COMPARACIÓN DE METODOLOGÍAS DE ISÓTOPOS PARA EVALUAR FIJACIÓN DE N ATMOSFÉRICO Y SU DESTINO EN SUELOS Y PLANTAS

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RESUMEN

El uso del isótopo estable 15N es considerado una herramienta

indispensable para investigar la fijación de N2 atmosférico por

leguminosas y para trazar el destino de fertilizantes nitrogenados

en sistemas suelo y planta. En este trabajo se describen los méto-

dos más comúnmente usados para determinar el proceso de fija-

ción de nitrógeno por leguminosas forrajeras y se destacan las

diferencias más importantes entre ellos. A fin de entender las

técnicas isotópicas disponibles, la revisión describe detallada-

mente los métodos de abundancia natural de 15N, la dilución

isotópica de 15N, la técnica de diferencia de N, la determinación

de reducción de acetileno y el método de ureidos. Aunque se acep-

ta que no existe un método perfecto para evaluar la fijación de

N2, se considera útil una descripción detallada de las técnicas

disponibles, que facilite la selección del método más conveniente

según las condiciones específicas del experimento. Se mencio-

nan las ventajas y desventajas y se discute la aplicación de los

métodos. Se destaca que una cuidadosa elección del método dará

resultados más precisos y confiables, lo que a su vez disminuirá

la probabilidad de errores.

Palabras clave: Fijación de N2, isótopos estables, sistemas suelo/

planta.

INTRODUCCIÓN

El nitrógeno es el constituyente más abundante deun gran número de compuestos esenciales queintervienen en el funcionamiento de múltiples or-

ganismos biológicos, y la deficiencia de este elementoen las plantas limita su productividad primaria. Sin em-bargo, la molécula inerte de N2 (nitrógeno atmosférico)no es utilizable por la mayor parte de los sistemas bioló-gicos, ya que éstos sólo pueden usar el “nitrógeno com-binado”, es decir aquél que está ya asociado con otroselementos para formar iones tales como el amonio (NH4

+)o nitrato (NO3

−). Así pues, las plantas dependen del N

COMPARACIÓN DE METODOLOGÍAS DE ISÓTOPOS PARA EVALUAR FIJACIÓNDE N ATMOSFÉRICO Y SU DESTINO EN SUELOS Y PLANTAS

COMPARISON OF ISOTOPE METHODOLOGIES TO ASSESS N2 FIXATION AND ITSFATE IN PLANTS AND SOILS

Braulio Valles-de la Mora1, Georg Cadisch2 y Andrés Aluja-Schunemann3

1Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Ganadería Tropical (CEIEGT). FMVZ-UNAM,Martínez de la Torre, Veracruz, 93600 México. ([email protected]). 2Imperial College atWye, University of London., Wye, Ashford, Kent, England. ([email protected]). 3ANUIES, Re-gión Sur-sureste, Mérida, Yucatán ([email protected])

Recibido: Julio, 2002. Aprobado: Diciembre, 2002.Publicado como ENSAYO en Agrociencia 37: 117-128. 2003.

ABSTRACT

The use of the stable isotope 15N is considered an indispensable

tool to study N2 fixation by plant legumes and trace the path of

nitrogen fertilizer in soil and plant systems. This paper describes

the most common methods used to assess the N2 fixation process

by forage legumes and highlights the most important differences

among them. A revision of the natural 15N abundance, 15N isotope

dilution, N-difference technique, the acetylene reduction assay

(ARA) and ureides methods is reviewed here in order to understand

the different available techniques. Although there is no absolute

method by which the N2 fixation can be tested, a detailed

description of the available methods is necessary in order to select

the most convenient according to specific experimental conditions.

Advantages and drawbacks of the different methods are discussed,

as well as their applicability. A careful choice of the method will

give more reliable and accurate results, and guidelines are given

for each one of the mentioned methods in order to diminish

potential errors.

Key words: N2 fixation, stable isotopes, plant/soil systems.

INTRODUCTION

Nitrogen is the most abundant component of agreat number of essential compounds that takepart in the functioning of multiple biological

organisms, and the deficiency of this element in the plantslimits its primary productivity. Nevertheless, the inertmolecule of N2 (atmospheric nitrogen) is not usable bymost of the biological systems, since these only can usethe combined nitrogen, that is already associate with otherelements to form ions such as the ammonium (NH4

+) ornitrate (NO3

−). Therefore, the plants depend on the presentN in more reactive combinations. This biologically usableN includes only a small fraction of the total N present inthe earth. Here the N2 fixation process acquiresimportance, because it is involved in the transformationof the greatest volume of atmospheric N2 to formsusable by the plants. It has been calculated that around

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presente en combinaciones más reactivas. Este N bioló-gicamente utilizable comprende sólo una pequeña frac-ción del N total presente en la tierra. Aquí el proceso defijación de N2 adquiere su importancia al ser responsablede la transformación del mayor volumen de N2 atmosfé-rico a formas utilizables por las plantas. Se ha calculadoque alrededor de 100 millones t de N combinado estándisponibles para la biosfera cada año por este proceso(Lewis, 1986).

Métodos para determinar la fijaciónde N2 atmosférico

Isótopos estables de nitrógeno

El isótopo más común del N tiene un peso atómicode 14, aunque existe un isótopo más pesado (15N), quecontiene un neutrón más que el núcleo de la forma abun-dante (14N). Aunque las características químicas de losátomos en 15N y 14N son idénticas, existen pequeñas di-ferencias cuantitativas debido a sus diferentes masas ydiferentes energías de activación. La concentración de15N en el aire es muy estable y constituye 0.3663%(Mariotti, 1983); ese valor tiene una variación de±0.0004% (Axmann y Zapata, 1990). A esta concentra-ción se le denomina abundancia natural.

Aunque la existencia del 15N fue demostrada en 1929(Middelboe y Johansen, 1990), su aplicación ha sido másintensa en las últimas tres décadas mediantemetodologías que utilizan la espectrometría de masasde flujo de isótopos. Ya que los fertilizantes nitrogenadoshan contribuido al incremento de la producción agríco-la, el empleo del isótopo estable de 15N ayuda a detec-tar, medir y rastrear el destino del fertilizante y el N delos residuos en plantas y suelo. La rápida expansión deluso de isótopos estables ha originado un mejoramientoen los equipos de detección y en las técnicas analíticas.Los isótopos estables tienen la ventaja de estar presen-tes en forma natural, y los cambios en su distribución yabundancia natural en plantas y suelos ofrecen informa-ción relevante relacionada con el funcionamiento de losecosistemas.

La evaluación precisa del N simbióticamente fijadopor leguminosas es esencial para determinar la funciónde estas especies en el mejoramiento de agroecosistemaso en el mantenimiento de los niveles de N en el suelo. Elproblema central en la cuantificación del N simbiótica-mente fijado es la selección del método apropiado. Nin-gún método puede determinar la cantidad de N sin in-troducir algún error inherente al método (Hauser, 1992).Chalk y Ladha (1999) mencionan que la principal difi-cultad es la elección de la planta de referencia no fijadorade N que debe emplearse en este proceso. Bergersen(1980) resumió las dificultades para evaluar el contenido

100 million t of combined N is available for the biosphereevery year by this process. (Lewis, 1986).

Methods to assess atmospheric N2 fixation

Stable nitrogen isotopes

The most common isotope of the N has an atomicweight of 14, although a heavier isotope exists (15N),which contains a neutron more than the nucleus of theabundant form (14N). Although the chemicalcharacteristics of atoms in 15N and 14N are identical, thereare small quantitative differences due to its differentmasses and different activation energies. Theconcentration of 15N in the air is very stable (Mariotti,1983) and constitutes the 0.3663%; this value has avariation of ±0.0004% (Axmand and Zapata, 1990). Thisconcentration is named natural abundance.

Although the existence of 15N was proven in 1929(Middelboe and Johansen, 1990), its application has beenmore intense in the last three decades with thedevelopment of new methodologies that use the flow-isotope mass spectrometry. Since the nitrogen fertilizershave contributed to the increase of the agriculturalproduction, the use of the stable isotope of 15N aid todetect, to measure and to track the fate of the N fertilizerand the residual N in plants and soil. The rapid expansionin the stable isotope use has originated an improvementin the detection instruments and analytical techniques.The stable isotopes have the advantage of being presentin natural form, and changes in their distribution andnatural abundance in plants and soils offer excellentinformation related to the functioning of the ecosystems.

The precise determination of the N symbioticallyfixed by legumes is essential to determine the role ofthese species in the improvement of agroecosystems orthe maintenance of the N levels in the soil. The centralproblem in the quantification of the N symbiotically fixedis the selection of the appropriate method. No methodcan determine the amount of N without introducing someinherent error to the method (Hauser, 1992). Chalk andLadha (1999) mention that the main difficulty is theelection of the non-fixing N reference plant that must beused in this process. Bergersen (1980) summarized thedifficulties to determine the N fixed and emphasized thatconsiderable losses occurs by denitrification or leaching;also, the variability in the content of the biologicalmaterial increases the analytical errors.

The use of the isotope 15N in the nitrogen fixation

Methods with 15N have been used to know thebiochemistry of the N2 fixation, to study the factors whichaffect the N2 fixation, to evaluate the capacity of

VALLES DE LA MORA et al.: METODOLOGÍAS DE ISÓTOPOS PARA EVALUAR FIJACIÓN DE N ATMOSFÉRICO 119

de N fijado y destacó que pérdidas considerables ocu-rren por desnitrificación o por lixiviación; además, lavariabilidad en el contenido del material biológicoincrementa los errores analíticos.

El uso del isótopo 15N en la fijación de nitrógeno

Los métodos con 15N se han utilizado para investi-gar la bioquímica de la fijación del N2, para estudiar losfactores que afectan la fijación del N2, evaluar la capa-cidad de microorganismos para fijar N2, medir el des-plazamiento de N2 simbióticamente fijado, en estudiosdel balance de N, y la calibración de la técnica para lareducción de acetileno.

La abundancia de 15N en cualquier medio es medidamediante el análisis de una planta de referencia (no-fijadora de N2), la cual es totalmente dependiente del Ndel suelo para su crecimiento. La fijación de N2 puedeser determinada por los cambios en el enriquecimientode 15N en una planta-fijadora debido a la asimilación deN2 atmosférico de bajo enriquecimiento. También pue-de usarse N sin 15N (N privado de 15N), pero el empleode este material es más delicado debido a riesgos de con-taminación, aunque su costo es menor que el 15N enri-quecido. El uso de 15N para medir la proporción de N2

tiene la ventaja de no ser dependiente del rendimientocosechado. Existen limitaciones inherentes en la utili-zación del 15N: (1) baja disponibilidad de espectrómetrosde masas en países en desarrollo; (2) restricciones parautilizar 15N en fase gaseosa en experimentos de campoy en experimentos de largo plazo debido a la dificultadpara mantener constantes las condiciones de fase gaseosaen un sistema cerrado; (3) es necesario determinar elnivel de enriquecimiento de 15N a utilizar; (4) debe co-nocerse la sensibilidad y la reproducibilidad de las me-diciones de 15N antes de diseñar el experimento; (5) debeconocerse el contenido de nitrógeno del material expe-rimental; (6) altos costos de equipo para medir 15N, asícomo del fertilizante enriquecido y, (7) se requiere unalto nivel de entrenamiento del personal para evitar con-taminaciones cruzadas.

El método de la dilución del 15N

El método de dilución de 15N permite evaluar cadauna de las diferentes fuentes de N en la planta, y es elmás usado para medir fijación de N2. El método requie-re la aplicación al suelo de una pequeña dosis de fertili-zante enriquecido con 15N previo a la siembra: 1-10 kgN ha-1 con 1 a 10 % de exceso de átomos 15N, a fin dereducir cualquier interferencia con la fijación de N2 dela leguminosa. El enriquecimiento de las muestras deplantas se expresa como porcentaje de átomos 15N enexceso, y se estima de la siguiente forma:

microorganisms to fix N2, to measure the displacementof N2 symbiotically fixed, to determine N balance, andfor calibration of the technique for the acetylenereduction.

The abundance of 15N in any environment isdetermined by analysis of a reference plant (non-fixingN2 plant), which is totally dependent upon the soil N forits growth. The N2 fixation can be determined by thechanges in the enrichment of 15N in the fixing plant dueto the assimilation of atmospheric N2 of low enrichment.Also 15N-depleted material (N deprived of 15N) can beused, but its use is more difficult due to contaminationrisks, although its cost is lower than the 15N enriched.Using 15N to measure the proportion of N2 has theadvantage of not being dependent upon the harvestedyield. There are inherent limitations in the use of 15N: (1)low availability of mass spectrometers in developingcountries; (2) restrictions to use 15N in gaseous phase infield experiments, as well as in long-term experimentsbecause it is difficult to maintain constant conditions forthe gaseous phase in a closed system; (3) it is necessaryto determine the level of enrichment of 15N to use; (4)sensitivity and reproducibility of the measurements of15N must be known before designing the experiment; (5)the nitrogen content of the experimental material mustbe known; (6) high costs of equipment to measure 15N,as well as of the enriched fertilizer and, (7) a high levelof training of the personnel is required to avoid cross-contaminations.

The method of the 15N-dilution

The method of 15N-dilution allows to evaluate eachone of the different N-sources in the plant, and it is themost used to determine fixation of N2. The methodrequires the application to the soil of a small dose offertilizer enriched with 15N before sowing: 1-10 kg Nha-1 with 1 to 10 atom % 15N in excess, in order to reduceany interference with the fixation of N2 of the legume.The enrichment of the samples of plants is expressed aspercentage of atoms 15N in excess, and it is determinedas follows:

% atom 15N excess = (% atom 15N sample − % atom 15Nin N2 air) (1)

where % of atoms of 15N in air N2 is 0.3663.

The proportion of the N of the plant that is derivedfrom the atmospheric N2 and the N of the soil, can becalculated if the isotopic abundance between these twosources is different. This is obtained comparing theenrichment in 15N of nodulated legume with non-fixingN2 reference plants.


% átomos 15N en exceso = (% átomos 15N muestra − %átomos 15N en N2 del aire) (1)

donde el % de átomos de 15N en el N2 del aire es0.3663.

La proporción del N de la planta que es derivada delN2 atmosférico y del N del suelo puede ser calculada sila abundancia isotópica entre estas dos fuentes es dife-rente. Esto se logra comparando el enriquecimiento en15N de leguminosas noduladas con plantas de referenciano fijadoras de N2.

La siguiente ecuación, tomada de McAuliffe et al.(1958), se puede utilizar para evaluar el porcentaje de Natmosférico fijado de la leguminosa (P):

% átomos 15N en exceso en legP = 1− × 100 (2)

% átomos 15N en exceso en ref

El porcentaje de átomos de 15N en el N derivado delsuelo en la leguminosa se mide a partir del porcentajede átomos de 15N de una planta de referencia no fijadorade nitrógeno que crece en el mismo suelo y en el mismoperiodo que la leguminosa.

En el método se supone que: (1) la relación 14N/15Nde la planta no fijadora es la misma que la del N delsuelo; (2) la leguminosa y la planta de referencia explo-ran el mismo volumen de suelo de idéntica relación 14N/15N; (3) ambas plantas deben absorber la misma canti-dad relativa del 15N añadido y de N del suelo y, (4) quela dinámica de absorción es la misma.

Salgado et al. (2001) compararon esta técnica y lade diferencia total de N para evaluar la eficiencia de re-cuperación de nitrógeno en caña de azúcar (Saccharumofficinarum L.) utilizando varias fuentes de N marcadascon 15N, en una zona cañera de Tabasco, México. Ellosencontraron que la eficiencia en la recuperación del Naplicado, determinada por el método de la diferenciatotal, fue mayor que la determinada por el métodoisotópico. En el mismo Estado, pero en la región PlanChontalpa, Espinoza-Flores et al. (2002) evaluaron laeficiencia de la fertilización nitrogenada en sorgo(Sorghum bicolor) por medio de la técnica isotópica de15N para medir la abundancia de este isótopo en tallos,hojas y grano a diferentes etapas fenológicas; los resul-tados para eficiencia de la fertilización nitrogenada fue-ron confiables.

Ledgard y Peoples (1988) y Peoples et al. (1989)mencionaron que los errores más frecuentes para medirla fijación de N2 ocurren cuando la leguminosa y la plantade referencia difieren en la relación del N absorbido pro-veniente del 15N con aquél tomado del suelo. Esto fueobservado por Gil et al. (1997), cuando utilizaron

The following equation, taken from McAuliffe et al.(1958), may be used to determine the atmosphericpercentage of fixed N of the legume (P):

% atom 15N in excess in legP = 1− × 100 (2)

% atom 15N in excess in ref

The percentage of atoms of 15N in the N derived fromthe soil in the legume is determined from the percentageof atoms of 15N of a non-fixing reference plant that growsin the same soil and in the same period that the legume.

In the method it is supposed that: (1) relation 14N/15Nof the non-fixing plant is the same as in the N of the soil;(2) the legume and the reference plant explore the samevolume of soil with identical relation 14N/15N; (3) bothplants must absorb the same relative amount of 15N addedand N of the soil, (4) that the absorption dynamics is thesame.

Salgado et al. (2001) compared this technique andthe one of the total N-difference to evaluate the efficiencyof sugarcane (Saccharum officinarum L.) nitrogenrecovery using several labeled 15N sources, in a sugarcanezone of Tabasco, México. They found that the efficiencyin the recovery of the applied N, determined by the totalN-difference method, was greater than that of the isotopicmethod. In the same State, but in the Plan Chontalparegion, Espinoza-Flores et al. (2002) evaluated theefficiency of the nitrogen fertilization in sorghum(Sorghum bicolor) using the isotopic technique of 15N tomeasure the abundance of this isotope in stems, leavesand grain at different phenologic stages; the results werereliable for efficiency of the nitrogen fertilization.

Ledgard and Peoples (1988) and Peoples et al. (1989)mentioned that the most frequent errors to measure theN2-fixation occurs when the legume and the referenceplant differ in the relation of the absorbed N originatedfrom 15N with that taken from the soil. This was observedby Gil et al. (1997), when they used Brachiariahumidicola as a non-fixing grass in pastures associatedwith the forage legumes Centrosema pubescens, Puerariaphaseoloides or Stylosanthes hamata. They observed anunequal pattern of N uptake from the soil between speciesand, therefore, measurements of the N2-fixed wereerroneous.

Previously, Wagner and Zapata (1982) approachedthe problem of the suitable reference crop for studies ofnitrogen fixation using the isotopic technique of doublelabeling (labeling of the soil with 15N and 35S). Theseresearchers used faba bean (Vicia faba) and soybean(Glycine max) as N2-fixing species; they determined thesymbiotic fixation of N using Sudan grass (Sorghumsudanense) radish (Raphanus sativus) and barley(Hordeum vulgare) as reference plants. The interval of


Brachiaria humidicola como gramínea no fijadora enpraderas asociadas con las leguminosas forrajerasCentrosema pubescens, Stylosanthes hamata o Puerariaphaseoloides. Ellos observaron un patrón desigual detoma de N del suelo entre especies y, por lo tanto, fue-ron erróneas las mediciones del N2 fijado.

Wagner y Zapata (1982) abordaron el problema delcultivo de referencia idóneo para estudios de fijación denitrógeno usando la técnica isotópica de doble marcaje(marcaje del suelo con 15N y 35S). Estos investigadoresemplearon haba (Vicia faba) y soya (Glycine max) comoespecies fijadoras de nitrógeno y determinaron su fija-ción simbiótica usando como plantas de referencia zacatesudán (Sorghum sudanense) rábano (Raphanus sativus)y cebada (Hordeum vulgare). El intervalo de fijación deN fue de 74 a 83% y concluyeron que los tres cultivosde referencia fueron satisfactorios para los propósitosindicados.

En vista de la importancia de la selección apropiadade una planta no fijadora de N2, Thomas et al. (1997)realizaron un experimento usando Brachiariadictyoneura como gramínea acompañante. Ellos califi-caron como satisfactoria a esta planta no fijadora de N2

al cotejarla con las leguminosas Stylosanthes capitata,Centrosema acutifolium y Arachis pintoi. La técnica dela dilución del isótopo 15N también fue utilizada porCadisch et al. (1989) para evaluar el efecto del aportede P:K en la fijación de N2 en ocho leguminosasforrajeras tropicales. Encontraron que suelo pobre en Py K la fijación de N2 se redujo, y reportaron considera-bles diferencias entre especies en el N derivado de laatmósfera. Algunas desventajas del método de diluciónde 15N son el alto costo del fertilizante enriquecido, lareducción (en el tiempo) del enriquecimiento de 15N delN del suelo disponible para la planta, la distribución no-uniforme de 15N (Witty y Ritz, 1984), y la contamina-ción cruzada. Estos efectos conducen a errores impor-tantes si la toma de N, en tiempo y espacio, por las plan-tas de referencia no fijadoras difiere de aquél que tomala leguminosa (Ledgard et al., 1985).

El método de la abundancia natural del 15N

Este método es una variación de la técnica de dilu-ción de isótopos, basada en pequeñas diferencias en laabundancia natural de 15N entre el N2 atmosférico(0.3663% átomos 15N) y el N del suelo. Estas diferenciasse expresan como delta (δ)15N o partes por mil (‰) rela-tivo a la composición de 15N en el N2 atmosférico (Shearery Kohl, 1986) y se calcula de la siguiente forma:

% átomos 15N (muestra) – % átomos 15N (std)δ 15N(‰) = × 1000 (3)

% átomos 15N (std)

N fixation was 74 to 83% and they concluded that thethree reference plants were satisfactory for theirobjectives.

Since the appropriate selection of a non-fixing N2

plant is important, Thomas et al. (1997) carried out anexperiment using Brachiaria dictyoneura asaccompanying grass. They found that this non-fixing N2

plant was satisfactory when matched with the legumesStylosanthes capitata, Centrosema acutifolium andArachis pintoi. The technique of the 15N isotope dilutionalso was used by Cadisch et al. (1989) to determine theeffect of the contribution of P:K in the fixation of N2 ineight tropical forage legumes. They found that in soillow in P and K the N2-fixation was reduced, and reportedlarge differences among species in the N derived fromthe atmosphere. Some disadvantages of the dilution of15N method are the high cost of the enriched fertilizer,the reduction (in the time) of the enrichment of 15N ofthe N of the soil available for the plant, the non-uniformdistribution of 15N (Witty and Ritz, 1984), and the cross-contamination. These effects lead to mistakes if the Nuptake, in time and space, by the reference non-fixingplants differs from the legume uptake (Ledgard et al.,1985).

Natural 15N abundance method

This method is a variation of the isotope dilutiontechnique, based on small differences in the naturalabundance of 15N between atmospheric N2 (0.3663%atoms 15N) and the soil N. These differences are expressedas delta (δ)15N or parts by thousand (‰) relative to thecomposition of 15N in the atmospheric N2 (Shearer andKohl, 1986) and it is calculated as follows:

% atom 15N (sample) – % atom 15N (std)δ 15N(‰) = × 1000 (3)

% atom 15N (std)

where (std) is the standard atmospheric abundance of 15N,that is, 0.3663% atoms of 15N. Therefore, by definition,the value of d15N of the N2 of the air is equal to zero.

Shearer and Kohl (1986) mentioned that soils aremore enriched in 15N (range of δ15N=−6 to +16%) incomparison to the atmospheric N2 (δ15N=0%); thisenrichment is due to the isotopic discrimination in theprocesses of volatilization of ammonium, nitrification,denitrification and other N transformations in the soil.Since 15N is heavier than 14N, the compounds with 15Ntend to react more slowly. The net effect is that throughtime, the soil becomes slightly more enriched with 15N,and these differences, in fixing and no-fixing plants, areused to calculate the fixed N2.


donde el (std) estándar es la abundancia de 15N atmosfé-rico, es decir 0.3663% átomos de 15N. Por consiguiente,por definición el valor de δ15N del N2 del aire es igual acero.

Shearer y Kohl (1986) mencionan que los suelos es-tán más enriquecidos en 15N (intervalo de δ15N= −6 a+16‰) en comparación con el N2 de la atmósfera(δ15N=0‰) y este enriquecimiento se debe a la discri-minación isotópica en los procesos de volatilización deamonio, nitrificacion, denitrificación y otras transfor-maciones del N en el suelo. Ya que el 15N es más pesadoque el 14N, los compuestos con el primero tienden a re-accionar más lentamente. El efecto neto es que a travésdel tiempo el suelo se vuelve ligeramente más enrique-cido con 15N, y estas diferencias, en plantas fijadoras yde referencia, son usadas para calcular el N2 fijado.

El porcentaje (P) de N2 atmosférico que es fijadopor la leguminosa se calcula mediante la siguiente ecua-ción (4) propuesta por Bergersen y Turner (1983) yLedgard et al. (1985):

δ 15N ref − δ 15N legP = × 100 (4)

δ 15N ref − B

donde B es el δ 15N de la leguminosa que crece con N2

atmosférico como la única fuente de nitrógeno, δ 15Nref y δ 15N leg son las unidades de d 15N (%) para lasplantas no fijadoras (referencia) y leguminosa.

Considerando que el N del suelo es generalmentemás abundante en 15N que el N2 atmosférico, se espera-ría que las plantas no fijadoras, en las que la fuente pri-maria de N es el derivado del suelo, tuvieron más 15Nque las plantas fijadoras que toman el N2 de la atmósfe-ra así como del suelo.

La separación de los isótopos 15N y 14N se puedehacer mediante espectrometría de emisión o de masas.La ventaja de los espectrómetros de alta precisión es sucapacidad de medir diferencias extremadamente peque-ñas en abundancia isotópica entre el material experimen-tal y un estándar del nitrógeno (Robinson y Smith, 1991).

Ledgard y Peoples (1988) mostraron resultados si-milares entre la técnica de la abundancia natural de 15Ny aquéllas que usan enriquecimiento artificial con 15N.Algunas ventajas y limitaciones del método de la abun-dancia natural de 15N son mencionadas por Peoples etal. (1989).

Ventajas: (1) no requiere la adición de 15N; (2) el δ15Ndel N del suelo disponible para las plantas puede serrelativamente constante con la profundidad y tiempo y,(3) la selección de las plantas de referencia puede ser de

The percentage (P) of atmospheric N2 that is fixedby the legume is calculated following the equation (4)proposed by Bergersen and Turner (1983) and Ledgardet al. (1985):

δ 15N ref − δ 15N legP = × 100 (4)

δ 15N ref − B

where B is the d15N of the legume that grows withatmospheric N2 as the only nitrogen source, d15N ref andd15N leg are the units of d15N (‰) for the non-fixingreference plant and legume.

Considering that soil is N generally more abundantin 15N than the atmospheric N2, it would be expected thatthe non-fixing plants in which the primary N source isthat derived from the soil, would have more 15N than thefixing plants which take N2 from the atmosphere and thesoil.

The separation of isotopes 15N and 14N can be doneby mass spectrometry or spectrometry of emission. Theadvantage of high precision spectrometers is its capacityto measure extremely small differences in isotopicabundance between the experimental material and a Nstandard (Robinson and Smith, 1991). Ledgard andPeoples (1988) showed similar results between the natural15N abundance technique and those using artificialenrichment with 15N. Some advantages and limitationsof the method of the natural 15N abundance are mentionedby Peoples et al. (1989).

Advantages: (1) it does not require the addition of 15N;(2) the δ15N of the N of the soil available for the plantscan be relatively constant with depth and time and, (3)the selection of the reference plants can be of minorimportance than in studies with 15N enriched, althoughin some cases it is necessary to take precautions whenmatching reference plants with N2-fixing plants (Cadischet al., 2000).

Limitations: (1) requirement of a precise massspectrometer and meticulous analytical procedures; (2)it is needed to measure the factor of discrimination (Bvalue) in the legumes during the N2-fixation; (3) thetechnique is insensible if the δ15N of the soil is near theδ15N of the air, and it is suggested that the δ15N of thesoil be >5 and, (4) the field variability can be considerablein some cases.

In order to reduce the effect of field variability,Unkovich et al. (1994) suggested a method of pairedsampling in systems of associated pastures, v.gr., by eachsample of legume, a grass sample from a bordering zoneis taken.


menor importancia que en estudios con 15N enriqueci-do, aunque en algunos casos es necesario tomar precau-ciones al cotejar plantas de referencia con las plantasfijadoras (Cadisch et al., 2000).

Limitaciones: (1) se requiere un espectrómetro de ma-sas preciso y procedimientos analíticos meticulosos; (2)se necesita medir el factor de discriminación (B value)en las leguminosas durante la fijación de N2; (3) la téc-nica es insensible si el δ15N del suelo es cercano al δ15Ndel aire y se sugiere que el δ15N del suelo sea >5 y, (4) lavariabilidad en el campo puede ser considerable en al-gunos casos.

Para reducir el efecto de variabilidad en el campo,Unkovich et al. (1994) sugirieron un método de muestreoapareado en sistemas de pasturas asociadas, v.gr., porcada muestra de leguminosa se toma una muestra de unagramínea aledaña.

Una deficiencia del método de abundancia naturalde 15N es que una pequeña variación en el δ15N corres-ponde comparativamente a una enorme diferencia en lafijación de N2 (Vose et al., 1981). Sin embargo se hausado este método de manera exitosa para determinar lafijación de N2 en leguminosas forrajeras y de grano(Cadisch et al., 2000; Cadisch et al., 1993; Hossain etal., 1995; Sanford et al., 1995; Bolger et al., 1995).

El método de la diferencia total de N

El método está basado en el rendimiento total del Nde la leguminosa, así como de la planta de referenciaque crece en el mismo suelo (Giller y Wilson, 1991). Lasubstracción del N en la planta de referencia de aquél enla planta fijadora dará un estimado del N2 fijado.

Peoples y Herridge (1990) mencionaron dos reque-rimientos básicos del método: (1) el N en la planta dereferencia proviene sólo del suelo y, (2) la leguminosa yla planta de referencia absorben la misma cantidad de Ndel suelo. Ellos sugirieron que las dos plantas debenexplorar idealmente el mismo volumen en la zona de lasraíces, tener la misma capacidad de extraer y utilizar elN mineral del suelo, y acumular el N del suelo en elmismo periodo. Las comparaciones de este método conlos de abundancia natural de 15N o de dilución de 15Nhan producido resultados contrastantes. Kohl et al.(1980) encontraron una buena relación entre el métodode diferencia total de N y abundancia natural de 15N entres experimentos con soya (Glycine max) usando comoreferencia una línea no nodulante de esta especie. Por elcontrario, Carrancá et al. (1999) con Trifoliumsubterraneum como leguminosa fijadora, y una mezclade Lolium perenne con Dactylis glomerata como plan-tas de referencia, observaron que el método de la dife-rencia de N mostró valores más bajos en varios períodosde muestreo, comparado con los métodos de dilución y

A deficiency of the natural 15N abundance method isthat a small variation in δ15N corresponds comparativelyto a large difference in the N2-fixation (Vose et al., 1981).Nevertheless, this method has been successfully used toestimate N2-fixation in forage legumes and grain legumes(Cadisch et al., 2000; Cadisch et al., 1993; Hossain etal., 1995; Sanford et al., 1995; Bolger et al., 1995).

The total N-difference method

The method is based on the total N yield of thelegume, as well as of the reference plant that grows inthe same soil (Giller and Wilson, 1991). The subtractionof the N in the reference plant of that one in the fixingplant gives an estimator of the N2 fixed.

Peoples and Herridge (1990) mentioned two basicrequirements of the method: (1) the N in the referenceplant comes only from the soil and, (2) the legume andthe reference plant absorb the same amount of N of thesoil. They suggested that the two plants must ideallyexplore the same volume in the root-zone, to have thesame capacity to extract and use the mineral soil-N, andto accumulate the N of the soil in the same period. Thecomparisons of this method with those of naturalabundance of 15N or dilution of 15N have producedcontrasting results. Kohl et al. (1980) found a goodrelationship between the total N-difference method andnatural 15N abundance in three experiments with soybean(Glycine max) using as reference a non-nodulating lineof this species. On the contrary, Carrancá et al. (1999)used Trifolium subterraneum as fixing-N2 legume, and amixture of Lolium perenne with Dactylis glomerata asreference plants, and observed that the total-N differencemethod showed lower values in several periods ofsampling, compared with the 15N-dilution and natural 15Nabundance methods. Nevertheless, since the method isdependent of the crop yield, it is considered not soreliable.

The acetylene reduction method

Since the nitrogenase (the N2-fixation enzyme) canreduce other substrates with triple bond such as acetylene(C2H2) to ethylene (C2H4), this latter reaction is the basisof the acetylene reduction technique. The reduction canbe quantified by gas chromatography (Giller and Wilson,1991) reading the concentration (peaks) of both gases.According to Turner and Gibson (1980) the technique issimple, rapid, of low equipment and resources costs.However, these authors added that the apparent simplicityof the method can be deceptive because of severaloperational problems, and interpretation of the resultsrequires great care. One disadvantage is that it iscomplicated to measure N2 fixation in soils due to the


de abundancia natural de 15N. Sin embargo, dado que elmétodo depende del rendimiento, se le considera pococonfiable.

El método por reducción de acetileno

Puesto que la nitrogenasa (enzima responsable de lafijación de N2) puede reducir otros substratos con tripleenlace tales como acetileno (C2H2) a etileno (C2H4), estaúltima reacción es la base del método por reducción deacetileno. La reducción se puede cuantificar porcromatografía de gases (Giller y Wilson, 1991) a travésde la lectura de los picos de concentración de ambosgases. Según Turner y Gibson (1980) la técnica es sim-ple, rápida, de bajo costo de equipo y recursos. Sin em-bargo, estos autores mencionaron que la simplicidadevidente del método puede ser engañosa debido a pro-blemas operativos y a que los resultados requieren unainterpretación cuidadosa. Otra desventaja es que es com-plicado medir la fijación del N2 en suelos debido a losefectos del acetileno en los procesos microbianos. Otrosproblemas resultan de la diferencia en solubilidad e ín-dices de difusión del acetileno y del etileno en suelos,asi como a alteraciones de la función nodular (Giller yWilson, 1991). Este método no es lo suficientementeexacto, ni siquiera para estudios comparativos entre le-guminosas (Peoples et al., 1989).

En el trópico húmedo de Veracruz, Melchor-Marroquin et al. (1999) aplicaron esta técnica y encon-traron que la aplicación de podas al follaje afectó la ac-tividad de la enzima nitrogenasa en cocuite (Gliricidiasepium). Así, los investigadores hicieron propuestas acer-ca del manejo de la especie como componenteagroforestal.

El método de ureidos

Debido a que existen importantes diferencias en lasformas principales de N transportadas en el xylema deleguminosas noduladas y no noduladas, es posible utili-zar la abundancia de ureidos en la savia del xylema comomedida indirecta de la proporción de N de la planta de-rivado de la fijación de N2. Muchas leguminosas tropi-cales, principalmente Phaseoleae y Desmodieae, trans-portan los productos de la fijación de N2 desde losnódulos a otras partes de la planta en forma de ureidos,alantoina y ácido alantoico (Giller y Wilson, 1991;Peoples y Herridge, 1990). Este método es aplicable alas leguminosas de grano más importantes, pero no amuchas leguminosas forrajeras.

El muestreo del xylema es rápido, sencillo, y no estotalmente destructivo. También se pueden extraer ureidosde muestras secas de plantas, como los peciolos, lo quesimplifica la aplicación de la técnica. Los componentes

effects of acetylene on microbial processes. Otherproblems result from the differences in solubility and ratesof diffusion of acetylene and ethylene in soils, as well asalterations on the nodulating function (Giller and Wilson,1991). This method is not accurate enough, even forcomparative studies between legumes (Peoples et al.,1989).

In the humid tropic of Veracruz, Melchor-Marroquinet al. (1999) applied this technique and found that thefoliage prunings affected the activity of the enzymenitrogenase in cocuite trees (Gliricidia sepium). Theauthors made proposals about the management of thisspecies as agroforestal component.

The ureides method

Because there are important differences in theprincipal forms of N transported in the xylem of nodulatedand non-nodulated legumes, it is possible to use theabundance of ureides in the xylem sap as an indirectmeasure of the proportion of plant N derived from N2

fixation.In many tropical legumes, mainly Phaseoleae and

Desmodieae, the product of N2 fixation is transportedfrom the nodules to other plant parts in form of theureides, allantoin and allantoic acid (Giller and Wilson,1991; Peoples and Herridge, 1990). This method isapplicable to the more important grain legumes, but notfor many forage legumes.

The sampling of xylem is rapid, simple, and notcompletely destructive. Also, it is possible to extractureides from dry samples of plants, as petioles, whichsimplifies the application of the technique. N solutecomponents can be analyzed by colorimetric analyses.Not expensive equipment is necessary, and many samplescan be collected and analysed on a single day. Somelimitations are: (1) the method is valid only for legumesthat export ureides; (2) it requires calibration for differentplant age to cover all stages of growth; (3) diurnalvariations for solute concentration and volume, (4) sapcomposition is stable for only 4 h at 25 to 30 oC (Peoplesand Herridge, 1990). However, the major disadvantageof the method is that it provides only a short-term measureof symbiotic dependence. Thus, to determine seasonalN2 fixation are required, it would be necessary to repeatmeasurements of xylem combined with sequentialsampling for dry matter and N.

Limitations to the biological nitrogen fixation

The environmental conditions determine to a largeextent the symbiotic efficiency of the N2-fixing legumes.Physical and chemical factors affect the fixation process:the first case includes the effects by high temperaturesand hydric stress; the second is related to problems bytoxic effects of the soil, such as acidity and aluminum


de N se pueden analizar por métodos colorimétricos. Noes necesario equipo costoso, y se puede recolectar yanalizar un gran número de muestras en un día. Algunaslimitaciones son: (1) el método es válido sólo para legu-minosas que exportan ureidos; (2) requiere calibraciónpara diferentes edades de la planta a fin de cubrir todaslas etapas de crecimiento; (3) se presentan variacionesdiurnas para la concentración del soluto y volumen y,(4) la composición de la savia es estable sólo por 4 h a25 a 30 oC (Peoples y Herridge, 1990). Sin embargo, ladesventaja principal del método es que proporciona sola-mente una medida a corto plazo de la dependenciasimbiótica. Así, para evaluar la fijación estacional de N2,es necesario repetir las mediciones del xylema combina-das con muestreos secuenciales para materia seca y N.

Limitaciones a la fijación biológica de nitrógeno

Las condiciones ambientales determinan en granparte la eficiencia simbiótica de las leguminosas fijadorasde N2. Factores físicos y químicos afectan el proceso defijación: el primer caso incluye los efectos por altas tem-peraturas y estrés hídrico; el segundo se relaciona conproblemas por efectos tóxicos del suelo, como acidez ypresencia de aluminio, así como deficienciasnutricionales (Giller y Cadisch, 1995; Giller y Wilson,1991).

Las altas temperaturas inhiben la fijación de N2, y lanodulación puede fallar si las temperaturas del suelo al-canzan 40 ºC o más en los primeros 5 cm de profundi-dad, temperatura que mata a muchas bacterias reducien-do su población en el suelo. Los límites máximos parael crecimiento de rizobios están entre 32 a 47 ºC, aun-que la tolerancia varía entre especie y cepas (Hungria yVargas, 2000). Las altas temperaturas también inhibenla formación de pelos radicales, lo cual disminuye elnúmero de sitios posibles para nodulación; es necesarioinocular repetidamente cuando las temperaturas son másaltas a fin de mantener el proceso de fijación de N2

(Hungria y Vargas, 2000). Giller y Wilson (1991) indi-caron que en periodos cortos las cepas deBradyrhizobium son más tolerantes a la sequía que lascepas de Rhizobium. La tolerancia a la sequía esinfluenciada por la capacidad de las plantas para captarel agua del suelo; las leguminosas de raíces profundaslo extraen de mayores profundidades para mantener supotencial hídrico y evitar una reducción en el índice defijación de N2 y en el desplazamiento de los productosde la fijación del N2 a los tallos.

Las limitaciones a la fijación de N2 por acidez delsuelo son importantes, y una proporción significativade las áreas tropicales posee esta condición. Dosimplicaciones son (Giller y Wilson, 1991): (1) supervi-vencia en un medio de pH bajo y, (2) cambios químicos

presence, as well as nutritional deficiencies (Giller andCadisch, 1995; Giller and Wilson, 1991).

The high temperatures inhibit the N2-fixation, and thenodulation can fail if the soil temperatures reach 40 ºCor more in the first 5 cm of depth, temperature which killmany bacteria reducing their population in the soil. Themaximum limits for the growth of rizobia are between32 and 47 ºC, although the tolerance varies betweenspecies and strains (Hungria y Vargas, 2000). The hightemperatures also inhibit the formation of root-hairs,which diminish the number of possible sites fornodulation; it is necessary to inoculate repeatedly whenthe temperatures are higher in order to maintain theN2 fixation process (Hungria y Vargas, 2000). Giller andWilson (1991) indicated that in short periods the strainsof Bradyrhizobium are more tolerant to the drought thatthe strains of Rhizobium. The tolerance to the drought isinfluenced by the capacity of the plants to absorb thewater of the soil; deep-root legumes extract it from greatersoil depths to maintain their hydric potential and avoid areduction in the N2-fixation rate and in the displacementof the N2 fixation products to the stems.

The limitations to the N2-fixation by acidity of thesoil are important, and a significant proportion of thetropical areas has this condition. Two implications are(Giller and Wilson, 1991): (1) survival in a low pHenvironment and, (2) chemical changes in the soil causedby high soil acidity, such as a high proportion ofaluminum and iron-manganese. In acid soils, theavailability of P and Mo diminish and there are Cadeficiencies. The common peanut (Arachis hypogaea) issusceptible to Ca deficiency which affects thedevelopment of the pods. The optimum pH for rizobiagrowth is between 6.0 and 7.0 and little rizobia growswell with pH below 5.0, in tropical soils. Hungria andVargas (2000) indicated that acidity affects the first stagesof the infection process for the nodulation. According toThomas (1995), most of the collected forage legumes byCIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical, Cali,Colombia) have been selected from acid soils of LatinAmerica and they are extremely tolerant to acidity. Thisauthor mentions that Calopogonium mucunoides, Arachispintoi and Centrosema spp are good options for poor soilof the tropic pastures. In fact, Arachis species are moretolerant to acidity that grain legumes, such as soybean orcommon bean. Table 1 shows information about thepotential for N2-fixation of several legumes forage. Therange of N2-fixed is between 52 and 88%, according tothe species, region and method used for determining it.The amount also depend upon type of legume and forageyield, in addition to their percentage of fixation.

CONCLUSIONS

The use of the stable isotope 15N has an extensiveapplication in understanding the chemical or biological


en el suelo causados por acidez alta, como una alta pro-porción de aluminio y hierro-manganeso. En suelos áci-dos disminuye la disponibilidad de P y Mo y hay defi-ciencia de Ca. El cacahuate común (Arachis hypogaea)es susceptible a la carencia de Ca que afecta el desarro-llo de las vainas. El pH óptimo para el crecimiento derizobio está entre 6.0 y 7.0 y poco rizobio crece biencon pH menor a 5.0, en suelos tropicales. Hungria yVargas (2000) asientan que la acidez afecta las primerasetapas del proceso de infección para la nodulación. Deacuerdo con Thomas (1995), la mayoría de las legumi-nosas forrajeras recolectadas en el CIAT (Centro Inter-nacional de Agricultura Tropical, Cali, Colombia) hansido seleccionadas de suelos ácidos de América Latinay son extremadamente tolerantes a la acidez. Este autormenciona que Calopogonium mucunoides, Arachis pintoiy Centrosema spp son buenas opciones para pasturas ensuelos pobres de los trópicos. Las especies de Arachisson más tolerantes a la acidez que las leguminosas de

Cuadro 1. Algunas estimaciones de la fijación de N2 por leguminosas forrajeras tropicales en nivel de campo (adaptado de Giller, 2001).Table 1. Some estimations of N2 fixation by tropical forage legumes on field (adapted from Giller, 2001).

N2 fijado PeriodoEspecies

(kg N ha-1) % (Años)País Método† Ref¶

Calopogonium 64-182 - 1 W. Samoa, Dif-N 1, 2mucunoides Brasil

Centrosema 43 82 0.33 Colombia DI 3acutifolium

Centrosema 41 83 0.33 Colombia DI 3macrocarpum

Desmodium 25-110 70-89 0.25-1 Colombia, Dif-N 1,3,4ascendens W. Samoa, Brasil

Galactia 31-54 81-93 0.27 Brasil DI 4striata

Pueraria 115 88 0.33 Colombia DI 3phaseoloides

Stylosanthes 3-179 73-88 0.3-1 Colombia, DI, AN 3, 5, 6capitata Brasil

Stylosanthes 7-102 68-79 0.3-1.3 Colombia, Brasil DI, 3, 5, 6guianensis Dif-N, AN

Stylosanthes 4-89 74-88 1-1.4 Colombia, DI, 3, 5, 6macrocephala Brasil Dif-N, AN

Stylosanthes 22-40 52-70 0.31 Brasil AN 6scabra

Zornia 61 88 0.33 Colombia DI 3glabra

† Dif-N = Diferencia de N; DI = Dilución de isótopos 15N; AN= abundancia natural 15N.¶ Referencias: (1) Reynolds (1982); (2) Seiffert et al. (1985); (3) Cadisch et al. (1989); (4) Viera-Vargas et al. (1995); (5) Thomas y de Andrade(1984); (6) Vallis et al. (1977).

processes that affect the nitrogen cycle and the nitrogencompounds, movement in the plant/soil system. Theevidences presented show that no method is precise andtotally reliable to measure the biological fixation of theatmospheric N2, due to multiple factors that affect theirquantification. Nevertheless, the methods that involve theuse of 15N, as 15N-dilution and natural 15N abundance,would be most recommendable. The method to selectdependes on the availability of laboratory equipment. Inmany developing countries, access to the spectrometryof masses is a serious limitation; therefore, a method thatdoes not require a sophisticated equipment, such as thatof total N-difference, could be more recommendable.

—End of the English version—

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grano como soya o frijol. El Cuadro 1 presenta informa-ción acerca del potencial de fijación de N2 por varias


leguminosas forrajeras. El intervalo de N2 fijado estáentre 52 y 88% según la especie, localidad y métodoempleado para medirlo. La cantidad depende tambiéndel tipo de leguminosa y los rendimientos de forraje,además de su porcentaje de fijación.

CONCLUSIONES

El empleo del isótopo estable 15N tiene una ampliaaplicación en la comprensión de los procesos químicoso biológicos que afectan el ciclo del nitrógeno y el mo-vimiento de compuestos nitrogenados en el sistema sue-lo/planta. Las evidencias presentadas muestran que nin-gún método es preciso y totalmente confiable para me-dir la fijación biológica del N2 atmosférico, debido amúltiples factores que afectan su cuantificación. Sinembargo, los métodos que involucran el uso de 15N, comola dilución de 15N y la abundancia natural de 15N, sonlos más recomendables. La elección del método depen-de de la disponibilidad de equipo de laboratorio. En mu-chos países en desarrollo el acceso a la espectrometríade masas es una limitación seria; por tanto, un métodoque no requiera equipo muy elaborado, como el de dife-rencia total de N, podría ser más recomendable.

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COMPARACIÓN DE METODOLOGÍAS DE ISÓTOPOS PARA EVALUAR FIJACIÓN DE N ATMOSFÉRICO Y SU DESTINO EN SUELOS Y PLANTAS