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ANÁLISIS DE LAS PROTEÍNAS
CONSIDERACIONESGENERALES
PROTEÍNAS
SON COMPONENTES ABUNDANTES EN TODAS LAS CÉLULAS.
CASI TODAS (EXCEPTO LAS DE ALMACENAMIENTO) SON IMPORTANTES PARA LAS FUNCIONES BIOLÓGICAS Y/O LA ESTRUCTURA CELULAR.
LAS PROTEÍNAS DE LOS ALIMENTOS SON MUY COMPLEJAS.
COMPOSICIÓN DE LAS PROTEÍNAS ESTÁN CONSTITUÍDAS POR: HIDRÓGENO,
CARBONO, NITRÓGENO, OXÍGENO Y AZÚFRE.
LOS “BLOQUES DE CONSTRUCCIÓN” DE LAS PROTEÍNAS SON 20
∞-AMINOÁCIDOS.
LAS UNIONES ENTRE RESIDUOS DE AMINOÁCIDOS EN UNA PROTEÍNA SON ENLACES PEPTÍDICOS.
COMPOSICIÓN DE LAS PROTEÍNAS EL NITRÓGENO ES EL ELEMENTO MÁS DISTINTIVO
PRESENTE EN LAS PROTEÍNAS.
GENERALMENTE LAS PROTEÍNAS RICAS EN AMINOÁCIDOS BÁSICOS CONTIENEN MÁS NITRÓGENO.
SIN EMBARGO, EL CONTENIDO DE NITRÓGENO EN VARIAS PROTEÍNAS ALIMENTICIAS VARÍA DE 13.4 19.1% DEBIDO A LA VARIACIÓN EN LA COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS ESPECÍFICA DE LAS PROTEÍNAS.
CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS COMPOSICIÓN
ESTRUCTURA
FUNCIÓN BIOLÓGICA
PROPIEDADES DE SOLUBILIDAD
COMPLICACIONES EN ELANÁLISIS DE PROTEÍNAS
CARACTERÍSTICAS FÍSICO QUÍMICAS DE LOS ALIMENTOS SIMILARES A LOS DE LAS PROTEÍNAS
FUENTES DE NITRÓGENO NO PROTÉICO
AMINOÁCIDOS LIBRES PEQUEÑOS PÉPTIDOS ÁCIDOS NUCLÉICOS FOSFOLÍPIDOS AZÚCARES AMINAS PORFIRINA ALGUNAS VITAMINAS
FUENTES DE NITRÓGENONO PROTÉICO
ALCALOIDES ÁCIDO ÚRICO UREA IONES DE AMONIO
OTROS MACROCOMPONENTES DE LOS ALIMENTOS QUE PUEDEN INTERFERIR CON EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS
LÍPIDOS
CARBOHIDRATOS
MÉTODOS DESARROLLADOS PARA MEDIR EL CONTENIDO PROTÉICO
FUNDAMENTOS: DETERMINACIONES DE NITRÓGENO ENLACES PEPTÍDICOS ÁCIDOS AROMÁTICOS ABSORTIVIDAD UV DE LAS PROTEÍNAS GRUPOS AMINO LIBRES PROPIEDADES DE DISPERSIÓN DE LA LUZ CAPACIDAD DE ADHESIÓN DE COLORANTES
IMPORTANCIA DEL ANÁLISISDE PROTEÍNAS
DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD BIOLÓGICA. EJEMPLO: PECTINASAS DURANTE LA MADURACIÓN DE FRUTOS.
INVESTIGACIÓN SOBRE PROPIEDADES FUNCIONALES. EJMPLO: GLIADINA Y GLUTENINAS PARA LA ELABORACIÓN DEL PAN.
ETIQUETAMIENTO NUTRICIONAL
NECDESIDAD DEL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS
CONTENIDO PROTÉICO TOTAL COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS CONTENIDO DE ALGUNA PROTEÍNA
PARTICULAR EN UNA MEZCLA CONTENIDO PORTEÍCO DURANTE EL
AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA
NITRÓGENO NO PROTÉICO VALOR NUTRITIVO DE UNA
(DIGESTIBILIDAD, BALANCE PROTÉICO)
CONTENIDO PROTÉICOEN LOS ALIMENTOS
PRODUCTOS LÁCTEOS LECHE ENTERA
3.5%LECHE DESHIDRATADA DESGRASADA
35.9% QUESO CHEDDAR
25%
HUEVOS 12.9%
CONTENIDO PROTÉICO EN LOS ALIMENTOS
CARNES RES, BISTEAK, MAGRO CON GRASA 28.6%PUERCO, MAGRO CON GRASA, DESHUESADO
17.1%PECHUGA DE POLLO 27.3% PESCADO BACALAO COCINADO 28.5%ATÚN EN ACEITE ENLATADO 24.2%
CONTENIDO PROTÉICO EN LOS ALIMENTOS
CEREALES ARROZ, INTEGRAL, CRUDO 7.5% ARROZ REFINADO, CRUDO 6.7%HARINA DE TRIGO INTEGRAL 13.3%HARINA DE MAÍZ 7.8%SPAGHETTI, SECO 12.5%ALMIDÓN DE MAÍZ 0.3%
CONTENIDO PROTÉICO ENLOS ALIMENTOS
FRUTAS Y VEGETALES PAPA ENTERA, CRUDA 1.6% ESPÁRRAGOS VERDES 2.5% TAPIOCA 0.6%FRIJOLES, SECOS, TODAS LAS VARIEDADES 22.3%SOYA SECA 34.1%
CONTENIDO PROTÉICO EN LOSALIMENTOS
FRUTAS Y SEMILLAS MANZANA ENTERA, CRUDA
0.2%
ALMENDRAS ENTERAS 18.6%
MÉTODOS DE DETERMINACIÓNDE PROTEÍNAS MÉTODO DE KJELDAHL MÉTODO DE BIURET MÉTODO DE LOWRY MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA) MÉTODO DE ABSORCIÓN UV A 280nm MÉTODO DE ADHESIÓN DE COLORANTE MÉTODO DE BRADFORD MÉTODO DE LA NINHIDRINA MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
MÉTODO DE KJELDAHL(JOHANN KJELDAHL, 1883) DIGESTIÓN CON H2SO4 CON LA ADICIÓN DE
PERMANGANATO DE POTASIO PARA COMPLETAR LA OXIDACIÓN Y CONVERSIÓN DEL NITRÓGENO A SULFATO DE AMONIO.
NEUTRANLIZACIÓN DE LA DIGESTA DILUIDA, SEGUIDA DE UNA DESTILACIÓN EN UN VOLUMEN CONOCIDO DE ÁCIDO ESTÁNDAR CON UN CONTENIDO DE IODURO DE POTASIO E YODATO.
TITULACIÓN DEL YODO LIBERADO CON TIOSULFATO DE SODIO ESTÁNDAR
MODIFICACIONES PARA EL MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE KJELDAHL
SE HAN AÑADIDO CATALIZADORES COMO: Hg, Cu, Se, Ti AL H2SO4 PARA LOGRAR UNA DIGESTIÓN COMPLETA.
EL DIÓXIDO DE SELENIO Y EL SULFATO DE COBRE EN PROPORCIÓN 3:1 SON MUY EFECTIVOS EN LA DIGESTIÓN.
MODIFICACIONES PARA EL MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE KJELDAHL
EL SULFATO DE POTASIO SE UTILIZA PARA AUMENTAR EL PUNTO DE EBULLICIÓN DEL ÁCIDO SULFÚRICO PARA ACELERAR LA DIGESTIÓN.
EL SULFURO O TIOSULFATO DE SODIO SE AÑADEN A LA DIGESTA DILUIDA PARA AYUDAR A LIBERAR EL NITRÓGENO DEL Hg EL CUAL TIENDE A ADHERIR AMONIO.
MODIFICACIONES PARA EL MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE KJELDAHL
EL AMONIACO SE DESTILA DIRECTAMENTE EN UNA SOLUCIÓN DE ÁCIDO BÓRICO Y ES SEGUIDO DE UNA TITULACIÓN CON UN ÁCIDO ESTÁNDAR.
SE UTILIZAN LA COLORIMETRÍA Y LA CROMATOGRAFÍA IÓNICA PARA DETERMINAR EL CONTENIDO DE NITRÓGENO POSTERIOR A LA DIGESTIÓN.
PROCEDIMIENTO GENERALY REACCIONES
DIGESTIÓN
EL SULFATO DE AMONIO NO VOLÁTIL SE FORMA DE LA REACCIÓN DEL NITRÓGENO Y EL ÁCIDO SULFÚRICO.
DURANTE LA DIGESTIÓN SE LIBERA EL NITRÓGENO PROTÉICO PARA FORMAR IONES DE AMONIO.
EL ÁCIDO SULFÚRICO OXIDA LA MATERIA ORGÁNICA Y SE COMBINA CON EL AMONIO FORMADO.
DIGESTIÓN
LOS ELEMENTOS CARBONO E HIDRÓGENO SE CONVIERTEN EN DIÓXIDO DE CARBONO Y AGUA
PROTEÍNAÁcido SulfúricoCalor, catalizador
(NH4)2 SO4
NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN
LA MUESTRA DIGERIDA SE DILUYE CON AGUA.
SE AÑADE EL ÁLCALI QUE CONTIENE TIOSULFATO DE SODIO PARA NEUTRALIZAR AL ÁCIDO SULFÚRICO.
EL AMONÍACO FORMADO SE DESTILA EN UNA SOLUCIÓN DE ÁCIDO BÓRICO QUE CONTIENE LOS INDICADORES AZÚL DE METILENO Y ROJO DE METILO.
REACCIONES DE LANEUTRALIZACIÓN Y LA DESTILACIÓN
(NH)2SO4+ 2NaOH → 2NH3+Na2SO4+2H2O
NH3+ H3BO3 → NH4 + H2BO3-
(ácido bórico) (ión borato)
REACCIONES DE LATITULACIÓN
EL ANIÓN BORATO (PROPORCIONAL A LA CANTIDAD DE NITRÓGENO) SE TITULA CON HCl ESTANDARIZADO:
H2BO3- + H+ → H3BO3
CÁLCULOS
MOLES DE HCl = MOLES DE NH3 = MOLES DE NITRÓGENO EN LA MUESTRA
FUNCIÓN DEL BLANCO EN LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS SE DEBE UTILIZAR UN BLANCO CON
REACTIVOS PARA SUSTRAER EL NITRÓGENO REACTIVO DEL NITRÓGENO DE LA MUESTRA.
N HCl = NORMALIDAD DEL HCl EN MOLES /1000 mL
VOL. ÁCIDO CORREGIDO = mL DE ÁCIDO ESTÁNDAR PARA LA MUESTRA) – (mL DE ÁCIDO ESTÁNDAR PARA EL BLANCO)
14 = PESO ATÓMICO DEL NITRÓGENO %N = N HCl X VOLUMEN DE ÁCIDCORR. g. DE MUESTRA X 14g N2 X 100 MOL
FACTOR
SE UTILIZA UN FACTOR DE CONVERSIÓN DE % DE N2 A % DE PROTEÍNA CRUDA.
LA MAYORÍA DE LAS PROTEÍNAS CONTIENEN 16% DE N2
EL FACTOR DE CONVERSIÓN ES: 6.25 (100/16 = 6.25)
%N2 X 6.25 = %PROTEÍNA Ó
%N2 = %PROTEÍNA 0.16
FACTORES DE CONVERSIÓNPARA ALGUNOS ALIMENTOSALIMENTO %N2PROTEÍNA FACTOR
HUEVO O 16 6.25CARNE, MAÍZ LECHE 15.7 6.38TRIGO 18 5.7SOYA 17.51 5.71AVENA 17.15 5.83
PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS DE DESTILACIÓN Y TITULACIÓN NESSLERIZACIÓNNH4OH + 2HGI2+ 2KI + 3KOH → NH4Hg2I +
7KI + 4H2O ( rojo-naranja, 440nm)
RÁPIDO Y FÁCIL PERO EL IODURO DIMERCÚRICO DE AMONIO ES COLOIDE Y EL COLOR ES INESTABLE
PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS DE DESTILACIÓN Y TITULACIÓN MEDICIÓN DEL pH POSTERIOR A LA
DESTILACIÓN EN UN VOLUMEN CONOCIDO DE ÁCIDO BÓRICO
MEDICIÓN DIRECTA DEL AMONÍACO, MEDIANTE EL MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA IÓNICA
VENTAJAS DEL MÉTODO DE KJELDAHL
APLICABLE A TODO TIPO DE ALIMENTOS
RELATIVAMENTE SIMPLE BARATO PRECISO ES EL MÉTODO OFICIAL PARA MEDIR
EL CONTENIDO DE PROTEÍNA CRUDA
DESVENTAJAS DEL MÉTODODE KJELDAHL
MIDE EL NITRÓGENO ORGÁNICO TOTAL, NO SÓLO EL NITRÓGENO PROTÉICO
CONSUME MUCHO TIEMPO (AL MENOS 2 HORAS PARA COMPLETARSE)
PRECISIÓN MÁS POBRE QUE EL MÉTODO DE BIURET
USA REACTIVOS CORROSIVOS
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BIURET
FUNDAMENTO
AL FORMAR COMPLEJOS LOS IONES CÚPRICOS CON LOS ENLACES PEPTÍDICOS DE LAS PROTEÍNAS SE PRODUCE UN COLOR VIOLETA-MORADO BAJO CONDICIONES ALCALINAS.
LA ABSORBANCIA DEL COLOR PRODUCIDO ES LEÍDO A 540nm.
LA INTENSIDAD DEL COLOR (ABSORBANCIA) ES PROPORCIONAL AL CONTENIDO PROTÉICO DE LA MUESTRA.
PROCEDIMIENTO PARA ELMÉTODO DE BIURET
5 mL DE REACTIVO DE BIURET SE MEZCLA CON 1mL DE SOLUCIÓN PROTÉICA (1-10 mg DE PROTEÍNA/mL).
EL REACTIVO INCLUYE SULFATO DE COBRE, NaOH, Y TARTRATO DE SODIO Y POTASIO EL CUAL SE UTILIZA PARA ESTABILIZAR EL IÓN COBRE EN LA SOLUCIÓN ALCALINA
PROCEDIMIENTO PARA ELMÉTODO DE BIURET DESPUÉS DE REPOSO A TEMPERATURA
AMBIENTE DURANTE 15 A 30 MINUTOS, SE LEE LA ABSORBANCIA A 540nm CONTRA UN BLANCO CON SÓLO REACTIVO.
SI LA REACCIÓN NO ES CLARA DEBE CENTRIFUGARSE LA MUESTRA PREVIO A LA LECTURA DE LA ABSORBANCIA
PROCEDIMIENTO PARA ELMÉTODO DE BIURET
SE DEBE ELABORAR UNA CURVA ESTÁNDAR DE CONCENTRACIÓN VS ABSORBANCIA UTILIZANDO ALBÚMINA DE SUERO DE BOVINO (BSA) PARA COMPARACIÓN CON LA MUESTRA BAJO ESTUDIO
VENTAJAS DEL MÉTODO DE BIURET MENOS CARO QUE EL MÉTODO DE KJELDAHL RÁPIDO (SE PUEDE COMPLETAR EN MENOS DE 30
MINUTOS) ES EL MÉTODO MÁS SIMPLE DE ANÁLISIS DE
PROTEÍNAS NO ES FRECUENTE ENCONTRAR DERIVACIONES DE
COLOR POCAS SUBSTANCIAS NO PROTÉICAS INTERFIEREN
CON LA REACCIÓN DE BIURET NO DETECTA N2 DE FUENTES NO PROTÉICAS O NO
PEPTÍDICAS
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DEBIURET NO ES MUY SENSIBLE COMPARADO CON EL MÉTODO
DE LOWRY REQUIERE DE AL MENOS 2 A 4 mg DE PROTEÍNA POR
PRUEBA LAS CONCENTRACIONES ALTAS DE SALES DE
AMONIO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN PUEDE OCURRIR OPALESCENCIA EN LA SOLUCIÓN
FINAL SI ESTÁN PRESENTES ALTAS CONCENTRACIONES DE LÍPIDOS O CARBOHIDRATOS
DEBE ESTANDARIZARSE EL COLOR MEDIANTE CANTIDADES DE PROTEÍNA CONOCIDAS
MÉTODO DE LOWRY
FUNDAMENTO COMBINA LA REACCIÓN DE BIURET CON LA
REDUCCIÓN DEL REACTIVO DE FENOL FOLIN-CIOCALTEAU (ÁCIDO FOSFOMOLÍBDICO-FOSFOTÚNGSTICO) POR LOS RESIDUOS DE TIROSINA Y TRIPTOFANO DE LAS PROTEÍNAS. EL COLOR AZULOSO DESARROLLADO ES LEÍDO A 750nm (ALTA SENSIBILIDAD PARA UNA CONCENTRACIÓN PROTÉICA BAJA) O A 500nm (ALTA SENSIBILIDAD PARA UNA CONCENTRACIÓN PROTÉICA ALTA)
VENTAJAS DEL MÉTODO DE LOWRY
MUY SENSIBLE MENOS AFECTADO POR LA TURBIDEZ
DE LA MUESTRA MÁS ESPECÍFICO QUE LA MAYORÍA DE
LOS OTROS MÉTODOS RELATIVAMENTE SIMPLE SE PUEDE COMPLETAR EN 1 A 1.5
HORAS
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DELOWRY
EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES PROTEÍNAS (MÁS QUE EL MÉTODO DE BIURET)
EL COLOR NO ES ESTRICTAMENTE PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS
LA SACAROSA, LÍPIDOS, BUFFERS FOSFATO, MONOSACÁRIDOS Y HEXOAMINAS INTERFIEREN CON LA REACCIÓN
LAS ALTAS CONCENTRACIONES DE AZÚCARES REDUCTORES, SULFATO DE AMONIO Y COMPUESTOS CON SULFHIDRILO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN
MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA) FUNDAMENTO SE BASA EN EL PRINCIPIO DE QUE LAS
PROTEÍNAS REDUCEN LOS IONES CÚPRICOS A IONES CUPROSOS BAJO CONDICIONES ALCALINAS. LOS IONES CUPROSOS REACCIONAN CON EL BCA (VERDOSO) PARA FORMAR UN COLOR MORADO. EL COLOR FORMADO ES PROPORCIONAL AL CONTENIDO PROTÉICO DE LA MUESTRA
VENTAJAS DEL MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA)
SENSIBILIDAD COMPARABLE A LA DEL MÉTODO DE LOWRY (0.5mg a 10mg)
LA MEZCLA EN UN PASO ES MÁS FÁCIL QUE EN EL MÉTODO DE LOWRY
EL REACTIVO ES MÁS ESTABLE QUE EL REACTIVO DE LOWRY
LAS SALES DE BUFFER Y DETERGENTE NO IÓNICO NO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN
LAS CONCENTRACIONES DEL MEDIO DE REACTIVOS DESNATURALIZANTES NO INTERFIEREN (GUANIDINA 4M-HCl O UREA 3M)
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DELÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA)
EL COLOR NO ES ESTABLE CON EL TIEMPO. SE NECESITA CONTROLAR CUIDADOSAMENTE EL TIEMPO ENTRE EL ANÁLISIS Y LA LECTURA EN ABSORBANCIA.
LOS AZÚCARES REDUCTORES INTERFIEREN CON LA REACCIÓN.
ALTAS CONCENTRACIONES DE SULFATO DE AMONIO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN.
LA RESPUESTA EN LA ABSORBANCIA NO ES LINEAL
MÉTODO DE ABSORCIÓN EN ULTRAVIOLETA A 280NM
FUNDAMENTO
LAS PROTEÍNAS MUESTRAN UN FUERTE GRADO DE ABSORCIÓN A 280nm EN UV, PRINCIPALMENTE DEBIDO PRINCIPALMENTE A LOS RESIDUOS DE TRIPTOFANO Y LA TIROSINA DE LAS PROTEÍNAS. YA QUE LAS CONCENTRACIONES DE ESTOS AMINOÁCIDOS EN LAS PROTEÍNAS ES FRANCAMENTE CONSTANTE SE PUEDE UTILIZAR LA ABSORBANCIA A 280nm PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS USANDO LA LEY DE BEER
MÉTODO DE ABSORCIÓN EN ULTRAVIOLETA A 280NM FUNDAMENTO DADO QUE CADA PROTEÍNA TIENE UNA
COMPOASICIÓN ÚNICA DE AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS, EL COEFICIENTE DE EXTINCIÓN (E280) O SU ABSORTIVIDAD MOLAR (Em) DEBEN SER DETERMINADOS PARA PROTEÍNAS INDIVIDUALES PARA LA ESTIMACIÓN DEL CONTENIDO PROTÉICO
VENTAJAS DEL MÉTODO DE ABSORCIÓN EN UV (280NM)
MÉTODO RÁPIDO Y RELATIVAMENTE SENSIBLE (VARIAS VECES MÁS SENSIBLE QUE EL MÉTODO DE BIURET)
NO EXISTE INTERFERENCIA DEL SULFATO DE AMONIO Y OTRAS SALES BUFFER
MÉTODO NO DESTRUCTIVO UTILIZADO EN DETECCIÓN POST-COLUMNA
DE LAS PROTEÍNAS
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE ABSORCIÓN EN EL UV (280NM)
LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS TAMBIÉN ABSORBEN EN LA REGIÓN DE 280nm
EL CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS DIFIERE CONSIDERABLEMENTE EN VARIAS PROTEÍNAS.
LA SOLUCIÓN DEBE SER CLARA E INCOLORA. LA TURBIDEZ PUEDE PRODUCIR RESULTADOS ERRÁTICOS
SE REQUIERE UN SISTEMA RELATIVAMENTE PURO PARA UTILIZAR ESTE MÉTODO
MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR ADHESIÓN DE UN COLORANTE
ADHESIÓN DE COLORANTE ANIÓNICO
MÉTODO DE BRADFORD
ADHESIÓN DE COLORANTEANIÓNICO FUNDAMENTO LA MUESTRA PROTÉICA SE MEZCLA CON UNA
CANTIDAD EXCESIVA CONOCIDA DE UN COLORANTE ANIÓNICO EN UNA SOLUCIÓN BUFFER.
LAS PROTEÍNAS SE UNEN AL COLORANTE PARA FORMAR UN COMPLEJO INSOLUBLE.
ADHESIÓN DE COLORANTEANIÓNICO FUNDAMENTO SE MIDE EL COLORANTE NO ADHERIDO,
SOLUBLE POSTERIOR A LA EQUILIBRACIÓN DE LA REACCIÓN Y LA REMOCIÓN DEL COMPLEJO INSOLUBLE POR CENTRIFUGACIÓN Y FILTRACIÓN.
EL COLORANTE NO ADHERIDO ESTÁ INVERSAMENTE RELACIONADO AL CONTENIDO PROTÉICO DE LA MUESTRA
ADHESIÓN DE COLORANTEANIÓNICO
FUNDAMENTO
PROTEÍNA + EXCESO DE COLORANTE →
COMPLEJO PROTEÍNA-COLORANTE INSOLUBLE + COLORANTE NO ADHERIDO SOLUBLE
COLORANTES UTILIZADOS EN ESTE MÉTODO ÁCIDO SULFÓNICO ANIÓNICO NARANJA ÁCIDO 12 NARANJA G NEGRO AMIDO 10B
UNEN GRUPOS CATIÓNICOS DE LOS RESIDUOS BÁSICOS DE AMINOÁCIDOS (IMIDASOL DE LA HISTIDINA, GUANIDINA DE LA ARGININA Y EL GRUPO ε-AMINO DE LA LISINA) Y EL GRUPO LIBRE TERMINAL AMINO DE LAS PROTEÍNAS.
VENTAJAS DEL MÉTODO DE ADHESIÓN DE COLORANTE ANIÓNICO
MÉTODO RÁPIDO (15 MINUTOS O MENOS) BARATO RELATIVAMENTE EXACTO PARA EL
ANÁLISIS DE PROTEÍNAS EN ALIMENTOS PUEDE UTILIZARSE PARA ESTIMAR LOS
CAMBIOS EN EL CONTENIDO DE LISINA DISPONIBLE DE LOS CEREALES DURANTE SU PROCESAMIENTO.
VENTAJAS DEL MÉTODO DE ADHESIÓN DE COLORANTE ANIÓNICO
NO UTILIZA REACTIVOS CORROSIVOS NO MIDE NITRÓGENO NO PROTÉICO MÁS PRECISO QUE EL MÉTODO
KJELDAHL
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE LA ADHESIÓN DEL COLORANTE ANIÓNICO
LAS PROTEÍNAS DIFIEREN EN SU CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS BÁSICOS DIFIEREN EN SU CAPACIDAD DE ADHESIÓN DEL COLORANTE
SE NECESITA ELABORAR CURVA DE CALIBRACIÓN
MUCHOS COMPONENTES NO PROTÉICOS TAMBIÉN SE PUEDEN ADHERIR AL COLORANTE (ALMIDÒN), METALES (Ca O P) Y CAUSAR ERRORES EN LOS RESULTADOS
MÉTODO DE BRADFORD
FUNDAMENTO
EL AZÚL BRILLANTE G-250 COOMASSIE SE ADHIERE A LA PROTEÍNA, EL COLORANTE SE TORNA DE ROJIZO A AZULADO YE L MÁXIMO DE ABSORCIÓN DEL COLORANTE CAMBIA DE 465 A 595nm. EL CAMBIO EN LA ABSORBANCIA A 595nm ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA EN LA MUESTRA.
VENTAJAS DEL MÉTODO DE BRADFORD
MÉTODO RÁPIDO (LA REACCIÓN SE PUEDE COMPLETAR EN 2 MINUTOS)
REPRODUCIBLE
SENSIBLE (MUCHO MÁS QUE EL MÉTODO DE LOWRY)
NO EXISTE INTERFERENCIA DE CATIONES COMO K+, Na+, Y Mg+
VENTAJAS DEL MÉTODO DE BRADFORD
NO EXISTE INTERFERENCIA DEL SULFATO DE AMONIO
NO EXISTE INTERFERENCIA DE LOS POLIFENOLES NI CARBOHIDRATOS COMO LA SACAROSA
MIDE PROTEÍNA O PÉPTIDOS CON UNA MASA MOLECULAR APROXIMADAMENTE IGUAL O MAYOR DE 4 000 DALTONS
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE BRADFORD
EL COMPLEJO PROTEÍNA-COLORANTE FORMADO PUEDE UNIRSE A LAS CELDAS DE CUARZO
EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES TIPOS DE PROTEÍNAS.
LA PROTEÍNA ESTÁNDAR DEBE SELECCIONARSE CON MUCHO CUIDADO
INTERFERENCIA CON DETERGENTES.
MÉTODO DE LA NINHIDRINA
FUNDAMENTO
AL SER HERVIDOS EN UN BUFFER A UN pH DE 5.5 EN PRESENCIA DE NINHIDRINA E HIDRINDANTINA, LOS AMINOÁCIDOS, AMONÍACO, Y LOS GRUPOS AMINO PRIMARIOS, ORIGINAN UN COLOR MORADO RUHEMANN
VENTAJA DEL MÉTODO DE LA NINHIDRINA
MÉTODO RELATIVAMENTE RÁPIDO SI SE COMPARA CON EL MÉTODO DE KJELDAHL
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE LA NINHIDRINA
LA PRESENCIA DE PEQUEÑAS CANTIDADES DE AMINOÁCIDOS, PÉPTIDOS, AMINAS PRIMARIAS, Y AMONÍACO OCASIONA UNA SOBREESTIMACIÓN DEL CONTENIDO PROTÉICO
BAJA PRECISIÓN
EL COLOR VARÍA CON LA DIFERENTE COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS
SE NECESITA ELABORAR UNA CURVA ESTÁNDAR EN CADA ANÁLISIS
