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Concentração
Potência a emissão de fluorescência (F) é proporcional à potência radiante do feixe de
excitação que é absorvido pelo sistema
F = emissão de fluorescência
Po = potência do feixe incidente
P = potência após ter percorrido um comprimento b do meio
K’ = constante que depende da eficiência quântica da fluorescência
bc
P
P 10
0
Lei de Beer
)101(´0
bcPKF
A expansão do termo exponencial resulta em uma Série de Maclaurin :
ε.b.c = A < 0,05: 2,303 ε.b.c é muito maior que os outros termos:
P0 constante
Concentração
...]!3
)303,2(
!2
)303,2(303,2[´
32
0
bcbcbcPKF
]303,2[´0
bcPKF
KcF
Soluções diluídas: fluorescência proporcional à concentração
Desvios da linearidade:
- 2,303εbc > 0,05: outros termos são significativos
- auto-supressão
- auto-absorção
Concentração
Auto-supressão
Auto-supressão
Colisões entre moléculas excitadas
com a concentração ocorrência de colisões
Transferência de energia não radiativa
Auto-absorção
Auto-absorção
de emissão se superpõe a um pico de absorção
Fluorescência: emissão atravessa
a solução e é reabsorvida por outras moléculas
fluorescentes
Antraceno em diclorometano
10-3
10-6
Supressão de fluorescência
do inglês, Quenching
efeito que diminui a intensidade de fluorescência
o mecanismo pode envolver o estado excitado ou o fundamental do fluoróforo
Supressão dinâmica
Transferência de energia não radiativa da espécie
excitada para outras moléculas
Supressão colisional
Contato entre supressor e espécie excitada
Rendimento quântico e o tempo de vida
Supressão de fluorescência
Formação de um complexo não fluorescente entre
supressor e fluoróforo no estado fundamental
Supressão estática
Tempo de vida não é afetado
Como medir a fluorescência?
Instrumentação similar à UV-VIS
Separar a radiação emitida daquela incidente utilizada para excitar a amostra
Fluorescência ocorre em todas as direções, mas é melhor observada quando medida à 90o
em relação ao feixe incidente
Configuração típica
Transmite a radiação que excita a
fluorescência, mas exclui ou limita a
radiação do de emissão fluorescente.
Configuração típica
Transmite a radiação que excita a
fluorescência, mas exclui ou limita a
radiação do de emissão fluorescente.
Ângulo reto minimiza as
contribuições do espalhamento e
da radiação intensa da fonte.
Isola a emissão da
fluorescência
Componentes
FONTES DE RADIAÇÃO:
-lâmpadas de mercúrio (mais comum para fluorímetros), deutério, tungstênio e xenônio (para
espectrofluorímetros)
-diodos emissores de luz (450-475nm)
-lasers
SELETORES DE :
-filtros de absorção ou interferência
-monocromadores de rede
CÉLULAS DE MEDIDA:
-cilíndricas/retangulares
-vidro/sílica/quartzo
DETECTORES:
-fotomultiplicadoras
Fluorímetro e espectrofluorímetro
Fluorímetro – apenas filtros
Espectrofluorímetro – 2 monocromadores
Aplicações
Determinação de espécies inorgânicas
direta: formação de complexo fluorescente
supressão de fluorescência
Determinação de espécies orgânicas
produtos de plantas, esteróides, vitaminas
Sensores ópticos para a determinação de metais pesados
Reagente fluorescente sofre supressão na presença de metais pesados
Sensor para oxigênio usando fibra-óptica
Medidas de oxigênio parcialmente dissolvido
Exercício
Um comprimido anti-malárico, contendo quinino, possui uma massa de 1,664 g, e foi
dissolvido com HCl 0,10 mol L-1 em quantidade suficiente para fornecer 500 mL de solução.
Uma alíquota de 20,00 mL foi então diluída para 100,0 mL com o ácido. A intensidade da
fluorescência para a amostra diluída, em 347,5 nm, forneceu uma leitura de 245 em uma
escala arbitrária. Uma solução-padrão de 100 ppm de quinino registrou o valor de 125,
quando medida em idênticas condições. Calcule a massa em miligramas de quinino no
comprimido original.
Fosforescência
Fosforescência geralmente ocorre em um comprimento de onda maior que a
fluorescência (ET < ES)
Diferença entre os comprimentos de onda dos dois processos é uma medida da
diferença de energia entre os estados singlete e triplete
Determinação de espécies bioquímicas como ácidos nucleicos, aminoácidos e enzimas
Necessário medidas à baixas temperaturas
Atualmente: pesquisas para medidas a temperatura ambiente
Quimiluminescência
Reação química produz espécies em estados eletronicamente excitados, que emite luz
ao retornar para o estado fundamental.
Método altamente seletivo, simples e extremamente sensível.
Reação:
A + B → C* + D
C* → C + hν
onde C* representa o estado excitado da espécie C
Quimiluminescência x Bioluminescência
Quimiluminescência é um termo geral para produção de luz quando a energia de excitação
é proveniente de uma reação química (ao invés da absorção de fótons, em fluorescência)
Bioluminescência é a denominação de um fenômeno de quimiluminescência onde a
reação química é realizada em um organismo, como o vaga-lume por exemplo
Medida de quimiluminescência
A instrumentação para medida de quimiluminescência é muito simples e pode consistir
de somente um recipiente para a reação e um detector.
Geralmente não é necessário um dispositivo para seleção de comprimentos de onda,
uma vez que a única fonte de radiação é a reação química.
Sinal obtido:
Após a mistura de reagentes
Exercício
Íons de ferro (II) catalisam a oxidação do luminol para H2O2. A intensidade da
quimiluminescência resultante aumenta linearmente com a concentração de ferro (II)
entre 10-10 e 10-8 mol L-1.
Exatamente 1,00 mL de água foi adicionado a uma alíquota de 2,00 mL de uma solução
de Fe(II) de concentração desconhecida, seguida pela adição de 2,00 mL de uma solução
diluída de H2O2 e 1,00 mL de uma solução alcalina de luminol. A quimiluminescência da
mistura foi integrada durante um período de 10,0 s e apresentou o valor de 14,3.
A uma segunda alíquota de 2,00 mL da amostra foi adicionado 1,00 mL de uma solução
de Fe(II) 3,58x10-5 mol L-1, seguida pelo mesmo volume de H2O2 e luminol. A intensidade
integrada foi 33,3. Encontre a concentração de Fe(II) na amostra.