lo que ocurre en otros

organismos modelo, los mutantes en la incorporación de Sec son viables. Para

abordar este problema hemos generado una plataforma de una serie de estirpes

mutantes knock out en los genes de interés: selenofosfato sintasa como control,

SecP43 involucrado en el tráfico de complejos supramoleculares y/o en la

metilación de ARNtSec, un gen presuntamente asociado a la incorporación de Sec

de función desconocida (R13A5.9) y en la proteína de unión al elemento SECIS

(SBP2), que permite reconocer el ARNm de selenoproteínas. Mediante sucesivos

retrocruces de la cepa mutante de interés con la cepa silvestre de referencia

Bristol-N2, hemos curado estirpes knock out en estos genes. Las estirpes knock out

en trxr-1 interferidas con ARN que codifica para la glutatión reductasa presentan

fenotipo de arresto larvario. Al realizar este ensayo de ARNi sobre las estirpes

curadas se reprodujo el fenotipo esperado. Por otra parte, encontramos que la

SBP2 anotada en el genoma de C. elegans es significativamente más corta que la

descrita para otros eucariotas; por lo que amplificamos el ARNm full length de la

SBP2 por RT-PCR, confimando la anotacion predicha teóricamente. En suma,

nuestros resultados preliminares sugieren que la R13A5.9 estaría implicada en la

incorporación de Sec, y que la SBP2 no sólo sería funcional sino que, en parte, el

mecanismo por el cual C. elegans incorpora Sec sería diferente al ya descrito.

64

P51) USO DE CODONES EN EL CFTR Y SU RELACIÓN CON LA

ESTRUCTURA PROTEICA

PIZZO L. *, IRIARTE A. §†, MARÍN M .

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias.

* Instituto de Genética Médica, Hospital Italiano § Laboratorio de Evolución y Laboratorio de Organización y Evolución del Genoma.

Facultad de Ciencias. †Área Genética. Depto. de Genética y Mejora Animal. Facultad de Veterinaria.

Una mutación sinónima alterará la secuencia nucleotídica pero no la secuencia de

aminoácidos. Sin embargo los tripletes sinónimos no son utilizados con igual

frecuencia: dependiendo del organismo, algunos codones son más utilizados que

otros. Este sesgo en el uso de codones se encuentra determinado por un balance

entre la selección natural, la deriva genética y el sesgo mutacional. Ciertas

sustituciones sinónimas pueden cambiar la especificidad de sustrato de una

enzima, la virulencia viral e incluso niveles de expresión proteica. Estos cambios

pueden asociarse con alteraciones en distintos eventos: la presencia de estructuras

secundarias, interacción con proteínas o la velocidad y fidelidad de la traducción

local.

Con el propósito de comprender el rol de codones poco frecuentes en secuencias

codificantes, se analizó el uso de codones en la proteína Cystic Fibrosis

Transmembrane Conductance Regulator (CFTR). Ésta tiene función de canal de

cloro, pertenece a la familia de transportadores ABC y es expresada en la

membrana apical de células epiteliales. Se caracteriza por ser una proteína multi-

dominio con cinco dominios: dos de unión a nucleótido (NBD), dos transmembrana

(MSD) y uno regulador (R). Estudios del plegamiento de CFTR indican que éste sería

predominantemente co-traduccional, y sólo interacciones entre dominios

transmembrana se presentarían post-traduccionalmente.

El análisis de la conservación de codones raros entre el CFTR de distintos

mamíferos placentados, definidos a partir de la base de datos KazUSA, identificó

un enriquecimiento en codones raros en regiones corriente abajo de los motivos

aminoacídicos Walker A (NBD2) y la secuencia “signature” (NBD1), al igual que en

los bucles intracelulares (ICL). Se propone que estos agrupamientos pueden tener

una potencial implicancia funcional en estas regiones en donde una velocidad

lenta de traducción resultaría fundamental para la correcta inserción en la

membrana y el adecuado plegamiento de los motivos, ambos eventos

imprescindibles para el funcionamiento del canal.

65

P52) DETERMINACIÓN DEL SEXO DE CANIDOS NEOTROPICALES

UTILIZANDO RT- PCR

LETICIA REPETTO1, SUSANA GONZÁLEZ 1, & JESÚS E. MALDONADO 2

1 Genética de la Conservación-IIBCE U. A. Facultad de Ciencias, Av. Italia 3318

Montevideo-Uruguay. 2Center for Conservation and Evolutionary Genetics, National Zoological Park/,

Smithsonian Institution. 3001 Connecticut Ave. NW., Washington, DC 20008 USA

Los marcadores moleculares son de gran utilidad para aplicar en la identificación

taxonómica, individual y diagnóstico del sexo permitiendo estimar parámetros

demográficos. El objetivo de este trabajo fue implementar un protocolo por RT-

PCR para sexaje molecular de cánidos neotropicales, analizando los perfiles de las

curvas de “melting”. Los primers empleados fueron ZFX-ZFY que amplifican un

fragmento de 195pb que se encuentra ubicado en un gen que codifica para una

proteína con dedos de zinc en el cromosoma X e Y. Para poder discriminar entre

machos y hembras, posteriormente se realiza una digestión con la enzima Taq I

que contiene en el gen ZFY un sitio de digestión en los machos que permite

visualizar en un gel de agarosa al 3% dos bandas una de 195 pb (ZFX) y otra de 152

pb (ZFY). Los mismos primers fueron empleados utilizando RT-PCR en el canal de

“High Resolution Melting”, empleando un termociclador Corbett 2000™, utilizando

en la reacción el fluorocromo Syto 9. Se sexaron muestras a partir de ADN

extraído de de tejidos y fecas de 23 individuos de las especies: 8 de zorro gris

(Pseudalopex gymnocercus), 6 de zorro de monte (Cerdocyon thous) y 7 de Aguara

guazú (Chrysocyon brachyurus) y 2 del perro doméstico (Canis familiaris). Esta

técnica permitió discriminar amplicones polimórficos teniendo un nivel de

detección de una mutación. Se analizaron los resultados a partir las curvas de

“melting” donde la presencia de un pico se asocia a la hembra y dos picos al

macho. El sexaje molecular empleando RT-PCR demostró ser eficiente, rápido,

tener mayor sensibilidad a bajas concentraciones de ADN molde, así como la

disminución de probabilidades de contaminación y la realización del diagnóstico en

un solo paso de amplificación, ahorrándose la digestión del amplicón y la

verificación por electroforesis.

66

P53) IDENTIFICACIÓN MEDIANTE MARCADORES MOLECULARES DE LA

ENFERMEDAD RENAL POLIQUÍSTICA FELINA (PKD)

MARTÍNEZ M1, LLAMBÍ S1, IRIARTE W1, ARTIGAS R1, MONTENEGRO M1, NICOLINI P2

Laboratorio Área Genética, Facultad de Veterinaria, UdelaR1. Laboratorio de

Técnicas Nucleares, Facultad de Veterinaria, UdelaR2. Lasplaces 1550.

La enfermedad renal poliquística es una de las principales patologías hereditarias

que afectan a varias especies incluyendo al hombre, siendo reportado a nivel

mundial una alta prevalencia en felinos domésticos, principalmente de raza Persa

y relacionados. Un SNP (C>A, posición 3284, exón 29) del gen PKD1 produce una

proteína defectuosa involucrada en la formación de quistes renales entre otros.

Las herramientas para su identificación a nivel molecular han sido la técnica de

PCR/RFLP y más recientemente el Real time PCR utilizando sondas fluorescentes

(Taqman, FRET). El presente estudio tiene como objetivos: amplificar el

fragmento de interés de 559 bp (exón 29, gen PKD1) por Real time PCR, analizar

las curvas de amplificación obtenidas y determinar la temperatura de melting (Tm)

del producto, con la finalidad de realizar a futuro el genotipado por Real time

PCR-HRM (High Resolution Melt). A partir de tres muestras (sangre entera y tejido

fetal) de felinos raza Persa y Siamés (uno) se realizó extracción de ADN mediante

la técnica de salting out ó utilización de kit comercial Axygen. La amplificación se

realizó con kit comercial (Quantimix easy SYG- Biotools) que utiliza SYBR Green

como agente intercalante fluorescente, en un equipo de Real time PCR (Rotor

Gene 6000, Corbett) utilizando el programa Three steps with melt. El amplicón fue

chequeado en gel de agarosa al 1.5% y digerido con la enzima de restricción SchI

evaluándose los resultados en minigeles de poliacrilamida al 6%. Una de las

muestras analizadas presentó tres fragmentos de restricción (559, 316 y 243 bp)

correspondientes al estadio portador de la enfermedad. La Tm obtenida en el

análisis de las curvas de amplificación resultó elevada (~ 99ºC),por lo que para

poder efectuar posteriormente un análisis HRM fue necesario rediseñar primers

que flanqueen un región más reducida y que generen un amplicón mas pequeño

con una Tm menor.

67

P54) RIDGEs, LA CROMATINA HIPERACETILADA, EL DAÑO GENÉTICO

INDUCIDO POR RADIACIONES Y LOS GENES DESREGULADOS EN

TUMORES COLOCALIZAN EN REGIONES ESPECÍFICAS DE CROMOSOMAS

HUMANOS

FOLLE GA, LIDDLE P*, LAFON-HUGHES L*, DI TOMASO MV.

Departamento de Genética, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente

Estable (IIBCE).

El análisis del transcriptoma humano ha revelado la existencia de regiones

genómicas de elevada expresión génica (RIDGEs) y regiones de escasa actividad

transcripcional (AntiRIDGEs). Hemos topografiado en idiogramas (850 bandas) y

transcriptomas de cromosomas humanos: a) regiones de histona H4 hiperacetilada

o H4+a 1; b) fracturas inducidas por radiaciones ionizantes 2; c) genes cuya

expresión aumenta o disminuye (10x o más) en tumores de diferentes tejidos; d)

genes que sólo se expresan en tumores pero no en células normales del mismo

tejido 3; e) sitios de inserción de constructos unidos a GFP con alto nivel de

expresión 4. Hemos observado una clara colocalización de regiones H4+a, lesiones

producidas por radiaciones ionizantes, genes desregulados en tumores e inserción

de constructos. Este fenómeno es evidente tanto en cromosomas con varios y/o

extensos RIDGEs (7, 12, 16, 17, 19) como en aquellos que poseen escasos (1-2) o

pequeños RIDGEs (9, 11, 14, 21). A fin de descartar la influencia de la riqueza

génica en las regiones que presentan co-localización de RIDGEs y genes

desregulados, seleccionamos las sub-bandas cromosómicas que concentran genes

desregulados en forma independiente a la densidad génica 3. Las 11 sub-bandas

que concentran genes sobrexpresados mapean en RIDGEs. De las 29 sub-bandas

que concentran genes subexpresados, 20 corresponden a RIDGEs. Estos resultados

sugieren una estrecha relación entre expresión génica, daño genético y

desregulación génica en tumores apoyando nuestra hipótesis 5 de una mayor

sensibilidad de la cromatina activa (RIDGEs, H4+a) al daño genético inducido,

inestabilidad genómica y otros fenómenos asociados a la transformación celular.

1 Jeppesen P (1997) Bioessays 19:67-74

2 Barrios L et al. (1989) Cancer Genet Cytogenet 41:61-70

3 Aouacheria A et al. (2006) BMC Genomics 7:94-104

4 Gierman H et al. (2007) Genome Research 17:1286-1295

5 Folle GA (2008) Mutat Res Rev 658:172-183

* Ambos co-autores contribuyeron igualmente en esta investigación

68

P55) ESTUDIO TOXICOLÓGICO EN APIS MELLIFERA EXPUESTAS A UN

INSECTICIDA ORGANOCLORADO, THIONEX 35

OJEDA, P.1,2; VILLAR, S.2; CARRASCO-LETELIER, L.1

1 Programa de Producción y Sustentabilidad Ambiental. Estación Experimental

“Alberto Boerger”, INIA La Estanzuela, Colonia, Uruguay.

2 Sección Genética, Facultad de Ciencias. Universidad de la República,

Montevideo, Uruguay.

En la agricultura moderna, los plaguicidas sintéticos continúan siendo la principal

línea de defensa en la mayoría de los programas de manejo de plagas. El objetivo

expreso de los insecticidas es “matar a las plagas”, sin embargo, estos pueden

tener impactos letales o subletales sobre organismos no blancos y reducir y/o

contaminar las fuentes de alimentos para organismos en niveles tróficos superiores

(Devine & Furlong, 2007).

Los compuestos organoclorados son el grupo de productos fitosanitarios más

exitosos, rentables y de mayor comercialización en el mundo (Kaushik & Kaushik,

2007).

El objetivo del presente estudio fue evaluar la toxicidad aguda por contacto (LD50)

del insecticida organoclorado Thionex 35 (p.a. Endosulfán) para la subespecie de

abejas presente en la región litoral oeste del país, de acuerdo con la guía

OEPP/EPPO Nº170 (2001). Las dosis tópicas administradas fueron de 1.75, 0.88,

0.44, 0.22 y 0.11µg/abeja. El valor de DL50 determinado para Thionex 35 fue de

1.51µg/abeja a las 48 horas. Este valor es 5 veces menor al reportado por Atkins et

al (1981), lo que sugeriría una mayor sensibilidad a esta formulación de Endosulfán

de la raza de A. mellifera evaluada. Para analizar el impacto mutagénico a dosis

subletales de éste insecticida, se utilizó el ensayo de electroforesis en células

individuales. La evaluación del daño genético mediante éste ensayo fue realizado

sobre células extraídas de la glándula hipofaríngea. Los resultados mostraron una

correlación positiva entre el daño genético provocado por el Endosulfán y los

niveles de exposición por contacto de los individuos, para los parámetros: tail

moment, % de ADN dañado y migración del ADN dañando. Se marca así, el primer

antecedente donde se analiza genotoxicidad en A. mellifera, utilizando una

herramienta molecular para establecer una correlación entre los análisis de

toxicidad aguda y daño genético.

69

NEUROCIENCIA Y NEUROBIOLOGÍA P56-P70

P56) DAÑO OXIDATIVO EN MITOCONDRIAS DE MÚSCULO

ESQUELÉTICO EN MODELOS ANIMALES DE ESCLEROSIS LATERAL

AMIOTRÓFICA.

AICARDO, A.&, CASSINA, P. &, BARBEITO, L.¶£, MURPHY M.P.§, RADI R.& AND

CASSINA, A.&.

& Facultad de Medicina, Universidad de la Republica, Montevideo, Uruguay; ¶Instituto Clemente Estable, Montevideo, Uruguay; £Institut Pasteur, Montevideo,

Uruguay, §MRC Dunn Human Nutrition Unit, Hills Road, Cambridge, UK. Email:

aaicardo@fmed.edu.uy

La disfunción mitocondrial y el estrés oxidativo contribuyen a la degeneración de

la motoneurona en la esclerosis lateral amiotrófica. Las neuronas motoras inervan

el musculo esquelético y mientras que, alteraciones en la actividad mitocondrial

en el sistema nervioso central han sido descritas, los datos acerca de la disfunción

mitocondrial en el músculo esquelético son escasos y controversiales.

Para evaluar el daño oxidativo y la disfunción mitocondrial en musculo esquelético

de ratas SOD G93A medimos la respiración mitocondrial tanto en mitocondrias

aisladas como en biopsias de músculo esquelético obtenidas de ratas transgénicas

en estadíos tempranos de la enfermedad. También estudiamos por western blot la

presencia de marcadores de estrés oxidativo (4-hydroxynonenal) en mitocondrias

aisladas de músculo esquelético y médula de ratas.

Encontramos que la respiración mitocondrial se vio reducida en músculo

esquelético de ratas SOD G93A comparados con ratas no transgénicas. El

tratamiento con un antioxidante dirigido a la mitocondria, MitoQ (ubiquinona

unido covalentemente a un catión trifenilfosfonio), 6 mg/kg i/p, 24 hrs. previas a

la eutanasia, restableció la respiración mitocondrial.

Nuestros datos muestran que la mitocondria de músculo esqulético se compromete

en estadíos tempranos de la enfermedad, y que esta disfunción puede ser causada

por el daño oxidativo encontrado.

70

P57) PROLIFERACIÓN DE ASTROCITOS AISLADOS DE MÉDULA ESPINAL

DE RATAS ADULTAS EN UN MODELO DE ELA

CRAGNOLINI A.B. 1, DIAZ AMARILLA P. 2, BARBEITO L.1,2

1. Institut Pasteur de Montevideo.

2. Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable.

Durante la injuria del sistema nervioso o procesos neurodegenerativos, los

astrocitos sufren cambios morfológicos y funcionales denominados astrogliosis,

proceso que también incluye proliferación. Existen pocas evidencias acerca del rol

de la proliferación de los astrocitos en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA),

enfermedad caracterizada por la degeneración de motoneuronas. En modelos

murinos de ELA familiar que expresan mutaciones en la enzima superoxido

dismutasa Cu/Zn (SOD1) se constata daño oxidativo en neuronas y astrocitos. La

mutación SOD1G93A no causa la pérdida de actividad de la enzima, sino una

alteración de la química redox, incluyendo activación de la enzima NADPH oxidasa

(NOX) y aumento de producción de H2O2. En este trabajo evaluamos el perfil

proliferativo de cultivos de astrocitos aislados de médula espinal de ratas adultas

SOD1G93A. Por tener características diferentes de los astrocitos de animales no

transgénicos se les denomina células AbA (de astrocito aberrante). Estas células

mostraron una mayor tasa de proliferación comparada con astrocitos de neonatos,

tanto transgénicos como no transgénicos. La producción de H2O2 por las células

AbA fue más elevada que astrocitos no transgénicos. Además, los niveles basales

de p-Akt fueron elevados. Exploramos distintos mediadores y vías de señalización

que podrían estar involucrados en la proliferación de estas células, tales como

ATP, NGF, NO, NOX y la vía de las kinasas MEK y Akt. El tratamiento con apocinina,

inhibidor de NOX, así como la inhibición de MEK, causaron disminución de la

proliferación de astrocitos AbA, sin causar muerte celular. Estos datos preliminares

sugieren que el fenotipo proliferativo de astrocitos AbA se asociaría a aumento de

producción de H2O2 y posterior aumento de p-Akt.

71

P58) EVALUACION IN VITRO DEL EFECTO NEUROPROTECTOR DE LA

APOCININA

ISASI E, DIAZ-AMARILLA PJ, BARBEITO L, OLIVERA-BRAVO S.

Departamento de Neurobiología Celular y Molecular (NBCM), Instituto Clemente

Estable (IIBCE), Montevideo, Uruguay.

La capacidad neuroprotectora de la apocinina (4-hidroxi-3-metoxiacetofenona) no

está confirmada. Se han reportado efectos beneficiosos en modelos de Esclerosis

Lateral Amiotrófica (ELA) y de Parkinson1 pero aumentos de estrés oxidativo in

vitro2. La acción mejor descripta de la apocinina es la inhibición del complejo

NADPH oxidasa, considerado el principal productor celular de especies reactivas

de oxígeno al catalizar la conversión de oxígeno en superóxido. NADPH oxidasa se

potencia en astrocitos reactivos3 por lo que su inhibición en astrocitos podría ser

neuroprotectora. Para validar esta hipótesis estamos caracterizando la acción de

la apocinina sobre astrocitos para posteriormente evaluar su efecto neuroprotector

en diferentes modelos de neurodegeneración. Se trataron cultivos primarios de

astrocitos corticales y estriatales de ratas normales o transgénicas del modelo de

ELA SOD1G93A con apocinina (0-3mM, 48h) y posteriormente con ácido glutárico 5

mM, LPS 5 µg/ml y bromodeoxiuridina (BrdU, 1µg/ml). 24h después, se estudió

viabilidad por conteo directo de núcleos marcados con DAPI, tasa de proliferación

evaluando células BrdU+:células totales y cambios morfológicos mediante

contraste de fase e inmunocitoquímica4. Nuestros resultados muestran que,

respecto de los controles obtenidos y sembrados simultáneamente, la apocinina en

concentraciones menores a 0.5mM no parece afectar la viabilidad ni la tasa de

proliferación; concentraciones mayores a 1.25mM disminuyen la viabilidad hasta

un 30% y la tasa de proliferación al 50%. A concentraciones mayores la mortalidad

no aumenta significativamente, mientras que la tasa de proliferación desciende al

10%. Por tanto, la apocinina afecta la viabilidad y la proliferación de astrocitos en

condiciones normales e injuriantes; lo que podría repercutir en la sobrevida

neuronal.

Financiación: PDT 76/23, PEDECIBA Biología

1 Anantharam et al., 2007. Neurotoxicol 28(5):988-97 2 Riganti et al., 2006. Toxicol Appl Pharmacol 212(3):179-87 3 Abramov et al., 2005. J Neurosci. (40):9176-84 4 Olivera et al., 2008. Neurobiol Dis. 32(3):528-34

72

P59) EL DICLOROACETATO RESTABLECE LA FUNCIÓN MITOCONDRIAL EN MODELOS DE ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRÓFICA MIQUEL, E.(1), CASSINA, A.(2), MARTÍNEZ-PALMA, L.(1), GANDELMAN, M.(1), BOLATTO, C.(1), RADI, R.(2), BARBEITO, L.(3), CASSINA, P.(1)

(1) Depto. de Histología y (2) Depto. de Bioquímica, Facultad de Medicina, UdelaR; (3)

Institut Pasteur de Montevideo. La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa fatal que afecta a las motoneuronas para la que no existen terapias efectivas. Los hallazgos anatomopatológicos incluyen pérdida de motoneuronas y gliosis en la médula espinal. Estudios en modelos animales portadores de la enzima SOD1 humana con la mutación G93A (SOD1G93A) han mostrado que los astrocitos SOD1G93A presentan una actividad mitocondrial disminuida asociada a menor capacidad trófica para motoneuronas comparados a los astrocitos no transgénicos. El Dicloroacetato (DCA) es un compuesto que inhibe la enzima piruvato deshidrogenasa kinasa (PDK), desviando el piruvato hacia la oxidación final de la glucosa en la mitocondria, y que ha sido utilizado para el tratamiento de mitocondriopatías hereditarias humanas. En este trabajo hemos investigado los efectos del DCA en modelos de ELA. En cultivo, el DCA restableció la función mitocondrial en astrocitos SODG93A, disminuyó su proliferación y redujo su toxicidad hacia las motoneuronas. La administración sistémica de DCA en el agua de bebida a ratones SODG93A provocó un retraso en el inicio de síntomas y aumentó la supervivencia de los animales. En la médula espinal de los ratones transgénicos tratados con DCA se observó un mayor número de motoneuronas y una disminución de la gliosis en comparación con los animales tratados con vehículo. Asimismo, el tratamiento con DCA provocó un restablecimiento del área de las placas neuromusculares en los ratones SODG93A. En conjunto, estos resultados sugieren que la disfunción mitocondrial cumple un rol en la ELA, y permiten considerar a la mitocondria como posible blanco para futuros tratamientos.

73

P60) ACTIVATION OF cAMP-RESPONSIVE ELEMENT BINDING PROTEIN IS MODULATED IN THE DEVELOPING RAT SUPERIOR COLLICULUS

OLIVEIRA, C. S., DE CORDOVA F.M., LEAL, R. B., ROSSI, F. M.*

Universidade Federal de Santa Catarina, Departamento de Bioquímica,

Florianópolis, SC, Brasil and *Institut Pasteur de Montevideo, Uruguay.

Objectives: The superior colliculus (SC) is an excellent experimental model for

studying plastic processes in the CNS. Recently we have shown that ERK 1/2 and

p38MAPK kinases are activated in the SC in temporal correlation with the period of

retino-collicular plasticity (1). Long-lasting changes in neuronal circuitry require

the pattern of kinase activation to be translated into a pattern of gene expression,

probably through transcription factors activation. A good candidate is the cAMP-

responsive element binding protein (CREB), whose activation depends upon ERK1/2

(2). Here, to further characterize the molecular framework required for SC

developmental plasticity, we analyze the expression of CREB during development

and following manipulation of the visual input.

Methods: Antibodies against phospho-CREB, total-CREB and beta-actin (Cell

Signaling, 1:1000) were used for western blot analysis. SC were obtained from

Long-Evans hooded rats at different postnatal ages (P0-P45). Visual deprivation

was performed at P3 or P21, and animals sacrificed one week later.

Results: Our results show that the ratio between the phosphorylated and the total

form of CREB (activation level index) increases in the SC between P4 and P9 (60%

vs. P0, n=4, p<0.05) in temporal correlation with the critical period for retino-

collicular plasticity. To test the involvement of CREB on plastic processes we used

the monocular deprivation protocol, known to induce strong plasticity in the young

but not in the adult SC. Preliminary results indicate that CREB is modulated by

deprivation in the young animal but not in the adult.

Conclusions: These results show that CREB is highly regulated during development

and following plasticity-inducing manipulation. Altogether, suggest that the

ERK1/2-CREB signaling pathway may play a fundamental role in directing the

refinement of retino-collicular projections.

References: (1) Oliveira et al., Int.J.Devl.Neurosci. 26: 355, 2008. (2) Cancedda et

al., J.Neurosci. 23: 7012, 2003.

Support: CNPq, FAPESC and FINEP (IBN-Net #01.06.0842-00).

74

P61) BASES MOLECULARES DE LA REGENERACIÓN DE LA MÉDULA

ESPINAL DE LA TORTUGA TRACHEMYS DORBIGNYI

G. GARCÍA-TEJEDOR1, G. LIBISCH2, O. TRUJILLO-CENÓZ1, R.E. RUSSO1, C.

ROBELLO2,3

Neurofisiología Celular y Molecular, Instituto de Investigaciones Biológicas

Clemente Estable1. Unidad de Biología Molecular, Instituto Pasteur Montevideo.2

Depto. De Bioquímica, Facultad de Medicina3

La tortuga de agua Trachemys dorbignyi presenta la capacidad de reconectar la

médula espinal luego de una sección total. A diferencia de los mamíferos, no se

observa una cicatriz glial que impida el cruce de los axones. Ya a los veinte días

post lesión se distinguen axones cruzando la región lesionada sobre un

“andamiaje” de células BLBP+ (Brain Lipid Binding Protein)(Rehermann et al.,

2009). La comprensión de los mecanismos moleculares responsables de la

regeneración y su análisis funcional, podrían contribuir en un futuro al desarrollo

de terapias génicas para permitir la reconexión de la médula espinal en

mamíferos.

Nuestro grupo demostró (Russo et al., 2008) la existencia de clusters funcionales

de células BLBP+/PAX6+ con capacidad proliferativa acopladas entre sí mediante

conexina43 (Cx43). Posiblemente esta sea la fuente de las células BLBP+ halladas

en la zona de unión. La ausencia de cicatriz glial estaría debida al rol de estas

células BLBP+ que recapitularían la condición embrionaria. ¿Hay cambios en la

expresión de Cx43 luego de la lesión? El PAX6 es un factor de transcripción

regulador de la proliferación y del destino celular. ¿Qué ocurre con su expresión?

¿Aumenta la expresión de BLBP luego de la lesión?

Para responder estas preguntas, se diseñaron oligonucleótidos degenerados a

partir de regiones altamente conservadas de las proteínas de interés (BLBP,

HuC/D, Cx43, PAX6) así como de proteínas control (β-actina, Piruvato Quinasa y

Lactato Deshidrogenasa). Mediante PCR se amplificaron fragmentos que fueron

posteriormente clonados y secuenciados. En base a estas secuencias, se analizaron

los cambios de expresión utilizando PCR en tiempo real con oligonucleótidos

específicos, comparando la médula espinal de tortugas lesionadas a diferentes

tiempos post-lesión y la de tortugas control. Los cambios observados en los niveles

de expresión de estas proteínas sugieren que las mismas podrían tener un rol

esencial en este fenómeno de reconexión.

75

P62) EL ESTRÓGENO DISMINUYE LA CAPACIDAD NEURITOGÉNICA DEL SUSTRATO UTERINO. PAPEL DE LA GEOMETRÍA DEL COLÁGENO. MARTÍNEZ G., SILVEIRA P., BIANCHIMANO P., RICHERI A., BRAUER M.M. Laboratorio de Biología Celular, IIBCE Las moléculas de la matriz extracelular son esenciales en el guiado de los axones hacia sus efectores definitivos y participan en los procesos de regeneración y plasticidad neuronal del adulto. El método de criocultivo permite estudiar la contribución del sustrato al crecimiento neurítico y consiste en cultivar explantos neurales sobre cortes de tejidos a congelación. Utilizando como sustrato cortes de útero de ratas castradas control y tratadas con estrógeno observamos que el sustrato uterino contribuye a generar el patrón histotípico de inervación simpática y que el estrógeno disminuye su capacidad de sustentar el crecimiento neurítico. Utilizando microscopías óptica y electrónica analizamos los componentes del sustrato uterino que son seguidos por las neuritas en el sistema de criocultivo y valoramos los cambios morfológicos en la matriz extracelular uterina que pudieran asociarse con su menor capacidad de sustentar el crecimiento neurítico en respuesta al estrógeno. In vitro, las neuritas crecían asociadas a la superficie de las células musculares lisas, siguiendo invariablemente la dirección de su eje mayor y preferentemente asociadas a la matriz perimuscular de colágeno. In situ, observamos que el estrógeno promueve una marcada reorganización de esta matriz de colágeno. En las hembras castradas, el colágeno presentaba una organización laxa y una orientación paralela al eje mayor de las células musculares. Luego del tratamiento con estrógeno, el colágeno presentaba una organización más compacta y una orientación mayormente perpendicular al eje mayor de las células musculares. En vista de la marcada dependencia del crecimiento neurítico de las características geométricas del sustrato, es posible que los cambios inducidos por el estrógeno en la matriz de colágeno impacten negativamente sobre su capacidad de sustentar el crecimiento neurítico. Financiado por FIRCA-NIH (EEUU).

76

P63) NEUROGÉNESIS POSTNATAL EN EL CEREBRO DE PECES DEL

GÉNERO Austrolebias

ROSILLO J.C.1, FERNÁNDEZ A.1,5 , CASANOVA G.2,3, OLIVERA S.4

1. Neuroanatomía Comparada, IIBCE; 2. Sección Biología Celular, Facultad de

Ciencias (FC); 3.Unidad de Microscopía Electrónica de Transmisión (MET), FC; 4

Neurobiología Celular y Molecular, IIBCE; 5. Unidad Asociada (FC) UDELAR

Montevideo URUGUAY

La neurogénesis postnatal ha sido demostrada en varios grupos de vertebrados,

incluyendo los peces teleósteos. En el cerebro de las Austrolebias, las zonas

proliferativas potencialmente neurogénicas están localizadas a lo largo de la línea

media del eje rostro-caudal. El objetivo de este trabajo fue: identificar, mapear y

cuantificar las principales regiones proliferativas en tres especies del género

Austrolebias: A. affinis, A reicherti y A.charrua. Ejemplares adultos de 8 meses de

edad recibieron una inyección única de 5´-Bromodeoxiuridina (BrdU) 100 mg/kg

ip.; veinticuatro horas después, se anestesiaron y perfundieron con

paraformaldehído 10%. Los cerebros disecados, se cortaron en serie en vibrátomo y

algunas zonas de interés se evaluaron por MET. Las células BrdU+ se detectaron

mediante inmunocitoquímica (anti-BrdU, 1:500) y se cuantificaron en tres

secciones de las cinco regiones proliferativas seleccionadas: bulbo olfatorio,

ventrículos telencefálicos, tectum óptico, torus longitudinales y cerebelo.

Mediante la reconstrucción 3D, se constató la distribución similar de estas regiones

en las tres especies y el cerebelo mostró el mayor número de células BrdU+.

Respecto al número de células marcadas, estuvieron en concordancia con

variaciones anatómicas entre las especies. A affinis mostró algunas diferencias con

respecto a A. reicherti y A. charrua, cercanas filogenéticamente. Para identificar

la naturaleza neuronal o glial, de células proliferantes se usaron marcadores

(HuC/D) o (S-100/GFAP) respectivamente. El doble marcado HuC/D-BrdU constató

la presencia de nuevas neuronas en zonas ventriculares telencefálicas, tectum

óptico y cerebelo. La población glial es variada en forma y tamaño en las

diferentes zonas cerebrales. La glia radial está presente principalmente en el

tectum y en las franjas ventriculares. La glia particularmente proliferativa se

identificó con el marcador glial temprano S-100. La MET de las regiones

proliferativas evaluadas, mostró heterogeneidad celular con neuronas maduras,

células gliales y células con distinta morfología que podrían indicar diferentes

estadios de diferenciación.

77

P64) GENOTIPO, FENOTIPO Y NEUROPATOLOGIA EN RATONES TREMBLER-J. PUIG N, CANCLINI L, CAL K, ROSSO G, DAMIÁN JP, RUIZ P, FERREIRA A, RODRIGUEZ H, MESA R, PIZZAROSSA C, PENELA M, VÁZQUEZ C, SOTELO JR, KUN A. (1) Departamento de Proteínas y Acidos Nucleicos (DPAN), IIBCE. (2) DPAN-Unidad Asociada a la Sección Bioquímica de la Facultad de Ciencias, UdelaR. (3) Departamento de Biología Molecular y Celular, Área Bioquímica, Facultad de Veterinaria, UdelaR.UdelaR. (4) Departamento de Biología Molecular y Celular, Área Biofísica. Facultad de Veterinaria, UdelaR. (5) Sección Fisiología y Nutrición, Instituto de Biología, Facultad de Ciencias, UdelaR. (6) Instituto de Neurología, Hospital de Clínicas, Facultad de Medicina, UdelaR.

En el sistema nervioso periférico (SNP), la interrelación entre células de Schwann

mielinizantes y neuronas, genera diferentes co-dominios interconectados. La bibliografía

reporta la importancia de la contribución integrada de ambas células en el funcionamiento del

SNP. En las neuropatías hereditarias, esta interrelación se encuentra alterada como

consecuencias de mutaciones génicas en una u otra célula. Los ratones Trembler-J (B6.D2-

Pmp22 <Tr-J>/J), han sido empleados como modelo animal para el estudio de estas

neuropatías. Poseen una mutación puntual en el gen pmp22 que codifica para la proteína

mielínica PMP22, que impide su inserción en la membrana, afectando la mielinización normal.

Aunque PMP22 ha sido intensamente estudiada, su función biológica es aún incierta. En este

trabajo estudiamos la expresión del gen-pmp22 durante el proceso de mielinización en

condiciones normales y patológicas mediante hibridación in situ e inmunomicroscopía

confocal. Se utlilizó un modelo de mielinización in vitro, desarrollado a partir de ganglios de la

raíz dorsal (GRD) de ratones Trembler J en estado embrionario (E13), de genotipo +/+

(normales) y TrJ/+ (patológicos), con 4 días de mielinización. El genotipo se determinó a

partir del ADN de los embriones mediante PCR-RFLP. Se observaron diferencias entre los

DRG provenientes de ratones +/+ y TrJ/+ en la localización celular tanto del ARNm de la

PMP22 como de la proteína. A su vez los DRG provenientes de ratones TrJ/+ presentaron

una marcada disminución de neurofilamentos fosforilados Estos resultados indicarían, por

primera vez, una influencia de la PMP22 en la cascada de señalización de fosforilación de los

neurofilamentos y por tanto un rol de la misma en el establecimiento del calibre axonal. Se

observó además, una correlación de 100% (Test Exacto de Fischer) entre el genotipo (PCR-

RFLP) y el fenotipo de los ratones evaluado por el test MSTT, indicando que es posible

inferir el genotipo a partir del fenotipo.

78

P65) VINCULO AXO-GLIAL EN NEUROPATÍAS HEREDITARIAS

PERIFERICAS HUMANAS

KUN A(1,2), SOTELO JR(1), ROSSO G(1), CANCLINI L(1) , VÁZQUEZ C(3), MESA R(3),

PIZZAROSSA C(3), PENELA M(3).

(1) Departamento de Proteínas y Acidos Nucleicos (DPAN), IIBCE.

(2) DPAN-Unidad Asociada a la Sección Bioquímica de la Facultad de Ciencias,

Universidad de la República.

(3) Instituto de Neurología, Hospital de Clínicas, Facultad de Medicina, Universidad

de la República.

El grupo de las neuropatías hereditarias periféricas humanas mas frecuentes,

identificadas generalmente como síndrome de Charcot Marie Tooth (CMT),

abarcan una diversidad de respuestas celulares que involucran a las células de

Schwann (CS) y/o a las neuronas (axones). A pesar de que por su mutación

original se las agrupa en mielinopatias (CMT1) y axonopatías (CMT2), todas

terminan generando axonopatías funcionales. Esto evidencia un complejo vinculo

axo-glial en la resultante fenotípica de la enfermedad.

Hemos estudiado este fenómeno a nivel molecular en nervios surales humanos de

pacientes CMT1 y CMT2. El citoesqueleto glial y axonal (actina, vimentina,

neurofilamentos), observado por inmunomicroscopia confocal, mostró alteraciones

en su distribución y arreglo. Frecuentemente, en mielinopatías, aparecían

brotamientos axonales rodeados de ribosomas gliales. La proteína glial MAG,

reguladora en trans de la actividad axonal (brotamientos, elongación axonal y

fosforilación dependiente de kinasas), mostró una distribución heterogenea y

discontinuada, respecto de su patrón normal. Concomitantemente, la fosforilación

de neurofilamentos mostró una distribución alterada, tanto longitudinalmente

como en el arreglo tridimensional de los heteropolimeros. La actividad

transcripcional fue evaluada en los nervios surales provenientes de biopsias

humanas, mediante la incorporación in vitro de bromouridina. Los ARN

neosintetizados mostraron un arreglo perinuclear y citoplasmático en la CS,

penetrando desde allí, hasta los dominios axonales. La expresión del gen NF-200

(detectado por hibridación in situ), mostró un patrón de distribución similar.

Las Incisuras de Schmidt-Lantermann y los nodos de Ranvier (dominios

citoplasmáticos gliales carentes de mielina compacta), parecen ser los caminos de

trafico para las macromoleculas estudiadas, tanto en condiciones normales como

patológicas. Nuestros resultados indican la existencia de una dinámica de

transferencia macromolecular transcelular, involucrada no solo en los procesos

degenerativos/regenerativos axo-gliales, sino en la regulación mutua de la

expresión génica entre neuronas y glias.

79

P66) OPTIMIZACIÓN DE ALGUNOS ABORDAJES HISTOQUÍMICOS E

INMUNO-HISTOQUÍMICOS PARA ESTUDIAR NEURODEGENERACIÓN

SARLABÓS M, ISASI E, BARBEITO L, OLIVERA BRAVO S.

Departamento de Neurobiología Celular y Molecular (NBCM)-Instituto Clemente

Estable (IIBCE)

Las enfermedades neurodegenerativas presentan manifestaciones clínicas muy

diversas que dependen de la degeneración de distintas células, estructuras o

regiones del SNC. Pese a que la mielina es uno de los blancos directos e indirectos

mas vulnerables1, en los modelos de neurodegeneración del SNC, el estudio de la

mielina se realiza generalmente en forma aislada del resto de las demás

poblaciones celulares. En este trabajo, nos proponemos optimizar diversas

técnicas morfológicas que permitan la evaluación simultánea del estado de la

mielinización y de otras poblaciones celulares en muestras de un mismo origen y

con el mismo procesamiento. Para ello, adaptamos técnicas clásicas de

reconocimiento de mielina (Sudan Black2, Kluver Barrera3), para su realización en

cortes de vibrátomo y su correspondencia con técnicas inmunohistoquímicas y

microscopía confocal4. Empleamos dos modelos animales de neurodegeneración: 1)

animales asintomáticos (90DPN) y sintomáticos (180DPN) del modelo animal de

esclerosis lateral amiotrófica por sobreexpresión de SOD1G93A mutada5; 2)

animales jóvenes inyectados con altas concentraciones de ácido glutárico como

modelo de enfermedad neurometabólica del desarrollo4. No fue posible lograr

buenos resultados en flotación para la técnica de Kluver, probablemente porque

originalmente fue desarrollada para material incluido en parafina, cortado en

crióstato y adherido a portaobjetos. En cambio, con la técnica adaptada de Sudan

Black logramos reconocer claramente la mielina, obteniendo una clara

diferenciación del cuerpo calloso y estriado. Se observó una correspondencia clara

entre ésta técnica y la inmunohistoquímica contra proteína asociada a mielina

(MAG). Ambos abordajes, permiten reportar una disminución y fragmentación de

los haces mielinizados en el estriado de animales tratados con ácido glutárico. Por

tanto, concluimos, que la adaptación de técnicas clásicas favorece la

complementariedad metodológica con los abordajes mas avanzados y permite el

mayor conocimiento de los eventos que subyacen la neurodegeneración.

1 Vercellino et al., 2009. J Neuropathol Exp Neurol. 68(5):489-502 2 Gerrits et al., 1992. J Neurosci Methods. 45(1-2):99-105

3 Geisler et al., 2002. Histochem Cell Biol 117(1):69-79 4 Olivera et al., 2008. Neurobiol Dis 32(3):528-34 5 Cassina et al., 2005. J Neurochem. 93(1):38-46

80

P67) OPTIMIZACIÓN DEL PARADIGMA EXPERIMENTAL PARA ESTUDIAR MODULACIÓN MOLECULAR DE RECEPTORES DE NEUROTRANSMISORES

OLIVERA BRAVO S

Departamento de Neurobiología Celular y Molecular, IIBCE

Los receptores de neurotransmisores (RN) son complejos proteicos de membrana

especializados en el reconocimiento de sus agonistas (neurotransmisores) y en la

transducción de señales corriente abajo. Median la transmisión sináptica y son

blancos terapéuticos relevantes ya que están implicados en diversas condiciones

neurológicas y enfermedades neurodegenerativas de relevancia sociosanitaria

[NatRev 2009, 8:733-750]. Su expresión y funcionalidad están sujetas a una

estricta modulación molecular y celular, cuyo desbalance sería relevante en la

patología del sistema nervioso. El conocimiento de los mecanismos subyacentes a

ésta modulación es difícil de lograr debido al gran número de RN y a sus diferentes

estequiometrías, conformaciones de membrana y mecanismos de transducción.

Dado que el estudio de la funcionalidad y de las relaciones estructura-función con

moduladores de interés farmacológico y/o terapéutico, requiere de preparaciones

enriquecidas en RN, el objetivo de este trabajo fue obtener preparaciones

cerebrales que permitan la evaluación funcional de distintas familias de RN en

condiciones control y frente a moduladores de interés. Para ello, se disecaron

cerebros de ratas SD adultas, homogeneizaron en teflon, centrifugaron

diferencialmente a 1000, 35000 y 60000g, sometieron a gradiente de sacarosa y

posteriormente a choque térmico para obtener membranas sinaptosomales de

cerebro (MSC) enriquecidas en RN predominantemente postsinápticos. Los

resultados de Western Blot permitieron reconocer subunidades constitutivas de

receptores de GABA, glutamato y acetilcolina en las MSC. Los ensayos de binding

[MCN 2003, 23:96-106] y electrofisiológicos [JMN en prensa] indicaron que dichos

RN conservan sus características funcionales prototípicas y son capaces de ser

modulados por sustancias de uso farmacológico y terapéutico donde los RN están

alterados en número y/o función [NeurobiolDis 2006, 23:481-489]. Por tanto, las

MSC parecen ser una preparación adecuada para el estudio de los distintos tipos de

NR y podrían complementar otros abordajes.

Apoyo: Grant-in-aid ISN, PEDECIBA Biología

81

P68) IDENTIFICACIÓN DE UN FENOTIPO ASTROCITARIO CON

ACTIVIDAD NEUROTÓXICA

DÍAZ-AMARILLA P.1, OLIVERA S.1, TRIAS E.1, MARTINEZ-PALMA L.2, CASSINA P.2,

CRAGNOLINI A.B.3, BARBEITO L.1,3.

1Instituto Clemente Estable; 2Depto de Histología, Facultad de Medicina; 3Institut

Pasteur Montevideo.

Las células gliales, y en particular los astrocitos, participan en la patogenia de las

enfermedades neurodegenerativas. La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) se

caracteriza por una degeneración de motoneuronas lo que lleva a una parálisis

progresiva. La muerte de motoneuronas espinales es acompañada por astrocitosis

reactiva, caracterizada por hipertrofia, proliferación y aumento de expresión de la

proteína GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein). Estudios previos realizados en un

modelo murino de ELA que expresa la mutación SOD1G93A han mostrado que los

astrocitos ejercen toxicidad sobre motoneuronas en condiciones de co-cultivo. Sin

embargo, aún no se ha estudiado en profundidad las características fenotípicas de

los astrocitos responsables de la muerte neuronal. Con este objetivo hemos

realizado cultivos de médula espinal de ratas SOD1G93A en la fase sintomática de

la enfermedad, en un intento de aislar e identificar astrocitos con capacidad

proliferativa y evaluar su potencial neurotóxico. Como resultado de esta

investigación se pudo establecer un cultivo homogéneo de astrocitos con alta

capacidad proliferativa y resistentes a sucesivos pasajes únicamente a partir de

animales SOD1G93A. Este fenotipo proliferativo no pudo ser obtenido a partir de

animales no transgénicos. Por tener características diferentes a los cultivos

primarios de astrocitos se les denominó células AbA (astrocito aberrante). Las

células AbA fueron caracterizadas como astrocitos mediante la detección de

marcadores como GFAP, Conexina 43 y S100 beta. Evaluados en condiciones de co-

cultivo con motoneuronas demostraron ser más tóxicos que los cultivos primarios

de astrocitos SOD1G93A. Se concluye que las células AbA podrían representar una

sub-población de astrocitos reactivos que por efecto de la mutación SOD1G93A

adquieren características aberrantes y neurotóxicas.

82

P69) VECTORES LENTIVIRALES: HERRAMIENTAS EFECTIVAS PARA LA

TRANSDUCCIÓN CELULAR.

NEGRO, M.L.1,2 BARBEITO, L.1 PELUFFO, H.1,2

1Laboratorio de Neurodegeneración, Institut Pasteur de Montevideo. 2Departamento de Histología y Embriología, Facultad de Medicina, Universidad de

la República.

Los vectores retrovirales derivados de lentivirus han evolucionado en los últimos

años, siendo muy populares en su uso como mecanismos moleculares

especializados para la introducción de transgenes tanto en células replicativas

como quiescentes. Los lentivectores derivados de HIV1 son capaces de mediar la

expresión in vivo a largo plazo en diversos órganos y tejidos. Cuando son

pseudotipados con la proteína G del virus de stomatitis vesicular (VSV-G) son

capaces de transducir un amplio rango de células incluyendo neuronas adultas y

células gliales del sistema nervioso central. Estos vectores poseen la capacidad de

introducir secuencias de gran tamaño, de entre 10 y 12 kb, siendo su expresión

estable debido a la inserción preferencial en sitios activos del genoma.

En el sistema de vectores HIV1, los genes virulentos son eliminados creando un

vector atenuado con muy baja inmunogenicidad. La producción de lentivectores de

3ª generación se realiza cotransfectando células productoras con 4 plasmidos

independientes, empaquetandose únicamente el plásmido que posee el transgen,

creando así virus deficientes en replicación. La utilización de sistemas de

expresión de última generación ha disminuido los problemas de bioseguridad

permitiendo una alta eficiencia de expresión génica.

El uso de lentivectores se extiende a la clínica así como a la investigación básica y

permiten realizar análisis de expresión tanto in vitro como in vivo. Aplicaciones

comunes para los vectores virales incluyen la restauración de genes funcionales en

estudios de terapia génica, silenciamiento de genes mediante la introducción de

siRNA entre otros. Dichos vectores han mostrado un gran potencial neuroprotector

para diversas neuropatologías espinales rescatando motoneuronas en modelos de

esclerosis lateral amiotrófica mediante el silenciamiento de genes involucrados en

la misma.

83

P70) VALIDACIÓN DE UN MODELO DE NEURODEGENERACIÓN:

DESCRIPCIÓN Y PARÁMETROS A EVALUAR

CÓPPOLA, V; SARLABOS, M N; BARBEITO, L; OLIVERA, S

Departamento de Neurobiología Celular y Molecular (NBCM)-Instituto Clemente

Estable (IIBCE)

Las células gliales están afectadas en la mayoría de las enfermedades

neurodegenerativas y dada su relación con las neuronas, podrían condicionar el

comienzo y/o la progresión de la neurodegeneración. Nuestro grupo ha

desarrollado un modelo de acidemia glutárica I (GAI) donde los astrocitos son

primariamente afectados y participarían de la neurotoxicidad retardada

observada1. Como la disfunción astrocitaria podría afectar la mielinización2 y en

GAI hay alteraciones significativas de la mielina3, el objetivo de este trabajo es

realizar en nuestro modelo un correlato del patrón de crecimiento, la

mielinización y el desempeño motor durante el desarrollo. Para ello, se inyectaron

ratas Sprague Dawley de 1 día con PBS (controles) o GA 0,75mM. Se determinó

peso semanalmente hasta los 60DPN. A los 7, 14, 21, 30, 45, 60 días, se

sacrificaron controles e inyectados mediante perfusión intracardíaca con PAF 10%.

Se realizó la evaluación morfométrica de los cerebros disecados, luego se cortaron

en vibrátomo para pruebas histológicas e inmunohistoquímicas por flotación. El

comportamiento locomotor se evaluó mediante test footprint4. Los resultados

preliminares indican que, respecto de controles inyectados con PBS, los animales

tratados con GA: a) no presentan diferencias significativas en la correlación peso-

edad ni en el desempeño motor grosero; b) el análisis morfométrico del cerebro

muestra una disminución transversal a nivel del estriado; c) existe una pérdida

significativa del área estriatal mielinizada así como alteración de algunas proteínas

relacionadas con la mielina. Las alteraciones observadas en la mielinización

podrían repercutir en la función y sobrevida neuronal. El uso de un modelo de

enfermedad neurometabólica de causa conocida y reproducible donde las células

gliales son primariamente afectadas facilita la comprensión de los mecanismos

subyacentes a la neurodegeneración y abre posibilidades terapéuticas basadas en

las células gliales. 1Olivera et al., 2008. NeurobiolDis. 32(3):528-34.

2 vanderKnaap et al., 2006. LancetNeurol. 5(5):413-23 3 Koeller et al., 2002. HumMolGenet. 11(4):347-57 4 Pallier et al., 2009. BrainResBull. 78(6):347-55

Financiación: PDT 76/23 y PEDECIBA Biologia.

84

OTRAS AREAS RELACIONADAS P71-P75

P71) TOXICIDAD AGUDA DE ABEJAS EXPUESTAS A INSECTICIDAS

EMPLEADOS EN CULTIVOS AGRÍCOLAS DEL LITORAL OESTE

CARRASCO-LETELIER, L.1, OJEDA, P.2, RAMALLO, G.3, DÍAZ, S.3 , MENDOZA, Y.3

1 Programa Nacional de Investigación en Producción y Sustentabilidad Ambiental,

INIA, Uruguay; E-mail:lcletelier@gmail.com

2 Prog. Maestría en Ciencias Ambientales, Facultad de Ciencias, UdelaR,

Montevideo, Uruguay.

3 Unidad de Apicultura, INIA-La Estanzuela, Colonia, Uruguay.

En el marco del proyecto INIA SA07 “Herramientas para la producción y

sustentabilidad de cuencas de aptitud forestal”, se han desarrollado estudios para

la validación de parámetros e indicadores; para evaluar los cambios en la calidad

ambiental por actividades agropecuarias. En este sentido, el desarrollo y

validación de parámetros internacionales de calidad ambiental con especies

nativas es un objetivo prioritario. Razón por la cual, el estudio de procesos de

contaminación por vía atmosférica con pesticidas en áreas rurales, se ha centrado

en el uso de la abeja como organismo centinela. Estrategia relevante tanto para el

soporte de redes de monitoreo atmosférico, como para la definición de las dosis

más adecuadas en el uso de pesticidas. Actividad que actualmente se basa en

recomendaciones internacionales, derivadas de estudios toxicológicos realizados

en un biotipo de abeja que no es el dominante en Uruguay. Principalmente, debido

al proceso de africanización existente en Uruguay. El cual ha generado biotipos

híbridos de abejas cuya sensibilidad toxicológica a insecticidas es desconocida. El

presente trabajo evaluó, mediante el procedimiento internacional estándar de la

EPPO, la toxicidad aguda de los insecticidas: Clorpirifos, Endosulfan, Imidacloprid,

Cipermetrina, Lamda-Cialotrina y Metoxifenocide. Pesticidas de amplia aplicación

en los cultivos del Litoral Oeste, y que representan el 30% de los insecticidas

importados por Uruguay. Los valores de DL50 resultantes presentaron una

toxicidad tres a cinco veces mayores que los descritos por la literatura

internacional, para un biotipo de abeja representativo del Litoral Oeste del

Uruguay.

Financiamiento:Proyecto INIA SA07, Uruguay.

85

P72) ESTUDIO LA DISRUPCIÓN ENDOCRINA EN CUENCAS AGRICOLAS Y

FORESTALES DEL LITORAL OESTE DEL URUGUAY

CANEDO PUOSO, L.3, EGUREN, G.2, CARRASCO-LETELIER, L.1, RIVAS-RIVERA, N.2

1 Programa Nacional de Investigación en Producción y Sustentabilidad Ambiental,

INIA, Uruguay; E-mail:lcletelier@gmail.com

2 Grupo de Investigación en Quimica Ambiental y Ecotoxicología, Facultad de

Ciencias, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

3 Universidad de Estocolmo, Suecia.

Entre los nuevos contaminantes ambientales identificados en los últimos veinte

años, se destacan los compuestos químicos con capacidad de perturbar las

funciones normales del sistema endocrino, denominados genéricamente

disruptores endocrinos. En Uruguay, un trabajo cooperativo entre Facultad de

Ciencias (UDELAR), el Canadian River Institute (Universidad de Saint John, Canadá)

y el INIA (proyecto INIA SA07) permitió validar el primer ensayo para evaluar

procesos de disrupción endocrina en el rìo Uruguay. Dada la naturaleza química de

los disruptores endocrinos, estos se encuentran asociados a: emisiones líquidas de

agroindustrias, residuos líquidos urbanos, productos fitosanitarios, y liberación de

fitoestrógenos y ácidos resínicos vinculados a al uso del suelo. En este marco, se

realizó una evaluación del efecto de cambio de uso del suelo en cuencas agrícolas,

basado en el ensayo validado para Uruguay. En el presente trabajo se presentan

los resultados del estudio de procesos de disrupción endocrina en dos cuencas del

Departamento de Río Negro con usos de suelo contrastantes (forestación vs

agricultura). En este bioensayo se expusieron juveniles de Cyprinus carpio a agua,

sedimento y mezclas de agua-sedimento colectados en las cuencas seleccionadas.

En este experimento se evaluaron los biomarcadores: vitelogenina plasmática,

índices hepato- y gonado-somático. Los resultados de este experimento evidencian

una mayor disrupción endocrina en peces expuestos a agua y sedimentos de

cuencas agrícolas que en cuencas forestadas.

Financiamiento:Proyecto INIA SA07, Uruguay.

86

P73)

Couto-PDF-

87

P74) ENVEJECIMIENTO SEXO-ESPECÍFICO Y DAÑO OXIDATIVO EN

COPÉPODOS MARINOS

LAURA RODRÍGUEZ-GRAÑA1, DANILO CALLIARI2, PETER TISELIUS 3, HELEN NILSSON

SKÖLD 3

1Sección Limnología y 2Sección Oceanología, Facultad de Ciencias, Universidad de

la República, Iguá 4225, C. P. 11400, Montevideo, Uruguay 3 Department of Marine Ecology, University of Gothenburg, Kristineberg 566, SE

450-34, Fiskebäckskil, Sweden

Este estudio analiza los efectos del envejecimiento en Acartia tonsa (Copepoda,

Crustacea); dichos efectos implicaron una disminución en las tasas de ingestión y

reproducción asociados con un incremento en la acumulación de daño oxidativo

(estimado como nivel de proteínas carboniladas). Bajo condiciones experimentales

en laboratorio se determinaron los efectos del envejecimiento en la alimentación

y daño oxidativo discriminado por sexos, y la fecundidad en hembras. También se

determinó el efecto materno sobre la descendencia mediante la estimación del

éxito en la eclosión de huevos y daño oxidativo en las crías producidas por madres

de diferente edad. Los machos manifestaron un mayor daño oxidativo con la edad

respecto a las hembras. La edad de la madre tuvo un efecto en la descendencia y

hembras más viejas presentaron una menor tasa reproductiva y originaron crías

con mayor daño oxidativo. Se exploró el efecto antioxidante de dos tipos de

alimento (microalgas) en las variables mencionadas. Este estudio proporciona una

base empírica para relacionar envejecimiento y expectativa de vida, diferencias

entre sexos y efecto materno en uno de los organismos más abundantes e

importantes en el ambiente acuático, con implicaciones en el campo de la

ecología funcional y evolutiva. Se propone además el uso de este crustáceo como

potencial organismo modelo en estudios de envejecimiento.

88

P75) DIFERENCIAS EN LA DISCRIMINACIÓN ISOTÓPICA DE 13C ENTRE

LOTUS corniculatus Y TRIFOLIUM repens

BERRIEL V, MORI C Y PERDOMO C.

CATNAS, Facultad de Agronomía, Universidad de la República.

Las plantas integran las señales ambientales en complejas respuestas fisiológicas

que pueden tener incidencia a corto o largo plazo en el consumo de agua y en el

rendimiento del cultivo. Sin embargo ante diferentes estímulos y/o estreses

ambientales las distintas especies no responden de la misma manera. Los

diferentes mecanismos de adaptación pueden estudiarse a través medidas

fisiológicas integradas en el tiempo y cuya significación biológica es más valiosa

que las instantáneas. La discriminación isotópica del 13C (Δ) es un parámetro

fisiológico que integra en el tiempo a otras respuestas como la conductancia

estomática y la tasa fotosintética y además se relaciona a la eficiencia en el uso

del agua del cultivo. En el año 2007 se realizó un estudio en campo donde se

evaluaron diferentes parámetros fisiológicos de las leguminosas Trifolium repens y

Lotus corniculatus sembradas en pasturas mezcla con Festuca arundinacea.

Durante los meses de agosto a noviembre se realizaron cuatro muestreos, que

consistieron en cortes de la parte aérea de las plantas, en cuatro sitios elegidos al

azar. Los resultados mostraron que ambas especies tuvieron diferentes respuestas

fisiológicas que determinaron distintos valores de Δ, concentración de carbono y

producción de materia seca. Los valores de Δ fueron disminuyendo en las dos

especies a medida que avanzó el año; esto puede explicarse en función del cambio

en las condiciones ambientales durante los meses evaluados que provocaron el

cierre estomático y la disminución de la fijación del carbono en la fotosíntesis. L.

corniculatus presentó valores significativamente mayores de Δ que T. repens para

todas las fechas evaluadas, y además la disminución de Δ fue mayor y más

temprana en T. repens. Este estudio confirma la utilidad del parámetro Δ para

detectar diferencias de respuesta entre especies a las condiciones ambientales.

89

PARASITOLOGÍA P76-P83

P76) PROTEÍNAS INVOLUCRADAS EN LA INTERACCIÓN HOSPEDERO-

PARASITO. ESTUDIO DE PROTEÍNAS TIPO CRISP EN CESTODOS

PARÁSITOS

COSTÁBILE, A; KOZIOL, U; MARÍN, M; CASTILLO, E.

Sección Bioquímica – Biología Molecular. Facultad de Ciencias. UDELAR

Se ha aislado en nuestro laboratorio una proteína, denominada McCRISP2, que

presenta una señal de excreción/secreción, expresada por distintos estadíos del

cestodo Mesocestoides corti. Presenta similitud aminoacídica significativa con

miembros de la familia de proteínas SCP/TAPS, presentes en muchos organismos.

Estas proteínas se caracterizan por tener un dominio SCP N-terminal y varios

residuos de cisteína en el extremo C-terminal. En el caso de parásitos, en

particular en el nematodo parásito Ancylostoma caninum, la proteína ASP1,

perteneciente a la familia CRISP, (51% de similitud aminoacídica con McCRISP2), se

expresa como producto de excreción/secreción en el estadío larvario infectivo;

además se ha probado que la inmunización de animales de laboratorio con la

proteína recombinante disminuye la carga parasitaria, por lo que se ha propuesto

como un candidato prometedor para el desarrollo de vacunas.

Con el objetivo de dilucidar la función de esta proteína, se clonó y expresó su

secuencia codificante en Escherichia coli. La proteína recombinante fue obtenida

en forma insoluble, fusionada a una cola de histidinas, lo que permite purificarla

mediante cromatografía de afinidad, en condiciones desnaturalizantes. La

obtención de la proteína pura permitirá la producción de anticuerpos específicos

contra la misma, lo que será una herramienta invalorable para estudiar su función

en relación a su posible rol en la interacción hospedero – parásito.

Por otro lado se está intentando obtener la secuencia codificante completa de tres

proteínas tipo CRISP aisladas en forma parcial. Se diseñaron oligonucleóticos

específicos a partir de la secuencia conocida y se está intentando amplificar sus

extremos mediante 5‟ y 3‟ RACE. Se ha obtenido la secuencia 3´para algunas de

ellas. Además se están diseñando cebadores específicos, en base al análisis del

genoma de Echinococcus multilocularis, para clonar proteínas tipo CRISP de

Echinococcus granulosus.

90

P77) CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA DE LA TRIPANOTIÓN SINTETASA

DE TRYPANOSOMA BRUCEI

MEDEIROS, A.1,2, RADI, R1 Y COMINI, M2.

1Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina. 2Laboratorio de Biologia

Redox de Tripanosomas, Instituto Pasteur.

En los tripanosomátidos, tripanotión (bis-glutationil-espermidina) es el principal

cofactor redox de bajo peso molecular encargado de sostener diversas funciones

celulares. Su síntesis a partir de glutatión y espermidina es catalizada por la

enzima Tripanotión Sintetasa (TryS). La indispensabilidad de TryS y tripanotión

para la sobrevida del tripanosoma africano T. brucei brucei fue demostrada

mediante técnicas de ARN interferencia. Esto, sumado a su ausencia en seres

humanos convierte a la TryS en un interesante blanco terapéutico contra las

tripanosomiasis.

En el presente trabajo hemos profundizado la caracterización biológica de la TryS

utilizando como modelo la forma infectiva de T. brucei brucei, especie patógena

para el ganado y organismo modelo de la tripanosomiasis africana humana.

Empleando técnicas bioquímicas determinamos la localización subcelular, el

patrón de expresión y la concentración intracelular de la TryS durante las distintas

fases del crecimiento del parásito, así como también frente a estrés oxidativo y

ARN interferencia (ARNi).

Los estudios revelaron que la TryS es una proteína relativamente abundante en el

parásito (1-5 µM) que presenta un patrón de expresión constitutivo y se distribuye

mayoritariamente en gránulos citoplasmáticos. A diferencia de lo observado para

triparredoxina y triparredoxina peroxidasa (dos enzimas importantes del sistema

de defensa anti-oxidante del parásito), no se detectó un aumento significativo en

la expresión de TryS en parásitos sometidos a estrés oxidativo (100 μM H202).

Mediante ARNi confirmamos que la concentración intracelular mínima de TryS

necesaria para mantener la viabilidad de los parásitos in vitro debe ser ≥ a 1 µM.

91

P78) PROGRESOS EN LA MANIPULACIÓN GÉNICA EN CESTODOS.

DOMINGUEZ, M. F., KOZIOL, U., DELL´OCA, N., MARIN, M., TORT, P., CASTILLO, E.

Sección Bioquímica –Biología Molecular – Facultad de Ciencias – Universidad de la

República.

Los platelmintos parásitos, representan un grupo muy diverso de organismos

responsables de infecciones tanto en seres humanos como en animales. Debido el

gran impacto sanitario y económico, estos han sido centro de estudios buscando

dilucidar aspectos básicos de su biología, inmunología, y epidemiología.

Uno de ellos E. granulosus presenta una gran importancia clínica y económica

debido a la infección de los huéspedes intermediarios que constituye un problema

muy importante de salud en humanos y es una causa de substanciales pérdidas

económicas en el ganado.

Además de estudiar este parasito nosotros usamos como modelo alternativo M.

corti para el estudio de cestodos.

El objetivo de nuestro trabajo es la implementación de metodologías de

manipulación génica “ knockdown”, que nos permitirá la determinación del rol

de determinados genes que podrá se aplicado a más largo plazo para el estudio del

tratamiento de enfermedades parasitarias.

Las técnicas de “knockdown”, particularmente interferencia mediada por ARN

doble cadena (ARNi) han sido aplicadas con éxito en varias especies de

invertebrados. Estas técnicas permiten el estudio de la función génica sin la

necesidad del desarrollo de transformantes estables, reduciendo el tiempo, el

costo y los riesgos asociados a las manipulaciones genéticas.

Hemos logrado la transfección de moléculas reporteras (Luciferasa) en M. corti

logrando detectar la misma dentro de los organismos electroporados utilizando RT-

PCR y la detección de la actividad.

Actualmente nos encontramos realizando experimentos de interferencia de ARN

con el uso de moléculas doble cadena. Esto nos permitirá realizar la interferencia

de un mensajero exógeno de Luciferasa para poder aplicar el sistema para la

interferencia de genes endógenos: Crisp y Tropomiosina.

92

P79) GLICANOS DE LA CAPA LAMINAR DE Echinococcus granulosus:

ANÁLISIS COMPARATIVO ENTRE DISTINTOS HOSPEDEROS.

GERARDO LIN1, MAGDALENA PORTELA3, FERNANDO FERREIRA2 Y ALVARO DÍAZ1

1 Cátedra de Inmunología, DEPBIO, Facultad de Química, Udelar. 2 Laboratorio de Carbohidratos y Glicoconjugados, DQO, Facultad de Química,

Facultad de Ciencias y Facultad de Medicina, Udelar 3 UBYPA, Institut Pasteur Montevideo

La larva (hidátide) del cestode E. granulosus está protegida externamente por una

matriz extracelular especializada (capa laminar), que es la única estructura

parasitaria expuesta al hospedero. La capa laminar está compuesta principalmente

por mucinas, cuyos glúcidos hemos mayoritariamente elucidado. Estos son O-

glicanos basados en los cores 1 o 2 convencionales, desnudos o decorados con un

repertorio acotado de motivos, que incluyen extensiones lineales con residuos de

galactosa y probables ramificaciones iniciadas con residuos de N-acetilhexosamina.

El trabajo de base se realizó con hidátides de origen bovino, hospedero al cual E.

granulosus no está bien adaptado, por lo que la inflamación frente al parásito no

se resuelve. Por lo tanto, en el presente trabajo se estudia comparativamente el

perfil de glicanos en hidátides provenientes de hospederos más permisivos (como

el ovino), para evaluar la posibilidad de que la predominancia hasta el momento

observada de glicanos cortos (incluyendo los cores desnudos) sea característica del

parásito solamente en el contexto de una reacción inflamatoria sostenida. Se

liberaron por -eliminación reductiva los glicanos de paredes de hidátides de 4

especies de hospederos, y se analizaron por gel filtración. Se encontró una

distribución de tamaños sumamente conservada, predominando en todos los casos

estructuras de 2 o 3 monosacáridos, con cantidades decrecientes de los glicanos

mayores. Los glicanos de hidátides de orígenes bovino y ovino se analizaron

adicionalmente por MALDI-TOF-TOF luego de permetilación, detectándose el

mismo conjunto de estructuras en ambos. Se concluye que la dominancia de O-

glicanos pequeños en la capa laminar es intrínseca a la biología del parásito. Sin

embargo, los resultados sugirieron también una mayor abundancia relativa de

aquellos glicanos con mayor número de residuos de N-acetilhexosamina (o sea,

más ramificados) en el hospedero ovino. Se buscará confirmar esta tendencia por

métodos cuantitativos, y evaluar su relevancia en la biología de E. granulosus.

Financiación: CSIC (I+D nº 404, Facultad de Química)

93

P80) CARACTERIZACIÓN DE LA TRIPARREDOXINA PEROXIDASA CITOSÓLICA DE Trypanosoma cruzi EN CONDICIONES DE OXIDACIÓN-REDUCCIÓN. 1,2GARDNER, M., 1,3ARCARI, T., 1,3PIÑEYRO, M.D., 2PARODI-TALICE, A., 1,3ROBELLO, C. 1Unidad de Biología Molecular, Instituto Pasteur Montevideo; 2Sección Genética, Facultad de Ciencias, UdelaR; 3Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, UdelaR Durante su ciclo de vida, Trypanosoma cruzi invade las células de sus hospederos vertebrados. Dentro de las células, el parásito está expuesto a especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno, producidas por sus propios procesos de respiración celular o por mecanismos de defensa del huésped, que pueden resultar letales. Sin embargo, los tripanosomátidos han desarrollado sistemas de detoxificación dependientes de tripanotión, que les permiten eliminar dichas especies reactivas. La Triparredoxina Peroxidasa citosólica de T. cruzi (cTcTXNPx) forma parte de uno de estos sistemas de enzimas antioxidantes. La cTcTXNPx es una peroxirredoxina de 2-Cys, con dos residuos de cisteína reactivos esenciales para su actividad catalítica. En la cTcTXNPx, el grupo sulfhidrilo de la cisteína peroxidática (CP) es oxidado al reaccionar con H2O2, formándose el derivado ácido sulfénico (Cys-SOH). La CP puede reaccionar con una segunda molécula de H2O2, formándose un derivado sulfínico (Cys-SO2H), obteniéndose así una forma inactiva de la enzima. La inactivación por “sobreoxidación” de las CP de Prx de 2-Cys se ha detectado in vitro e in vivo en varios tipos celulares. En mamíferos, se ha demostrado que este proceso es reversible, formando parte de mecanismos de regulación de cascadas de señalización mediados por H2O2. En este trabajo caracterizamos, desde un punto de vista proteómico, el estado de la cTcTXNPx en condiciones de oxidación-reducción. La caracterización comprendió la expresión y purificación de la proteína cTcTXNPx y formas mutantes en varios residuos de cisteína. Se caracterizaron los cambios en la movilidad electroforética de las proteínas, provocados por su oxidación al ser incubadas en presencia de H2O2, mediante la utilización de técnicas de electroforesis bidimensional y espectrometría de masa (MS). Por último, se detectó la presencia de ácido sulfínico (SO2H) mediante análisis por Western Blot utilizando anticuerpos específicos.

94

P81) ARNs PEQUEÑOS EN FASCIOLA HEPATICA, UNA PRIMER

APROXIMACIÓN.

DELL‟OCA N, GARCIA R, CANCELA M, CAYOTA, TORT J.

En los últimos años una nueva clase de ARNs pequeños no codificantes (ncRNAs)

reguladores ha sido descubierta. Algunos de los rasgos que definen esta población

de ncRNA son tamaño de aproximadamente 20 a 30 nucleótidos y la unión con

proteínas de la familia Argonauta.

Los miembros más representativos de esta familia son micro RNAs (miRNAs), ARNs

pequeños de interferencia (siRNAs) y piwi RNAs (piRNAs). Hoy sabemos que miRNAs

y siRNAs son fuertes reguladores post-trancripcionales de la expresión génica. Los

piRNA y ra-siRNA una subclase de piRNA, se expresan solo en la línea germinal en

distintos organismos donde han sido descritos y actúan como estabilizadores del

genoma de estas células. El universo de ncRNA continua creciendo con nuevos

tipos caracterizados recientemente en plantas y hongos aunque no se conoce bien

su función.

La mayoría de los trabajos sobre ncRNA utilizan se han centrado en vertebrados

(organismos deuterostomados) y en los ecdizosoos modelo, el nematodo C.elegans

y la mosca Drosophila. Poco se sabe de estos mecanismos en el tercer linaje de los

metazoarios, los lofotrocozoos, donde los trabajos que hablan de ncRNA

reguladores se limitan casi exclusivamente a Schistosomas y Planarias.

Siguiendo protocolos establecidos comenzamos a analizar los ARN pequeños

presentes en el trematodo Fasciola hepatica. Generamos 124 ARNs pequeños

distintos de 18 a 32 nucleótidos del estadio juvenil de Fhepatica. El análisis de

estas secuencias puede representar la primera evidencia de ncRNAs en el

trematodo F.hepatica.

Esto resulta de vital importancia para comprender los mecanismos de control de la

expresión génica en este parasito, lo que puede facilitar el desarrollo de la

interferencia de ARN, y de otras herramientas de estudio de la función génica y

eventualmente aportar al control de las parasitosis.

95

P82) AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE GENES TIPO NANOS EN

PLATELMINTOS PARÁSITOS.

BIZZOZERO R. , KOZIOL U. , DOMÍNGUEZ F. , COSTÁBILE A. , CASTILLO E.

Sección Bioquimica – Biología Molecular, Facultad de Ciencias, UDELAR.

Un aspecto de la biología de platelmintos parásitos que es interesante profundizar

es sobre sus células indiferenciadas (neoblastos). Uno de los genes que se expresan

durante la proliferación y diferenciación celular en los neoblastos es el gen nanos.

La expresión de este gen está relacionada con la diferenciación de líneas celulares

germinales en planarias, y probablemente también lo esté en otros platelmintos.

El gen nanos codifica para una proteína de unión al ARN, que contiene un presunto

motivo de dedos de Zinc que exhibe semejanzas con otros genes nanos en

vertebrados e invertebrados. Estudios en diferentes organismos han demostrado la

conservación del rol de la proteína Nanos en el desarrollo y en la diferenciación

celular.

Nos hemos propuesto aislar y caracterizar genes tipo nanos de platelmintos

parásitos y también determinar los posibles patrones de expresión de estos genes

en algunas etapas del desarrollo. Mediante PCR con cebadores degenerados hemos

aislado la secuencia de ADN copia correspondiente al dominio Nanos de unión al

ARN (zf-nanos; Nanos RNA binding domain) de Fasciola Hepática y Mesocestoides

corti. Los fragmentos aislados han sido clonados en vectores procariotas y luego

secuenciados.

Actualmente estamos amplificando por medio de RACE (Rapid Amplification cDNA

Ends) ambos extremos flanqueantes al dominio ya aislado. De este modo,

hallaremos la secuencia completa del gen codificante, para luego clonarla y

secuenciarla. Hemos completado el extremo 3´del cDNA de nanos de M.corti.

También, estamos diseñando sondas específicas para realizar ensayos de

hibridación in situ, y así establecer posibles patrones de expresión en diferentes

estadíos de desarrollo de los parásitos de estudio.

96

P83) EgGST3: UNA NUEVA GLUTATIÓN S-TRANSFERASA DE

Echinococcus granulosus

LA-ROCCA S1., IRIARTE A.2, ARBILDI P.1, FERNÁNDEZ V1.

1Cátedra de Inmunología, Facultad de Química-Ciencias, UdelaR. 2Laboratorio de

Organización y Evolución del Genoma. Facultad de Ciencias.

Las glutatión transferasas (GSTs) son una superfamilia de proteínas

multifuncionales involucradas en la detoxificación celular de componentes

exógenos y endógenos. Estas enzimas conjugan glutatión a una amplia variedad de

compuestos, algunos potencialmente tóxicos, favoreciendo la inactivación de los

mismos. Existen además, GSTs involucradas en la síntesis de prostaglandinas, en

particular las de clase sigma pueden producir PGD2, que participa en diversos

mecanismos de regulación de la respuesta inmune. De esta forma, las GSTs

adquieren gran relevancia en los helmintos parásitos, ya que constituyen un

importante mecanismo de detoxificación y contribuyen a la evasión de la

respuesta inmune del hospedero. En Echinococcus granulosus hemos caracterizado

molecularmente dos GSTs (EgGSTs): EgGST1 de clase Mu que podría estar

involucrada en la detoxificación de lípidos hidroperoxidados, y recientemente,

EgGST2 con alta homología con las de clase Sigma. En este trabajo se describe el

clonado y secuenciación del gen de una nueva enzima parasitaria, EgGST3. Se

presentan estudios filogenéticos, implementando el método Bayesiano y de

distancias “Neighbor-joining”, que permitieron relacionar a EgGST3 con otras GSTs

de E. granulosus y otros organismos. Asimismo, se incluye un análisis de la

evolución molecular y un estudió de la conservación de residuos aminoacídicos,

que podrían ser relevantes para el entendimiento de su actividad enzimática

actual y pasada. De esta forma, el análisis realizado constituye un punto de

partida en el estudio de EgGST3 y sus posibles roles en la biología del parásito, en

particular, en una infección por el mismo.

97

BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE LOS MICROORGANISMOS

P84-P102

P84) ESTANDARIZACIÓN DE UN ENSAYO MOLECULAR PARA EL

DIAGNÓSTICO DE IBV EN URUGUAY

MARANDINO A, PANZERA Y, HERNÁNDEZ M, HERNÁNDEZ D & PÉREZ R

Sección Genética Evolutiva, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

La Bronquitis Infecciosa Aviar es una enfermedad respiratoria aguda que afecta

exclusivamente a aves de corral. El agente causal de esta enfermedad es el virus

de la bronquitis infecciosa (IBV) perteneciente al género Coronavirus de la familia

Coronaviridae. IBV es un virus pleomórfico, con diámetro de 80-120 nm, en cuyo

interior aloja un genoma ARN simple hebra de polaridad positiva de 27,6 kb. El

diagnóstico clínico de la Bronquitis Infecciosa Aviar es dificultoso ya que, por

tratarse de una enfermedad esencialmente respiratoria, suele confundirse con

otras patologías aviares que provocan síntomas similares. El diagnóstico por

aislamiento e identificación del virus con pruebas serológicas utilizadas

tradicionalmente, como la neutralización viral, generalmente es muy laborioso y

poco seguro debido a la alta tasa de cambios antigénicos que posee IBV. Por esta

razón nos encontramos desarrollando, por primera vez en el Uruguay, un método

de diagnóstico molecular para IBV mediante el uso de la técnica de RT-PCR.

Nuestra metodología se basa en la detección de la presencia del genoma viral

mediante la amplificación de un fragmento de 437 pb del gen de la nucleocápside

(N). Inicialmente esta técnica se aplicó en virus obtenidos directamente de viales

de vacunas de IBV comercializadas en Uruguay. Los parámetros del ensayo fueron

ajustados correspondientemente de manera de utilizar el virus vacunal como

control positivo para el diagnóstico de cepas de campo. Recientemente se detecto

la presencia del genoma viral de IBV en muestras provenientes de un lote de aves

con sintomas respiratorios. Actualmente se está aplicando la metodología

estandarizada en nuevas muestras de campo con diagnostico clínico presuntivo de

esta enfermedad

98

P85) ESPECIFICIDAD POR SUSTRATOS OXIDANTES DE LA ALQUIL HIDROPEROXIDO REDUCTASA E DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS REYES A. M.1,2, HUGO M.1,2, RADI R.1,2 Y TRUJILLO M.1,2

1Departamento de Bioquímica y 2Centro de Investigaciones Biomédicas en Radicales Libres, Facultad de Medicina Mycobacterium tuberculosis, el agente causante de la enfermedad tuberculosis, es capaz de sobrevivir y proliferar en los fagosomas de macrófagos activados, y sus mecanismos de defensa antioxidante constituyen un campo de investigación activo. En nuestro trabajo previo demostramos que la alquil hidroperóxido reductasa E (AhpE), peroxirredoxina de 1-cisteína de M. tuberculosis, reduce al peroxinitrito mas rápidamente que al peróxido de hidrogeno (2 x 107 y 8 x 104 M-1s-

1 a pH 7,4 y 25°C, respectivamente). Aquí continuamos investigando la especificidad de MtAhpE por sustratos oxidantes. El peroximonocarbonato, formado a través de la reacción de equilibrio lenta entre el peróxido de hidrógeno y el dióxido de carbono presente en concentraciones mM en sistemas celulares, oxidó a la enzima rápidamente (4 x 106 M-1s-1). Los hidroperóxidos de tert-butilo y de cumeno fueron reducidos por la enzima con constantes de velocidad similares al peróxido de hidrogeno. El hidroperóxido en posición 15 del ácido araquidónico reaccionó con la enzima con una constante de velocidad de 2 x 108 M-1s-1, reactividad mayor que la descrita para la reducción de hidroperóxidos lipídicos por la glutatión peroxidasa 4 de mamíferos. Exceptuado a este último, la cinética de oxidación del tiol peroxidático en MtAhpE por los sustratos estudiados siguió una tendencia en la que aquellos con menor pKa de grupo saliente (alcóxido) reaccionaron más rápidamente. Este comportamiento es similar al del glutatión y el único grupo tiol de la albumina sérica bovina, pero difiere de otros tioles peroxidáticos previamente reportados. La sobreoxidación de la cisteína peroxidática de MtAhpE a acido sulfínico por estos peróxidos también fue

estudiada, y la cinética fue paralela aunque 1000 veces mas lenta que la de oxidación.

99

P86) DIVERSIDAD Y EFICIENCIA SIMBIÓTICA DE RIZOBIOS AISLADOS DE NÓDULOS DE LOTUS ULIGINOSUS EN URUGUAY

BATISTA L., SÁNCHEZ M., AZZIZ G. Y MONZA J.

Laboratorio de Bioquímica, Dpto. de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía

Leguminosas del género Lotus son utilizadas en Uruguay para el mejoramiento de las pasturas. Lotus

uliginosus, típicamente nodulado Bradyrhizobium sp., interesa por su alta concentración de taninos,

y por la adaptación a suelos ácidos y de baja fertilidad. En este trabajo se evaluó la diversidad y

eficiencia simbiótica de 111 aislados de nódulos de L. uliginosus, colectados de sitos con y sin historia

de inoculación. Usando cebadores ERIC se obtuvieron 75 aislados con perfiles únicos, ninguno igual al

del inoculante comercial. La diversidad por sitio varió entre el 50 y 79%. A los amplificados del gen

16S ARNr de los 75 aislados diferentes se les realizó ARDRA con MspI y HinfI, que permitieron definir 3

ribogrupos, de los que se seleccionaron 14 aislados y se secuenciaron los genes 16S ARNr, atpD y nifH.

El análisis de la secuencia del gen 16S ARNr evidenció que 13 aislados pertenecen al género

Bradyrhizobium, y 1 al género Mesorhizobium. El agrupamiento obtenido a partir de la secuencia del

gen atpD coincidió con el obtenido a partir del gen 16S ARNr. Sin embargo la asignación a nivel de

especie no fue la misma con estos genes housekeeping. El análisis de secuencias del gen nifH mostró

concordancia a nivel de género con los análisis obtenidos con los genes 16S ARNr y atpD. El gen nodC

no pudo ser amplificado como única banda con los cebadores usados, que amplifican ese gen en

Mesorhizobium sp. Los aislados indujeron nódulos en L. uliginosus y 8 de ellos también lo hicieriero en

L. corniculatus. La producción de biomasa con las 6 cepas ensayadas no evidenció ninguna más

eficiente que la usada como inoculante comercial en cada leguminosa. Esta evaluación continúa con

la totalidad de los aislados, por el particular interés que esto tiene.

100

P87) NODULACIÓN DE Parapiptadenia rigida (ANGICO) POR BETA

RIZOBIOS.

MAREQUE,C., TAULÉ,C., AZZIZ,G., SARTORI,L., ZABALETA, M., BATTISTONI,F. Y

FABIANO E.

Laboratorio de Bioquímica y Genómica Microbiana.IIBCE-MEC. Av.Italia 3318

Montevideo.cmareque@iibce.edu.uy

El angico es una leguminosa arbórea nativa con alto potencial para la forestación

debido a sus características maderables, su rápido crecimiento y su contribución a

la recuperación de suelos degradados. La inoculación temprana de las leguminosas

arbóreas con bacterias promotoras del crecimiento:BPC, incrementa la

supervivencia y el rendimiento de las plantas en el campo. Una de las asociaciones

planta-BPC más conocida es la establecida entre leguminosas y bacterias

simbióticas fijadoras de nitrógeno, denominadas rizobios. Como resultado de la

interacción se forman en la planta estructuras simbióticas (nódulos) donde se

alojan los rizobios. Uno de los compuestos responsables de la nodulación son los

factores Nod (codificados por los genes nod) sintetizados por los rizobios. Hasta

hace pocos años se consideraba que los rizobios comprendían solamente -

Proteobacterias pero recientemente se demostró que también hay rizobios

(Burkholderia y Cupriavidus) pertenecientes a las -Proteobacterias.

El presente trabajo se propone avanzar en el conocimiento de la interacción leguminosa-rizobio. En particular nos centramos en el estudio de la fisiología de la nodulación y de la filogenia de los genes nodA y nodC en cepas de Burkholderia y Cupriavidus presentes en nódulos de angicos en suelos uruguayos. Se estudió en condiciones gnotobióticas, la cinética de nodulación de angico. Se

evaluó la presencia de los genes nodA y nodC mediante PCR. Los amplicones

obtenidos se secuenciaron en Macrogen y las secuencias se analizaron

bioinformáticamente. Se estudió la filogenia de ambos genes y se comparó con los

datos disponibles sobre la filogenia del gen rRNA 16S. Se determinó también la

capacidad de los microsimbiontes de fijar libremente el N2 mediante ensayos de

reducción del acetileno.

Financiación: INIA-FPTA (216), PDT-MEC (67/03) y PEDECIBA.

101

P88) PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO DE CULTIVOS DE CAÑA DE

AZÚCAR POR BACTERIAS ENDÓFITAS

1,2 *TAULÉ, C., 2*BARLOCCO,C., 1*MAREQUE, C., 1PLATERO, R., 3HACKEMBRUCH, F., 2SICARDI, M. Y 1BATTISTONI, F.

1Laboratorio de Bioquímica y Genómica Microbiana, IIBCE-MEC. Av. Italia 3318.

Montevideo 11600. 2Laboratorio de Microbiología de Suelos. Facultad de Ciencias, UdelaR. Mataojo

2055. Montevideo 11400. 3Alcoholes Uruguay S.A. Camino Calnú S/N. Bella Unión. *igual contribución

En Uruguay, la caña de azúcar se planta con dos objetivos principales: la

producción de azúcar y como materia prima para la producción de

biocombustibles. Actualmente el "Proyecto Sucro-Alcoholero" promueve su

plantación como cultivo estratégico, (ley Nº 18.195) encomendando a ANCAP a

incorporar biodiesel producido en el país con materias primas nacionales.

Uno de los problemas que presenta este cultivo son los altos costos de producción

relacionados a la fertilización química nitrogenada, asi como los problemas

ecológicos relacionados a esta práctica.

Actualmente se está desarrollando una línea de investigación cuya finalidad es

contribuir a la sustentabilidad económica y ambiental del cultivo de caña,

mediante el uso de bacterias promotoras del crecimiento (BPC), particularmente

endófitas-diazótrofas (bacterias fijadoras de nitrógeno). El término endófito

refiere a bacterias que colonizan los tejidos vegetales sin causar daño. El objetivo

del presente trabajo es aislar y caracterizar dichas bacterias, para posteriormente

evaluar su efecto promotor del crecimiento del cultivo caña.

Ensayos de dilución isotópica del 15N se estan llevando a cabo con el fin de conocer

la fijación biológica de nitrógeno (FBN) que realizan naturalmente las variedades

comerciales utilizadas en el país y poder seleccionar aquella que presente la

mayor capacidad de FBN.

Paralelamente se están realizando aislamientos de bacterias endófitas-diazótrofas

a partir de tallos de cañas de las variedades comerciales plantadas. Se pretende

caracterizar e identificar los aislamientos mediante técnicas morfológicas y

moleculares. Resultados preliminares serán presentados

Financiación: INIA-FPTA, ANII

102

P89) DIAGNÓSTICO Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE

SUBESPECIES DE CAMPYLOBACTER FETUS CIRCULANTES EN GANADO

BOVINO URUGUAYO

IRAOLA, G1; HERNÁNDEZ, M1; CALLEROS, L1; SILVEIRA, S2; CARRETTO, L1; PÉREZ,

R1

1Sección Genética Evolutiva, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

2Laboratorio “Miguel C. Rubino”. Dirección de Laboratorios Veterinarios,

Ministerio de Ganadería Agricultura y Pesca.

La campylobacteriosis bovina es una enfermedad infecciosa que provoca

infertilidad crónica y abortos esporádicos en ganado bovino. El agente causante es

la épsilon-proteobacteria Campylobacter fetus. Existen dos subespecies de esta

bacteria, denominadas Campylobacter fetus fetus y Campylobacter fetus

venerealis, que presentan importantes diferencias en la virulencia y en sus

manifestaciones clínicas.

En este trabajo describimos la aplicación de herramientas moleculares para el

diagnóstico y caracterización de las subespecies de C. fetus circulantes en

Uruguay. El objetivo es desarrollar métodos de diagnóstico molecular y generar

información, a nivel de secuencias de ADN, que sea útil en el estudio de la

epidemiología y evolución de este patógeno en nuestro país.

Para la investigación se utilizaron cepas de referencia de ambas subespecies y una

muestra de campo uruguaya aislada en el 2008. Esta muestra fue previamente

tipificada como C. fetus venerealis por métodos bacteriológicos tradicionales

(ensayos de crecimiento en medios selectivos y producción de metabolitos), según

las recomendaciones internacionales de detección de este patógeno.

Se estandarizaron protocolos de PCR en base a primers descritos en la bibliografía

para amplificar fragmentos de los genes para el ARNr 16S, cstA y virB11 específicos

del género Campylobacter, la especie C. fetus y la subespecie C. fetus venerealis

respectivamente. Los productos de PCR fueron secuenciados automáticamente y

las secuencias comparadas con aquellas depositadas en la base de datos del

GenBank. Las cepas de referencia fueron amplificadas por los primers específicos

de género y especie. El primer específico de C. fetus venerealis amplificó solo en

la cepa de referencia correspondiente.

En la cepa de campo se obtuvieron amplificaciones con los tres juegos de primers.

El análisis de nuestras secuencias indicó una alta homología con secuencias de

aislamientos de otras partes del mundo. Nuestros resultados indican la factibilidad

del diagnóstico molecular de este patógeno en bóvidos uruguayos.

103

P90) UNA CASEÍNO-QUINASA (I) SEÑALIZA EL DESTINO DE LOS TRANSPORTADORES DE AMINOÁCIDOS EN ASPERGILLUS NIDULANS

HARISPE, L.1,2,3; APOSTOLAKI, A1; RINCÓN, A2; PEÑALVA, MA3 Y C. SCAZZOCCHIO1,4.

1Institut de Génétique et Microbiologie, Université Paris-Sud XI, Francia.2Facultad de

Ciencias, Univ. de la República, Uruguay. 3Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC,

España.4Department of Molecular Microbiology and Infection, Imperial College, Reino Unido.

En este trabajo se establece que una caseíno-quinasa de tipo I (CKI), esencial para el

hongo ascomiceto filamentoso A. nidulans, se encuentra implicada de manera específica

en el tráfico subcelular de las permeasas de aminoácidos. El gen que codifica esta

quinasa, denominado aauZ, fue identificado mediante el aislamiento de dos mutaciones

recesivas, llamadas aauZ102 y aauZ1919, que impiden la utilización de aminoácidos

como fuente de nitrógeno y confieren resistencia a varios análogos tóxicos de

aminoácidos. Se demuestra aquí que ambas mutaciones impiden la utilización de los

aminoácidos prolina, glutamato y glicina como fuente de nitrógeno debido a la

incapacidad de las cepas de transportar estas sustancias a través de la membrana

plasmática. Se analiza el rol de la esta CKI en la distribución subcelular de las permeasas

de aminoácidos mediante la construcción de una fusión génica entre el marco abierto de

lectura de la permeasa AgtA (transportador de aspartato y glutamato) y la proteína

fluorescente verde (GFP) y se establece que ambas mutaciones impiden la expresión de

AgtA:GFP en la membrana plasmática, causando su re-direccionamiento hacia la vía de

los cuerpos multivesiculares. aauZ102 y aauZ1919 son mutaciones puntuales que, en cada

caso, llevan a la sustitución de un único aminoácido. El probable rol de esta quinasa en

la prevención de la endocitosis de una proteína de membrana constituye un desafío al

paradigma actual sobre el rol de las quinasas CKI en los transportadores de membrana

plasmática en hongos ascomicetos, según el cual, la fosforilación de estos

transportadores es necesaria para su internalización endocítica.

104

P91) SECUENCIACIÓN PARCIAL DE 2 GENOMAS DEL VIRUS DE LA

HEPATITIS C EN PACIENTES URUGUAYOS.

CASTELLS M., MORENO P., CAPPETTA M., CRISTINA J., COLINA R.

Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad

de Ciencias, Universidad de la República.

El virus de la Hepatitis C (HCV) es el mayor agente causal de hepatitis no A, no B,

post-transfusionales y parenteralmente adquiridas en todo el mundo. El genoma de

HCV está constituido por una única molécula de ARN de sentido positivo de

aproximadamente 9.7 Kb. Estudios de secuencias nucleotídicas obtenidas de

distintos pacientes y regiones geográficas del mundo han determinado la

existencia de seis genotipos y un número mucho mayor de sub-tipos. Estos

genotipos responden de manera diferente a las terapias antivirales y en la mayoría

de los países occidentales los mas predominantes son los subtipos 1a, 1b y 3a ,

mientras que en Uruguay es el genotipo 1. Actualmente es necesaria la

amplificación de al menos dos regiones del genoma de HCV para la correcta

asignación del genotipo y subtipo. Sin embargo para analizar el grado de

variabilidad genética y los posibles eventos de recombinación a lo largo de todo el

genoma viral, es necesario secuenciarlo en su totalidad.

Con el fin de secuenciar 2 genomas completos de HCV provenientes de pacientes

uruguayos, desarrollamos un protocolo unificado obtenido de los trabajos de Brach

& cols. 2006 y Yao & cols. 2005. Este procedimiento nos permite amplificar el

genoma completo en 6 regiones contiguas utilizando 16 pares de oligonucleotidos

específicos. Se realizó la transcripción reversa con hexámeros al azar, luego la

amplificación por nested PCR de las diferentes regiones, los productos fueron

purificados y finalmente secuenciados en la plataforma del IPMON. Mediante la

implementación de este método se logró la amplificación y secuenciación del 70%

de ambos genomas, los cuales pertenecen al genotipo 1, subtipo 1b. La obtención

de estas secuencias nos permitirá evaluar el grado de evolución de HCV en

Uruguay y la región así como identificar la emergencia de nuevas variantes

genéticas dentro del genotipo 1.

105

P92) ESTUDIO DE BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS AISLADAS DE

SUELO

AGUILAR, M., SOUBES, M. Y PIANZZOLA, M.J.

Cátedra de Microbiología, Facultad de Química. CC1157. Montevideo, Uruguay.

mpianzzo@fq.edu.uy

Las bacterias sulfato reductoras (BSR) constituyen un grupo diverso de bacterias

anaerobias que llevan a cabo la reducción desasimilatoria de compuestos

sulfurados como sulfato, sulfito, tiosulfato, y el propio azufre a sulfhídrico. Varias

industrias incluidas la petrolera y del gas han sido afectadas por su actividad

metabólica y la causa fundamental es la producción de H2S, tóxico y corrosivo.

Dada la importancia ecológica y económica de las BSR nos planteamos el

relevamiento de su presencia en suelos de diferentes características de Uruguay.

El objetivo de nuestro trabajo es determinar el grado de diversidad de estas

bacterias en nuestros suelos y conocer su potencial de biocorrosión. Para ello

colectamos muestras de suelo con diferentes características geológicas, realizando

su estudio desde el punto de vista químico y microbiológico. Si bien el principal

obstáculo para entender su ecología y diversidad es la incapacidad de cultivar

muchos de los microorganismos que provienen de suelos esta dificultad puede ser

salvada mediante el empleo de técnicas moleculares que permiten estudiar los

microorganismos o sus genes, directamente sobre las muestras.

En este trabajo abordamos el estudio de BSR por métodos clásicos y moleculares

en los diferentes suelos estudiados. Se presentan los resultados de los análisis en

muestras de suelo provenientes de diversos puntos de cateo a lo largo de más de

400 km de tuberías de gas. Se optimizaron la detección a partir de

enriquecimientos y a partir de ADN genómico total de suelo a partir de primers

específicos. Paralelamente iniciamos el estudio de biodiversidad de las BSR y se

presentarán los avances obtenidos hasta el momento.

106

P93) ESTUDIOS DE EXPRESIÓN GÉNICA DE LOS TRANSPORTADORES

DE PURINAS EN Phanerochaete chrysosporium

BARRACO VEGA M., IBÁÑEZ C. Y CECCHETTO G.

Laboratorio de Microbiología, IQB, Facultad de Ciencias - Facultad de Química

Los basidiomycotas causantes de la podredumbre blanca de la madera se

encuentran en hábitats extremadamente pobres en nitrógeno lo que influye

directamente en la expresión de enzimas ligninolíticas. En este marco se comenzó

a estudiar el rol de las purinas bajo la hipótesis de que estos organismos

cenocíticos enfrentados a condiciones de falta de fuente de nitrógeno deberían

utilizar compuestos nitrogenados alternativos presentes en madera. Se demostró

que Phanerochaete chrysosporium utiliza purinas como fuente de nitrógeno y

posee transportadores específicos.

En el presente trabajo nos planteamos el estudio de la regulación transcripcional

de los genes de transportadores de purinas de P.chrysosporium (phU y phZ)

previamente clonados en el laboratorio.

Debido a que la técnica de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) no era de

rutina en nuestro laboratorio, inicialmente, se hizo la puesta a punto de la misma

mediante el estudio de un sistema similar y conocido: expresión de los

transportadores de purinas de Aspergillus nidulans.

Se diseñaron primers específicos para los genes phU, phZ, phacn y gpd de

P.chrysosporium. phacn (β-actina) y gpd (Glyceraldehyde 3-fosfato

deshidrogenada) fueron elegidos como los genes normalizadores requeridos para

la cuantificación relativa. La especificidad de los amplicones se verificó mediante

en análisis de las curvas de melting y secuenciado de los productos. Se determinó

la eficiencia de amplificación de cada par de primers a partir de una curva de Ct

versus concentración de ADNc. El tiempo de inducción se determinó mediante

cinéticas de expresión entre las 2 horas y los 11 días luego del cambio de la fuente

de nitrógeno (shift), observándose el máximo de inducción a las 24 horas.

Agradecemos a ANII (Becas de iniciación y FCE)

107

P94) MICROARRAYS: APLICACIONES AL ESTUDIO DE RALSTONIA

SOLANACEARUM (IIB1) Y DESARROLLO DE MÉTODOS DE DETECCIÓN.

SIRI M.I.1, BOUCHER C.2, PIANZZOLA M.J.1

1Cátedra de Microbiología, Facultad de Química, DEPBIO, UdelaR, Montevideo,

Uruguay; 2Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes, INRA, Toulouse,

Francia.

Ralstonia solanacearum es el agente causal del marchitamiento bacteriano,

enfermedad que afecta a más de 200 especies vegetales. Este amplio rango de

hospederos se ve reflejado por su gran diversidad a nivel infraespecífico. La

clasificación actual establece la existencia de cuatro filotipos, los cuales se

subdividen en varios secuevares. En particular, las cepas pertenecientes al filotipo

II, secuevar 1 (IIB1) son las que afectan al cultivo de papa, ocasionando

importantes pérdidas económicas en todo el mundo. En este trabajo se presentan

los resultados de un estudio de hibridación genómica comparativa sobre una

colección uruguaya de cepas de R. solanacearum IIB1. Para ello, se utilizó un chip

de microarrays construido a partir de la secuencia genómica de tres cepas de R.

solanacearum pertenecientes a distintos filotipos. Esta tecnología permite realizar

comparaciones genómicas a gran escala estableciendo el repertorio de genes

presentes en cada cepa analizada, evidenciando diferencias genéticas entre cepas

de distinto tipo. Los resultados obtenidos se utilizaron con dos enfoques

diferentes. Por un lado, se generó una lista de 70 genes y 15 secuencias

intergénicas presentes exclusivamente en cepas de R. solanacearum IIB1 que luego

fueron validados por PCR. Estas secuencias constituyen blancos ideales para el

desarrollo de métodos de detección más sensibles y específicos que contribuyan a

un mejor control de su diseminación. Por otro lado, los resultados generados se

contrastaron con los datos de agresividad, generando una lista de genes candidatos

de patogenia presentes en las cepas con mayor agresividad y ausentes en cepas

poco agresivas. En esta lista se destacan varios genes que podrían estar

involucrados en la interacción con el hospedero y explicar las diferencias de

agresividad observadas. Estos determinantes genéticos serán validados y se

emprenderá un análisis funcional de forma de profundizar en el conocimiento

sobre los mecanismos de virulencia de este importante patógeno.

108

P95) ESTRATEGIAS PARA LA IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE

FUSARIUM EN TRIGO

UMPIÉRREZ, M.A;GARMENDIA, G.A; RUFO, C.B; RODRÍGUEZ, A.C; PEREYRA, S.;D

VERO, S.A

aCátedra de Microbiología-DEPBIO, Facultad de Química; bÁrea Alimentos, cÁrea Análisis Químicos, Polo Tecnológico de Pando-Facultad de Química; d INIA La Estanzuela. e-mail:marianau@fq.edu.uy La fusariosis es una de las enfermedades más destructivas y la que causa, a nivel

mundial, mayores pérdidas económicas en trigo, cebada y otros granos. Nuestro

país no ha sido la excepción a este problema, registrándose en la década pasada

brotes moderados o severos de la misma. El principal agente etiológico de esta

enfermedad, a nivel mundial, es el Fusarium gramineraum. Dentro de esta especie

se han reconocido 13 linajes diferentes, los cuales según O´Donnell et al. (2004) y

Starkey et al. (2007) son filogenéticamente diferentes y deben ser considerados

como especies diferentes. Los hongos pertenecientes a este grupo producen

tricotecenos del tipo B y se pueden agrupar en tres quimiotipos diferentes:

quimiotipo NIV, aquellos que producen nivalenol y derivados acetilados,

quimiotipo 3ADON, aquellos que producen deoxynivalenol y 3-acetil-

deoxynivalenol y quimiotipo 15ADON, aquellos que producen deoxynivalenol y 15-

acetil-deoxynivalenol.

El presente trabajo estudia la diversidad de hongos causantes de la fusariosis de la

espiga de trigo en Uruguay, buscando determinar la correlación con el nivel de

micotoxinas presentes en los granos. A partir de granos contaminados de la

cosecha 2008 de distintos puntos del país, se aislaron cepas de Fusarium que

fueron identificadas a nivel de especie realizando la amplificación y secuenciación

de la región del Factor de Elongación de la traducción 1 alfa (Tef 1-alfa). Sumado

a esto y con el fin de disminuir costos y tiempo de análisis, se diseñó una técnica

de RFLP de dicha región y un método de RAPD que permite determinar perfiles

diferentes para cada especie. Asimismo, se puso a punto un método para la

determinación de micotoxinas (deoxynivalenol, nivalenol, 15acetildeoxynivalenol y

3acetildeoxynivalenol) en granos contaminados, por cromatografía líquida

acoplada a un espectrómetro de masa como detector.

109

P96) EVIDENCIA DE RECOMBINACIÓN EN POBLACIONES NATURALES

DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C (VHC).

MORENO P, ALVAREZ M, LOPEZ L, MORATORIO G, COLINA R, CRISTINA J.

Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad

de Ciencias, UdelaR.

Los eventos de recombinación, el alto grado de mutaciones y la dinámica de

cuasiespecies le confieren a los virus de ARN una gran adaptabilidad lo cual

represente uno de los mayores obstáculos para la prevención y control de las

enfermedades causadas por estos virus. Han sido descritos eventos tanto de

recombinación inter como intragenotípica en poblaciones naturales de VHC

pertenecientes a diferentes regiones geográficas como Rusia (2k/1b), Perú

(1a/1b), Vietnam (2/6), Filipinas (2b/1b), Francia (2/5), Uzbekistan (2k/1b),

Japón (1a/1c) e Irlanda. Viendo la importancia que tiene la recombinación en la

evolución de los virus de ARN, es fundamental determinar el rol que tiene la

recombinación en la evolución de VHC tanto en pacientes crónicos como en

poblaciones de cuasiespecies cuando los pacientes son sometidos a terapia

antiviral. Con el fin de realizar estos estudios se analizaron por un lado 10 cepas

de VHC provenientes de pacientes crónicos y por otro lado secuencias de

poblaciones de cuasiespecies del gen NS5A de VHC provenientes de pacientes

sometidos a terapia antiviral. Los estudios de recombinación se llevaron a cabo

utilizando los programas GARD y Simplot. Se utilizó el programa LARD para

determinar si el modelo de recombinación tenia mejor soporte estadístico que el

modelo de no recombinación. Los resultados de este trabajo muestran la presencia

de una cepa de VHC recombinante 1b/1a circulante en un paciente crónico y la

presencia de un recombinante intrapaciente circulando en un paciente sometido a

terapia antiviral. Estos resultados junto con nuevos estudios realizados

recientemente a nivel de recombinación intrapaciente sugieren que los eventos de

recombinación en VHC, hasta ahora subestimados, deben ser considerados como

un mecanismo potencialmente importante en la generación de diversidad genética

con importante implicancias en el desarrollo de vacunas y terapias antivirales

efectivas.

110

P97) IYSV EN URUGUAY: AMENZA EMERGENTE PARA LA PRODUCCION

DE CEBOLLA

ACHIGAR R. GALVÁN G. PIANZZOLA M.J.

Cátedra de Microbiología, Departamento de Biociencias Facultad de Química,

UdelaR.

Iris Yellow Spot Virus (IYSV) es un miembro del género Tospovirus (familia Bunyaviridae), virus fitopatógenos transmitidos por trips. Es el causante de alrededor de cien millones de dólares al año en pérdidas para los productores de semillas de cebolla únicamente en el oeste de E.E.U.U. En el año 2005 fueron observadas por primera vez plantas con síntomas característicos en nuestro país, cuya presencia fue confirmada en 2006 por pruebas serológicas. Con el objetivo de validar este resultado nos enfocamos en optimizar las técnicas de detección mediante RT – PCR y Real Time – PCR a partir de muestras sintomáticas recolectadas en el año 2007. Además, a los efectos sanitarios es fundamental contar con una técnica sensible que nos permita detectar la presencia precoz del virus y el estudio de la dispersión del IYSV en cultivos comerciales. Luego procederemos al análisis de muestras de cebolla recolectadas este año y de plantas autóctonas con el fin de determinar un posible reservorio. Paralelamente nos enfocaremos al análisis filogenético tanto del género como de la especie, con el fin de obtener una filogenia más completa y robusta que las hasta ahora publicadas y determinar el posible origen de la cepa nacional. Hemos optimizado la detección del virus mediante RT – PCR con primers específicos obtenidos a partir de la bibliografía, los cuales amplifican un fragmento del gen N (nucleocápside viral). En lo que respecta al análisis filogenético, tenemos resultados preliminares que apoyan la hipótesis de la existencia de tres grandes clados. Los mismos poseen la característica distintiva de tener como vector de transmisión géneros diferentes de trips. Además el clado más cercano a la raíz de nuestro árbol preliminar, ha reportado su presencia hasta el momento únicamente en Asia, lo que podría dar indicios del posible origen del género.

111

P98) ESTRÉS OSMÓTICO Y LUMÍNICO SOBRE Calothrix sp; UNA

CIANOBACTERIA AISLADA DE ARROZALES URUGUAYOS.

DOLDÁN, S; PÉREZ, G; BORSANI, O. E IRISARRI, P.

Laboratorio de Bioquímica, Depto. de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía.

Las cianobacterias evolucionaron hace tres billones de años, por lo que han

sobrevivido a diversos tipos de estrés ambientales como temperaturas extremas,

salinidad, sequía, estrés osmótico y lumínico. Su amplia distribución denota una

gran habilidad para adaptarse a hábitats muy diversos.

Además de su importante contribución a la producción fotosintética de biomasa,

algunas cianobacterias son capaces de fijar nitrógeno atmosférico, siendo así una

importante fuente de nitrógeno para ecosistemas acuáticos y terrestres.

El potencial agronómico de las cianobacterias como biofertilizantes de arrozales

ha sido ampliamente estudiado. Sin embargo, la viabilidad y potencial fijador de

nitrógeno de estos microorganismos son afectados por diversos factores de estrés.

Los niveles de radiación UV-B que alcanzan la superficie de la tierra han

aumentado considerablemente en los últimos años. Esta radiación posee un gran

potencial de daño a nivel celular por su efecto directo sobre proteínas y ADN, e

indirecto al generar especies reactivas del oxígeno.

Las condiciones de estrés individuales son objeto de muchas investigaciones, sin

embargo, en el campo las cianobacterias están expuestas a la combinación de

diferentes estreses. La falta de sobrevivencia del inoculante en el campo puede

deberse a la suma de incidencia de luz UV, sequía y otros factores de estrés.

El objetivo del presente trabajo fue estudiar los efectos de la luz ultravioleta en

conjunto con estrés osmótico sobre algunos parámetros bioquímicos en Calothrix

sp. Entre los resultados obtenidos hasta el momento cabe destacar la disminución

de la relación Fv/Fm al aumentar el tiempo de exposición a ambos factores de

estrés, siendo este resultado un indicador de daño en el aparato fotosintético.

También se cuantificó la peroxidación de lípidos usando el método de TBARS. Se

estudiaron algunas de las respuestas frente a estrés como actividad de enzimas

antioxidantes, acumulación de prolina y de compuestos del tipo de las

micosporinas.

112

P99) EFECTO DE CODONES SINÓNIMOS EN LA FUNCIONALIDAD Y

LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE UNA PROTEÍNA DE MEMBRANA DE

ASPERGILLUS NIDULANS

SIGNORELLI S, SANGUINETTI M, MARIN M Y RAMÓN A.

Sección Bioquímica, Depto. de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias

Los mecanismos moleculares que gobiernan el plegamiento de una proteína aún no

se comprenden en su totalidad. Entre éstos, se propone que el uso de codones

rápidos o lentos podría modular la velocidad de traducción de un ARNm y así

favorecer determinadas interacciones en la cadena polipeptídica naciente,

determinando su conformación final. Como una aproximación para contribuir a

elucidar este fenómeno, proponemos utilizar Aspergillus nidulans como sistema

eucariota en el que se puede estudiar fácilmente in vivo el efecto de mutaciones

sinónimas en la funcionalidad de una proteína de membrana, UreA, el

transportador específico de urea en este organismo.

Se estudió la secuencia de ureA determinando el uso de codones en la misma, así

como la estructura secundaria y las regiones transmembrana predichas

bioinformáticamente en la proteína UreA. Se predice una secuencia de anclaje a la

membrana con un alto contenido de codones rápidos, así como “clusters” de

codones rápidos o lentos en otros dominios de la proteína, algunos conservados en

los homólogos putativos de UreA en otras 7 especies de Aspergillus. Estamos

llevando a cabo la sustitución de estos codones por sus sinónimos de tipo contrario

y la fusión de las proteínas mutadas con la GFP para estudiar el efecto de las

mismas sobre la estructura de la proteína, su funcionalidad y su destino dentro de

la célula.

113

P100) DIVERSIDAD MOLECULAR DE LA COMUNIDAD DIAZÓTROFA EN SUELOS AGRÍCOLAS HAGHJOU,T1; BAJSA,N1,2; AZZIZ,G1; ARIAS,A1.

1 Laboratorio de Ecología Microbiana, Instituto de Investigaciones Biológicas

Clemente Estable (IIBCE). Av. Italia 3318. CP 11600. Montevideo, Uruguay. Unidad

Asociada a Facultad de Ciencias, UdelaR.2 Sección Bioquímica. Facultad de

Ciencias, UdelaR. Iguá 4225. CP 11400. Montevideo, Uruguay.

La diversidad microbiana en el suelo es de gran importancia para una agricultura sustentable. Las prácticas agrícolas pueden afectar la estructura de las comunidades microbianas y por lo tanto las funciones de las mismas. La rotación de cultivos es una práctica agrícola sustentable y ha sido incorporada por los productores en Uruguay. Sin embargo, se desconoce su impacto sobre las comunidades microbianas del suelo. Las bacterias diazótrofas cumplen una función económica y ambientalmente importante, ya que el nitrógeno atmosférico debe ser reducido para poder ser asimilado por las plantas. El objetivo de este trabajo fue evaluar el impacto de diferentes sistemas de rotaciones sobre la diversidad de la comunidad diazótrofa. A partir del ADN extraído del suelo de las estaciones experimentales INIA-La Estanzuela e INIA-Treinta y Tres, se amplificó un fragmento del gen nifH por PCR nested y posteriormente se analizó la estructura de la comunidad mediante la técnica molecular DGGE (electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante). Asimismo se determinó la abundancia de esta comunidad y de heterótrofas totales por la técnica de recuento en placas. En el ensayo de La Estanzuela se detectó un cambio en la estructura de la comunidad diazótrofa en el tratamiento de agricultura continua respecto a los tratamientos de rotación con pasturas, y en el tratamiento de agricultura continua con fertilizantes la estructura de la comunidad resultó más similar a alguna de las rotaciones. En el ensayo de Treinta y Tres, la estructura de la comunidad no se relacionó con el tratamiento agrícola. Respecto al análisis de la abundancia de las bacterias diazótrofas y heterórofas totales, se observó que en ambas estaciones experimentales, la introducción de pasturas resultó en un aumento en el número de ambos grupos funcionales respecto a la agricultura continua de cultivos de grano.

114

P101) CARACTERIZACIÓN DE COMUNIDADES MICROBIANAS

TERRESTRES DE LA ISLA REY JORGE (PENÍNSULA FILDES- ANTÁRTIDA

MARÍTIMA)

ANTELO, V.1 Y BATISTA, S.1

1Unidad Microbiología Molecular, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente

Estable. Av. Italia 3318. Montevideo, CP11600. Uruguay. veronica@iibce.edu.uy

Palabras claves: bacteria, antibiótico, gasoil.

Estudiamos las comunidades microbianas terrestres que se desarrollan durante el

período estival en la península Fildes (Isla Rey Jorge). Se trabaja con muestras

colectadas en áreas bajo evidente influencia humana, animal y otras en zonas

presuntamente prístinas. Se generó una colección de organismos aislados y se

efectuó un estudio de perfiles de crecimiento al ser cultivados en dos condiciones

ambientales definidas: presencia de antibióticos y gasoil.

Los aislamientos capaces de crecer en medio LB a 5ºC y 24ºC, fueron cultivados en

ese mismo medio para establecer un perfil de resistencia a antibióticos a

diferentes concentraciones (Ampicilina, Kanamicina, Streptomicina y Ácido

Nalidíxico). Mediante el análisis de secuencia de parte del gen 16S ARNr, se

identificó primariamente algunos aislamientos especialmente resistentes como

Bacillus thuringiensis, Stenotrophomonas sp., Pseudomonas fluorescens.

Las muestras extraídas en suelos cerca de los tanques de depósito de combustible

y la costa frente al pasaje Drake, fueron utilizadas para inocular matraces con

medio salino-gasoil 0.2%.. Estos matraces se incubaron a 5 y 24ºC con agitación.

Las suspensiones se subcultivaron en el mismo medio cada 5 días, y las mismas

fueron utilizadas para generar un conjunto de aislamientos puros capaces de

crecer en esas mismas condiciones. Se identificó primariamente estos organismos

como Pseudomonas putida y Pseudomonas migulae. Actualmente estamos

intentando determinar el perfil de degradación del gasoil por las dos comunidades

y los aislamientos cultivados.

Este trabajo se enmarca en la identificación de elementos de transferencia

horizontal (TH) como los integrones, y su asociación con mecanismos de

resistencia a condiciones ambientales adversas. Se purificó el ADN ambiental de

las muestras colectadas y se lo utilizó como templado en reacciones de PCR

dirigidas a amplificar genes integrasa Clase I y genes cassette asociados.

FINANCIACIÓN: IAU, ANII, PEDECIBA.

115

P102) DETECCION Y CONFIRMACION DE LOS VIROIDES CITRICOS

PRESENTES EN URUGUAY A PARTIR DE MUESTRAS EXTRAIDAS DE

CAMPO

PAGLIANO, G1, UMAÑA, R1 Y PRITSCH C1.

1 Laboratorio de Biotecnología, Facultad de Agronomía, UdelaR.

Los viroides presentes en las plantaciones citrícolas de Uruguay son CEVd (Citrus

Exocortis Viroids), CBLVd (Citrus Bent Leaf Viroids), HSVd (Hop Stunt Viroids) y

CDVd (Citrus Darwarfing Viroid). En el año 2000 éstos viroides han sido detectados

y caracterizados mediante sPAGE seguido de Northern y/o Dot o Slot blot,

mediante hibridación molecular con sondas específicas marcadas con digoxigenina

a partir de muestras de tejido de planta indicadora Cidro Etrog 861.

En la actualidad se dispone de una nueva metodología desarrollada por Murcia N.,

2008. Con el uso de ésta metodología adaptada a nuestras condiciones se ha

podido confirmar la presencia de los viroides previamente descriptos presentes en

nuestro país (CEVd, CBLVd, HSVd y CDVd) a partir de cortezas de rama de árboles

a campo. La metodología consiste en extracción de ARN (Semancik,1975), PAGE

seguido de Northern, fijación de la membrana con cross linking, hibridación con

sondas marcadas con digoxigenina y autorradiografía con sustrato CSPD. La

metodología ha sido ensayada con éxito para todas las variedades de citrus y en

cualquier época del año y aún a partir de tejidos congelados.

Los resultados reflejan alta especificidad, sensibilidad y rapidez, evitando la etapa

de indexing de plantas indicadoras, donde la expresión de síntomas requiere de 1 a

3 meses bajo condiciones controladas. El límite de detección obtenido se

encuentra entre 4-8mg de tejido infectado. Se confirma que en nuestras

plantaciones citrícolas los viroides presentes antes mencionados aparecen en

combinaciones de dos o más viroides, detectados inicialmente con las técnicas

previamente empleadas.

Hoy la ciencia demanda y es una necesidad disponer de métodos moleculares

sensibles, específicos, sencillos, de bajo costo y rápidos para la incorporación en

el Programa de Certificación, Sistemas Cuarentenarios y en el control de los

bancos de germoplasma existentes en nuestro país.

Palabras claves: detección, viroides cítricos, PAGE-Northern, Uruguay.

116

INMUNOLOGÍA P103-P108

P103) PRIMERA ESTRUCTURA CRISTALOGRÁFICA DE UNA IGA1

HUMANA.

CORREA A, TRAJTENBERG F, OBAL G, PRITSCH O, OPPEZZO P, BUSCHIAZZO A.

Institut Pasteur de Montevideo, Unidad de Biología Estructural, Montevideo,

Uruguay

El conocimiento de las estructuras tridimensionales de las inmunoglobulinas ha

generado información esencial sobre el reconocimiento antigénico. A pesar de

contar con cerca de 300 estructuras de fragmentos Fab de IgG humanos, al

presente solo hay una estructura cristalográfica de un Fab de IgA de ratón (PDB

2FBJ). La mayor dificultad en la obtención de estructuras cristalográficas de IgA1

humana se debe a la presencia de varios sitios O-glicosilados en la región bisagra.

Este patrón de glicosilación es heterogéneo, dificultando la purificación y

posterior cristalización. Es bien sabido que el tener una muestra homogénea es

uno de los requerimientos más importantes para la obtención de cristales de

buena calidad. Para superar este obstáculo se produjeron fragmentos Fab

cortando con la proteasa recombinante de Clostridium ramosum, la cual corta

específicamente la IgA1 humana en el extremo amino terminal de la región

bisagra, liberando así fragmentos Fab sin sitios de glicosilación. En este trabajo

se utilizó una IgA1 monoclonal purificada del suero de un paciente con linfoma

inmunocítico, lo que permitió la obtención de las cantidades necesarias de una

IgA1 nativa para los distintos ensayos de cristalogénesis. Con esta metodología se

lograron resolver dos estructuras cristalográficas diferentes a alta resolución (1.5

y 2.3 Å), reportándose así la primera estructura cristalográfica de un fragmento

Fab de la IgA1 humana. Además nuestro trabajo muestra una herramienta de

gran utilidad para estudios posteriores en el área inmunológica.

117

P104) PRODUCCIÓN DE ANTIGENO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LEUCOSIS BOVINA ENZOÓTICA.

FURTADO, A.; ALGORTA, A.; ALVAREZ, J.; DE BRUM, L.; PUENTES, R

Área de Inmunología – Facultad de Veterinaria – Universidad de la Republica – URUGUAY.

Leucosis Bovina Enzoótica (BLV) es una enfermedad causada por un Retrovirus, con alta repercusión en la producción lechera de nuestro país. Las manifestaciones clínicas son caracterizadas por linfosarcomas (neoplasias malignas) y linfocitosis persistente. Sin embargo, solamente el 5% de los animales infectados, evolucionan hacia la formación neoplásica, siendo el restante asintomático, pudiendo contagiar la enfermedad a otros animales. Esto hace que la vigilancia epidemiológica a partir de la detección de anticuerpos específicos contra BLV, sea una herramienta fundamental en el control de la enfermedad. La Inmunodifusión en gel agar (IDGA) es una de las técnicas serológicas más utilizadas a nivel mundial y es una de las recomendadas por la Organización Internacional de Epizootias (OIE) para el diagnóstico de esta enfermedad. El objetivo de este trabajo fue la producción de antígeno de Leucosis Bovina, para su utilización en la técnica de IDGA. Para esto, se propago el virus utilizando la línea celular FLK y se precipitó con Sulfato de Amonio las proteínas virales. Luego el antígeno fue enfrentando a un panel de 50 sueros bovinos, comparando los resultados con un Kit de IDGA comercial de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de La Plata - Argentina. Los resultados demostraron una concordancia de 94% entre ambas técnicas. En este momento se están procesando más sueros de bovinos elegidos al azar, con el fin de validar la técnica y posibilitar su utilización en el diagnóstico de Leucosis Bovina Enzoótica en el Uruguay.

118

P105) TERAPIA GÉNICA DEL CARCINOMA HEPATOCELULAR Y

DIAGNÓSTICO DE TUMORES HEPÁTICOS CON MICRO-PET

ZABALA M.1, LASARTE J.J1, PEÑUELAS I.2, PERRET C.3, PRIETO J.1,4, KRAMER M.G1

1División de Hepatología y Terapia Génica, Centro de Investigación Médica

Aplicada (CIMA), Pamplona, España. 2Departamento de Medicina Nuclear y 4Medicina Interna, Clínica Universitaria de Navarra, España. 3Institut Cochin,

Institut de la Santé et de la Recherche Medicale, París, Francia.

El carcinoma hepatocelular (HCC) se encuentra entre las cinco principales causas

de muerte por cáncer en el mundo. Dado que los tratamientos curativos son

aplicables a un número muy limitado de pacientes es necesario desarrollar

nuevas terapias y técnicas para la detección precoz de esta enfermedad. La

interleuquina 12 (IL-12) posee un potente efecto antitumoral aunque puede ser

tóxica si se administra de forma sistémica. En este trabajo evaluamos una

estrategia de terapia génica con IL-12 en un modelo murino de HCC. Empleamos

ratones transgénicos que sobre-expresan el oncogen c-myc en el hígado (L-PK/c-

myc) y desarrollan tumores hepáticos con características similares a HCCs

aislados de pacientes. A un grupo de ratones se le administró un vector

conteniendo un sistema que permite inducir la expresión de IL-12 con doxiciclina

de forma específica de hígado. Al cabo de varias rondas de inducción de IL-12

observamos una clara inhibición del crecimiento tumoral en 40% de los animales

tratados. La respuesta al tratamiento no se vio correlacionada con los niveles de

IL-12 e IFN- -

apoptóticos o de estimulación de proliferación en los tumores. Sin embargo,

observamos un mayor número de linfocitos T reguladores y un aumento de

moléculas inmunosupresoras en HCCs extraídos de animales no respondedores.

Con el fin de detectar HCC ensayamos distintos trazadores usando un Philips

Mosaic microPET scanner. El análisis combinado de las medidas con 18FDG y 11C-

Colina permitió visualizar 78% de las lesiones tumorales en ratones L-PK/c-myc.

Concluimos que la terapia génica basada en la expresión intrahepática de IL-12

es parcialmente efectiva en un modelo murino de HCC, puesto que la respuesta

antitumoral puede verse afectada por mecanismos inmunosupresores. El análisis

combinado de imágenes obtenidas con 18FDG y 11C-Colina podría utilizarse como

herramienta para incrementar el diagnóstico de HCC en pacientes.

119

P106) REDES DE ACTIVACIÓN E INHIBICIÓN CELULAR EN EL SISTEMA INMUNE: ESTRUCTURA VERSUS FUNCIÓN.

GIBERT, J.P.1; MASNER, M.; MONIN, L.2 & CABANA, A.3

1: Sección Paleontología, Facultad de Ciencias, UdelaR 2: Departamento de Inmunobiología, Facultad de Medicina, UdelaR 3: Sección Biofísica, Facultad de Ciencias, UdelaR

El estudio del sistema inmune se ha focalizado tradicionalmente en los

mecanismos moleculares y celulares que llevan a la activación de las distintas

vías de respuesta. A pesar de la valiosa información obtenida de este modo, aún

queda mucho por hacer para comprender su funcionamiento como un todo. El

estudio de sistemas altamente complejos como el sistema inmune, requiere pues

de aproximaciones multidisciplinarias que permitan obtener resultados

holísticos. Así fue que en un trabajo anterior se compiló y analizó la red de

interacciones documentadas del sistema inmune. Los nodos fueron definidos

como poblaciones celulares que participan en la respuesta inmune; las aristas

como interacciones directas (dependientes de contacto) e indirectas (mediadas

por citoquinas). En este trabajo, se analizaron dos subredes de la red inicial. La

primera solo considera las interacciones que llevan a la activación de las

poblaciones celulares. La segunda de ellas solo considera las interacciones de

tipo inhibitorio. Se estudiaron aquellas propiedades estructurales que permiten

echar luz sobre los procesos biológicos subyacentes a la estructura y evolución de

la red (en este caso: conectancia, coeficiente de clustering, distribución del

grado y análisis de clusters). La red de interacciones positivas posee una

distribución del grado lineal, tal como la exhibida por la red original. Esto es

importante porque manifiesta la presencia de nodos altamente conectados. El

análisis de clusters reveló grupos bien definidos en la red de activación. Éstos

contienen poblaciones celulares que actúan en respuestas de activación

específicas (e.g. tipo 1 y 2). La red de inhibición también mostró este

comportamiento, aunque de manera menos marcada. La estructura de ambas

redes muestra pues un compromiso entre la especificidad de las vías de

respuesta y la redundancia del cableado, así como una clara jerarquización tanto

en la activación del sistema inmune como en su inhibición.

120

P107) PROTEÍNAS S100 DE FAGOCITOS EN LA RESPUESTA

INFLAMATORIA EN LA HIDATIDOSIS

BASIKA T1, MUÑOZ N1, CASARAVILLA C1, IRIGOÍN I1, DURÁN D2, BONILLA M1,

SALINAS S1, PACHECO JP3, ROTH J4 & DÍAZ A1

1. Cátedra de Inmunología, DEPBIO, Facultad de Química, UdelaR. 2. UBYPA.

Instituto Pasteur Montevideo. 3. Departamento de Patología. Facultad de

Veterinaria. UdelaR. 4. Institute of Immunology, University of Münster,

Alemania.

Las proteínas S100 específicas de fagocitos (S100A8, S100A9 y S100A12) tienen

papeles importantes pero mal comprendidos en procesos inflamatorios. La

infección por la larva de Echinococcus granulosus (hidatidosis) normalmente

cursa con control de la inflamación del hospedero. Sin embargo, esto admite

excepciones, de las cuales la más extrema es la infección de bovinos por la cepa

más extendida (ovina) del parásito. En este sistema se desarrolla una respuesta

granulomatosa, cuyos productos de secreción se suelen encontrar asociados con

la pared de la hidátide. A partir de una observación inicial de presencia de

S100A8 y S100A9 en hidátides de infecciones experimentales en ratón, quisimos

profundizar en la expresión de proteínas de esta familia en respuesta a la

hidátide en hospederos naturales, incluyendo el bovino. Encontramos que en

extractos de paredes quísticas de infecciones bovinas, una banda proteica

dominante corresponde a S100A12. La identificación proteómica fue confirmada

por inmunoblot, usando un anticuerpo generado contra la S100A12 bovina, que

fue expresada en forma recombinante. En un panel de muestras bovinas, la

S100A12 se encontró consistentemente, en abundancias que correlacionaron con

el grado de inflamación, determinado histológicamente. Entre las células de la

reacción del hospedero, la S100A12 se localizó, por inmunohistoquímica,

principalmente en los macrófagos epitelioides que forman la primera capa

celular adyacente a la pared quística y, en menor medida, en fibroblastos

activados. Los macrófagos epitelioides también mostraron inmunoreactividad

para S100A9; sin embargo, ni S100A9 ni S100A8 fueron detectadas a nivel

proteómico, sugiriendo que sus niveles de expresión deben ser menores que el de

S100A12. Nuestros resultados, en conjunto con publicaciones recientes, sugieren

que la S100A12 puede ser altamente expresada por macrófagos epitelioides,

tanto en contextos Th1 (sarcoidosis, tuberculosis) como en contextos sesgados

hacia Th2 (infección por un helminto).

Financiacion: PDT 54/078

121

P108) VALOR PRONOSTICO Y DIAGNOSTICO DE ANTICUERPOS ANTI

NITROTIROSINA EN ARTRITIS REUMATOIDEA

KEUSHKERIAN, M.1; CELANO, L. 1; SOSA, D.2; NAVILIAT, M. 2; Y THOMSON, L.1

1Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias y 2 Instituto de

Reumatología de la Facultad de Medicina, Universidad de la República.

La artritis reumatoidea es una patología sistémica, crónica y de naturaleza

inflamatoria, en la que se encuentran involucradas especies oxidantes y

nitrantes. Nuestro objetivo es demostrar y caracterizar la capacidad de neo-

epitopos proteicos nitrados, previamente descritos en la sinovitis artrítica, de

desencadenar una respuesta autoinmune. Con este fin se obtuvo el suero de

pacientes portadores de Artritis Reumatoidea del Instituto Nacional de

Reumatología, y las correspondientes historias clínicas, radiología y pruebas

básicas de laboratorio clínico (factor reumatoideo, VES, hemograma,

proteinograma, etc.). El título de anticuerpos anti-nitrotirosina en el plasma de

los pacientes (0.52, n=34) fue significativamente (p0.001) superior al

encontrado en controles sanos (0.34, n=15). Con el fin de determinar el isotipo

de las inmunoglobulinas reactivas contra nitrotirosina en el plasma de los

pacientes artríticos se utilizó una columna de afinidad. Con las fracciones

obtenidas se realizó una electroforesis empleando SDS-PAGE al 10 %. El gel fue

luego revelado mediante tinción con nitrato de plata, obteniéndose en la

primera fracción unida a la columna dos bandas bien definidas correspondientes

al peso molecular de las cadenas pesadas de IgG e IgM (51 y 72 kDa,

respectivamente). Otro gel sembrado de la misma manera fue utilizado para el

ensayo de Western Blot mediante el cual se evidenció la presencia de IgG e IgM

en las bandas aisladas. Para determinar la capacidad antioxidante de las

muestras de plasma se realizaron ensayos de FRAP (Ferric Reducing Antioxidant

Power Assay).

122

BIOQUÍMICA, BIOFÍSICA Y BIOLOGÍA ESTRUCTURAL P109-P134

P109) ESTUDIO DE ALGUNOS FENÓMENOS IÓNICOS DURANTE LA

CICATRIZACIÓN DE HERIDAS EN ENDOTELIO VASCULAR

EVANS, F. 1, HERNÁNDEZ, J.A.2, CHIFFLET, S.1

1Depto. Bioquímica, Fac. Medicina, 2S. Biofísica, Fac. Ciencias, UdelaR

La cicatrización de heridas constituye un proceso complejo aún incompletamente

comprendido. Nuestro laboratorio encontró que durante la cicatrización de heridas

en endotelio de córnea de bovino en cultivo ocurre una despolarización del

potencial de membrana plasmática (PMP) a nivel de las células del borde de la

herida, consecuencia del incremento del sodio intracelular ([Na+]i). Esta es, a su

vez determinada por un aumento en la expresión del canal de sodio epitelial

(ENaC) y su inhibición retrasa de manera importante la cicatrización (Chifflet et

al, Am.J.Physiol.288:C1429,2005). Resultados análogos se encontraron en MDCK y

en epitelio de córnea de conejo en cultivo. El objetivo del presente trabajo fue

establecer si la respuesta cicatrizal de células de endotelio de aorta bovino (BAEC)

presenta fenómenos iónicos similares.

Los estudios de cicatrización se hicieron sobre monocapas confluentes de BAEC

realizando heridas empleando una aguja de jeringa. Los cambios en el PMP y en la

[Na+]i se determinaron utilizando las sondas fluorescentes oxonol V y CoroNa

Green, respectivamente. La expresión del ENaC se estudió mediante

inmunofluorescencia y la inhibición de este canal se realizó con fenamil. Durante

la cicatrización de BAEC no se encontraron cambios en el PMP a nivel de las células

del borde de la herida ni se constató un aumento de la [Na+]i o de la expresión de

ENaC. Sin embargo, la inhibición del ENaC disminuyó la velocidad de cicatrización

de BAEC. El hecho de que las células de endotelio vascular no presenten los

mecanismos iónicos de los epitelios mencionados anteriormente suscita la

investigación de otros fenómenos iónicos involucrados en su proceso cicatrizal.

123

P110) DETECCIÓN ELECTROQUÍMICA DE SECUENCIAS ESPECÍFICAS DE

ADN: DOS MÉTODOS DIRECTOS EN UN ÚNICO SENSOR.

TOSAR, J.P.; KEEL, K.; LAÍZ, J.

Unidad de Bioquímica Analítica. Centro de Investigaciones Nucleares

(CIN). Facultad de Ciencias, Universidad de la República.

Los genosensores de base electroquímica permiten una detección rápida y sensible

de secuencias específicas de ácidos nucleicos en muestras biológicas. A diferencia

de las técnicas actuales de biología molecular, su uso es compatible con la

fabricación de dispositivos automatizables para uso de campo. Esto permitiría,

por ejemplo, la detección de una amplia gama de agentes infecciosos en el propio

punto de atención del paciente, obteniéndose resultados al instante sin la

necesidad del envío de muestras al laboratorio. Sin embargo, este campo se

encuentra aún en estado incipiente. En el presente trabajo (1) se inmovilizaron

secuencias específicas de ADN a electrodos de oro/polipirrol. La detección de

secuencias complementarias se realizó amperométricamente mediante dos

métodos distintos e independientes. Se demostró que la inyección en la celda de

trabajo de secuencias de ADN complementarias a los oligonucleótidos

inmovilizados produce –en determinadas condiciones experimentales- un aumento

de la corriente eléctrica en el tiempo, debido a la oxidación de los nucleótidos de

guanina presentes en las secuencias inyectadas. Asimismo, la hibridación también

puede detectarse por voltamperometría cíclica, monitoreando cambios en los

picos de oxidación y reducción del polipirrol. Con este último método, se han

podido detectar secuencias específicas en una concentración de 53pM, frente a un

exceso de 2000x de secuencias no complementarias. Ambos métodos son directos;

las señales eléctricas en cuestión son producidas como consecuencia de la propia

reacción de bioreconocimiento, por lo cual no se requiere la adición de reactivos

indicadores de ningún tipo. Este aspecto, sumado al hecho de que pueden

combinarse dos métodos independientes de detección en un mismo dispositivo,

hace de esta una aproximación prometedora para el diseño futuro de genosensores

aplicables a uso de campo. El esfuerzo actual se centra en evaluar la performance

del biosensor en matrices biológicas complejas.

1) J.P. Tosar, K. Keel, J. Laíz, Biosensors and Bioelectronics 24 (2009) 3036-304

124

P111) EXPOSICION AGUDA DE CORAZON AISLADO A PLOMO,

PROVOCA FALLAS EN RITMO Y CONTRACCION CARDIACAS.

ROMPANI, J; SCHMIDT, A; COTA, C ; FERREIRA, J, BRUM, G Y FERREIRA G.

Laboratorio de Canales Iónicos. Departamento de Biofísica. Facultad de Medicina.

Universidad de la República.

El Plomo es un metal pesado capaz de producir intoxicación aguda o crónica en

humanos, ante la exposición aguda o crónica al mismo. Siendo no biodegradable,

las fuentes de contaminación se encuentran en un delicado equilibrio entre seres

vivos, agua, tierra, aire y alimentos. Es resultado de actividades industriales

humanas (naftas y aditivos, pinturas, baterías, etc) y como tal se registra un

aumento de casos a nivel internacional, en zonas de alto riesgo de exposición. Una

vez en el organismo, el Plomo penetra a distintas células, donde ejerce su acción

tóxica afectando sobre todo residuos de S, N y O a nivel de aminoácidos de

proteínas. En otros trabajos previos, hemos mostrado que los canales iónicos

constituyen una vía de entrada fundamental del Plomo a la célula (Rompani y col,

2007a,b). Como consecuencia se ve alterada la función cardíaca. Concentraciones

crecientes de plomo producen alteraciones de la contracción y ritmo cardíacos. A

bajas concentraciones de Plomo (10 a 50 uM), se altera el ritmo cardíaco

aumentando la frecuencia de extrasístoles ventriculares y alternancia de la

contracción. A concentraciones mayores (25 a 100 uM), es posible observar una

marcada disminución de la amplitud de la contracción junto con un aumento de la

tensión basal cardíaca. Los efectos fueron reversibles solamente a bajas

concentraciones.

Sorprendentemente, en condiciones de ausencia de Calcio extracelular,

concentraciones de Plomo 500 uM o mayores, son capaces de sustituir al Calcio y

provocar contracciones cardíacas alteradas en amplitud y duración, respecto a las

observadas en Calcio. La aplicación previa de DHP 1 uM, disminuye enormemente

este efecto sugiriendo un rol de los canales de Calcio L en la entrada de Plomo a la

célula. Estos resultados muestran efectos insospechados del Plomo a nivel

cardíaco. Futuras investigaciones aclararán mecanismos de producción de estas

alteraciones con trascendencia en Salud Pública.

125

P112) CAMBIOS EN NIVELES ENZIMÁTICOS BASALES DURANTE EL

CICLO DE CULTIVO DE CEBOLLA (Allium cepa L.)

GALEANO P1,2, GALVÁN GA2, FRANCO FRAGUAS L1

1 Cátedra de Bioquímica, DEPBIO, Facultad de Química, UdelaR. 2 Centro Regional Sur, Departamento de Producción Vegetal, Facultad de Agronomía, UdelaR. e-mail: pgaleano@fq.edu.uy

Nuestro grupo ha reportado la participación de peroxidasas, glucanasas y

quitinasas en respuestas de defensa a patógenos fúngicos en cebolla. Estas

enzimas aumentaron su actividad en plantas expuestas a algunos patógenos. La

bibliografía describe resistencia en cebolla frente a Fusarium oxysporum asociada

a la edad, siendo mas susceptible en el estado de plántula y en el final del ciclo de

cultivo y más resistente durante la fase intermedia de crecimiento foliar. El

conocimiento de los niveles enzimáticos basales en las distintas etapas permitiría

inferir el rol de las enzimas en la resistencia asociada a la edad.

En este trabajo se estudió la variación durante el ciclo del cultivo en las

actividades basales de peroxidasas, β-1,3-glucanasas y quitinasas en distintos

órganos de cuatro variedades de cebolla. La actividad peroxidásica fue mayor en

raíces que en el resto de la planta en todas las edades, con cambios asociados a

variaciones en factores ambientales más que a la edad. La actividad peroxidásica

en hojas y falso tallo tendió a ser menor en plantas más adultas. El perfil de

isoperoxidasas fue diferente para cada órgano, se modificó conforme la planta se

desarrolló, y mostró escaso polimorfismo entre las cuatro variedades. La actividad

β-1,3-glucanasa fue mayor en raíces con valores máximos al estado de plántula. En

hojas la actividad aumentó con el desarrollo de las plantas, y en falso tallo fue

siempre mínima, aproximándose a cero al final del ciclo. La actividad quitinasa en

raíces y hojas fue similar, aumentando con la edad de la planta. En el falso tallo

esta actividad disminuyó con la edad, excepto en la variedad INIA Colorada que

mostró los mayores niveles al final del ciclo. En síntesis, estas enzimas varían para

distintos estados de desarrollo de la planta, y podrían participar en la resistencia

asociada a la edad.

Financiación: Proyecto INIA-FPTA Nº 250.

126

P113) EFECTO DE LA MELATONINA SOBRE LA EXPRESIÓN

ENDOMETRIAL DEL RECEPTOR DE PROGESTERONA EN OVEJAS

SUBNUTRIDAS

FERNÁNDEZ- FOREN A.1; VÁZQUEZ M.I. 2; GIMÉNEZ M.1; SARTORE I.1; ABECIA J.A.2;

FORCADA F.2; MEIKLE A.1

1Laboratorio de Técnicas Nucleares, Facultad de Veterinaria. 2Producción Animal,

Universidad de Zaragoza, España

Se ha documentado que los tratamientos con melatonina (MEL) exógena son un

método efectivo para inducir la ciclicidad y aumentar la fertilidad, y contrarresta

los efectos de la subnutrición. Se estudió el efecto del tratamiento con MEL sobre

la expresión del receptor de progesterona –hormona de la preñez- (RP) en el

endometrio de ovejas post parto, alimentadas con una dieta 1,5xM (C) o 0,5xM (B)

veces sus necesidades de mantenimiento y tratadas (+MEL) o no (-MEL) con MEL

durante la estación reproductiva y el anestro estacional. Se estudió la intensidad

de tinción en epitelio luminal (EL), estroma superficial (ES) y profundo (EP),

epitelio glandular superficial (EGS) y profundo (EGP). La estación afectó el

contenido de receptores (P<0.05): en la mayor parte de los tipos celulares, las

ovejas en estación reproductiva tuvieron más RP. Se encontró mayor contenido de

RP en ES y EGP en las subnutridas respecto de dieta de mantenimiento durante el

anestro. El tratamiento con MEL disminuyó o tendió a disminuir los RP en ovejas

subnutridas en todos los tipos celulares menos en EL en ovejas en anestro;

mientras que aumentó los RP en EGP en ovejas controles. Por otro lado, se observó

un aumento de RP en EGP en ovejas subnutridas en estación reproductiva. En este

estudio se demostró que los tratamientos con MEL afectan la expresión de RP en

una forma dependiente a la estación y al estado nutricional; sugiriendo que la MEL

exógena interactúa con los mecanismos de señalización de la melatonina

endógena. Como la sensibilidad endometrial a la progesterona esta en la base de

los mecanismos de crecimiento embrionario y manutención de la gestación y estos

a su vez fueron afectados por la MEL, este podría ser uno de los mecanismos

implícitos en la mejora de la fertilidad observada con tratamiento de esta

hormona.

127

P114) EXTRACCION Y PURIFICACION DE POLIFENOL OXIDASA DE

MANZANA: UNA ETAPA HACIA EL CONTROL DEL PARDEAMIENTO

ENZIMATICO.

PERALTA, G*.; GIOIA, L*.;MANTA, C.; OVSEJEVI, K.

Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de Química,

UDELAR

Uno de los procesos que afecta severamente la conservación de frutas y vegetales

es el “pardeamiento enzimático”. La enzima responsable del mismo es la

polifenol oxidasa, PPO, (EC1.14.18.1), una metaloproteína, con dos Cu(II) en su

sitio activo. Siendo una enzima citoplasmática y sus sustratos (compuestos

fenólicos) estar en vacuolas dicho “pardeamiento” solo ocurre cuando el tejido

vegetal es dañado (por golpes, compresión, abrasión o cortes). Así, la enzima

entra en contacto con sus sustratos y en presencia de oxígeno, utilizando al cobre

como grupo prostético, inicia la oxidación de los mismos, transformando los o-

fenoles en quinonas. Estas quinonas rápidamente se polimerizan a melaninas

dando el color marrón característico, causando la pérdida de valor nutricional,

aromas, textura y presentación, llevando al rechazo del producto por parte del

consumidor.

El control del “pardeamiento enzimático” se centra principalmente en la

inhibición de la PPO, la cual puede alcanzarse por diversos caminos: captura de

sus sustratos, reducción de los iones Cu(II), o combinación de ambas estrategias.

Para dilucidar el mecanismo por el cual se logra controlar la actividad catalítica de

la PPO es necesario su aislamiento y purificación. En el caso particular de la PPO

de manzana, su condición de termosensible, dificulta notoriamente su extracción y

purificación.

En el presente trabajo se reporta la optimización de un protocolo de aislamiento y

purificación de PPO de Manzana Red Delicious. Se evaluó la influencia del pH,

fuerza iónica y composición del buffer, así como la importancia del Triton X-100,

en el proceso de extracción. Combinando diferentes técnicas de purificación de

proteínas (fraccionamiento salino, diálisis, cromatografía de intercambio iónico y

cromatografía hidrofóbica) se logró un alto grado de purificación de la enzima con

respecto al extracto original. Dicha purificación será relevante para posteriores

estudios espectrales que permitan evaluar el mecanismo de inhibición de esta

enzima.

* El orden de los presentadores es indistinto

128

P115) GENERACION DE SIALO-ISOFORMAS DE LACTOFERRINA BOVINA

MEDIANTE ESTRATEGIAS QUIMICA Y ENZIMATICA.

BUSTAMANTE, M. J., FRANCO FRAGUAS, L.

Cátedra de Bioquímica, Departamento de Biociencias. Facultad de Química. Av. Gral. Flores 2124, Montevideo, Uruguay. e-mail: mjbustamante@fq.edu.uy

Las glicoproteínas existen como isoformas generadas por microheterogeneidad

siendo la más común debida a variaciones en la estructura de sus oligosacáridos.

Las glicoproteínas animales contienen en sus oligosacáridos, diferentes ácidos

sialicos y se ha reportado que el contenido de los mismos juega un papel

importante en el reconocimiento celular. Se observa que durante el desarrollo de

enfermedades hepáticas hay reducción en la sialilación de ciertas glicoproteínas y

durante ciertos cánceres aumentan la sialilación y la fucosilación.

La Lactoferrina (LF) es una glicoproteína de la familia de las transferrinas, con capacidad de unión al hierro, presente en la leche y otros fluidos corporales. Numerosos reportes indican que presenta actividad antimicrobiana in vitro sobre un amplio espectro de agentes patógenos. En estudios in vivo parece actuar como modulador de la inflamación y de la respuesta inmune. En este trabajo se estudió la modificación del grado de sialilación de LF bovina comercial mediante estrategias química y enzimática, de liberación de ácido siálico. La LF fue re-cromatografiada mediante intercambio iónico, se realizó la desialilación completa mediante método químico y desialilación parcial con neuraminidasa de C. perfringens, la cual fue inmovilizada en soporte tipo agarosa. El ácido siálico liberado fue cuantificado mediante reacción de reductores y las diferentes subpoblaciones de lactoferrina generadas, se analizaron mediante isoelectroenfoque. También se utilizaron como haptenos en ensayos de inhibición de hemoaglutinación (HAG) usando una lectina fúngica. Se observaron modificaciones en el patrón de bandas de pI debidas a la desialilación y en los ensayos de inhibición de HAG, la asialo-lactoferrina perdió su capacidad de interacción con la lectina utilizada, mientras que las isoformas parcialmente sialiladas mantuvieron su capacidad inhibitoria aunque con diferente intensidad. Las estrategias de desialilación utilizadas permitieron generar diferentes subpoblaciones de lactoferrina, las cuales serán evaluadas mediante estudios in vitro, frente a diferentes microorganismos.

Financiamiento: ANII, PEDECIBA-QUIMICA.

129

P116) ESTUDIO DE LA INHIBICIÓN DE TRIPSINA CON LA PROTEÍNA

KUNITZ EgKU-7

PELLIZZA, L.1 , FLÓ, M.1, 2, MARGENAT, M.1 , SALINAS, G.1 , ALVAREZ, B.2,

FERNÁNDEZ, C.1

1Cátedra de Inmunología – Facultad de Química y 2Laboratorio de Enzimología -

Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Uruguay

EgKU-7 pertenece a una familia de proteínas del tipo Kunitz de Echinococcus

granulosus (EgKU-1 – EgKU-8) que participarían en la interacción del parásito con

su hospedero definitivo. Presenta un residuo Arg en su sitio antiproteasa, lo que

indica que sería un inhibidor de tripsina. En este trabajo, se describe su

producción como recombinante y el ensayo de condiciones que permiten reducir la

formación de agregados insolubles a fin de obtener una mayor concentración de la

proteína soluble y activa. Además, se presenta el resultado de estudios cinéticos

que revelan su capacidad de inhibir tripsina con alta afinidad.

Se clonó la secuencia codificante para EgKU-7 maduro (sin la secuencia del péptido

señal) en el vector pET 28a (+), y se utilizaron células E.coli BL21 para la

expresión. La presencia de una extensión N-terminal de poli-histidina permitió

purificar la recombinante por afinidad a una matriz de niquel-NTA-agarosa. Pese a

que la mayor parte de EgKU-7 se recuperó en la fracción insoluble del lisado

bacteriano, probablemente como cuerpos de inclusión, la modificación de algunas

condiciones físicas, como densidad celular a la cual se induce la expresión y

duración de la misma, permitieron mejorar el rendimiento de proteína soluble. Se

observó un aumento de la concentracción de EgKU-7 en la fracción soluble cuando

la expresión se indujo tempranamente (A600 = 0.2 - 0.3) y durante tiempos cortos

(2 – 3 hs).

Los resultados de los ensayos cinéticos mostraron que EgKU-7 es un excelente

inhibidor de tripsina de alta afinidad (Ki en el orden pM). Además, mediante el

estudio de los cursos temporales de la inhibición, se evidenció que la formación

del complejo enzima-inhibidor involucraría sólo un equilibrio, a diferencia de otros

inhibidores Kunitz que involucran dos.

130

P117) SINGULARIDADES DEL COMPUESTO ANTITUMORAL

OXALIPLATINO EVIDENCIADAS POR COMPARACIÓN DE POTENCIALES

ELECTROSTÁTICOS 3D.

MERLINO, A.1; MARÍN, R.2; DANS, P.1; DAZA, E.2; COITIÑO, E.L.1

1Laboratorio de Química Teórica y Computacional, Instituto de Química Biológica,

Facultad de Ciencias, UdelaR, Montevideo- Uruguay.

2Grupo de Química Teórica, Universidad Nacional de Colombia, Bogótá D.C.,

Colombia.

En los últimas décadas se ha realizado un gran esfuerzo en el desarrollo de nuevas

entidades conteniendo Pt/Pd con el fin de mejorar los problemas de solubilidad,

toxicidad y resistencia asociados al Cisplatino, un fármaco ampliamente utilizado

en el tratamiento de distintos tipos de tumores sólidos. Si bien en este contexto

han surgido compuestos que presentan menor toxicidad (Carboplatino) o resultan

efectivos en células resistentes al Cisplatino (Oxaliplatino) [1] aun no están claras

las características estereoelectrónicas que causan esas diferencias en el perfil

farmacológico de dichos compuestos.

Teniendo en cuenta lo anterior en nuestro grupo de trabajo hemos realizado una

serie de estudios teóricos a fin de encontrar patrones estructurales que permitan

predecir la actividad antitumoral de complejos de Pt/Pt, lo cual resulta

fundamental para el diseño racional de nuevos compuestos más selectivos y

efectivos [2].

En el presente trabajo, el potencial electrostático molecular 3D calculado a nivel

DFT (PCM-B3LYP/LANL2DZ/6-31G*) de 35 complejos de Pt/Pd fue comparado

mediante el uso del método TARIS (Tree Analysis and Representation of

Isopotential Surfaces) [3]. Este método ha permitido clasificar los compuestos

teniendo en cuenta la similitud del potencial de cada molécula en base a

superficies isopotenciales moleculares negativas (NMIS). El análisis realizado

muestra que el Oxaliplatino presenta un potencial electrostático que es

claramente diferente al de las otras moléculas estudiadas. Lo anterior concuerda

con la idea de que estos fármacos utilizan distintos transportadores para ingresar a

la célula lo cual podría explicar la variación en el espectro de acción frente a

distintos tipos de tumores.

[1] Rixie, O.; Ortuzar, W.; Álvarez, M.; Parker, R.; Reed, E.; Paull, K.; Fojo, T.

Biochem. Pharmacol.

1996, 52, 1855.

[2] Dans, P.D.; Coitiño, E.L. J. Chem. Inf. Model. 2009, 49, 1407.

[3] Marín, R.M.; Aguirre, N.F.; Daza, E.E. J. Chem. Inf. Model. 2008, 48, 109

131

P118) ALOSTERISMO EN LA ALBUMINA SÉRICA HUMANA SEGÚN ESTUDIOS DE DIFRACCIÓN DE RAYOS X

BOTTI, H.; BONILLA, L.; TRAJTENBERG, F.; FERRER-SUETA, G.; BUSCHIAZZO, A.;

RADI, R.

Institut Pasteur de Montevideo, Unidad de Cristalografía de Proteínas y

Centro de Investigaciones Biomédicas en Radicales Libres, Facultad de Medicina,

UdelaR

Cambios conformacionales y dinámicos se conjugan para explicar la señalización

intramolecular. Son pocos los mecanismos alostéricos bien comprendidos a

resolución atómica/casi atómica. Los modelos estructurales cristalográficos por

difracción de rayos X brindan información estructural detallada de

macromoléculas, incluyendo información sobre la movilidad atómica. Sin embargo,

la dinámica de proteínas es mayormente estudiada en casos favorables por

resonancia magnética nuclear (RMN). La albúmina sérica humana (HSA) cumple

diversas funciones, entre ellas la regulación del balance redox del plasma,

principalmente a través de su unico tiol libre (Cys34). También transporta iones,

biomoléculas, xenobióticos y drogas. Nosotros estudiamos por métodos biofísicos

en solución y en cristales el mecanismo alostérico que vincula a distancia el sitio

de unión a fármacos de Sudlow I y el sitio del tiol de la HSA. La oxidación de la

Cys34 y la unión de Ca2+ (modulador alostérico conocido) no parecen afectar en

gran medida la conformación proteica, ya que no se observan cambios de FRET

Trp214-Prodan atribuibles a cambios en la distancia dador-aceptor, aunque se

observan cambios en constantes de afinidad y en los rendimientos cuánticos de la

sonda unida. Esto está de acuerdo con el análisis del espacio conformacional de la

HSA según estudios cristalográficos, que muestra que el dominio II es rígido. Se

realizaron ensayos cristalogénicos manuales y robóticos sobre isoformas oxidadas

sin éxito hasta el momento. De los estudios cristalográficos a T criogénica sobre la

isoforma reducida obtuvimos un nuevo modelo, el que permite definir mejor los

cambios dinámicos que ocurren en la proteína por unión de fármacos al sitio de

Sudlow I. En conjunto con modelos cristalográficos previos, hemos podido

identificar componentes del mecanismo alostérico en estudio. Los estudios

cristalográficos de las isoformas oxidadas se continuarán sobre formas truncadas

de la proteína, particularmente dominios I y II, y dominio I aislado.

132

P119) ESTUDIO DE LOS MECANISMOS DE NITRACIÓN CITOCROMO C

USANDO PROTEÍNAS MUTANTES EN TIROSINAS.

SCANDROGLIO. F1; TÓRTORA. V1; BONILLA. L1; MARÍN. M2; RADI. R1 AND CASTRO.

L1.

1Facultad de Medicina y 2Facultad de Ciencias, Universidad de la República,

Montevideo, Uruguay.

El citocromo c (citc) es una hemoproteína mitocondrial que participa en la

transferencia de electrones a través de la cadena respiratoria y en la apoptosis, al

liberarse desde la mitocondria al citosol llevando a la activación del apoptosoma al

unirse a APAF-1 junto con dATP y procaspasa 9.

En la mitocondria, el citc está unido a la membrana mitocondrial interna mediante

interacciones electrostáticas, además, un 15% aproximadamente, se encuentra

fuertemente unido a la cardiolipina, por interacciones electrostáticas,

hidrofóbicas y puentes de hidrógeno. La unión a la cardiolipina determina un un

cambio conformacional del citc que produce un significativo aumento en su

actividad peroxidasa. Hemos mostrado que la nitración también determina una

ganancia en la actividad peroxidásica del citc.

El citc presenta 4 residuos de tirosinas altamente conservados (dos adyacentes al

hemo Y48, Y67 y dos expuestas al solvente, Y74, Y97). Por mutagénesis dirigida se

realizaron simples mutantes en tirosina por fenilalanina del ctic de corazón de

caballo con el fin de determinar el rol de las Y en la nitración medida por

derivados del .NO. Las proteínas mutantes (Y97F, Y74F, Y67F, Y48F) fueron

expresadas en E coli BL21Star, purificadas y expuestas a peroxinitrito, H2O2 y NO-2

,H2O2 y .NO; y analizadas por western blot anti-citc y anti-nitrotirosina.

Los simples mutantes presentaron una menor nitración por peroxinitrito

comparado con la WT; y las Y48F y la Y67F exhibieron menor formación de

agregados proteicos. El H2O2 induce menos polimerización en las Y48F y Y67F que

la WT, Y74F y Y97F. En presencia de H2O2 y NO2- la polimerización disminuye y se

vuelve evidente la formación de nitrotirosina.

Proponemos que las tirosinas más internas son esenciales en promover la

transferencia electrónica desde, o hacia, el hemo a la proteína y hacia la

cardiolipina durante su peroxidación y la nitración puede alterar esta vía.

133

P120) IMPLEMENTACION DE METODOS PARA LA CRISTALIZACION Y

DIFRACCION DE RAYOS X DE MACROMOLECULAS BIOLOGICAS

LARRIEUX, N; TRAJTENBERG, F; BOTTI, H Y BUSCHIAZZO, A.

I

nstitut Pasteur de Montevideo, Unidad de Cristalografía de Proteínas

La cristalografía de rayos X es la aproximación experimental más poderosa para determinar las

estructuras tridimensionales de macromoléculas biológicas. El objetivo de la Unidad de Cristalografía

de Proteínas del IPMont es el de proveer infraestructura y soporte en conocimiento técnico, para

permitir a investigadores locales y regionales realizar estudios estructurales de relevancia científica.

Para ello se han adquirido e instalado instrumentos estado del arte, en las áreas de cristalización,

difracción de rayos X y determinación / refinamiento de estructuras 3D. La Unidad comenzó a

funcionar en 2007, y fue incorporando personal técnico y científico en forma escalonada, asociada a

la instalación de equipamiento. Aquí presentamos el progreso en la implementación de técnicas en el

área de cristalogénesis de macromoléculas biológicas, con énfasis en las aproximaciones que han sido

puestas a punto y que nos han permitido cristalizar 20 proteínas diferentes. El setup elegido para

llevar adelante experimentos de difracción de rayos X sobre cristales únicos, ha hecho posible

colectar más de 100 juegos de datos, habiéndose determinado y refinado 31 estructuras, de las cuales

13 ya se han depositado en la base de datos PDB. Se presentarán algunas cifras de interés sobre

características y uso de la muestra inicial en cristalización, máxima resolución obtenida y tamaño de

las proteínas resueltas. Hasta el momento sólo se han procesado proteínas solubles. Un objetivo

importante es el entrenamiento de nuestro personal en el estudio cristalográfico de proteínas de

membrana. En términos de equipamiento, resta la incorporación de un segundo robot para el área de

cristalogénesis. En el área computacional podemos ahora trabajar con mapas de densidad obtenidos

por microscopía electrónica, tanto para fasear nuevas estructuras incógnita, como para ajustar

proteínas resueltas por rayos X dentro de la envoltura de microscopía. Actualmente estamos así

mismo incorporando métodos complementarios para simular interacciones por docking.

134

P121) IMPLEMENTACION DE METODOS PARA LA CRISTALIZACION Y

DIFRACCION DE RAYOS X DE MACROMOLECULAS BIOLOGICAS

LARRIEUX, N; TRAJTENBERG, F; BOTTI, H Y BUSCHIAZZO, A.

Institut Pasteur de Montevideo, Unidad de Cristalografía de Proteínas

La cristalografía de rayos X es la aproximación experimental más poderosa para

determinar las estructuras tridimensionales de macromoléculas biológicas. El

objetivo de la Unidad de Cristalografía de Proteínas del IPMont es el de proveer

infraestructura y soporte en conocimiento técnico, para permitir a investigadores

locales y regionales realizar estudios estructurales de relevancia científica. Para

ello se han adquirido e instalado instrumentos estado del arte, en las áreas de

cristalización, difracción de rayos X y determinación / refinamiento de estructuras

3D. La Unidad comenzó a funcionar en 2007, y fue incorporando personal técnico y

científico en forma escalonada, asociada a la instalación de equipamiento. Aquí

presentamos el progreso en la implementación de técnicas en el área de

cristalogénesis de macromoléculas biológicas, con énfasis en las aproximaciones

que han sido puestas a punto y que nos han permitido cristalizar 20 proteínas

diferentes. El setup elegido para llevar adelante experimentos de difracción de

rayos X sobre cristales únicos, ha hecho posible colectar más de 100 juegos de

datos, habiéndose determinado y refinado 31 estructuras, de las cuales 13 ya se

han depositado en la base de datos PDB. Se presentarán algunas cifras de interés

sobre características y uso de la muestra inicial en cristalización, máxima

resolución obtenida y tamaño de las proteínas resueltas. Hasta el momento sólo se

han procesado proteínas solubles. Un objetivo importante es el entrenamiento de

nuestro personal en el estudio cristalográfico de proteínas de membrana. En

términos de equipamiento, resta la incorporación de un segundo robot para el área

de cristalogénesis. En el área computacional podemos ahora trabajar con mapas

de densidad obtenidos por microscopía electrónica, tanto para fasear nuevas

estructuras incógnita, como para ajustar proteínas resueltas por rayos X dentro de

la envoltura de microscopía. Actualmente estamos así mismo incorporando

métodos complementarios para simular interacciones por docking.

135

P122) SERIN/TREONIN QUINASAS DE Leishmania: UN ESTUDIO

ESTRUCTURAL

HORJALES S. & BUSCHIAZZO A.

Unidad de Cristalografía de Proteínas- Institut Pasteur de Montevideo

Las Ser/Thr proteín quinasas (STPQs) son moléculas ubicuas que participan en la

transducción de señales en pro y eucariotas. Son enzimas que presentan al menos

2 conformaciones tridimensionales extremas: el estado activado y el inactivo,

actuando asi como “interruptores moleculares”. Pretendemos comprender cómo

esta flexibilidad está asociada a su función al nivel molecular, con particular foco

en los cambios conformacionales asociados a los ciclos catalítico y regulatorio. Nos

centraremos en el estudio estructural de MAP ('mitogen activated protein')

quinasas de Leishmania, que forman parte de cascadas de fosforilación, disparadas

por estímulos extracelulares. El estudio cristalográfico de MPK10 y MPK7 de

Leishmania major resulta de interés, tanto por los correlatos fenotípicos asociados

a la enfermedad (son MAPQs asociadas a virulencia y/o diferenciación de estadio

durante el ciclo de vida), como a particularidades en sus secuencias que las

diferencian de MAPQs humanas (por ende, blancos terapéuticos potenciales). MPK7

por ejemplo, posee dos inserciones en sitios clave de la molécula: el sitio de unión

al ATP y el bucle de activación. Para realizar estudios cristalográficos de estas dos

MAPQs, hemos expresado MPK7 y MPK10 recombinantes en Escherichia coli. MPK7

se encuentra en la fracción insoluble, obstáculo que necesariamente debemos

franquear para progresar hacia estudios estructurales. Una batería de variantes

fue utilizada hasta el momento para mejorar la expresión, sin éxito. Ahora

estamos enfocados en usar Leishmania y Drosophila como huéspedes de expresión

alternativos. MPK10 se expresó en forma soluble, con buen rendimiento,

permitiendo su purificación a homogeneidad. Se rastrearon condiciones de

cristalización, identificando varias condiciones iniciales. Estos cristales están

siendo optimizados. Los cristales iniciales difractan hasta 3 angstroms y crecieron

en el grupo de espacio tetragonal P43212 (o P41212, ambigüedad que se resolverá

en la determinación), lo cual permite prever la obtención de la primer estructura

3D de una MAP quinasa de tripanosomátidos próximamente.

136

P123) CHARACTERIZATION OF A POTENTIAL SUBSTRATE-TRAPPING

MUTANT OF THE TYROSINE PHOSPHATASE PtpA FROM

Mycobacterium tuberculosis.

PURIFICAÇÃO M.A, RAZZERA G.B, OBAL G.C, FERREIRA A.M.D, DURÁN R C, LIMA AC,

HERNÁN TERENZI H.A Y VILLARINO A.A

aLaboratório de Expressão Gênica, Departamento de Bioquímica, Universidade

Federal de Santa Catarina, 88040-900, Florianópolis, SC, Brazil bNational Center for Nuclear Magnetic Resonance Jiri Jonas, CNRMN, UFRJ, Brazil. cInstitut Pasteur de Montevideo, Unidad de Biofísica de Proteínas y

Unidad Tecnológica de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Montevideo, Uruguay. dCátedra de Inmunología, Facultad de Ciencias, Instituto de Higiene, Montevideo,

Uruguay.

Several bacterial phosphatases can contribute to pathogen intracellular survival by

modifying the phosphorylation/dephosphorylation equilibrium in their host. The M.

tuberculosis tyrosine phosphatase PtpA has been shown to participate in

pathogenicity. However, which are all the PtpA targets is unknown. The best way

to identify PTP targets is the substrate-trapping method, based on the generation

of a mutated enzyme that retains the ability to bind substrates, but is either

unable or severely impaired in carrying out dephosphorylation, allowing the

isolation of the PTP-substrate complex. The mutated residues are involved in the

conserved catalytic mechanism of phospho-mono-ester hydrolysis of the PTP

enzyme family. In the present study, we report the generation of the M.

tuberculosis PtpA D126A mutant and the effect of this mutation on its kinetic

properties and structure and propose a new strategy to purify the putative isolated

substrates. We obtained in a good yield a pure and homogeneous PtpA D126A

mutant that potentially presents all the features for a good substrate-trapping

mutant: (i) it is barely active (lower kcat than wild-type enzyme), (ii) it binds

efficiently its substrate (Km similar to wild-type), and (iii) it presents no

substantial conformational changes. In fact, preliminary results obtained by a

combination of the substrate-trapping mutant and the Surface Plasmon Resonance

method showed an hydrophobic protein-protein interaction involving the active

site of PtpA with a potential substrate present in a whole soluble protein extract

of macrophages. Thus, we conclude that the PtpA D126A mutant prepared in this

study can be potentially used to characterize physiological substrates and

contribute to determine the signaling pathway in which M. tuberculosis PtpA is

involved, by in vitro-pull down approaches and further crystallographic studies of

enzyme/substrate complexes.

137

P124) CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA PRELIMINAR DE LA

GLUTARREDOXINA MONOTIÓLICA 1 DE TRYPANOSOMA BRUCEI

BRUCEI

MANTA B1, KRAUTH-SIEGEL L2, COMINI M1

1. Grupo de Biología Redox de los Tripanosomas, Institut Pasteur Montevideo,

Uruguay. 2. Biochemistry Center, Heidelberg University, Germany.

Las glutarredoxinas monotiólicas (1-C-Grx) son proteínas ubicuas a organismos de

diferentes Géneros. Ellas pertenecen a la superfamilia de las tiorredoxinas y se

diferencian de las glutarredoxinas clásicas (sitio activo CPXC) por poseer un único

residuo de cisteína en su sitio activo (CXXS). A diferencia de aquellas, las 1-C-Grxs

carecen de actividad oxidoreductasa tiol-disulfuro y su rol fisiológico parece tener

relación con la capacidad de las mismas para ensamblar en su estructura centros

ferrosulfurados. En Trypanosoma brucei brucei (Tb), un organismo modelo de la

tripanosomiasis Africana, se ha reportado la presencia de tres 1-C-Grxs, siendo al

momento la 1-C-Grx1 la mejor estudiada de ellas. La 1-C-Grx1 de T. brucei es una

proteína homodimérica que en su holoforma secuestra un centro ferrosulfurado

empleando glutatión como cofactor y cumple un rol indispensable en el

mitocondrio de este parásito. Ahora hemos iniciado estudios tendientes a

completar la caracterización bioquímica y biofísica de la 1-C-Grx1 de T. brucei.

Los resultados obtenidos al momento indican que: i) la dimerización no-covalente

de 1-C-Grx1 es mediada por una extensión N-terminal solo conservada en ortólogos

de otros tripanosomátidos, ii) la cisteína del sitio activo participa en la

coordinación del centro ferrosulfurado, tal como ocurre con 1-C-Grxs de otros

organismos, iii) el tratamiento con oxidantes y reductores no induce cambios

notorios en el espectro de fluorescencia de una región de unión no covalente a

glutatión, iv) la magnitud de los cambios conformacionales en la estructura de la

apoproteína dependen del oxidante empleado.

138

P125) DETERMINACIÓN DE pKa Y NUCLEOFILIA DE TIOLES DE BAJO

PESO MOLECULAR EN COMPARACIÓN CON TIOLES PROTEICOS.

SARDI, F1., MANTA, B2. Y FERRER-SUETA, G1.

1Laboratorio de Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias. 2Instituto Pasteur Montevideo.

El grupo tiol (RSH) es uno de los grupos más versátiles en bioquímica, participa en

la estabilización de estructuras terciarias de proteínas mediante la formación de

disulfuros, catálisis enzimática, entre otras.

La gran mayoría de los tioles biológicos son derivados del aminoácido cisteína, y

sus reacciones comienzan con el ataque nucleofílico del tiolato sobre la molécula

blanco. Siendo la nucleofilia del tiolato una característica extraordinaria, fue la

considerada a estudiar. Las determinaciones de pKa de tioles mediante la

reactividad diferencial entre tiol y tiolato proporcionan una forma de medir la

nucleofilia.

De esta manera, hemos estudiado las constantes de acidez de diferentes tioles de

bajo peso molecular por medio de la reacción de alquilación con

monobromobimano (mBBr), y con la posterior construcción de una escala

nucleofílica, la cual consiste en correlacionar constantes de velocidad de una

reacción con la acidez del tiol. Con los valores de constantes de velocidad para las

reacciones con mBBr y los pKas obtenidos hemos construido correlaciones de

Bronsted, a partir de la cual se puede comprender la relación entre la acidez y la

nucleofilia, y utilizar como marco de referencia para la ubicación de cisteínas

proteicas que caen en la ubicación esperada por la correlación y aquellas que

tienen su pKa o nucleofilia alterada por el entorno proteico.

Hemos escogido el sistema de la enzima Sulfirredoxina humana (hSrx) en

presencia de ATP y Mg2+, determinando los pKa del tiol proteico por medio de la

reacción de alquilación con mBBr. Nos hemos planteado hipótesis acerca de

posibles factores adicionales que contribuyen en las reacciones catalizadas por la

proteína.

139

126) REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD QUINASA DE PknG EN

Mycobacterium tuberculosis

GIL, M., BATTHYÁNY, C., DURÁN, R., CERVEÑANSKY, C.

Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Institut Pasteur de Montevideo/Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Mataojo 2020, Uruguay. La fosforilación reversible de proteínas constituye la base de un lenguaje universal

utilizado tanto por organismos eucariotas como procariotas para la transmisión de

información en respuesta a estímulos. En bacterias, la señalización recae

fundamentalmente sobre sistemas de dos componentes constituidos por una

quinasa de histidina (sensor) y un regulador de respuesta. La secuenciación del

genoma de Mycobacterium tuberculosis reveló la importancia de sistemas de

fosforilación en serinas y treoninas típicamente eucariotas (STPK), dicho genoma

codifica para once STPK (pknA a pknL) y una fosfoserina/treonina fosfatasa (pstP).

Nuestro interés se centra en la caracterización de PknG, quinasa citosólica que

participaría en la regulación de los niveles intracelulares de glutamina/glutamato

e intervendría en la supervivencia del bacilo dentro del macrófago inhibiendo la

fusión del fagosoma y el lisosoma. Además del dominio catalítico quinasa, PknG

posee dominios N- y C- terminales con roles poco estudiados. El extremo amino-

terminal presenta un motivo rubredoxina, caracterizado por la presencia de un

hierro coordinado a cuatro residuos de cisteínas y que en muchas bacterias

anaerobias participa en la transferencia de electrones. En este trabajo nos

propusimos ahondar en la regulación de la actividad quinasa de PknG por el

dominio rubredoxina. PknG de M. tuberculosis se expresó como proteína

recombinante en E. coli, la purificación se realizó en dos etapas: cromatografía de

afinidad por metales inmovilizados y cromatografía de exclusión molecular. Por

espectrometría de masa MALDI-TOF se corroboró la identidad de la proteína

purificada. Además, se confirmó que la enzima purificada era activa y por tanto

capaz de transferir grupos fosfato. Posteriormente, estudiamos la relevancia del

estado de oxidación del hierro coordinado a las cisteínas del dominio rubredoxina y

el efecto de la modificación química de dichas cisteínas sobre la actividad

catalítica de PknG.

140

P127) ESTRUCTURA OLIGOMÉRICA Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA REDOX-

DEPENDIENTE DE LA GLUCOSA-6-FOSFATO DESHIDROGENASA DE

Trypanosoma cruzi

ORTÍZ C., MEDEIROS A., COMINI M.

Laboratorio de Biología Redox de los Tripanosomas, Institut Pasteur de

Montevideo.

La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) cataliza la primera reacción y etapa

limitante de la vía de las pentosas fosfatos, una ruta metabólica que genera

NADPH además de otros metabolitos importantes (por ej. ribosa-5-fosfato y

productos intermediarios de la glicólisis). Estudios recientes demostraron que la

G6PDH de Trypanosoma cruzi (TcG6PDH) cumpliría un rol importante en el

mecanismo de defensa antioxidante del parásito y sugirieron que la actividad de la

misma sería blanco de regulación redox (Igoillo-Esteve y Cazzulo, 2006). Nuestro

objetivo es determinar si existe un mecanismo de retroalimentación redox-

dependiente que regule la actividad de la TcG6PDH en función de la demanda de

poder reductor del parásito, tal como es el caso de G6PDHs de organismos

fotosintéticos. Aquí se reportan los resultados preliminares obtenidos en pos de

ese objetivo.

En una primera instancia, se procedió a optimizar el protocolo de expresión y

purificación de la forma recombinante corta (TcG6PDHc, 518 aminoácidos) y larga

(TcG6PDHL, 555 aminoácidos) de la enzima. Los estudios de cromatografía de

exclusión molecular revelaron que ambas proteínas forman tetrámeros no-

covalentes cuya conformación no es alterada por el agregado de agentes

reductores y/o coenzima. La oxidación, espontánea o inducida, de la TcG6PDHL

condujo a la formación de enlace(s) disulfuro(s) intermoleculares entre dos

subunidades del tetrámero. Dicho fenómeno fue revertido por reductores e

involucraría a cisteínas de la extensión N-terminal, ausentes en la secuencia de la

TcG6PDHc. La actividad de la G6PDHL fue evaluada en presencia de distintas

relaciones fisiológicas de pares redox (glutatión y tripanotión reducido y oxidado),

observándose que las diferentes duplas tiol/disulfuro afectaron de manera

moderada y específica la actividad de la enzima. Metales divalentes (Zn2+, Cu2+,

Fe2+, Co2+ y Ni2+) provocaron distintos grados de inactivación de la TcG6PDHL

sugiriendo la formación de un complejo enzima-metal y/o la oxidación de grupos

funcionales (Cys o His) de la proteína.

141

P128) INHIBICION DE LA ACTIVIDAD COAGULANTE DEL VENENO “BOTHROPICO” POR PARTE DEL PLASMA DE RHINOCEROPHIS ALTERNATUS.

MORAIS V. & CARREIRA S.

Instituto de Higiene.

En Uruguay, existen unos 65 accidentes ofídicos al año causados por dos especies,

Bothropoides pubescens y Rhinocerophis alternatus. El único tratamiento eficaz

hasta el momento es la administración de suero antiofídico específico. No

obstante, se conoce hace tiempo la capacidad de resistencia de ciertos animales

como la comadreja (Philander opossum), la zarigüeya (Didelphys marsupialis) e

incluso otros ofidios (Bothropoides, Bothrops y Rhinocerophis) a ciertas toxinas del

veneno. Generalmente ésta resistencia viene dada por inhibidores de enzimas

específicas del veneno tales como inhibidores de fosfolipasas, metalo y serino

proteasas. En este trabajo preliminar determinamos si existe capacidad inhibitoria

del plasma sanguíneo de R. alternatus frente al veneno de B. pubescens. Para ello

ensayamos frente a uno de los efectos tóxicos principales del veneno como es el

potencial coagulante. Los resultados indican una inhibición importante del

potencial de coagulación del veneno cuando se le aplica plasma ofídico. Si bien el

potencial inhibitorio es evidente en el ensayo, no sería suficiente como para

neutralizar una inyección directa de veneno por parte de otro ejemplar por lo que

se supone que esta propiedad neutralizante defendería el plasma de la serpiente

de pequeñas cantidades de veneno propio, o de otro ofidio, que accidentalmente

pudiesen ingresar en el organismo en las actividades normales. La identificación

futura de este componente inhibitorio no solo tiene importancia en lo que refiere

al tratamiento del accidente ofídico, sino también en lo relacionado al desarrollo

de nuevos fármacos en el área hemostática, debido a la relación entre este tipo de

toxinas y la cascada de coagulación.

142

P129) NITROALQUENOS DE SÍNTESIS COMO ATRAPADORES DE

ESPECIES OXIDANTES

PROLO C1,2, CELANO L1, FRACHE R3, GONZÁLEZ M3, ÁLVAREZ M N2, THOMSON L1.

1Laboratorio de Enzimología, Facultad de Ciencias. 2Centro de Investigaciones

Biomédicas en Radicales Libres, Departamento de Bioquímica, Facultad de

Medicina. 3Laboratorio de Química Orgánica, Facultad de Ciencias.

Durante los procesos inflamatorios existe una producción excesiva de especies

reactivas del oxígeno y nitrógeno por parte de las células fagocíticas, generando

daño oxidativo sobre proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. La activación de las

células fagocíticas conlleva la inducción de la enzima óxido nítrico sintasa,

responsable de la producción de óxido nítrico (•NO) y el ensamblaje de la enzima

NADPH oxidasa, generando superóxido (O2•-). El •NO y O2

•- reaccionan para formar

peroxinitrito (ONOO-), molécula con mayor poder oxidante que ambos precursores,

responsable en parte del daño nitro-oxidativo en células cercanas. Por esta razón

existe una búsqueda constante de agentes antioxidantes con aplicaciones

terapéuticas y con este fin estudiamos las propiedades antioxidantes de dos

nitroalquenos de síntesis: el (1Z)-1-dimetilamino-4-(2-nitro-1-propenil)benceno y

(E)-5-(2-nitro-1-propenil)-3a7a-dihidrobenzo[d][1,3]dioxol (02 y 03,

respectivamente) en un modelo de macrófagos. En macrófagos activados, la

oxidación de la dihidrorodamina mediada por radicales derivados de ONOO-, fue

fuertemente inhibida por la presencia de 5μM de los nitroalquenos 02 (90%) y 03

(64%). Evaluamos la capacidad de atrapar •NO y O2•- usando ensayos in vitro e in

vivo que detectan estas especies, observando que no se inhibe la detección de •NO

por oxihemoglobina, ni la reducción de citocromo c por O2•-. Por otra parte, se

analizó el efecto de los compuestos sobre la viabilidad celular usando un ensayo de

exclusión de ioduro de propidio por citometría de flujo y otro de poder reductor

intracelular (MTT). El compuesto 03 resultó tóxico para las células (20% de células

viables a las 24 horas de exposición a 10μM de compuesto), mientras que el 02 no

afectó la viabilidad luego de 48 horas de exposición. Por tanto el compuesto 02 no

es tóxico para las células y es capaz de atrapar radicales derivados del ONOO-

siendo un buen candidato para continuar su evaluación como protector en

procesos inflamatorios.

143

P130) LA ACONITASA MITOCONDRIAL: ¿BLANCO PREFERENCIAL DE

ESPECIES OXIDANTES Ó UN SENSOR REDOX?

SCANDROGLIO, F.; TÓRTORA, V; CASTRO, L.

Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad de la República.

La mitocondria, organelo de control bioenergético, constituye además un sitio de

formación de especies oxidantes derivadas del oxígeno y del óxido nítrico que

median reacciones de oxidación de biomoléculas, que cumplen roles señalizadores

o determinan alteraciones estructurales y funcionales mediando la disfunción

mitocondrial.

El radical superóxido y especies derivadas de su reacción con óxido nítrico

(peroxinitrito y radical carbonato) reaccionan rápidamente con el centro Fe-S de

la aconitasa mitocondrial, determinando la inhibición de esta enzima del ciclo de

Krebs. La presencia de la aconitasa oxidada y nitrada en diversos modelos animales

de sepsis, inflamación, envejecimiento y diabetes la revelan como un blanco

preferencial de especies oxidantes in vivo.

Este proyecto busca determinar el umbral de inhibición de la aconitasa de

distintos tejidos de rata y en diversos tipos celulares con diferentes perfiles

metabólicos. Esto permitirá definir el coeficiente de control de flujo de la

aconitasa sobre el ciclo de Krebs y la respiración celular, para determinar si la

inactivación de la aconitasa puede ser un mecanismo de control del estrés

oxidativo.

En este trabajo realizamos: a)Estudios de consumo de oxigeno citrato dependiente

de mitocondrias aisladas de los diferentes parénquimas, para evaluar el

metabolismo mitocondrial (ciclo de Krebs, cadena respiratoria y fosforilación

oxidativa) a partir de la actividad aconitasa; y b)medidas de la actividad aconitasa

en fracciones enriquecidas en matriz mitocondrial.

El umbral funcional de la enzima fue determinado usando fluorocitrato (inhibidor

competitivo). La actividad aconitasa en riñón fue de 117 ± 15 mU/mg y 30 ± 5

mU/mg en hígado; la titulación con fluorocitrato resultó en un IC50 de 20 µM en

riñón y 35 µM en hígado.

Nuestros resultados preliminares nos permiten observar que hay diferencia significativa del umbral funcional de la aconitasa en los diferentes órganos, lo cual puede traducirse en la diferente sensibilidad tisular al estrés oxidativo.

144

P131) FORMACIÓN DE .NO Y O2.- EN CÉLULAS ENDOTELIALES:

EFECTO SOBRE BLANCOS CELULARES

SUBELZÚ, N., ROMERO, N Y RADI, R.

Departamento de Bioquímica y Centro de Investigaciones Biomédicas en Radicales

Libres, Facultad de Medicina, UDELAR.

El oxido nítrico (.NO) es producido en las células endoteliales a partir de L-arginina, O2 y NADPH, reacción catalizada por la enzima eNOS, y difunde a las células musculares adyacentes, induciendo vasorelajación y aumento del flujo sanguíneo. Algunas fisiopatologías como diabetes e hipertensión, se asocian al aumento de formación vascular de radical superoxido (O2

.-), el cual reacciona con .NO produciendo peroxinitrito y disminuyendo la biodisponibilidad de .NO. Las fuentes de O2

.- vasculares incluyen NADPH oxidasas, cadena de transporte mitocondrial y la eNOS desacoplada. El peroxinitrito puede reaccionar con diferentes blancos celulares como residuos de tirosina proteicos, formando 3-nitrotirosina lo que provoca pérdida o ganancia de función de la proteína nitrada. Un posible blanco celular es la eNOS, la cual se oxida por peroxinitrito disminuyendo la formación de .NO, convirtiéndose en una fuente de O2

.- y peroxinitrito. La MnSOD, enzima mitocondrial responsable de la descomposición de O2

.-, es también nitrada e inactivada por peroxinitrito. Evaluamos la formación de .NO en cultivos de células endoteliales de aorta bovina (BAEC) utilizando diferentes concentraciones de ionomicina y del ionóforo de calcio A23187 mediante fluorescencia de la sonda DAF-FM. Para el radical O2

.- se indujo su producción mitocondrial con antimicina, inhibidor de la cadena respiratoria y DMNQ, un reciclador redox que produce O2

.- utilizando equivalentes de reducción intracelulares. La detección se realizó con la sonda fluorescente Amplex Red. La formación celular de peroxinitrito se analizó usando la sonda fluorescente dihidrorodamina, la cual reacciona con radicales derivados de peroxinitrito. El efecto de la formación de peroxinitrito sobre blancos celulares se estudio con las enzimas MnSOD y eNOS. Los trabajos realizados permitieron optimizar las condiciones para la formación endógena de .NO y O2

.- comprobándose el desacoplamiento de la enzima eNOS y la nitración e inactivación de la MnSOD en condiciones de formación simultánea de .ambos radicales.

145

P132) PORFIRINAS DE MANGANESO COMO PROTECTORAS DEL DAÑO

MEDIADO POR PEROXINITRITO EN MITOCONDRIAS

VALEZ, V.; CASSINA, A.; FERRER-SUETA, G.; RADI, R.

Centro de Investigaciones Biomédicas en Radicales Libres, Departamento de

Bioquímica, Facultad de Medicina.

Laboratorio de Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias.

La mitocondria es el principal sitio de formación de especies reactivas del oxígeno

y del nitrógeno, que pueden derivar en disfunción mitocondrial y señalización para

la muerte apoptótica. Uno de los oxidantes más importantes formados es el

peroxinitrito (ONOO-), que puede oxidar y nitrar proteínas alterando su función.

Las porfirinas sintéticas metálicas son capaces de catalizar una gran cantidad de

reacciones redox y han sido ampliamente usadas como superóxido dismutasas y

como catalizadores de la descomposición de ONOO-, el metal de transición puede

existir bajo 4 estados de oxidación (del II al V). Trabajos previos en nuestro

laboratorio mostraron que las porfirinas en estado III pueden catalizar la reducción

de ONOO- produciendo Mn (IV) y radical .NO2. Este proceso puede ser reciclado por

algunos reductores comunes como ascorbato y urato. Además, datos más recientes

mostraron que el Mn (II) puede también reducir al ONOO- pero produce Mn (IV) y

NO2-, especie menos oxidante que el .NO2. El ciclo redox entre el Mn (II)/ Mn (IV)

puede ser llevado a cabo por flavoenzimas aisladas, debido a su potencial de

reducción, como la glucosa oxidasa o la xantino oxidasa, aunque también lo

pueden hacer las flavoenzimas de la cadena respiratoria como el complejo II o

succinato deshidrogenasa (Ferrer-Sueta, G., et al (2006) Free Radic Biol Med

41(3), 503-512).

En este trabajo se muestra que las porfirinas se pueden incorporar a mitocondrias

aisladas, que también pueden ser reducidas por el complejo I (NADH

deshidrogenasa) y que esto puede suceder a un nivel de oxígeno fisiológico en las

mitocondrias. Por otra parte, se muestra que dicha reducción permite un ciclo

redox entre Mn (II) / Mn (IV) que protege al complejo I y II del daño mediado por

ONOO-. Se observa también protección de la nitración mediada por los productos

de descomposición del peroxinitrito.

146

P133) EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE PROPÓLEOS

URUGUAYOS

SILVA, V. 1,3, GENTA, G.1,3, MÖLLER, M. 1,3, ROMERO, N.2,3, FIERRO, W.1, DENICOLA,

A.1,3.

1Lab. Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias, 2 Departamento de

Bioquímica, Facultad de Medicina, y 3Center for Free Radical and Biomedical

Research, Universidad de la República

El propóleos es un producto natural elaborado por las abejas a partir de material

colectado de diferentes plantas y de su propio metabolismo. Este producto ha

probado tener importantes propiedades biológicas entre las que se destacan

antiinflamatoria, antitumoral, antiséptica y antioxidante. La bioactividad del

propóleos se relaciona con la calidad y el contenido de los polifenoles en general y

de los flavonoides en particular, cuya proporción varía según el origen geográfico,

botánico y según el método y tiempo de recolección del mismo. Dado que el

mercado internacional de este producto se encuentra en amplio crecimiento, es

importante estudiar la composición y propiedades de propóleos de diferentes

regiones, y encontrar parámetros de estandarización química y/o biológica.

En este trabajo estudiamos las propiedades antioxidantes de los propóleos

uruguayos provenientes de diferentes regiones del país. Se realizó la

caracterización organoléptica y fisicoquímica de las muestras y se prepararon

extractos etanólicos de las mismas. Se determinó el contenido total de polifenoles

y flavonoides, y la capacidad antioxidante de los extractos etanólicos de propóleos

fue evaluada in vitro mediante diferentes aproximaciones. Todos los propóleos

analizados mostraron capacidad de inhibir la oxidación de la lipoproteína

proaterogénica LDL, la formación de nitrotirosina y una importante capacidad

secuestradora de radicales peroxilo, evaluada por el método ORAC. Los extractos

etanólicos de propóleos con mayor capacidad antioxidante fueron aquellos con

mayor contenido en polifenoles y flavonoides. Por otro lado se estudió también el

efecto de los extractos en la inducción de la expresión de la óxido nítrico sintasa

endotelial (eNOS).

En este trabajo demostramos que los propóleos uruguayos son potentes

antioxidantes naturales, con valores ORAC significativamente mayores que otros

productos naturales, con gran capacidad de inhibir la oxidación tanto de lípidos

como de proteínas y también inducir la expresión de la eNOS.

147

P134) INHIBICIÓN DE LA NADPH OXIDASA POR ÁCIDO

NITROARAQUIDÓNICO EN MACRÓFAGOS ACTIVADOS

GONZÁLEZ, L.I, ÁLVAREZ, M.N., RUBBO, H. Y TROSTCHANSKY, A.

Centro de Investigaciones Biomédicas en Radicales Libres, Departamento de

Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad de la República, Montevideo,

Uruguay.

La NADPH oxidasa (NOX2) cataliza la producción de anión superóxido (O2● -) hacia

el espacio extracelular a partir de oxígeno y NADPH. Está compuesta por el

flavocitocromo b558 inserto en membrana, tres subunidades citosólicas y GTPasa-

Rac2. La activación de la enzima involucra la fosforilación de un componente

citosólico (p47phox), desencadenando la migración de los las subunidades

citosólicas hacia la membrana y el ensamblaje de la enzima. La sobreproducción

de O2●- puede conducir a la formación de fuertes oxidantes, por lo que la

modulación de la actividad y/o ensamblaje de la NOX2 podría evitar efectos

tóxicos provocados por radicales libres. Hemos demostrado previamente que los

nitrolípidos, en particular el nitroaraquidonato (AANO2), ejercen acciones anti-

inflamatorias como ser la inducción de la expresión de la hemooxigenasa-1, la

inhibición de la inducción de la óxido nítrico sintasa 2 (NOS2) y de la secreción de

citoquinas pro-inflamatorias por macrófagos activados. Nuestra hipótesis es que

otras respuestas efectoras en macrófagos pueden ser moduladas por AANO2 en

particular el ensamblaje y/o actividad de NOX2. Al incubar macrófagos con

AANO2, previo a su activación con PMA o zymosán opsonizado, se observó una

inhibición de la actividad NOX2 (IC50 = 10µM AANO2), medida por

quimioluminiscencia del luminol y fluorescencia del Amplex Red. Además, se

observó una disminución de la migración de p47phox a la membrana por Western

blot. Como los nitroalquenos son potentes electrófilos, especulamos que un posible

mecanismo de inhibición de NOX2 por AANO2 podría implicar la formación de un

aducto entre el AANO2 y residuos críticos de cisteína o histidina, impidiendo la

formación del complejo activo de la enzima. Estos resultados nos permitirán

avanzar en elucidar los mecanismos implicados en la inhibición de NOX2 por AANO2

y sus consecuencias en las respuestas inflamatorias.

148

ADDENDUM

Biología Molecular

METODO ALTERNATIVO DE EXTRACCION DE ADN PARA EL ESTUDIO DE GENOTIPOS

PANDULLI, I; TRUJILLO, A GRIGNOLA P; GOMES DE FREITAS, S; LLAMBÍ, S Y NICOLINI, P.

Laboratorio de Técnicas Nucleares, Facultad de Veterinaria y Laboratorio de Biología Molecular y Endocrinología Metabólica, Facultad de Agronomía, UDELAR.

La extracción de ADN se puede realizar de distintas muestras biológicas y con distintos procedimientos de extracción. La correcta toma de muestras, el tipo de tejido y la elección del protocolo de extracción de ADN son puntos críticos para estudios basados en PCR. El primer objetivo del presente estudio consistió en estandarizar una técnica de extracción de ADN a partir de pelo bovino, por ser un método no invasivo, de fácil obtención y almacenamiento. La extracción se realizó con Chelex (resina quelante de cationes), que es simple, reproducible, económico y rápido. En segundo lugar, se comparó dicha técnica con la de extracción de ADN de sangre bovina (n=28) por método salting out para validar la eficacia del primer método para genotipado de SNPs por High Resolution Melting (HRM). Se extrajo ADN con el método salting out a partir de sangre y con Chelex a partir de pelo. Se realizó la lectura de ADN a 260 nm y se evaluó la relación de absorbancia 260nm/280nm para determinar la concentración y pureza del ADN, respectivamente. Ambos valores fueron menores para las muestras de pelo respecto a las obtenidas para muestras de sangre (50-70 vs 350ng/µl, 1,7-2,1 vs 1,9), pero adecuadas para estudios posteriores de genotipado. Este se realizó mediante la técnica HRM, que es un método de análisis de curvas de disociación que se realiza inmediatamente después de la amplificación por PCR en tiempo real y para el cual es necesaria una buena calidad de ADN. Se obtuvieron un 75 % genotipos concordantes con los obtenidos para sangre, aunque los valores de eficiencia y confianza resultaron menores (0,70 y ≥75% respectivamente). En el 25% restante de las muestras, donde no hubo concordancia, el análisis de confianza y el perfil visual indicaron la necesidad de repetir el genotipado. Se concluye que la extracción de ADN a partir de pelo bovino con Chelex es un método promisorio para discriminar genotipos por HRM requiriéndose futuros trabajos con mayor número de muestras y mejorar las condiciones de amplificación.

Palabras claves: Pelo, SNP, HRM.

149

PURIFICACIÓN DE PROTEINAS DE UNIÓN A (TG/CA)n EN Trypanosoma

cruzi

GUGGERI, L. 1#, PASTRO, L.1#, DUHAGON, M. A.1, SMIRCICH, P.1, DALLAGIOVANNA,

B.2, WILLIAMS, N.3 Y GARAT, B.1

1 Laboratorio de Interacciones Moleculares. Facultad de Ciencias, Montevideo, 2 Instituto de Biología Molecular de Paraná. Brasil. 3 Department of Microbiology and Immunology. University at Buffalo USA. #contribuyeron igualmente a este trabajo

El protozoario parásito Trypanosoma cruzi es el agente etiológico de la

Trypanosomiasis Americana, que afecta a millones de personas en América Latina.

La biología molecular en tripanosomátidos presenta peculiaridades.

Los genomas eucariotas contienen un gran número de secuencias repetidas en

tándem que han sido vinculadas a diferentes procesos fisiológicos. Los repetidos de

dinucleótidos son particularmente abundantes en el genoma de T. cruzi.

En este trabajo, se busca profundizar en el rol de los elementos (TG/CA)n en la

regulación de la expresión génica en Trypanosoma cruzi. Nuestro grupo ha

propuesto que las secuencias (TG/CA)n constituyen una señal de regulación en este

parásito (Duhagon y col., 2003). Una de las aproximaciones elegidas para estudiar la

funcionalidad de estos repetidos, consiste en el análisis bioinformático de la

expresión y la función biológica de los genes que contienen estos elementos en cis.

A su vez, nos planteamos la identificación de los elementos que actúan en trans

mediante cromatografías de afinidad y análisis por espectrometría de masas

previamente utilizadas en el laboratorio para la caracterización de una proteína de

unión a los repetidos TG (Tc38). Actualmente, estamos estudiando las interacciones

de las proteínas purificadas y las secuencias repetidas a través de ensayos de

cambio de movilidad electroforética (EMSA). Resultados preliminares indican que

existen al menos tres complejos diferentes para cada repetido. Los complejos

formados no son desplazados por un anticuerpo específico para Tc38, lo cual

indicaría la existencia de otras proteínas que interaccionan con estos elementos.

150

Bioquimica , Biofisica y Biologia Estructural

ENTEROTOXINA LTB DE E.Coli ALTERA LA FUNCION CARDIACA EN

CORAZON AISLADO DE COBAYO.

COTA, C *; ROMPANI, J *, GARCIA, S *; FONTES, J; CHERONI, C, TORRES, H;

SCHMIDT, A; PUGLISI, J # Y FERREIRA, G.

* contribución equivalente. # Dept. Pharmacology.

Univ. California Davis. USA. Laboratorio de Canales Iónicos. Departamento de

Biofísica. Facultad de Medicina. Universidad de la República.

E.Coli, produce enterotoxinas resistentes (ST) o lábiles (LT) al calor, que se

clasifican en A y B. Estas toxinas guardan una homología bastante alta con sus

símiles producidos por Vibrio Cholerae. Clásicamente, se han atribuido losefectos

celulares y patológicos producidos por estas toxinas, a la fracción A de las mismas,

atribuyéndose a la fracción B un rol de transportador del tipo A. Recientemente, se

ha descrito que la fracción B es capaz de unirse a receptores de gangliósidos de

membranas celulares como GM1 (Marengo, 1998). Los cardiomiocitos tienen

abundantes receptores de gangliósidos, variables de acuerdo al tipo y estado

celular, acumulados en ciertas regiones, balsas lipídicas de membrana. Teniendo en

cuenta estos antecedentes y que la activación de GM1 puede producir una

alteración de los niveles de Calcio intracelular, se expusieron corazón y células

aisladas de cobayo a distintas concentraciones de la fracción LTB purificada. Los

resultados muestran que en corazón aislado, con aumento de la dosis de exposición

a LTB se produce: i) Un patrón de contracción alternada, donde el nivel intermedio

de tensión va disminuyendo cada vez menos, produciéndose finalmente varias

contracciones con niveles de tensión sostenidos ii) Un aumento y posterior

disminución de la frecuencia cardíaca iii) Alteraciones del electrograma de

superficie consistentes pero menos dramáticos que los efectos observados en

tensión. Todos los efectos son reversibles y capaces de ser lavados a concetraciones

bajas. La curva dosis-respuesta de ajuste por ec de Hill, muestra una dosis media de

0.2ug/ml, prácticamente igual que la de unión de GM1 a LTB in vitro. Un modelo de

corazón virtual, suponiendo alteraciones en manejo de Calcio intracelular,

reproduce lo observado. Los resultados obtenidos en corazón aislado fueron

consistentes con los de células aisladas e indican que LTB per se, es capaz de

producir alteraciones dramáticas de la función cardíaca.

151

ALTERACIONES EN VIABILIDAD Y MOTILIDAD DE ESPERMATOZOIDES HUMANOS ANTE EXPOSICION AGUDA A PLOMO.

FERREIRA, G *; TREVIÑO, C; OCAMPO, Y; DE BLAS, G; ORTA, G; GUERRERO, A,

MARTINEZ, P; BALDERAS, E Y DARSZON, A.

* Laboratorio de Canales Iónicos. Departamento de

Biofísica. Facultad de Medicina. Universidad de la República. URUGUAY

Departamento de Genetica del Desarrollo y Fisiologia Molecular. Instituto de

Biotecnologia. UNAM. MEXICO.

El espermatozoide humano, para tener éxito en su función de fecundación,

necesita de una serie de cambios adecuados que habitualmente tienen lugar en un

ambiente propicio, en el tracto genital femenino. Debido a sus características

fisiológicas y genético-moleculares, estas células son bastante sensibles a agentes

tóxicos y farmacológicos. Ha sido reportado que la intoxicación por metales

pesados origina en individuos afectados, graves trastornos de fertilidad. Los

espermatozoides maduros cuentan con un gran número de canales y

transportadores, algunos específicos y otros comunes con células de músculo

cardíaco. Dados estos antecedentes y teniendo en cuenta nuestros reportes

anteriores (Rompani y col, 2007a,b), decidimos estudiar como la exposición aguda

al Plomo origina estas fallas en fertilidad, valorando trastornos funcionales en

motilidad, viabilidad y vías de entrada de Plomo al espermatozoide. Respecto a la

letalidad, valorada mediante tincion por eosina, para un indice de letalidad

maxima o final de 100%, el Kd observado fue de 121uM y la cinetica´ ante 100uM

de Plomo, mostro un T1/2 de 1.44 hs. Respecto a los parámetros de motilidad

medidos por Computer Assisted Sperm Analysis, disminuyeron la frecuencia de

batido, la amplitud de desplazamiento lateral, la velocidad de desplazamiento y

porcentaje de hiperactivacion con Kds entre 90 y 400 uM. En contraste, aumento el

% de velocidad lineal de traslación, con Kd de aprox 70 uM. Estos cambios se

produjeron durante las primeras dos horas de exposición a Plomo. Bay K 8644

250nM aumenta y DHP 1uM disminuye parcialmente los efectos observados. Ante la

carga de espermatozoides con pigmentos fluorescentes sensibles a metales pesados

se observaron efectos consistentes, existiendo abolición total de la entrada de

Plomo ante la aplicación de Gd 1uM. Estos datos sugieren que la entrada de Plomo

al espermatozoide ocurre tanto por canales de Calcio L como por otros canales

permeables a Calcio (Trp).

152

MODELOS DE COMPLEJIDAD CRECIENTE PARA LA FORMACIÓN DE

RADICALES ETANOLAMINILO EN EL SITIO ACTIVO DEL SITEMA

EAL/COENZIMAB12.

SIGNORELLI, S.; BONANATA J.; COITIÑO, E. L.

Laboratorio de Química Teórica y Computacional, Instituto de Química Biológica,

Facultad de Ciencias, Universidad de la República.

Etanolamina amonio liasa (EAL) es un enzima presente en bacterias entéricas que

cataliza la conversión de etabolamina en amonio y acetaldehído, en presencia de

adenosilcobalamina (AdoCbl, una coenzima B12).1 El mecanismo global de reacción

más aceptado incluye: (a) formación de radicales 5-desoxiadenosilo (Ado·) por

homólisis del enlace Co-C en AdoCbl; (b) activación del sustrato por abstracción de

H en C1 por Ado·.; (c) migración 1,2 de –NH2 en el radical sustrato; (d) regeneración

de Ado· y su recombinación (e) eliminación de NH3 formando acetaldehído.1-3

Los primeros pasos vienen siendo objeto de numerosos estudio experimental, siendo

además modelados a nivel ab-initio y DFT con distintas representaciones del entorno

proteico, intentando explicar la cinética observada mediante protonación parcial

por His o por catálisis “push-pull” asistida por dos aminoácidos del enzima.2b-c,3b-c En

éstos modelos se recortó drasticamente el sistema reaccionante y su entorno,

principalmente debido al desconocimiento de la estructura 3D de la EAL, en parte

elucidada más recientemente.

Nuestro grupo viene investigando los efectos del entorno sobre el mecansimo

detallado y cinética de b y c con el modelo continuo PCM-IEF (que no requiere

detallar su naturaleza discreta), contrastando los resultados así obtenidos con

aquellos publicados por los grupos de Scahwart2 y Radom3 quienes modelaron en fase

gaseosa al sustrato y recortes del radical Ado· y de los aminoácidos asistentes. Aquí

examinaremos a nivel B3LYP/6-31G(d,p) qué influencia tiene cambiar la descripción

molecular del paso b (particularmente atractivo por experimentar efecto túnel) en

una progresión de modelos moleculares de complejidad creciente para reactivos,

productos, complejos intermediarios y estado de transición de la transformación,

caracterizados sin/con protonación. Conjugando este conocimiento con el de la

estructura 3D de la EAL proponemos cuáles serían los residuos participantes en caso

de ocurrir asistencia por protonación parcial simple o de tipo push-pull.

[1] a) Chemistry and Biochemestry of B12, R. Banerjee (ed.), 1999; b) T. Toraya,

Chem. Rev. 2003 101, 2095-2127.

[2] a) M. Semijaljac, H.Schwartz, Chem. Eur. J. 2004 10, 2781-2788; b) 2003 J. Org.

Chem. 68, 6967-6983; 2002 J. Am. Chem. Soc. 124, 8974-8983.

[3] a) G. M. Sandala, D. M. Smith, L. Radom, J. Am. Chem. Soc. 2005 127, 8856-

8864; b) S. D. wetmore, D. M. Smith, J. T. Bennett, L. Radom, J. Am. Chem. Soc.

2002 124, 14054-14065.

[4] Joint Center for Structural Genomics, 2007 (no publicado; depositado en RCSB

PDB Databank, código 2qez).

153

Bioquimica y Biologia Molecular de Microorganismos.

EXPRESIÓN DE ENZIMAS MANGANESO DEPENDIENTES DE

Phanerochaete chrysosporium EN FUNCIÓN DE CONDICIONES DE

CULTIVO.

IBÁÑEZ C.1, BARRACO M.2, CERDEIRAS M.2 Y CECCHETTO G.3

1 Unidad Académica de Gestión Tecnológica, Facultad de Química; 2 Microbiología,

Facultad de Ciencias; 3 Cátedra de Microbiología, Facultad de Química, Universidad

de la República. Montevideo Uruguay

Uno de los más importantes agentes bióticos causantes del deterioro de la madera

son los hongos de la podredumbre blanca. Estos basidiomycetes se caracterizan por

poseer un sistema enzimático capaz de degradar los tres componentes

constitutivos de la madera, la celulosa, hemicelulosa y la lignina. En particular, su

sistema ligninolítico está formado por cuatro enzimas: una lacasa (Lac) y tres

peroxidasas con distintos potenciales de oxidación, pertenecientes al metabolismo

secundario, manganeso peroxidasa (MnP), lignino peroxidasa (LiP) y peroxidasa

versátil (VP).

Este trabajo forma parte de una investigación en curso que estudia la aplicación de

una solución rica en Zn y Mn, obtenida de un proceso de reciclado, como

preservante para madera. Se va a analizar el efecto de los mencionados metales

sobre la expresión enzimática de las MnP empleando PCR en tiempo real, iniciando

el análisis con el Phanerochaete chrysosporium, microrganismo modelo, cuya

producción enzimática depende fuertemente de las condiciones de cultivo. El

primer paso que se presenta es la realización de cinéticas de expresión de cultivos

en medios de diferente composición y diferentes condiciones de incubación, con el

objetivo de determinar las condiciones y los tiempos de mayor expresión de los

genes mnp y de la actividad enzimática respectiva en los que posteriormente se

analizará el efecto de los metales. Se compara el efecto de un medio rico (RB) con

medios en las denominadas condiciones ligninolíticas, carencia de carbono (CLB) o

de nitrógeno (NLB), las temperaturas de cultivo son 28°C y 37°C.

La actividad enzimática se determina espectrofotometricamente. La expresión

génica por PCR cuantitativa en tiempo real, empleando como gen de referencia el

de la gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa (Gpd). Los resultados de estos

ensayos se vinculan con las determinaciones de actividad enzimática realizadas

sobre las mismas condiciones de cultivo.

154

Parasitología Molecular

ANÁLISIS DE PROTEÍNAS DE TEGUMENTO DE FASCIOLA HEPATICA INVOLUCRADAS EN LA RESPUESTA DEL HOSPEDADOR OVINO

BASIKA, T.1,2, BERNAL, D.3, VALERO, L.4, SÁNCHEZ DEL PINO, M.M.4, ACOSTA, D1.,

CARMONA, C.1 & MARCILLA, A.2

1Unidad de Biología Parasitaria, Instituto de Higiene, UdelaR, Montevideo, Uruguay; +5982 4801597; tbasika@higiene.edu.uy; 2Departamento de Biología Celular y Parasitología, Facultat de Farmacia, Universitat de Valencia (Valencia, España), 3Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Biológicas, Universitat de Valencia (Valencia, España); 4Servicio de Proteómica, Centro de Investigación “Príncipe Felipe” (Valencia, España); Con el objetivo de identificar las proteínas de tegumento de Fasciola hepatica involucradas en la respuesta del hospedador ovino se han analizado por técnicas de proteómica (electroforesis en geles bidimensionales, espectrometría de masas e inmunodetección con sueros de ovinos infectados experimentalmente) los materiales liberados del parásito mediante tratamiento con deoxicolato sódico. Se han realizado ensayos utilizando tiras de gradiente de pH inmovilizado (IPG) de 3-10 y de pH 5-8. Los resultados obtenidos muestran que las proteínas del tegumento fueron resueltas en aproximadamente 16 manchas con pI comprendidos entre 5.7 y 7.7 y con pesos moleculares (PM) comprendidos entre 20 y 77 kDa. Comparativamente, en extractos totales del parásito las proteínas mayoritarias fueron resueltas en aproximadamente 19 manchas con pI entre 5.4 y 7.7, y con PM entre 19 y 86 kDa. El análisis por inmunoblot ha detectado varias manchas inmunogénicas detectadas por los sueros de ovejas infectadas experimentalmente con F. hepatica (procedentes de Uruguay), que han sido cortadas y enviadas para su identificación por espectrometría de masas. Estudio financiado por Vicerrectorado de Relaciones Institucionales y Cooperación de la Universitat de València-Estudi General – Fundació General de la Universitat de València y PROMETEO/2009/081 de la Generalitat Valenciana (Valencia, España).

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AUSPICIANTES

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