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Liz Paola Domingues
CONSEQUÊNCIAS DO ESTRESSE DE DERROTA SOCIAL
(EPISÓDICO E CONTÍNUO) SOBRE OS EFEITOS PSICOMOTORES E
REFORÇADORES CONDICIONADOS DA NICOTINA EM
CAMUNDONGOS
São Paulo
2016
Dissertação de Mestrado apresentada à
Universidade Federal de São Paulo –
Escola Paulista de Medicina, para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Liz Paola Domingues
CONSEQUÊNCIAS DO ESTRESSE DE DERROTA SOCIAL
(EPISÓDICO E CONTÍNUO) SOBRE OS EFEITOS PSICOMOTORES E
REFORÇADORES CONDICIONADOS DA NICOTINA EM
CAMUNDONGOS
Orientadora: Profa. Dra. Isabel Marian Hartmann de Quadros
São Paulo
2016
Dissertação de Mestrado apresentada à
Universidade Federal de São Paulo –
Escola Paulista de Medicina, para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Domingues, Liz Paola
Consequências do estresse de derrota social (episódico e contínuo) sobre os efeitos
psicomotores e reforçadores condicionados da nicotina em camundongos / Liz Paola
Domingues – São Paulo, 2016
xii, 56
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina.
Programa de Pós Graduação em Psicobiologia.
Título em inglês: Consequences of social defeat stress on nicotine – induced psychomotor
and rewarding effects in mice.
1. Dependência de drogas. 2. Sensibilização comportamental. 3. Preferência condicionada
ao lugar. 4. Estresse social. 5. Recompensa. 6.Efeito estimulante
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
Chefe do Departamento: Profª. Drª. Deborah Suchecki
Coordenadora do Programa de Pós-Graduação: Profª. Drª. Vânia D'Almeida
iv
LIZ PAOLA DOMINGUES
CONSEQUÊNCIAS DO ESTRESSE DE DERROTA SOCIAL
(EPISÓDICO E CONTÍNUO) SOBRE OS EFEITOS PSICOMOTORES E
REFORÇADORES CONDICIONADOS DA NICOTINA EM
CAMUNDONGOS
Presidente da banca:
Profª. Drª. Isabel Marian Hartmann de Quadros
Branca examinadora:
Profª Drª Ana Regina Noto
Prof. Dr. Fábio Cardoso Cruz
Profª Drª Lisiane Bizarro Araújo
v
Dedicatória
Dedico essa dissertação à Angela Maria da Silva, por ter me ensinado a
não desistir dos meus sonhos. Eu te amo incondicionalmente, mãe.
vi
Agradecimentos
Gostaria de agradecer primeiramente a minha mãe, Angela, que desde o
meu nascimento não mediu esforços para me proporcionar as melhores
condições possíveis de vida, me apoiando a cada escolha e me ensinando a
acreditar que todos os meus sonhos são possíveis, eu só preciso lutar por eles
de forma honesta. Obrigada por estar ao meu lado em todas as batalhas, me
fortalecendo com o seu amor. Agradeço ao restante de minha família, incluindo
meu pai, irmãos e sobrinhos, que me motivaram a persistir em meus objetivos
de vida e, assim, seguir neste caminho de formação. E a meus filhotes, Moreno
e Elvis, por toda a alegria e carinho que tanto aquecem meu coração.
Agradeço também as amigas e amigos que estiveram ao meu lado ao
longo desses últimos dois anos, me apoiando em meio a dificuldades e
multiplicando as alegrias. Quanta sorte a minha ter encontrado vocês!
Sou muito agradecida pela pessoa Isabel Quadros, que me recebeu com
tanto carinho e se dedicou a me orientar durante esta etapa de meu processo de
formação. Sua atenção e cuidado garantiu não somente que eu construísse e
executasse um projeto de mestrado, mas que vivenciasse ao máximo todas as
oportunidades da pós graduação e, assim, crescesse ainda mais cientificamente.
Um agradecimento especial a Giovana e a Cristiane, que além da amizade me
possibilitaram conhecer o significado de trabalho em grupo. O Dream Team me
proporcionou imenso crescimento profissional e pessoal.
Não posso deixar de agradecer aos funcionários do Departamento de
Psicobiologia, as equipes de cuidado com os animais, limpeza, técnica e
administrativa, cujos trabalhos possibilitaram as melhores condições possíveis
para desenvolvimento deste estudo.
Por fim, agradeço ao financiamento do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq - 131585/2014-2), a
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e a
Associação Fundo de Incentivo à Pesquisa (AFIP).
vii
Sumário
Dedicatória ......................................................................................................... v
Agradecimentos ................................................................................................ vi
Sumário ............................................................................................................ vii
Lista de Figuras ................................................................................................. ix
Lista de Abreviaturas ......................................................................................... x
Resumo ............................................................................................................. xi
Abstract ............................................................................................................ xii
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 1
1.1. Tabagismo ......................................................................................... 1
1.2. Aspectos neurobiológicos da dependência ao tabaco ...................... 2
1.3. Sensibilização Comportamental ........................................................ 5
1.4. Preferência Condicionada ao Lugar (PCL) ........................................ 7
1.5. Estresse como fator de vulnerabilidade à dependência de drogas ... 8
2. OBJETIVOS ............................................................................................... 13
2.1. Objetivos Específicos ...................................................................... 13
3. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................... 14
3.1. Sujeitos experimentais ........................................................................ 14
3.2. Drogas ................................................................................................. 14
3.3. Estresse de derrota social ................................................................... 15
3.4. Avaliação da atividade locomotora ...................................................... 18
3.5. Condicionamento de preferência ao lugar ........................................... 18
3.6. Análise estatística ................................................................................ 19
4. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E RESULTADOS ............................ 20
4.1. Estudo 1: Consequências de dois protocolos de derrota social
(episódica e contínua) sobre os efeitos psicomotores da nicotina ............. 20
4.1.1. Experimento 1: Impacto da derrota social sobre os efeitos
psicomotores da nicotina (desafios sequenciais) ....................................... 20
4.1.2. Experimento 2: Impacto da derrota social sobre os efeitos
psicomotores da nicotina (desafios em dias separados) ............................ 24
viii
4.2. Estudo 2: Consequências de dois protocolos de derrota social (episódica e
contínua) sobre os efeitos reforçadores condicionados da nicotina ................ 30
4.2.1. Experimento 3: Padronização da PCL induzida por nicotina ...... 30
4.2.2. Experimento 4: Consequências da derrota social sobre a aquisição
da PCL induzida por nicotina ........................................................................... 32
5. DISCUSSÃO .............................................................................................. 37
5.1. Interações entre estresse de derrota social e efeitos psicomotores da
nicotina ....................................................................................................... 37
5.2. Interações entre estresse de derrota social e efeitos reforçadores
condicionados da nicotina .......................................................................... 39
6. CONCLUSÃO ............................................................................................ 44
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................... 45
Anexo 1
ix
Lista de Figuras
Figura 1. Ilustração da via da recompensa cerebral .......................................... 3
Figura 2. Esquema dos protocolos de Derrota Social ......................................17
Figura 3. Linha do tempo experimento 1 – Impacto da derrota social sobre os
efeitos psicomotores da nicotina (desafios sequenciais) ................................... 21
Figura 4. Resultados experimento 1 – Avaliação locomotora pós protocolo de
derrota social (desafios sequenciais) ............................................................... 23
Figura 5. Linha do tempo experimento 2 – Impacto da derrota social sobre os
efeitos psicomotores da nicotina (desafios em dias separados) ..................... 25
Figura 6. Resultados experimento 2 – Avaliação locomotora pós protocolo de
derrota social (desafios em dias separados) ................................................... 27
Figura 7. Resultados experimento 2 – Avaliação locomotora pós protocolo de
derrota social (desafio metanfetamina) ............................................................ 29
Figura 8. Linha do tempo experimento 3 – Padronização PCL induzida por
nicotina ............................................................................................................. 31
Figura 9. Resultados experimento 3 – Padronização da PCL induzida por nicotina
.......................................................................................................................... 32
Figura 10. Linha do tempo experimento 4 – Consequências da derrota social
sobre a aquisição da PCL induzida por nicotina .............................................. 33
Figura 11. Resultados experimento 4 – Influências da derrota social sobre a
aquisição de PCL induzida por nicotina ........................................................... 34
Figura 12. Resultados experimento 4 – Avaliação locomotora pós protocolo de
PCL em animais previamente estressados ..................................................... 36
x
Lista de Abreviaturas
ACTH Hormônio Adrenocorticotrófico
CRF Fator Liberador de Corticotrofina
HPA Hipotálamo-Pituitária-Adrenal
mRNA RNA mensageiro
NAc Núcleo Accumbens
PCL Preferência Condicionada ao Lugar
PFC Córtex Pré-Frontal
VTA Área Tegmentar Ventral
xi
Resumo
Objetivo: Investigar as consequências de dois protocolos de estresse de derrota
social (episódica e continua) sobre os efeitos psicomotores e reforçadores
condicionados da nicotina. Métodos: Foi utilizado o modelo do residente intruso,
no qual o sujeito experimental (camundongo intruso) foi derrotado diariamente
por um camundongo agressor diferente. Após cada período de confronto o
camundongo intruso retornou para sua gaiola moradia (derrota episódica) ou
permaneceu coabitando com o residente por 24 horas (derrota continua). Após
o período de 10 dias do protocolo de derrota social os animais foram
direcionados para os testes locomotores ou para a preferência condicionada ao
lugar (PCL). Tanto para avaliação locomotora quanto para indução de PCL pós
protocolo de derrota social foi utilizada a dose de 0,1 mg/kg de nicotina.
Resultados: Ambos os protocolos de derrota social (episódica e continua)
induziram redução da atividade locomotora a curto prazo, efeito potencializado
pela nicotina somente no grupo exposto à derrota episódica. Essa atenuação
locomotora induzida tanto pelo estresse quanto pela nicotina não foi observada
10 dias após o fim do protocolo de derrota social. Nenhum dos protocolos de
derrota social favoreceu a aquisição de preferência ou aversão condicionada ao
lugar induzida por nicotina. Uma semana após a exposição à nicotina durante
protocolo de PCL, o grupo exposto previamente a derrota episódica apresentou
atenuação locomotora induzida por nicotina. Conclusão: Foram observadas
diferentes consequências dos protocolos de derrota social episódica e continua
sobre os efeitos psicomotores da nicotina, havendo favorecimento do efeito
atenuador de atividade locomotora da droga pelo grupo derrota continua nos
testes a curto prazo. Uma semana após exposição repetida à nicotina durante
protocolo de PCL o grupo derrota episódica, mas não continua, também
apresentou redução da atividade locomotora induzida pela droga. Nenhum dos
protocolos de derrota social favoreceu a aquisição de preferência ou aversão
condicionada induzida por nicotina.
xii
Abstract
Objective: This study aimed to investigate the consequences of two types of
repeated social defeat stress (episodic and continuous) on nicotine-induced
psychomotor effects and conditioned reward in mice. Methods: Using the
resident-intruder model, experimental mice (intruder) were defeated by an
aggressive one (resident). After each daily defeat, intruders returned to their
homecage (episodic stress) or cohabitated with the aggressor for 24h
(continuous stress), until the next defeat. After the 10-day stress protocol,
different batches of mice received nicotine (0.1 mg/kg, s.c.) in locomotor tests
(short- and long-term), or for conditioned place preference (CPP). Results: Both
defeat protocols induced short-term (within 24h) locomotor suppression, which
was potentiated by nicotine only after continuous defeat stress. Ten days after
the final defeat, locomotor suppression was no longer observed due to stress or
nicotine. Nicotine failed to induce place preference or aversion after either defeat
protocol. Only the episodic defeat group showed nicotine-induced locomotor
suppression one week after the additional nicotine exposure during the CPP
protocol. Conclusion: Our findings indicate that different consequences of
episodic and continuous stress on nicotine psychomotor effects were observed
shortly after stress. Differential long-term effects on nicotine locomotor response
were only observed when stressed mice were further exposed to repeated
nicotine administration (during CPP). Also, neither episodic nor continuous defeat
stress facilitated the acquisition of conditioned place preference or aversion to
nicotine.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Tabagismo
O consumo do tabaco teve origem na América antiga, havendo indícios
de seu uso pela população indígena cerca de 10 mil anos atrás (Castaldelli-Maia
et al, 2016). Seu uso foi disseminado pela Europa a partir do século XVI e
diversas formas de consumo foram desenvolvidas com o passar dos séculos,
havendo a ascensão do cigarro em meados do século XIX (Rosemberg, 2003).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (2015), atualmente 21% da
população mundial adulta é fumante. No Brasil, dados do II Levantamento
Domiciliar Sobre o Uso de Drogas Psicotrópicas no Brasil (2005) indicam que
10% da população preenche critérios de dependência ao tabaco, enquanto a
Pesquisa Nacional de Saúde (PNS, 2013) relata que 14,7 % da população
brasileira é fumante. O fumo do tabaco está intimamente relacionado com mais
de 90% dos casos de câncer de pulmão (OMS, 2008), 85% das mortes
decorrentes de doenças pulmonares, como enfisema e bronquite (INCA, 2015),
além de 25% dos casos de doenças cardiovasculares e derrames (Benowitz,
2010; OMS, 2015). Por esse motivo, a Organização Mundial de Saúde considera
o tabagismo a principal causa de morte evitável no mundo, com número de óbitos
que ultrapassam cinco milhões de registros ao ano, dos quais cerca de 200 mil
apenas no Brasil (INCA, 2015).
O tabagismo é classificado como doença pela Organização Mundial de
Saúde, uma vez que possui potencial de induzir dependência. A dependência de
drogas de abuso é caracterizada por um conjunto de fenômenos fisiológicos,
cognitivos e comportamentais decorrentes do uso de substâncias psicotrópicas,
na qual a substância em questão adquire valor sobressaliente em relação a
outros aspectos da vida do indivíduo (OMS, 2015). A última edição do Catálogo
Internacional de Doenças (CID-10) contempla o tabagismo em sua classificação
F17 – “Transtornos mentais e comportamentais devido ao uso de fumo”,
definindo a síndrome de dependência pela manifestação de um conjunto de
sintomas (3 ou mais, no período de 12 meses), dentre eles o desenvolvimento
de tolerância aos efeitos da substância, a perda de controle e compulsão pelo
2
seu uso, a negligência de atividades em decorrência do uso da substância, a
manutenção do uso apesar de prejuízos associados, e a manifestação da
síndrome de abstinência no caso de interrupção do uso (CID-10). A última edição
do Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSM–V) também
considera o tabagismo como um “Transtorno por uso de substâncias”, sob código
305.1, o qual pode ser classificado como leve, moderado ou grave conforme a
quantidade de sintomas apresentados no período de 12 meses.
Apesar de ser possível encontrar mais de 4 mil substâncias químicas nos
derivados do tabaco, a nicotina é a substância farmacologicamente ativa
considerada responsável por seus efeitos reforçadores e pelo desenvolvimento
de dependência pelos usuários crônicos (Stolerman & Jarvis, 1995; Benowitz,
2010). Pelo seu modo de consumo mais comum, ou seja, através do fumo do
tabaco, a nicotina leva cerca de 10 segundos para atingir o sistema nervoso
central (Benowitz et al, 2009). Esse curto intervalo de tempo entre consumo e
efeito vem a favorecer seu potencial de induzir dependência (Benowitz, 2010),
uma vez que facilita a associação entre o uso da substância e a manifestação
dos efeitos desejados. Os principais efeitos da nicotina estão relacionados com
a promoção de prazer e redução do estresse e ansiedade, além de favorecer
aspectos cognitivos como concentração e tempo de reação a estímulos
(Benowitz, 2010). Assim como outras substâncias psicotrópicas, como o álcool,
cocaína e anfetaminas, a nicotina é capaz de alterar o funcionamento cerebral
aguda e cronicamente, modificando a plasticidade neuronal de forma a favorecer
a instalação da dependência (Robinson & Berridge, 2001).
1.2. Aspectos neurobiológicos da dependência ao tabaco
Wise & Bozarth (1987) propõe que os efeitos reforçadores das drogas de
abuso são decorrentes da ativação de um mecanismo cerebral comum, o
sistema de recompensa cerebral. Este sistema contempla as regiões da área
tegmentar ventral (VTA), do núcleo accumbens (NAc) e do córtex pré-frontal
(PFC) (Pierce & Kalivas, 1997), havendo modulação de seu funcionamento por
diversas vias neurais (figura 1). De forma simplificada, a VTA possui projeções
dopaminérgicas para o NAc e para o PFC, enquanto o PFC possui projeções
glutamatérgicas para o NAc e para a VTA. Já o NAc possui projeções
3
GABAérgicas para a VTA. (Pierce & Kalivas, 1997). A via dopaminérgica
mesolímbica parece ser crucial para o processo de desenvolvimento da
dependência de substâncias (Koob, 1992; Robinson e Berridge, 2001; Polter &
Kauer, 2014).
O aumento da liberação de dopamina no núcleo accumbens é uma resposta
comum a quase todas as drogas de abuso (Di Chiara & Imperato, 1988) e parece
estar relacionado com a predição de estímulos que geram reforços de valores
positivos (Di Chiara, 2000; Shim et al, 2001), ou seja, que aumentam a
probabilidade de repetição do comportamento relacionado (Skinner, 2003). As
substâncias psicotrópicas como cocaína, heroína e etanol podem sensibilizar a
neurotransmissão dopaminérgica mesolímbica, tornando-a hiper-responsiva à
ação dessas substâncias e aumentando a saliência dos comportamentos
relacionados a seu consumo, os quais se tornam mais atrativos e desejados
(Reid et al, 1996; Robinson & Berridge, 2001; Shim et al, 2001; Sanchis-Segura
& Spanagel, 2006; Steketee & Kalivas, 2011). A exposição repetida, portanto,
torna a substância e os estímulos associados a ela progressivamente mais
Figura 1. Ilustração simplificada de cérebro humano (esquerda) e de roedor (direita),
mostrando a localização das estruturas da via da recompensa cerebral e suas projeções
dopaminérgicas (DA), glutamatérgicas (Glu) e GABAérgicas (GABA). NAc, Núcleo
Accumbens; PFC, Córtex Pré Frontal; VTA, Área Tegmentar Ventral.
4
atraentes e capazes de favorecer o comportamento de busca pela droga, de
acordo com a teoria de Robinson e Berridge (2001). DiFranza e Wellman (2005)
sugerem ainda que a sensibilização à nicotina, em particular, potencializa sua
capacidade de suprimir os mecanismos de fissura (do inglês “craving”, desejo
intenso de consumir a substância), o que levaria à uma resposta homeostática
de aumento na geração da fissura. Assim, o aumento exacerbado da fissura
ocorrido com a retirada de nicotina também viria a favorecer o comportamento
de busca por essa substância (DiFranza & Wellman, 2005, 2007).
A nicotina, assim como outras drogas de abuso, também é capaz de ativar e
induzir modificações no funcionamento da via da recompensa cerebral. O
mecanismo de ação da nicotina se dá através da ativação dos receptores
colinérgicos nicotínicos, que são canais iônicos dependentes de ligante
amplamente difundidos pelo cérebro e geralmente ativados pelo
neurotransmissor acetilcolina (DiFranza & Wellman, 2005; Benowitz, 2010;
Feduccia et al, 2012). No entanto, a ligação de moléculas de nicotina também
pode induzir a ativação desses receptores, levando à abertura do canal e
possibilitando o influxo de cátions, o que pode vir a ocasionar despolarização
neuronal (Benowitz, 2010; Feduccia et al, 2012). Esses receptores estão
presentes tanto na pré quanto na pós sinapse, podendo assim modular a
liberação de neurotransmissores (Benowitz, 2010; Feduccia et al, 2012). Os
receptores nicotínicos são compostos por cinco subunidades, combinadas entre
os nove tipos de subunidades α (α2 a α10) e três tipos de subunidades β (β2 a β4)
(Benowitz, 2010; Feduccia et al, 2012; Picciotto & Mineur, 2014). Os receptores
do tipo α4β2, em particular, aparentam estar diretamente relacionados com o
processo de dependência à nicotina (Arik et al, 2009; Benowitz, 2010; Feduccia
et al, 2012; Picciotto & Mineur, 2014), havendo indícios de sua participação na
ativação dopaminérgica e nos efeitos comportamentais induzidos pela droga,
conforme observado em estudos com camundongos knock out para os genes da
subunidade α4 ou β2 (para revisão, ver Benowitz, 2010, Feduccia et al, 2012;
Picciotto & Mineur, 2014).
A nicotina age diretamente sobre os receptores nicotínicos da VTA
promovendo a estimulação dos neurônios dopaminérgicos que se projetam
dessa região para o núcleo accumbens (Di Chiara, 2000; Benowitz, 2010;
Steketee & Kalivas, 2011). Ao mesmo tempo, a nicotina age nos receptores
5
nicotínicos dos terminais neuronais glutamatérgicos, potencializado a liberação
de glutamato e consequente estimulação dos neurônios dopaminérgicos por
esse neurotransmissor (Benowitz, 2010; Feduccia et al, 2012; Picciotto & Mineur,
2014). A nicotina também age em receptores localizados em neurônios
GABAérgicos, no entando, a rápida dessensibilização desses receptores acaba
por reduzir a liberação de GABA e, consequentemente, o controle inibitório sobre
os neurônios dopaminérgicos (Benowitz, 2010; Feduccia et al, 2012; Picciotto &
Mineur, 2014). A ação da nicotina, portanto, vem a favorecer a excitabilidade dos
neurônios dopaminérgicos que se projetam para o núcleo accumbens, levando
ao aumento de dopamina nessa estrutura, o que pode ser observado por horas
após administração da droga (para revisão, ver Vezina et al, 2007; Feduccia et
al, 2012; Picciotto & Mineur, 2014).
Os efeitos reforçadores da nicotina podem ser evidenciados
experimentalmente com a autoadministração operante, utilizando a via
intravenosa para a administração voluntária da droga (Olivier et al, 2007; Le Foll
et al, 2009; Leão et al, 2012; Cohen et al, 2012, 2015), e por processos como o
de condicionamento de preferência ao lugar (para revisão, ver Bardo & Bevins,
2000; Sanchis-Segura & Spanagel, 2006), como utilizado neste estudo. Já os
efeitos estimulantes da nicotina podem ser avaliados pelo processo de
sensibilização comportamental (para revisão, ver Sanchis Segura & Spanagel,
2006; DiFranza & Wellman, 2007; Steketee & Kalivas, 2011), o qual também foi
avaliado neste estudo.
1.3. Sensibilização Comportamental
A sensibilização comportamental é um fenômeno comum a diversas
substâncias psicotrópicas, como cocaína, heroína, etanol e nicotina (para
revisão, ver Sanchis Segura & Spanagel, 2006; DiFranza & Wellman, 2007;
Steketee & Kalivas, 2011). Em modelos experimentais, o processo de
sensibilização comportamental caracteriza-se pelo aumento duradouro da
atividade locomotora decorrente da administração repetida da droga (Domino,
2001; Robinson & Berridge, 2001; Shim et al, 2001; Steketee & Kalivas, 2011),
refletindo alterações neuroadaptativas ocorridas na via da recompensa cerebral,
6
as quais potencializam a resposta dopaminérgica à droga em questão (Robinson
et al, 1993, 2001).
Dados da literatura e estudos prévios do nosso laboratório demonstraram que
os efeitos da nicotina são dependentes de dose e do tempo de tratamento
(Clarke & Kumar, 1983; Domino, 2001; DiFranza & Wellman, 2007). Clarke e
Kumar (1998) observaram que, agudamente, a dose de 0,1 mg/kg de nicotina
não induziu alterações locomotoras em ratos, enquanto a dose de 0,4 mg/kg
induziu redução da atividade locomotora nos primeiros 20 minutos pós
administração da droga. Observaram também que a administração diária da
dose de 0,4 mg/kg levaria a uma tolerância a esse efeito de atenuação da
atividade locomotora, havendo manifestação do efeito estimulante dessa dose
após 1 semana de administração crônica. Domino (2001) também observou o
efeito redutor da atividade locomotora induzido pela administração aguda de
nicotina na dose de 0,32 mg/kg e, menos marcadamente, pela dose de 0,1
mg/kg, em ratas. Ambas as doses também produziram estimulação locomotora
após 6 dias de administração crônica, efeito mais saliente para a dose de 0,32
mg/kg. Em nosso laboratório a dose de 0,1 mg/kg não proporcionou efeitos
locomotores agudos, porém apresentou uma tendência a induzir efeitos
estimulantes após administração crônica, em camundongos. A dose de 0,4
mg/kg agudamente induziu uma considerável redução da atividade locomotora,
efeito tolerado após administração crônica. A estimulação locomotora que
caracteriza a sensibilização comportamental, no entanto, só foi observada
quando houve reexposição à droga (teste desafio) após um período de retirada.
Já a dose de 1,0 mg/kg também induziu supressão locomotora agudamente, no
entanto não houve desenvolvimento de tolerância a esse efeito mesmo após
administração crônica ou período de abstinência (dados não publicados).
A sensibilização neural e de respostas comportamentais à nicotina podem
contribuir para o desenvolvimento e manutenção da dependência, assim como
para a reinstalação da busca pela droga (para revisão, ver Robinson & Berridge,
1993, 2001; Sinha, 2001; Di Franza & Wellman, 2005; Steketee & Kalivas, 2011).
Há evidências de que a sensibilização à nicotina pode durar por até 4 semanas
e ser eliciada por pistas contextuais que tenham sido previamente pareadas com
a droga (DiFranza & Wellman, 2007). Dados sugerem que a sensibilização à
nicotina também é capaz de aumentar o consumo da droga em protocolo de livre
7
escolha (two-bottle choice) (Renda & Nashmi, 2014), potencializar a aquisição e
motivação para busca de nicotina por autoadministração operante (Neugebauer
et al, 2014), e aumentar a aquisição da preferência condicionada ao lugar
induzida por nicotina (Hilario et al, 2012).
1.4. Preferência Condicionada ao Lugar (PCL)
A preferência condicionada ao lugar (PCL) é um dos procedimentos
utilizados para avaliação dos efeitos condicionados induzidos por estímulos
reforçadores de naturezas variadas, como drogas, alimentos ou comportamento
sexual (para revisão, ver Bardo & Bevins, 2000). A PCL é baseada no
pareamento de um estímulo incondicionado (no caso, o ambiente onde o
estímulo é experienciado) aos efeitos do estímulo reforçador de interesse. Com
a repetição desse pareamento, o ambiente (estímulo incondicionado) associado
ao estímulo passa a eliciar um comportamento de aproximação (preferência) ou
evitação (aversão), de acordo com as características do estímulo (para revisão,
ver Sanchis-Segura & Spanagel, 2006). Em doses consideradas reforçadoras,
as drogas de abuso induzem uma preferência condicionada ao lugar em que o
animal foi pareado com a droga (estímulo reforçador). Ou seja, quando tendo
livre acesso a todos os ambientes o animal passa a maior parte do tempo
naquele que havia sido associado aos efeitos da droga, mesmo na ausência
desta.
Risinger e Oakes (1995) testaram a PCL para quatro doses de nicotina
(0,25; 0,5; 1,0 e 2,0 mg/kg) injetadas intraperitonealmente (i.p.) em
camundongos suíços albinos. Observaram efeitos dependentes de dose após 8
sessões de condicionamento, com preferência condicionada induzida pela dose
de 0,5 mg/kg e aversão condicionada induzida pela dose de 2,0 mg/kg, enquanto
as doses de 0,25 e 1,0 mg/kg demonstraram efeitos neutros. Outros grupos
também relataram efeitos de preferência / aversão dependentes de dose da
nicotina em outras espécies/linhagens de roedores e sob diferentes protocolos
experimentais (Kim et al, 1999; Leão et al, 2009; Sershen et al, 2009; Pastor et
al, 2013).
8
1.5. Estresse como fator de vulnerabilidade à dependência de
drogas
O estresse pode ser entendido como um conjunto de respostas
adaptativas a estímulos internos ou externos, denominados agentes estressores,
(Selye, 1936; 1985; Koob & Le Moal, 2001; Chartoff & Carlezon Jr, 2014). Essa
resposta adaptativa possui componentes fisiológicos, psicológicos e
comportamentais, manifestando-se, por exemplo, pela ativação do sistema
nervoso simpático, dos sistemas emocionais do cérebro, e do eixo hipotálamo-
pituitaria-adrenal (HPA) (Selye 1936; Koob & Le Moal, 2001; Sinha, 2001, 2008;
Chartoff & Carlezon Jr, 2014). O eixo HPA é responsável pela regulação da
liberação de glicocorticoides na corrente sanguínea, apresentando um ritmo
circadiano de funcionamento basal (Dallman, 1993). Sua ativação se dá pela
ação do fator liberador de corticotrofina (CRF) hipotalâmico sobre a pituitária,
estimulando a liberação do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH). O ACTH é
liberado na corrente sanguínea e age sobre o córtex da glândula adrenal,
estimulando a liberação de glicocorticoides, como o cortisol (em humanos) e
corticosterona (em roedores). Os glicocorticoides, por sua vez, regulam
negativamente o funcionamento do eixo HPA, agindo sobre a pituitária de forma
a inibir a liberação de ACTH (Dallman, 1993; Koob & Le Moal, 2001; Koob, 2008).
Os agentes estressores levam à ativação do eixo HPA pela indução da liberação
de CRF (Dallman, 1993) e, cronicamente, podem levar a alterações em seu
funcionamento que agreguem valores patológicos à resposta de estresse
(Dallman, 1993; Koob & Le Moal, 2001), como aumento da ansiedade, prejuízos
cognitivos e comprometimentos endócrinos (Koob & Le Moal, 2001). O CRF
também é produzido por outras regiões além do hipotálamo, como a amigdala
central e o núcleo leito da estria terminal (Sawchenko et al, 1993; Koob & Le
Moal, 2001; Stamatakis et al, 2014). George Koob (1993) considera que esse
CRF extra hipotalâmico também esteja envolvido nas respostas adaptativas ao
estresse. No entanto, os glicocorticoides regulam positivamente esse sistema
extra hipotalâmico do estresse, estimulando a liberação de CRF (Koob & Le
Moal, 2001).
9
As drogas de abuso, como cocaína, heroína, álcool e nicotina, também
são consideradas agentes estressores e, assim, são capazes de ativar o eixo
HPA (Koob, 2008; Chartoff & Carlezon Jr, 2014). Estudos sugerem que a
nicotina, particularmente, é capaz de modificar a liberação de CRF, ACTH e
glicocorticoides (Matta et al, 1998; Chen et al, 2008; Yu et al, 2008). Matta e
colaboradores (1998) observaram que a infusão intracerebral de nicotina induz
a liberação de ACTH, o que não foi observado com a administração direta de
nicotina em células da pituitária, sugerindo que a ação dessa droga decorra da
estimulação da liberação de CRF hipotalâmico. Já Yu e colaboradores (2008)
observaram que a autoadministração crônica de nicotina leva à uma redução no
número de células hipotalâmicas marcadas com mRNA de CRF, sugerindo que
cronicamente a nicotina venha a suprimir a liberação desse hormônio.
Corroborando com esses dados, Chen e colaboradores (2008) observaram que
a autoadministração aguda de nicotina leva ao aumento dos níveis de ACTH e
corticosterona em ratos, o que deixou de ser observado com a autoadministração
crônica da droga. No entanto, a autoadministração crônica de nicotina
potencializou a liberação desses hormônios frente à um estresse brando de
choque nas patas, sugerindo uma sensibilização desse mecanismo de resposta
a um estressor de natureza distinta (Chen et al, 2008).
O estresse é um importante fator de risco para o aumento da
vulnerabilidade ao uso prejudicial de drogas de abuso, podendo interferir desde
o uso inicial até a própria dependência e recaída (Sinha, 2001, 2008; Bruijnzeel,
2012). Diversos estudos mostram uma associação entre eventos estressantes e
aumento do abuso de drogas. O histórico de eventos estressores na infância,
como agressões físicas, abuso sexual e psicológico, se mostra como fator de
risco para o abuso de substâncias na vida adulta (Sinha, 2001, 2008). O estresse
vivido na vida adulta, como a perda de suporte social, também está associado
ao consumo de drogas de abuso (Sinha, 2001, 2008). Considera-se que o
consumo de substâncias como uma resposta de enfrentamento para o estresse
está associado ao uso abusivo e dependência (Miczek et al, 2008; Sinha, 2008).
Em relação à nicotina, o estresse parece estar relacionado tanto com o aumento
no número de cigarros consumidos, quanto com a fissura e recaída em
indivíduos abstêmios (Cohen & Lichtenstein, 1990; Niaura et al, 2002).
10
Modelos animais demonstram que o estresse é capaz de sensibilizar o
sistema dopaminérgico de recompensa cerebral de maneira semelhante ao que
ocorre com a administração repetida de drogas de abuso, tornando os animais
mais sensíveis aos efeitos estimulantes e reforçadores dessas substâncias
(Robinson & Berridge 1993; Aguilar et al, 2013; Miczek et al, 2008; Miczek et al,
2011; Bardo et al, 2013; Garcia-Keller et al, 2013). Essa sensibilização do
sistema de recompensa cerebral pode ser decorrente tanto da ação dos
glicocorticoides (Stephens & Wand, 2012; Montoya et al, 2014) quanto do CRF
extra hipotalâmico (Koob & Le Moal, 2001; Polter & Kauer, 2014; Stamatakis et
al, 2014) sobre a VTA, núcleo accumbens e estruturas modulatórias do sistema
de recompensa.
Estressores sociais parecem ser cruciais no aumento da vulnerabilidade
para instalação de comportamentos relacionados à dependência (Miczek et al,
2008; Aguilar et al, 2013). Estudos demonstram que a exposição repetida a
breves episódios de derrota social pode potencializar a estimulação locomotora
(sensibilização cruzada), a taxa de aquisição e da motivação para
autoadministração de cocaína e anfetamina (Kabbaj et al, 2001; Covington &
Miczek 2005; Quadros & Miczek 2009; para revisão, ver Miczek et al, 2008).
McLaughlin e colaboradores (2006) observaram que o estresse crônico de
derrota social também foi capaz de potencializar a aquisição da preferência
condicionada ao lugar induzida por cocaína em camundongos.
No entanto, variações nos protocolos de estresse de derrota social
parecem atuar de formas distintas nas neuroadaptações dopaminérgicas do
núcleo accumbens e nos comportamentos relacionados à dependência de
drogas (Miczek et al, 2011). Protocolos de derrota social intermitente (derrota
episódica) induzem nos animais derrotados uma resposta dopaminérgica
sensibilizada a um desafio com a droga, sensibilização locomotora cruzada e
aumento da autoadministração de psicoestimulantes, conforme mencionado
anteriormente (Quadros & Miczek, 2009; Miczek et al, 2011). Já protocolos de
estresse de derrota contínua, no qual os animais derrotados permanecem
coabitando com os animais agressores (Berton et al, 2006; Miczek et al, 2011),
observa-se redução dos níveis basais de dopamina, além da indução de
tolerância ao efeito estimulante e redução do consumo de cocaína (Miczek et al,
2011). Isso sugere que estresse social contínuo promoveria anedonia e déficits
11
motivacionais na busca por reforçadores, além de alterações opostas àquelas
induzidas pela derrota episódica no funcionamento da via dopaminérgica
mesolímbica (Miczek et al, 2011).
Além disso, as consequências do estresse de derrota social também
parecem variar conforme a droga administrada. Diferente dos psicoestimulantes,
não foram observados grandes impactos da derrota social episódica no consumo
de heroína (Cruz et al, 2011). Já as consequências sobre os efeitos reforçadores
do álcool são variáveis (Blanchard et al, 1987; Van Erp et al, 2000; Croft et al,
2005) e dependentes da intensidade dos confrontos (Norman et al, 2015).
Estudos prévios do nosso grupo mostraram que animais expostos cronicamente
a derrota social contínua apresentam supressão da hiperatividade locomotora
induzida pelo etanol, além de facilitação da PCL induzido pela mesma droga. Em
contrapartida, animais que foram expostos ao estresse de derrota social
episódica não apresentam alteração da resposta locomotora ao etanol, nem
parecem alterar seus efeitos reforçadores na PCL (manuscrito em preparação).
Especificamente em relação à nicotina, os efeitos do estresse parecem
ser controversos. Há evidências de que o estresse crônico de restrição
potencializa os efeitos estimulantes da nicotina em ratos (Cruz et al, 2008), o que
não foi observado para o estresse de isolamento social (McCormick et al, 2005).
Ratos expostos ao estresse crônico moderado também apresentaram
sensibilização cruzada aos efeitos estimulantes da nicotina, assim como
aumento na busca por nicotina no protocolo de autoadministração operante
(Leão et al, 2012). No entanto, Al-Hasani e colaboradores (2013) relataram que
o estresse crônico moderado não interferiu nos efeitos reforçadores da nicotina,
avaliados por protocolo de PCL. Zou e colaboradores (2014) também não
observaram consequências do estresse de derrota social episódica sobre a
autoadministração operante de nicotina.
Tendo em vista que os dois tipos de estresse de derrota social – episódica
e contínua - podem influenciar os comportamentos relacionados à dependência
de drogas de maneiras distintas, este estudo teve por objetivo comparar as
consequências desses dois tipos de estresse sobre os efeitos psicomotores e
reforçadores condicionados da nicotina, em camundongos. Nossa hipótese era
a de que haveriam consequências distintas dos dois protocolos de derrotas sobre
os efeitos da nicotina, com aumento dos efeitos psicomotores e facilitação da
12
instalação de preferência condicionada à nicotina em decorrência da derrota
episódica, enquanto a derrota contínua reduziria os efeitos da droga.
13
2. OBJETIVOS
Este projeto teve por objetivo verificar e comparar as consequências de dois
protocolos de estresse de derrota social (episódica e contínua) sobre os efeitos
psicomotores e reforçadores condicionados da nicotina em camundongos.
2.1. Objetivos Específicos
Estabelecer uma curva dose-resposta do condicionamento de preferência
ao lugar induzido pela nicotina.
Verificar as consequências da exposição prévia ao estresse de derrota
social episódica e contínua sobre os efeitos psicomotores da nicotina.
Verificar as influências do estresse de derrota social episódica e contínua
sobre a preferência ou aversão condicionada ao lugar induzida pela
nicotina.
14
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Sujeitos experimentais
Foram utilizados camundongos suíços albinos machos, adultos (60 dias),
provenientes do biotério central do CEDEME (Centro de Desenvolvimento de
Modelos Experimentais) da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Os
animais foram mantidos no biotério do departamento de Psicobiologia da
UNIFESP/EPM, individualmente (exceto quando mencionado) em gaiolas
plásticas (30 x 19 x 13 cm) forradas com sabugo, tendo livre acesso a água e
ração. Os animais foram mantidos em condições controladas de temperatura (22
± 1 ºC) e luz (ciclo claro/escuro de 12 horas, com fase clara iniciada às 7:00
horas). Os experimentos foram realizados na fase clara. Todos os
procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Utilização Animal da
UNIFESP, conforme parecer número 2406280214 (Anexo 1).
3.2. Drogas
Nicotina 99% (Sigma, St Louis, MO) foi diluída em salina (0,9% NaCl, pH 7,2)
e injetada subcutaneamente (doses de 0,1; 0,4 e 1,0 mg/kg). As doses de
nicotina foram escolhidas com base na literatura (Clarke & Kumar, 1983; Risinger
& Oakes, 1995; Domino, 2001; DiFranza & Wellman, 2005) e em estudos piloto.
Estudos prévios de nosso grupo demonstraram que a dose de 0,1 mg/kg não
apresenta efeitos locomotores agudos, porém apresenta uma tendência a induzir
efeitos estimulantes após administração crônica em camundongos. A dose de
0,4 mg/kg agudamente induz uma considerável atenuação da atividade
locomotora, efeito tolerado após administração crônica. Já a dose de 1,0 mg/kg
também induz atenuação locomotora agudamente, no entanto não há
desenvolvimento de tolerância a esse efeito mesmo após administração crônica.
Dados da literatura sugerem que as doses de 0,1 e 1,0 mg/kg de nicotina tendem
a ser neutras no condicionamento de preferência / aversão ao lugar, não
induzindo nenhuma das situações propostas (Risinger & Oakes, 1995), enquanto
15
a dose intermediária (0,4 mg/kg) tende a induzir preferência condicionada ao
lugar (Pastor et al, 2013).
A metanfetamina utilizada no experimento 4.1.2. foi doada pela Polícia
Federal (São Paulo, Brasil) e testada quanto a seu grau de pureza. A
metanfetamina foi diluída em salina e injetada intraperitonealmente (dose de 1,0
mg/kg). A dose de metanfetamina foi baseada em estudos do nosso laboratório
que demonstraram um claro efeito estimulante após administração aguda
(Abrahao et al, 2009; Soeiro et al, 2012).
A administração das drogas e do veículo (salina) foi feita no volume de 10
ml/kg.
3.3. Estresse de derrota social
Os sujeitos experimentais desse estudo foram separados em dois grupos:
grupo controle e grupo estresse social. Os animais do grupo estresse, chamados
de “intrusos”, foram introduzidos na gaiola-moradia de animais coespecíficos,
chamados de “residentes”, para episódios de derrota social. Os residentes
agressores eram camundongos suíços albinos, machos, alojados em parceria
com uma fêmea e previamente treinados e estabilizados para a apresentação de
comportamentos agressivos contra machos da mesma espécie. O treino dos
residentes agressores consistiu na apresentação de camundongos “estímulo”
machos, de forma similar ao episódio de derrota social, até que o residente
apresentasse estabilidade no comportamento agressivo no confronto com outro
animal. O comportamento era considerado estável quando o animal realizasse
comportamento de perseguição e ataque sempre que exposto a um
camundongo “estímulo”, o que geralmente acontecia após 4 a 6 sessões de
treino, ocorridas em dias intercalados.
O episódio de derrota social consiste em três fases: iniciação, derrota e
ameaça (Tornatzky & Miczek, 1993) (figura 2). Após retirada da fêmea, o intruso
foi colocado na gaiola moradia do residente e mantido separado deste por uma
divisória de acrílico transparente com paredes perfuradas, por um período de 5
minutos (fase de iniciação). Esta divisória permite o contato auditivo, olfativo e
visual entre os animais, mas o animal intruso é protegido de mordidas
16
potencialmente prejudiciais. Durante a fase de derrota a divisória de acrílico foi
retirada e o residente teve oportunidade de perseguir, ameaçar e atacar o animal
intruso até que este assumisse postura de submissão, ou seja, postar-se ereto
sobre as patas traseiras, com cabeça inclinada para cima e orelhas retraídas
(Miczek et al, 1982). A fase de derrota teve duração de até 5 minutos, sendo
terminada antes caso o intruso apresentasse sinais de submissão por um
período de 4 segundos consecutivos, levasse 15 mordidas ou apresentasse
feridas aparentes. Ao término da fase de derrota os animais foram novamente
separados por divisória de acrílico e mantidos assim (fase de ameaça) por um
período de 5 minutos (derrota episódica) ou 24 horas (derrota contínua), neste
caso com livre acesso a água e alimento.
Ambos os protocolos de derrota social (episódica e contínua)
desenvolvidos em todos os experimentos deste trabalho foram realizados ao
longo de 10 dias, com um episódio de derrota por dia. Houve rotação dos
residentes agressores, de forma que a cada dia o intruso era apresentado a um
novo residente, de forma a evitar habituação.
Animais do grupo controle para a derrota episódica foram mantidos
isolados em suas gaiolas moradia, sendo manipulados apenas para pesagem e
limpeza. Já os animais do grupo controle para a derrota contínua foram mantidos
aos pares, separados por divisória perfurada de acrílico, durante os 10 dias de
protocolo. Estes animais também tiveram rotação diária de seus pares, conforme
descrito por Golden e colaboradores, 2011.
Ao fim dos 10 dias de protocolo de estresse, todos os animais retornaram
para suas gaiolas individuais.
17
Figura 2. Esquema dos protocolos de derrota social, indicando camundongo intruso
(preto) e camundongo residente agressor (branco). Diferença dos protocolos está no
período pós confronto, no qual o intruso da derrota episódica retorna para sua gaiola
moradia (a) e o intruso da derrota contínua permanece em coabitação com o
residente agressor (b) até o próximo confronto com um novo residente.
18
3.4. Avaliação da atividade locomotora
A atividade locomotora dos animais foi avaliada em caixas automáticas de
registro de locomoção Opto – M3, com dimensão de 47,5 x 25,7 x 20,5 cm
(Columbus Instruments, Columbus, Ohio), e contendo 16 pares de feixes
fotoelétricos no eixo horizontal. A interrupção subsequente de dois feixes
adjacentes foi registrada como uma unidade de atividade locomotora. A atividade
locomotora dos animais foi registrada por 30 minutos, imediatamente após
administração de droga ou veículo nos dias de teste.
3.5. Condicionamento de preferência ao lugar
O condicionamento de preferência ao lugar foi feito em caixas de acrílico
fosco divididas em três compartimentos (Insight Ltda, Brasil). Os compartimentos
laterais tinham as mesmas dimensões (15,5 cm x 12,5 cm x 12 cm, 4 pares de
feixes fotoelétricos), mas padrões distintos nas paredes internas e piso: um lado
possuía padrões verticais preto/branco nas paredes e grade de aço inoxidável
no piso, enquanto o outro lado possuía padrões horizontais preto/branco nas
paredes e barras de aço inoxidável no piso. Os compartimentos laterais eram
ligados por um compartimento central neutro (9,5 cm x 12,5 cm x 12 cm, 2 pares
de feixes fotoelétricos), com paredes em cinza e chapa de aço inoxidável no piso.
Os compartimentos eram separados por portas removíveis que permitiam o
confinamento dos animais em cada um dos compartimentos ou, quando abertas,
o livre acesso do animal a todo o aparelho. Os feixes fotoelétricos registraram o
tempo de permanência em cada compartimento.
O protocolo de condicionamento de preferência ao lugar utilizado foi
adaptado de Risinger e Oakes (1995) e consistiu em três fases: 1 – Teste pré –
condicionamento: no primeiro dia os animais foram individualmente colocados
no aparelho sem administração prévia de droga ou veículo, tendo livre acesso a
todos os compartimentos por quinze minutos. Os animais foram então
distribuídos em dois grupos (veículo e nicotina) conforme o tempo de
permanência em cada compartimento. Baseado em experimentos anteriores,
utilizou-se protocolo do tipo unbiased (sem viés), de forma que, em média, os
19
níveis de preferência inicial pelos dois compartimentos laterais foram similares
entre os grupos durante o teste pré – condicionamento. A escolha pelo
compartimento pareado com nicotina foi aleatória, porém balanceada para que
houvessem animais pareados com droga nos dois compartimentos laterais. 2 –
Fase de condicionamento: Os animais receberam administração diária de droga
ou veículo, seguido de imediato confinamento no compartimento previamente
estabelecido por um período de 15 minutos. Foram realizadas 8 sessões de
condicionamento, 4 pareadas com droga em um compartimento e 4 pareadas
com veículo no compartimento oposto, em dias alternados. Quando necessário,
4 pareamentos adicionais (2 droga, 2 veículo) foram realizados após o teste pós
condicionamento. 3 – Teste pós – condicionamento: 24 horas após o último
condicionamento foi realizado o teste pós condicionamento, exatamente
conforme descrição do primeiro teste. O tempo de permanência em cada
compartimento foi registrado em todos os testes.
3.6. Análise estatística
Todos os dados estão apresentados como média ± erro padrão (EP). A
atividade locomotora foi analisada por análise de variância (ANOVA) de medidas
repetidas, utilizando o fator grupo (controle ou estresse) como variável
independente e desafios (salina ou nicotina) como medidas repetidas. A
preferência condicionada ao lugar também foi avaliada por ANOVA de medidas
repetidas, considerando o fator grupo (controle e estresse, ou dose de nicotina)
como variável independente e o fator testes (pré e pós condicionamento) como
medidas repetidas. Em caso de detecção de efeitos significativos pela ANOVA,
a análise a posteriori utilizada foi o teste de Newman-Keuls para múltiplas
comparações. A preferência condicionada ao lugar também foi analisada por
teste t de Student pareado, considerando os testes pré e pós condicionamento
para cada grupo. Em todos os casos o nível de significância foi fixado em 5%.
20
4. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E RESULTADOS
4.1. Estudo 1: Consequências de dois protocolos de derrota social
(episódica e contínua) sobre os efeitos psicomotores da nicotina
Objetivo: Verificar as consequências da exposição prévia ao estresse de derrota
social episódica e contínua sobre os efeitos psicomotores da nicotina.
4.1.1. Experimento 1: Impacto da derrota social sobre os efeitos
psicomotores da nicotina (desafios sequenciais)
Após aclimatização ao laboratório durante pelo menos 7 dias, os
camundongos foram expostos à caixa de atividade locomotora por um período
de 30 minutos (teste de reação à novidade). Os animais foram divididos em dois
grupos: controle e estresse, os quais apresentavam níveis semelhantes de
resposta locomotora à novidade, assim como semelhantes médias de peso
corporal. Os animais do grupo estresse foram então expostos aos dois
protocolos de derrota social (episódica ou contínua), conforme descrito
previamente (item 3.3), por um período de 10 dias. Houve dois grupos controles
separados, um para cada protocolo de derrota social, como mencionado no item
3.3. Vinte e quatro horas após o último episódio de derrota social (para derrota
episódica) ou após o fim do período de coabitação (para derrota contínua), os
animais de ambos os grupos foram deslocados para outra sala. Foram então
testados nas caixas de atividade locomotora após administração de veículo
(salina), por um período de 30 minutos (desafio salina). Os animais foram então
retirados das caixas de atividade, receberam administração da dose de 0,1
mg/kg de nicotina e imediatamente retornaram para mais 30 minutos de teste
nas caixas de atividade (desafio nicotina). Os desafios salina e nicotina foram
realizados novamente 10 dias após o fim dos protocolos de derrota social, como
mostrado na linha do tempo (figura 3).
21
Para avaliação das consequências da derrota social sobre os efeitos
psicomotores da nicotina optamos por trabalhar apenas com a dose de 0,1
mg/kg, uma vez que esta apresenta efeitos agudos neutros e tendência a efeitos
crônicos estimulantes, conforme descrito no item 3.2. Nossa hipótese era a de
que o estresse de derrota social episódica, mas não contínua, viria a favorecer
a expressão do efeito estimulante dessa dose (sensibilização cruzada).
A ANOVA de uma via não mostrou diferenças estatísticas preexistentes
entre grupo controle e estresse durante o teste de reação à novidade (figuras 4a
e 4c). A ANOVA de medidas repetidas comparando o grupo estresse de derrota
social episódica e seu controle durante os testes locomotores (salina e nicotina)
detectou diferenças significativas para o fator testes (F(3,51)=17,23; p<0,001), mas
não para o fator grupo (F(1,51)=1,47; p=0,24) ou para a interação entre fatores
(F(3,51)=0,35; p=0,79). Análise a posteriori desprotegida indicou que a nicotina
induziu redução da atividade locomotora no grupo controle, tanto a curto quanto
a longo prazo, em comparação com os respectivos desafios salina. O grupo
Figura 3. Linha do tempo experimento 1 – impacto da derrota social sobre
os efeitos psicomotores da nicotina (desafios sequenciais). Durante este
protocolo um grupo de animais passou por dez dias de derrota social
episódica (controles mantidos isolados), enquanto outro grupo passou por
10 dias de derrota social contínua (controles mantidos aos pares). A barra
cinza corresponde ao período do protocolo de derrota social. Neste
experimento os desafios foram conduzidos no mesmo dia, de forma
sequencial: 24 horas (desafios a curto prazo) e 10 dias (desafios a longo
prazo) após o fim de cada protocolo de derrota social a atividade
locomotora dos animais foi testada após administração de salina e, em
seguida, após administração de nicotina (0,1 mg/kg).
22
derrota episódica apresentou redução da atividade locomotora induzida por
nicotina a curto, mas não a longo prazo, quando comparado com os respectivos
desafios salina. Não houve diferenças entre grupos controle e estresse episódico
em nenhum dos testes (figura 4b).
Para o protocolo de derrota social contínua a ANOVA de medidas
repetidas não detectou diferenças para o fator grupo (F(1,54)=0,12; p=0,74), no
entanto houve diferenças estatisticamente significativos para o fator testes
(F(3,54)=53,21; p=0<001) e para a interação entre os fatores grupo e testes
(F(3,54)=4,23; p=0,009). Análise a posteriori indicou que tanto o grupo controle
quanto o grupo derrota contínua apresentaram atividade locomotora reduzida
após administração de nicotina nos testes a curto e a longo prazo, em
comparação com os respectivos desafios salina. Não houve diferenças entre os
grupos (controle e estresse contínuo) em nenhum dos testes (figura 4d).
23
Figura 4. Resposta locomotora (média ± EP) registradas no teste de reação à
novidade (antes do início das derrotas; a, c) e nos desafios salina e nicotina (0,1
mg/kg, s.c.) (b, d) em camundongos expostos aos protocolos de estresse crônico
de derrota social episódica (a, b) ou contínua (c, d). Desafios a curto prazo foram
conduzidos 24 horas após o fim dos protocolos de derrota social, enquanto os
desafios a longo prazo foram conduzidos 10 dias após o fim desses protocolos.
Os desafios salina e nicotina foram realizados em sequência: animais receberam
salina e tiveram atividade locomotora registrada por 30 minutos, logo em seguida
receberam administração de nicotina e voltaram para as caixas de atividade para
mais 30 minutos de registro. + atividade locomotora no desafio nicotina diferente
do respectivo desafio salina (p<0,05).
24
Em experimentos anteriores de padronização (dados não mostrados),
havíamos observado a ausência de efeitos locomotores para a administração
aguda de nicotina na dose de 0,1 mg/kg, em camundongos “naive”. Assim,
consideramos inesperada a supressão locomotora apresentada pelos animais,
principalmente dos grupos controle de ambos os protocolos de derrota social
(episódica e contínua). Levantamos três hipóteses quanto ao que poderia estar
induzindo esse efeito: 1. A droga utilizada poderia ter deteriorado; 2. O efeito da
droga seria diferente para animais alojados em grupo (como durante a
padronização) e animais em isolamento social (neste experimento); 3. O
momento de administração da droga interfere em seus efeitos, já que neste
experimento a nicotina foi administrada em sequência ao desafio salina,
enquanto que na padronização o efeito da nicotina foi testado separadamente.
Testamos essas hipóteses em experimentos adicionais (dados não mostrados)
que demonstraram que o efeito atenuador da atividade locomotora induzido pela
dose de 0,1 mg/kg de nicotina estava sendo favorecido pelos desafios
sequenciais, no qual o efeito da nicotina foi avaliado imediatamente após os
animais terem sido testados com salina.
Uma vez que o protocolo utilizado neste experimento teve fatores não
previstos influenciando os resultados, optamos por realizar um novo experimento
para avaliação das consequências da derrota social sobre os efeitos
psicomotores da nicotina, no qual os desafios salina e droga seriam realizados
em dias distintos.
4.1.2. Experimento 2: Impacto da derrota social sobre os efeitos
psicomotores da nicotina (desafios em dias separados)
O segundo experimento, para análise das consequências da derrota
social sobre os efeitos psicomotores da nicotina, foi realizado de forma similar
ao primeiro, descrito no item 4.1.1, passando pelo teste de reação à novidade e
10 dias de derrota social (protocolos de derrota episódica e derrota contínua). A
única diferença entre os experimentos está no momento de realização dos
25
desafios salina e nicotina: no experimento 2, todos os animais passaram pelo
desafio salina três horas após o último episódio de derrota social (derrota
episódica) ou período de coabitação (derrota contínua), enquanto o desafio
nicotina foi realizado 24 horas após o fim do protocolo de derrota social. Os
desafios salina e nicotina foram repetidos respectivamente 9 e 10 dias após o
fim do protocolo de derrota social. Dois dias após o último desafio nicotina foi
realizado um desafio adicional, com a dose de 1,0 mg/kg de metanfetamina,
como mostrado na linha do tempo (figura 5).
A ANOVA de uma via não mostrou diferenças estatísticas preexistentes
entre grupo controle e estresse durante o teste de reação à novidade (figuras 6a
e 6c). A ANOVA de medidas repetidas comparando o grupo estresse de derrota
episódica e seu controle durante os testes locomotores (salina e nicotina) não
identificou diferença significativa para o fator grupo (F(1,48)=1,29; p=0,27), mas
revelou efeito significativo para o fator testes locomotores (F(3,48)=8,621;
p<0,001), além de interação significativa entre os fatores grupo e testes
Figura 5. Linha do tempo experimento 2 – impacto da derrota social sobre os efeitos
psicomotores da nicotina (desafios em dias separados). Durante este protocolo um grupo
de animais passou por dez dias de derrota social episódica (controles mantidos isolados),
enquanto outro grupo passou por 10 dias de derrota social contínua (controles mantidos
aos pares). Barra cinza corresponde ao período do protocolo de derrota social. Neste
experimento os desafios foram conduzidos em dias diferentes: os desafios a curto prazo
foram realizados 3 horas (salina) e 24 horas (nicotina) após o fim de cada protocolo de
derrota social, enquanto os desafios a longo prazo foram conduzidos 9 e 10 dias após o
fim desses protocolos.
26
locomotores (F(3,48)=3,701; p=0,018). Nos animais do grupo controle, análise a
posteriori indicou uma supressão locomotora induzida por nicotina no desafio a
curto prazo, em comparação com o respectivo desafio salina (p<0,05), efeito que
não foi observado no desafio a longo prazo. Já no grupo submetido ao estresse
episódico, observou-se ausência de efeitos locomotores induzidos pela nicotina,
em comparação com as respostas locomotoras à salina, tanto nos desafios a
curto quanto a longo prazo. No entanto, o grupo derrotado apresentou maior
atividade locomotora nos desafios a longo prazo (salina e nicotina) do que nos
respectivos desafios a curto prazo (p<0,05). Isso sugere uma redução da
atividade locomotora nos testes de curto prazo (até 24 horas) pós protocolo de
estresse de derrota episódica, que retorna a níveis mais altos nos desafios a
longo prazo. Não houve diferenças entre grupos controle e estresse de derrota
episódica em nenhum dos testes (figura 6b).
Para o protocolo de derrota social contínua a ANOVA de medidas
repetidas indicou um efeito significativo para os fatores grupos (F(1,42)=18,6;
p=0,001) e testes locomotores (F(3,42)=5,8; p=0,002), além de significativa
interação entre os fatores (F(3,42)=4,13; p=0,012). Análise a posteriori da
interação indicou diferenças entre os grupos controle e estresse de derrota
contínua nos dois desafios a curto prazo (salina e nicotina), nos quais o grupo
derrota contínua apresentou menor atividade locomotora em relação ao grupo
controle (p<0,05). Não foram observadas diferenças entre grupos nos testes a
longo prazo. Comparações entre os testes do grupo derrota contínua indicaram
uma tendência de intensificação da atenuação locomotora induzida pela nicotina
durante os desafios a curto prazo (p=0,06). Essa redução de atividade
locomotora não foi observada no desafio nicotina a longo prazo. Neste teste, o
grupo estressado continuamente apresentou maior atividade locomotora do que
no desafio nicotina a curto prazo (p<0,05), sugerindo tolerância aos efeitos
psicomotores da nicotina. Foi observada atenuação locomotora induzida por
nicotina durante o desafio a curto prazo do grupo controle (p<0,05 em relação
ao respectivo desafio salina), efeito que não foi observado no desafio a longo
prazo (figura 6d).
27
Figura 6. Resposta locomotora (média ± EP) registradas no teste de reação à
novidade (antes do início das derrotas; a, c) e nos desafios salina e nicotina (0,1
mg/kg, s.c.) (b, d) em camundongos expostos aos protocolos de estresse crônico
de derrota social episódica (a, b) ou contínua (c, d). Desafios salina e nicotina
foram conduzidos em dias separados: desafios a curto prazo foram conduzidos 3
horas (salina) e 24 horas (nicotina) após o fim dos protocolos de derrota social,
enquanto os desafios a longo prazo foram conduzidos 9 dias (salina) e 10 dias
(nicotina) após o fim desses protocolos. * atividade locomotora diferente do grupo
controle no mesmo teste; + atividade locomotora diferente do desafio salina
equivalente; # atividade locomotora diferente entre o referido desafio a curto e a
longo prazo. Em todos os casos, p<0,05.
28
Com o intuito de verificar a capacidade dos animais de apresentar
resposta estimulante frente a um psicoestimulante típico, nós comparamos os
dados do segundo desafio salina (desafio a longo prazo) com os dados
referentes ao desafio metanfetamina (realizado dois dias após o último desafio
nicotina). Para o protocolo de derrota social episódica a ANOVA de medidas
repetidas não detectou diferenças significativas para o fator grupo (F(1,16)=0,11;
p=0,74) ou para a interação entre fatores (F(1,16)=0,07; p=0,79). Também não
foram observadas diferenças para os fatores grupo (F(1,14)=2,43; p=0,14) e
interação entre fatores (F(1,14)=0,05; p=0,83) para o protocolo de derrota social
contínua. No entanto, para cada protocolo de derrota social (episódica e
contínua) a ANOVA de medidas repetidas detectou efeito significativo para o
fator teste: F(1,16)=21,35 (p<0,001) para derrota episódica (figura 7a) e
F(1,14)=13,52 (p=0,002) para derrota contínua (figura 7b). Análise a posteriori
desprotegida indicou que a metanfetamina induziu significativa hiperatividade
locomotora (p<0,05) para ambos os grupos (controle e estresse) do protocolo de
derrota episódica, enquanto no protocolo de derrota social contínua a
hiperatividade induzida por metanfetamina foi observada somente para o grupo
controle (p<0,05), havendo apenas uma tendência de estimulação para o grupo
derrota contínua (p=0,068).
29
Figura 7. Resposta locomotora (média ± EP) registradas no desafio salina
e metanfetamina (1 mg/kg, i.p.) em camundongos expostos aos protocolos
de estresse crônico de derrota social episódica (a) ou contínua (b). Desafio
salina foi conduzido 9 dias após o fim do protocolo de derrota social,
enquanto desafio metanfetamina foi conduzido 2 dias após o último
desafio nicotina. + atividade locomotora diferente do desafio salina
(p<0,05)
30
4.2. Estudo 2: Consequências de dois protocolos de derrota social
(episódica e contínua) sobre os efeitos reforçadores condicionados
da nicotina
Objetivo:
- Estabelecer uma curva dose-resposta do condicionamento de
preferência ao lugar induzido pela nicotina.
- Verificar as influências do estresse de derrota social episódica e contínua
sobre a preferência ou aversão condicionada ao lugar induzida pela nicotina.
4.2.1. Experimento 3: Padronização da PCL induzida por nicotina
Os animais alojados em grupos (4 a 5 animais por caixa) e, após período
de aclimatização ao laboratório, foram expostos ao protocolo de PCL descrito
previamente (item 3.5). Com base nos dados do teste pré-condicionamento
esses animais foram divididos em 4 grupos, conforme o tratamento a ser
recebido durante o protocolo de PCL: salina (grupo controle); nicotina 0,1 mg/kg;
nicotina 0,4 mg/kg e nicotina 1,0 mg/kg. Foram realizadas então 8 sessões de
pareamento (1 sessão por dia) e 1 teste pós condicionamento, conforme descrito
previamente (ver figura 8).
31
Os dados da preferência condicionada ao lugar estão apresentados como
escore de preferência, ou seja, porcentagem de tempo de permanência no
compartimento pareado com nicotina menos a porcentagem de tempo de
permanência no compartimento pareado com veículo em cada teste (média
±EP). A ANOVA de medidas repetidas não detectou efeito significativo para os
fatores tratamento (F(3,36)=0,41; p=0,74), testes (F(1,36)=2,14; p=0,15) ou para a
interação entre esses fatores (F(3,36)=2,01; p=0,130), sugerindo que nenhuma
das doses de nicotina induziu preferência ou aversão condicionada ao lugar. No
entanto, apesar da ausência de significância estatística, o grupo tratado com a
dose de 0,4 mg/kg de nicotina aparentou apresentar uma tendência a aversão
ao ambiente pareado com a droga. Uma análise complementar com esse grupo,
teste T pareado entre os testes pré e pós condicionamento, confirmou esse efeito
não detectado pela ANOVA de medidas repetidas (t=3,84, p=0,003), indicando
o condicionamento de aversão ao lugar induzido pela dose de 0,4 mg/kg de
nicotina. Análise com teste T pareado não detectou diferenças entre os testes
pré e pós condicionamento para nenhum dos outros grupos (figura 9).
Figura 8: Linha do tempo experimento 3 – padronização do
protocolo de preferência condicionada ao lugar induzida por
nicotina. Cores alternadas indicam pareamento com nicotina (■) ou
salina (■).
32
Uma vez que trabalhamos em cima da hipótese de que o estresse de
derrota social viria a potencializar os efeitos reforçadores da nicotina, optamos
por utilizar a dose mais baixa da droga (0,1 mg/kg), que neste momento
apresentou efeitos neutros. Esperávamos que após exposição ao estresse de
derrota social episódica, mas não contínua, essa mesma dose viria a induzir
preferência ou aversão condicionada ao ambiente em que foi pareada.
4.2.2. Experimento 4: Consequências da derrota social sobre a
aquisição da PCL induzida por nicotina
Como descrito previamente (item 3.3), os animais foram distribuídos em
grupos controle e estresse e expostos a 10 dias de protocolo de derrota social
(episódica e contínua). Como mostrado na linha do tempo (figura 10), sete dias
após o fim do protocolo de derrota social os animais foram submetidos ao
protocolo de PCL para nicotina, com 8 pareamentos iniciais seguidos do teste
Figura 9. Escore de preferência (porcentagem, média ± EP) na padronização do
protocolo de preferência condicionada ao lugar induzida por nicotina. * diferença
entre os testes pré e pós condicionamento para o referido grupo (p<0,05).
33
pós condicionamento. Devido à ausência de condicionamento após 8
pareamentos, foram realizados ainda 4 pareamentos adicionais e um novo teste
pós condicionamento, sendo que somente este último teste pós
condicionamento foi considerado para análise. Cinco e sete dias após o término
do protocolo de PCL, os animais tiveram sua atividade locomotora avaliada após
administração de salina e nicotina (0,1 mg/kg, s.c.), respectivamente.
Foram considerados para análise somente o teste pré condicionamento e
o segundo teste pós condicionamento, uma vez que o primeiro teste pós
condicionamento não indicou nenhuma alteração nos escores de preferência
(dados não mostrados). A ANOVA de medidas repetidas não detectou efeito
significativo para os fatores grupo (controle e estresse) (F(1,15)=0,86; p=0,77),
testes (F(1,15)=1,63; p=0,22) ou para a interação entre esses fatores (F(1,15)=0,12;
p=0,73) para o protocolo de derrota episódica, e nem para os mesmo fatores do
protocolo de derrota contínua (grupo (F(1,16)=1,90; p=0,19), testes (F(1,16)=1,23;
p=0,28), interação (F(1,16)=2,16; p=0,16). A exposição crônica tanto à derrota
episódica (figura 11a) quanto à derrota contínua (figura 11b) não interferiu com
a aquisição da preferência ou aversão condicionada induzida por nicotina. Nas
mesmas condições, ambos os grupos controle também não apresentaram
preferência significativa pelo ambiente pareado com nicotina mesmo após os 4
pareamentos adicionais (2º teste pós condicionamento). O grupo controle da
derrota episódica, no entanto, pareceu apresentar uma tendência à aversão ao
Figura 10. Linha do tempo experimento 4 – Consequências da derrota social sobre
a aquisição da PCL induzida por nicotina. Barra cinza corresponde ao período do
protocolo de derrota social. Cores alternadas indicam pareamento com nicotina (■)
ou salina (■). Somente o teste pré condicionamento e o segundo teste pós
condicionamento (dia 31) foram considerados para análise da PCL.
34
ambiente pareado com nicotina, o que não foi evidenciado pela análise com teste
t de Student (t=1,81; p=0,11).
Cinco e sete dias após o protocolo de PCL os animais foram desafiados com
salina e nicotina, respectivamente. Para o protocolo de derrota episódica, a
ANOVA de medidas repetidas detectou efeito significativo do fator desafio
Figura 11. Escore de preferência pelo compartimento associado à nicotina
(porcentagem, média ± EP) no protocolo de preferência condicionada ao lugar
induzida por nicotina (0,1 mg/kg), conduzido 7 dias após o fim dos protocolos
de 10 dias de derrota social episódica (a) e contínua (b), com seus respectivos
grupos controle.
35
(F(1,15)=6,77; p=0,02), mas ausência de efeito para o fator grupo (F(1,15)=2,20;
p=0,16) ou para a interação entre fatores(F(1,15)=2,53; p=0,13). A análise a
posteriori desprotegida revelou que somente o grupo derrota episódica
apresentou supressão locomotora induzida por nicotina em comparação com o
desafio salina, efeito não observado no grupo controle (figura 12a). A ANOVA de
medidas repetidas para o protocolo de derrota contínua identificou diferenças
significativos para o fator desafio (F(1,16)=6,13; p=0,02), mas não para o fator
grupo (F(1,16)=1,43; p=0,25) ou para a interação entre fatores (F(1,16)=1,99;
p=0,18). A análise a posteriori revelou que o grupo controle apresentou resposta
locomotora reduzida no desafio nicotina, em comparação com o desafio salina,
enquanto o grupo derrota contínua não apresentou nenhum efeito da nicotina
(figura 12b).
36
Figura 12. Atividade locomotora (média ± EP) registrada nos desafios salina
e nicotina (0,1 mg/kg), conduzidos 5 e 7 dias após o fim do protocolo de PCL,
respectivamente, em animais previamente expostos cronicamente ao
estresse de derrota social episódica (a) ou contínua (b). + atividade
locomotora diferente entre desafios salina e nicotina (p<0,05).
37
5. DISCUSSÃO
Este foi o primeiro estudo que sistematicamente comparou dois tipos de
estresse de derrota social (episódica e contínua), com tempos de duração
equivalentes, ocorrendo simultaneamente e utilizando o mesmo grupo de
residentes agressores em ambos os protocolos. Também foi o primeiro estudo a
avaliar as consequências da derrota social crônica sobre os efeitos psicomotores
e reforçadores condicionados da nicotina.
Nossa hipótese de que os protocolos de derrota social episódica e contínua
promoveriam efeitos distintos sobre os efeitos psicomotores e reforçadores
condicionados da nicotina foi parcialmente confirmada. Observamos que o
estresse de derrota social contínua, e não episódica, como esperado, viria a
aumentar os efeitos psicomotores da nicotina a curto prazo, favorecendo uma
atenuação da atividade locomotora após administração da droga. No entanto,
animais com histórico de exposição à nicotina após protocolo de estresse de
derrota episódica (durante PCL) apresentaram atenuação locomotora quando
reexpostos à nicotina após período de retirada da droga, o que não foi observado
pelos animais previamente expostos à derrota contínua. Nosso estudo não
confirmou nossa hipótese de que o estresse de derrota social episódica facilitaria
a PCL induzida por nicotina, enquanto o estresse de derrota social contínua viria
a prevenir a PCL, de forma similar às consequências da derrota episódica e
contínua na autoadministração de cocaína (Miczek et al, 2011).
5.1 Interações entre estresse de derrota social e efeitos
psicomotores da nicotina
Dados da literatura indicam que o estresse caracteristicamente induz
redução da atividade locomotora (Martinez et al, 1998; Blanchard et al, 2001;
Beery & Kaufer, 2015), assim como observamos em nosso estudo. No entanto,
esta foi uma consequência imediata da derrota social crônica, observada nos
desafios a curto prazo (ocorridos até 24 horas após o fim do protocolo de
38
estresse) mas não nos desafios a longo prazo (ocorridos 9-10 dias após o
protocolo de estresse). Em nosso estudo, a redução da atividade locomotora foi
consequência de ambos os protocolos de derrota social (contínua e episódica),
no entanto, Miczek et al (2011) reportou que o protocolo crônico de derrota
contínua, mas não episódica, reduziria os comportamentos exploratórios em
testes de campo aberto ocorridos poucas horas após a derrota social. Assim
como em nosso estudo, nenhum dos protocolos de derrota social afetou a
atividade locomotora dos animais frente a um desafio com salina 10 dias após o
fim do protocolo de estresse (Miczek et al, 2011). A ausência de supressão
locomotora logo após o protocolo de derrota social episódica indicada por Miczek
e colaboradores (2011) pode ser decorrente de diferenças nos protocolos, uma
vez que o protocolo de derrota social episódica consistiu em quatro confrontos
espaçados em 72 horas (4 derrotas em 10 dias), enquanto o protocolo de derrota
social contínua compreendeu cinco derrotas semanais ao longo de cinco
semanas (Miczek et al, 2011). Em nossos dois protocolos de estresse, houve 10
derrotas em 10 dias, e nessas condições, ambos os tipos de derrota promoveram
redução de atividade motora exploratória a curto prazo.
Em animais com histórico de derrota social episódica a nicotina não induziu
alterações da atividade locomotora. No entanto, esta droga pareceu potencializar
a supressão locomotora de curto prazo induzida pelo estresse de derrota social
contínua. Houve tolerância a este efeito no desafio com nicotina a longo prazo.
Nossos dados sugerem que as consequências do estresse sobre os efeitos
psicomotores da nicotina podem ser diferentes conforme o protocolo de derrota
social, assim como entre diferentes estressores. Por exemplo, Cruz e
colaboradores (2008) relataram que o estresse crônico de restrição favoreceu o
efeito estimulante da nicotina em ratos, enquanto outro estudo não detectou
nenhum efeito significativo do estresse utilizando protocolo semelhante (Zago et
al, 2012). Utilizando o estresse crônico variado, Leão e colaboradores (2012)
observaram que a exposição ao estresse aumentou a estimulação induzida por
nicotina. No entanto, todos esses experimentos que observaram favorecimento
do efeito estimulante da nicotina foram realizados em ratos. Portanto há a
possibilidade de diferentes perfis de sensibilidade e de resposta ao estresse
crônico ou à própria nicotina, em espécies diferentes (ratos e camundongos,
39
neste caso). Há relatos de que o estresse de derrota social em camundongos
induz sensibilização cruzada a um desafio com metanfetamina (Yap et al, 2007),
mas não ao efeito estimulante do etanol (Norman et al, 2015). Dessa forma, é
possível que diferentes consequências da derrota social sejam observadas
conforme a droga administrada.
Curiosamente, em animais derrotados que foram expostos à nicotina durante
protocolo de preferência condicionada ao lugar, observamos efeitos a longo
prazo da droga, durante o desafio nicotina realizado 29 dias após a derrota
social. Neste momento, o grupo derrotado episodicamente apresentou resposta
locomotora reduzida no desafio nicotina, enquanto o grupo derrotado
continuamente não foi afetado pela droga. Enquanto em nosso estudo a
exposição ao estresse e à nicotina ocorreram em diferentes fases do protocolo,
outros estudos avaliaram as consequências da exposição concomitante ao
estresse e nicotina. Kita e colaboradores (1999) observaram que ratos que
recebem nicotina imediatamente após cada sessão de estresse psicológico, no
qual testemunhavam outros ratos recebendo choque nas patas, apresentaram
estimulação locomotora exacerbada nos dias 5 e 10 do tratamento combinado.
Harris e colaboradores (2014) relataram que a exposição à nicotina durante
estresse de restrição preveniu a supressão locomotora de curto prazo induzida
pelo protocolo de estresse, no entanto não foram observados efeitos da nicotina
a longo prazo (ver também Zago et al, 2012). Sendo assim, podemos dizer que
não somente o tipo de estressor como também o intervalo entre a exposição ao
estresse e à droga pode ser crítico na determinação das consequências da
exposição ao estresse sobre os efeitos psicomotores da nicotina.
5.2. Interações entre estresse de derrota social e efeitos reforçadores
condicionados da nicotina
Dados da literatura sugerem que a nicotina pode induzir tanto preferência
condicionada ao lugar (Risinger & Oakes, 1995, Kashkin & Witte, 2005; Brunzell
et al, 2009; Brielmaier et al, 2008; Ise et al, 2014; Kutlu et al, 2015) quanto
40
aversão condicionada ao lugar (Risinger 1995; Ise 2014; Kutlu et al, 2015;
Jorenby et al, 1990), efeitos que são dependentes da dose da droga e da
linhagem dos animais. Em nosso estudo não observamos a indução de
preferência nem de aversão condicionada após os protocolos de estresse de
derrota social. O experimento de padronização do protocolo de preferência /
aversão condicionada induzido por nicotina (item 4.2.1) demonstrou que a dose
de 0,4 mg/kg de nicotina induzia aversão condicionada ao lugar, então optamos
por trabalhar com a dose de 0,1 mg/kg, a qual se mostrou neutra neste e também
em outro estudo com camundongos (Risinger & Oakes, 1995). Nos baseamos
na hipótese de que o estresse favoreceria a aquisição de preferência
condicionada ao lugar induzida por essa dose, como observado por Brielmaier e
colaboradores (2012) com a dose de 0,2 mg/kg de nicotina, a qual induziu
preferência condicionada ao lugar em ratos adolescentes estressados, mas não
teve efeito nos animais controle.
Alguns fatores podem ter influenciado nossos resultados, como o intervalo
entre a exposição ao estresse e ao protocolo de PCL ou o tipo de estressor
utilizado. Em nosso estudo o protocolo de preferência condicionada ao lugar teve
início uma semana após o fim dos protocolos de derrota social, no entanto
Brielmaier e colaboradores (2012) relataram que uma única sessão de estresse
de choque nas patas favoreceu a aquisição de preferência condicionada
induzida por nicotina, utilizando apenas uma sessão de condicionamento 24
horas após o evento estressor. Por outro lado, Al-Hasani e colaboradores (2013)
também não viram interferência da exposição ao estresse crônico moderado na
aquisição de preferência condicionada ao lugar induzida por nicotina, em
protocolo iniciado 24 horas após o fim do protocolo de estresse.
Em nosso estudo nós avaliamos as consequências da exposição crônica
ao estresse de derrota social na aquisição da PCL induzida por nicotina. Outros
estudos sugerem que a exposição ao estresse pode ser relevante em outras
fases do protocolo de PCL, como a extinção ou reinstalação da preferência pelo
ambiente pareado com a droga. Leão e colaboradores (2009) e Jackson e
colaboradores (2013) observaram que um único dia de estresse de restrição ou
dois dias de estresse de nado forçado, respectivamente, induziram a
reinstalação da preferência ao lugar induzida por nicotina. Leão e colaboradores
41
(2010) também reportaram que a exposição ao estresse crônico de restrição
retarda a extinção da preferência condicionada induzida por nicotina, mas não
interfere com a reinstalação por. Al-Hasani e colaboradores (2013) observou que
o estresse crônico moderado também não interfere com a reinstalação de PCL
induzida por administração aguda da droga.
Ainda que em nosso estudo o estresse social não tenha afetado a
aquisição de PCL induzida por nicotina, dados da literatura sugerem que ele
pode afetar a PCL induzida por outras drogas em camundongos (Montagud-
Romero et al, 2015; Ribeiro do Couto et al, 2009). Ribeiro do couto e
colaboradores (2009) utilizaram diferentes condições de alojamento como
estressores sociais crônicos em camundongos adolescentes e adultos,
avaliando as consequências dessas experiências sobre a aquisição da
preferência condicionada ao lugar induzida por cocaína. Os animais foram
alojados em grupo (n=4 por gaiola moradia), isoladamente, em superlotação
(introdução de um novo animal a cada dois dias, até que houvessem 8 animais
por gaiola moradia) ou pareados com uma fêmea, permanecendo nessas
condições por duas semanas até o início e também durante todo o protocolo de
PCL. Observaram que a condição de isolamento social preveniu a aquisição de
preferência condicionada pela dose de 3,125 mg/kg de cocaína em
camundongos adolescentes, não sendo reportados outros prejuízos de
aquisição para doses mais elevadas ou para camundongos adultos. No entanto,
em camundongos adultos alojados em grupo, o isolamento social ocorrido após
a aquisição da PCL potencializou a reinstalação da preferência após
administração aguda de cocaína. Da mesma forma, a ocorrência prévia de um
episódio de derrota social também potencializou a reinstalação da PCL (Ribeiro
do Couto et al, 2009). Já Montagud-Romero e colaboradores (2015) verificaram
que a exposição a um episódio de derrota social antes de cada sessão de
condicionamento na PCL por cocaína (1,0 mg/kg) viria a prevenir a instalação de
preferência em camundongos adolescentes, no entanto, além de não interferir
na aquisição de PCL em animais adultos, também veio a favorecer a reinstalação
dessa preferência frente à uma exposição aguda à droga.
A variabilidade de influências do estresse nos efeitos reforçadores da
nicotina também foi observada em protocolos de autoadministração operante,
42
nos quais os animais devem desempenhar determinado comportamento para
que ocorra o recebimento da droga. Leão e colaboradores (2012) relataram que
o estresse crônico moderado aumentou a motivação para busca de nicotina em
protocolo de autoadministração em razão progressiva. Por outro lado, Zou e
colaboradores (2014) observaram que a exposição repetida ao estresse de
derrota social episódica não afetou a aquisição da autoadministração de nicotina
nem o padrão de resposta em protocolo de razão progressiva. Buczek e
colaboradores (1999) observaram que uma única sessão de estresse de choque
nas patas induziria a reinstalação da busca por nicotina em protocolo de
autoadministração operante. É possível também que cada tipo de estressor
induza consequências diferentes conforme a droga testada. Por exemplo, Cruz
e colaboradores (2011) relataram que ratos expostos ao estresse de derrota
social episódica apresentaram aumento escalado da autoadministração de
cocaína e speedball (mistura de cocaína e heroína), mas não de heroína, durante
uma sessão com 24 horas de acesso à droga.
Nosso estudo não confirmou nossa hipótese de que o estresse de derrota
social episódica facilitaria a PCL induzida por nicotina, enquanto o estresse de
derrota social contínua viria a prevenir a PCL; de forma similar às consequências
da derrota episódica e contínua na autoadministração de cocaína (Miczek et al,
2011).
No entanto, observamos perfis de resposta diferentes entre os grupos
controle de cada protocolo de derrota social (episódica e continua). Ainda que
não tenham sido encontradas diferenças significativas, o grupo controle
episódico deslocou-se no sentido de permanecer mais tempo no ambiente
pareado com a droga, enquanto o grupo controle contínuo deslocou-se no
sentido de permanecer mais tempo no ambiente pareado com veículo. Uma
análise comparativa entre a resposta desses dois grupos no segundo teste pós
condicionamento (ANOVA de uma via) revelou que essas repostas são
significativamente opostas (F(1,14)=4,96; p=0,04). Já nos testes locomotores
realizados após o protocolo de PCL, o grupo controle contínuo, mas não
episódico, apresentou redução da atividade locomotora após administração de
nicotina (p<0,05). Esse perfil diferente de resposta observada entre os grupos
controle episódico e contínuo pode ser decorrente de influencias sociais, como
43
as condições de alojamento. É sabido que as condições sociais influenciam as
respostas às drogas de abuso (para revisão ver Aguilar et al (2013); Bardo et al,
2013), sendo que o isolamento social por si só é considerado um agente
estressor capaz de modificar o efeito dos psicoestimulantes (Ribeiro do Couto et
al (2009); Aguilar et al (2013); Bardo et al, 2013). Devemos considerar que em
nosso experimento os animais controles da derrota episódica foram
permanentemente mantidos em isolamento social, enquanto os animais
controles da derrota contínua permaneceram aos pares, ainda que sem contato
físico, durante os 10 dias do protocolo de derrota social. Essas diferenças
observadas nas respostas dos dois grupos reforça a necessidade de utilização
de grupos controles apropriados para cada protocolo de derrota social,
permitindo assim reduzir a interferência de fatores sociais além daqueles de
interesse no estudo.
O estudo das consequências do estresse sobre os efeitos
comportamentais e reforçadores das drogas de abuso é fundamental para o
avanço no entendimento dos mecanismos neurobiológicos envolvidos nessa
questão e suas manifestações. A utilização do estresse de derrota social, além
de favorecer a análise de um comportamento orgânico aos camundongos,
permite uma aproximação das condições clínicas, uma vez que a maioria dos
eventos estressores vivenciados por seres humanos são de natureza social.
Além disso, o entendimento de que diferentes tipos de estressores, ainda que de
natureza similares, podem induzir consequências distintas, e que essas
consequências podem também variar conforme a droga de abuso em questão,
permite uma melhor avaliação dos casos de vulnerabilidade à dependência de
substâncias, podendo auxiliar na elaboração de estratégias de prevenção e
tratamento da dependência de drogas.
44
6. CONCLUSÃO
Este foi o primeiro estudo que sistematicamente comparou dois tipos de
estresse de derrota social (episódica e contínua) sobre os efeitos psicomotores
e reforçadores da nicotina. Ambos os protocolos de estresse crônico de derrota
social induziram redução da atividade locomotora a curto prazo, consequência
que não foi mais observada 9 dias após o fim dos protocolos de estresse. Houve
tendência de potencialização desse efeito supressor inicial induzido pela derrota
social contínua, mas não episódica, após administração de nicotina; no entanto,
10 dias após o fim do protocolo de estresse esse efeito sedativo da nicotina foi
tolerado. Nenhum dos protocolos de derrota social facilitou a aquisição da
preferência ou aversão condicionada induzida por nicotina, porém, os animais
derrotados episodicamente apresentaram supressão locomotora induzida por
nicotina uma semana após o fim do protocolo de PCL, enquanto o grupo
derrotado continuamente apresentou sinais de tolerância a esse efeito supressor
da nicotina.
A utilização do estresse de derrota social permite uma aproximação das
condições clínicas, uma vez que a maioria dos eventos estressores vivenciados
por seres humanos são de natureza social. Além disso, o entendimento de que
diferentes tipos de estressores, ainda que de natureza similares, podem induzir
consequências distintas, e que essas consequências podem também variar
conforme a droga de abuso em questão, permite uma melhor avaliação dos
casos de vulnerabilidade à dependência de substâncias, podendo auxiliar na
elaboração de estratégias de prevenção e tratamento da dependência de
drogas.
45
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXO 1
Rua Botucatu, 572, 1º andar conjunto 14 CEP 04023-061 São Paulo - tel: 55 (11) 5571-1062 / fax: 55 (11) 5539-7162
Horário de atendimento: das 9:00 as 13:00hs : e-mail:[email protected]
CEUA Nº 2406280214
São Paulo, 17 de abril de 2014
CEUA N 2406280214
IImo(a). Sr(a).
Pesquisador(a): Liz Paola Domingues
Depto/Disc: Departamento De Psicobiologia, Disciplina De Psicofarmacologia
Pesquisadores associados: Giovana Camila De Macedo (unifesp); Profa Dra Isabel Marian Hartmann De Quadros
(orientador)
Título do projeto: "Efeitos do estresse de derrota social sobre os efeitos estimulantes e reforçadores condicionados da nicotina
em camundongos".
Parecer Consubstanciado da Comissão de Ética no Uso de Animais UNIFESP/HSP
Atualmente cerca de um terço da população mundial é fumante, sendo que 10% da população brasileira preenche critérios de
dependência ao tabaco. O tabagismo é considerado a principal causa de morte evitável no mundo; no Brasil os números
ultrapassam 200 mil óbitos ao ano em decorrência deste hábito. A principal ação da nicotina relacionada com o
desenvolvimento da dependência é a ativação do sistema de recompensa cerebral levando ao aumento de dopamina no
núcleo accumbens, o que é comum a quase todas as drogas de abuso e está relacionado aos efeitos reforçadores das
mesmas. O estresse social é capaz de induzir neuroadaptações no sistema de recompensa cerebral de maneira semelhante
ao que ocorre com a administração repetida de drogas de abuso, sendo capaz então de potencializar seus efeitos reforçadores.
Pouco foi descrito a respeito das influências do estresse de derrota social sobre os comportamentos relacionados à
dependência de nicotina. Tendo em vista que ambos os tipos de estresse de derrota social – episódico e contínuo - podem
influenciar os comportamentos relacionados à dependência de drogas de maneiras opostas, este projeto tem o interesse de
comparar as consequências desses dois tipos de estresse sobre os efeitos estimulantes e reforçadores condicionados da
nicotina, em camundongos. Para avaliar possíveis alterações nos efeitos estimulantes ou depressores da nicotina, será
avaliada a resposta locomotora a um desafio com a droga, após os animais terem sido expostos a cada tipo de estresse social.
Já os efeitos reforçadores condicionados da nicotina serão analisados pelo modelo de condicionamento de preferência ao
lugar (CPP).
ANIMAIS:
Serão utilizados:
198 Camundongos heterogênicos Suíço albino, Machos, idade: 3 meses
Procedência: Biotério CEDEME - registro CEUA/UNIFESP: 01
Manutenção: Biotério do Departamento de Psicobiologia - registro CEUA/UNIFESP: 19
30 Camundongos heterogênicos Suíço albino, Fêmeas, idade: 3 meses
Procedência: Biotério CEDEME - registro CEUA/UNIFESP: 01
Manutenção: Biotério do Departamento de Psicobiologia - registro CEUA/UNIFESP: 19
VIGÊNCIA DO ESTUDO:
início previsto para: março/2014 com término previsto para: março/2016
A Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de São Paulo/Hospital São Paulo, na reunião de 17/04/2014,
ANALISOU e APROVOU todos os procedimentos apresentados neste protocolo.
1. Comunicar toda e qualquer alteração do protocolo.
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2. Comunicar imediatamente ao Comitê qualquer evento adverso ocorrido durante o desenvolvimento do protocolo.
3. Os dados individuais de todas as etapas da pesquisa devem ser mantidos em local seguro por 5 anos para possível auditoria
dos órgãos competentes.
4. Relatórios parciais de andamento deverão ser enviados anualmente à CEUA até a conclusão do protocolo.