Condizioni che possono destabilizzare la doppia elica provocando la separazione delle

due catene (denaturazione)

1. Alte temperature2. pH alcalino estremo (>13)3. Bassa forza ionica [Na+] 4. Presenza in soluzione di sostanze che

rompono i ponti a idrogeno (urea, formamide).

Ibridazione degli acidi nucleici e misurazione dell’espressione di un gene

La denaturazione della doppia elica si accompagna a grosse variazioni delle proprietà

fisiche delle soluzioni di DNA

1. Diminuzione della viscosità2. Aumento di assorbanza a 260nm3. Variazione dell’attività ottica

Curve di denaturazione

La denaturazione non è un processo irreversibile.Infatti se dopo la separazione delle eliche si fa scendere gradualmente la temperatura, le singole eliche complementari si possono riappaiarea doppia elica può riformarsi. Questo processo si chiama ibridazione.

La discesa graduale della temperatura e la permanenza delle molecole per un certo tempo pochi gradi al di sotto della temperatura di denaturazione sono fondamentali affinchè ci possa essere ibridazione, processo dipendente dai moti di agitazione termica. Se dopo la denaturazione la soluzione viene portata a bassa temperatura non si ha ibridazione, ma stabilizzazione della struttura secondaria delle singole catene.

Per mezzo dell’ibridazione si possono formare delle doppie eliche di DNA-DNA, DNA-RNA o RNA-RNA. La condizione fondamentale perché ciò avvenga è che in soluzione si mettano molecole con sequenza complementare (antiparallele). L’ibridazione è una forma di riconoscimento molecolare estremamente specifica.

In condizioni opportune di

temperatura e forza ionica (stringenza) si

possono ottenere anche delle eliche in

cui sono tollerati degli appaiamenti non

perfetti

Effetti della stringenza di ibridazione

Cinetiche di rinaturazione

Sintesi chimica oligonucleotidi:

Con questo sistema si possono sintetizzare in vitro singoli filamenti di DNA di

grandezza compresa tra 6 e 100 nucleotidi

Metodi di marcatura degli acidi nucleici

Le DNA polimerasi batteriche possono essere purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro

DNA stampo (singolo filamento)5’ 3’

Primer sintetico3’ 5’

DNA polimerasi

dATPdCTPdGTPdTTP

Le DNA polimerasi batteriche possono essere purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro

DNA stampo (singolo filamento)5’ 3’

5’DNA polimerasi

Le DNA polimerasi batteriche possono essere purificate e utilizzate per sintetizzare DNA in vitro

5’ 3’

5’3’

Traccianti utilizzati

Nucleotidi marcati con isotopi radioattivi

Traccianti utilizzati

Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive

Traccianti utilizzati

Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive

- Fluorocromi (marcatura diretta)- Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina)- Digossigenina (riconosciuta da anticorpi specifici marcati con fluorocromi o enzimi)- Biotina (riconosciuta da avidina marcata con fluorocromi o enzimi)

Traccianti utilizzati

Fluorocromi

Marcatura di DNA mediante random priming

Esempio di ibridazione: FISH (fluorescent in situ hybridization)

Come si fa a vedere se un gene è espresso?

Purificazione dell’mRNA(non obbligatoria)

• L’mRNA rappresenta il 2-4 % dell’RNA totale presente nelle cellule.

• L’mRNA può essere purificato mediante cromatografia di affinità con oligo-dT legata a diversi supporti solidi.

• L’mRNA purificato prende anche il nome di poly-A+, e rappresenta la base per diverse procedure di analisi di espressione, oltre che per la sintesi del cDNA necessario alla produzione di genoteche.

Misurazione espressione a livello della proteina

2D-Gel electrophoresis