Contribuição da hiperexpressão do sistema de efluxo AdeABC ...lemc.com.br/public/uploads/teses/Juliana_Provasi_Cardoso-MESTRADO.pdf · Contribuição da hiperexpressão do sistema

JULIANA PROVASI CARDOSO

Contribuição da hiperexpressão do sistema de efluxo AdeABC e da

hiperprodução de AmpC na resistência aos β-lactâmicos em isolados clínicos de

Acinetobacter baumannii produtores de OXA-23 no Brasil

Tese apresentada à Universidade Federal

de São Paulo - Escola Paulista de Medicina,

para obtenção de título de Mestre em

Ciências.

São Paulo

2013

ii





Orientadora: Profª. Drª. Ana Cristina Gales

Co-orientador: Dr. Rodrigo Cayô da Silva

Este trabalho foi realizado com o auxílio

financeiro fornecido pelo Conselho Nacional

de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico - CNPq.

São Paulo

2013

iii

Cardoso, Juliana Provasi Contribuição da hiperexpressão do sistema de efluxo AdeABC e da hiperprodução de AmpC na resistência aos β-lactâmicos em isolados clínicos de Acinetobacter baumannii produtores de OXA-23 no Brasil Juliana Provasi Cardoso - São Paulo/SP - Brasil, 2013. xxi, 130f. Tese (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia. Departamento de Medicina, Disciplina de Infectologia. Título em Inglês: Contribution of the overexpression efflux pump AdeABC and hiperproduction of AmpC in the resistance to β-lactams in clinical isolates of Acinetobacter baumannii producing OXA-23 in Brazil.

1. Acinetobacter baumannii. 2. OXA-23. 3. Sistema de efluxo. 4. Brasil.

iv

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA

Chefe do Departamento:

Professora Drª Maria Tereza Zanella

Coordenador do curso de Pós-graduação:

Professor Dr. Ricardo Sobhie Diaz

Chefe da Disciplina de Infectologia:

Prof. Dr. Celso Franciso Hernandes Granato

São Paulo

2013

v





BANCA EXAMINADORA:

Presidente:

Profa. Dra. Ana Cristina Gales

Professora Adjunta e Diretora do Laboratório ALERTA da Disciplina de Infectologia do

Departamento de Medicina da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP.

Titulares:

Profa. Dra. Anna Sara Shafferman Levin

Professora Associada do Departamento de Doenças Infecciosas e Parasitárias da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e Presidente da Comissão de

Controle de Infecção Hospitalar do Hospital das Clínicas - HC-FMUSP.

Prof. Dr. José Rodrigues do Carmo Filho

Professor Adjunto da Pontifícia Universidade Católica de Goiás - PUC-GO e Analista

em saúde da Secretaria Municipal de Saúde de Goiânia.

Dra. Paola Cappellano

Médica Infectologista da Comissão de Epidemiologia Hospitalar do Hospital São Paulo

- HSP da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP e Coordenadora do grupo de

Racionalização de Antimicrobianos em Infecções em pacientes com Doenças Onco-

Hematológicas e Transplante de Medula Óssea.

Suplente:

Profa. Dra. Silvia Figueiredo Costa

Professora Associada ao Departamento de Doenças Infecciosas e Parasitárias da

Faculdade de Medicina da Uiversidade de São Paulo - USP e chefe do Laboratório de

Investigação Médica LIM-54 do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina - HC-

FMUSP.

vi

“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água

no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota.”

Madre Tereza de Calcutá

vii

Dedicatória

Dedico este trabalho a todas as pessoas que contribuíram, de alguma forma, para sua

realização e àquelas, que um dia, o poderão usufruir.

viii

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, por me conceder a vida e a sabedoria, por ser a

minha força nos momentos de fraqueza e por intervir por mim quando tudo parecia ser

impossível;

... à todos da minha família, em especial à minha mãe Valquiria Provasi, ao meu pai

Vitor Eduardo Cardoso, à minha avó Terezinha Bariani Provasi e ao meu avô Ari

Provasi (in memoriam) por não pouparem esforços, me dando a melhor educação, por

me ensinarem princípios, sempre acreditando no meu sucesso e por me apoiarem em

cada decisão difícil da vida;

... agradeço principalmente à minha mãe. Posso imaginar o quanto foi difícil para você

ver sua única filha saindo de casa... mas você sempre me apoiou nas minhas decisões

e sempre me deu muita força para seguir com os meus sonhos, me ajudou a superar

as dificuldades e esteve comigo nos momentos mais importantes. Muito obrigada... por

absolutamente tudo!

... ao meu tio Udo Kehrle, à minha tia Zuleika Provasi por serem meus pais postiços,

sempre me dando bons conselhos, me recebendo com todo coração e por terem me

ajudado tanto nesses anos em que eu mais precisei;

... às minhas primas Aline, Karen e Ellen Kehrle, pelos conselhos acadêmicos,

mesmo quando não entendiam nada sobre o assunto do meu estudo, pela amizade,

pelas muitas risadas, pela companhia, mesmo algumas de vocês estando longe, pela

força e por aguentarem minhas reclamações. Vocês são as irmãs que eu não tive;

ix

... aos meus tios Ricardo José Cardoso, Renato Cardoso Filho, á minha avó Lauria

Carésia Cardoso (in memoriam), e ao meu irmão João Vitor Cardoso, por serem os

primeiros a me receber em São Paulo de braços abertos, pelo carinho com que me

acolheram e por sempre me apoiarem nos meus estudos;

... à minha orientadora Profa. Drª. Ana Cristina Gales, por me acolher em seu

laboratório e acreditar na minha capacidade, por seus ensinamentos, conselhos e

conhecimentos incontestáveis, por ser a grande pesquisadora que é e por permitir a

concretização deste estudo. Não poderia ter realizado meu mestrado num lugar

melhor;

... ao Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari, por todo conhecimento e apoio no

LEMC;

... ao meu co-orientador Dr. Rodrigo Cayô, por todo ensinamento, paciência,

dedicação, amizade, puxões de orelha e também incentivos, pelo apoio fundamental

no final do mestrado e por me guiar nesta jornada dos Acinetos;

... à Dra. Renata Cristina Picão que me recebeu no ALERTA, pela amizade e

carinho, pelos ensinamentos acadêmicos e da vida e por estar sempre à disposição;

... à querida Jéssica Werneck, que me introduziu ao maravilhoso mundo dos

Acinetos;

... à todos do Laboratório ALERTA: Adriana Nicolletti, Adriana Matos, Ana Carolina

Ramos, Bruna Nonato, Cecília Carvalhaes, Dandara Cassu, Danilo Xavier, Eloiza

Campana, Eliete Frigatto, Fernanda Petrolini, Fernanda Rodrigues, Graziela

Braun, Jhonatha Moura, Lorena Fehlberg, Lucas Andrade, Lygia Schandert,

x

Marina Visconde, Rafael Affini, Raquel Girardello, Rodrigo Cayô e Talita Baroni

que contribuíram de alguma forma com a realização deste trabalho, pelos

conhecimentos trocados, pela amizade e pela ótima convivência diária, que fez com

que esses três anos de estudo se tornassem mais divertidos e leves;

... à Raquel Girardello por todo apoio, auxílio e conhecimento que me ofereceu ao

longo do meu mestrado, principalmente na reta final, e por me ensinar a fazer aquelas

contas...;

... em especial à Adriana Matos, Ana Carolina Ramos, Fernanda Rodrigues,

Graziela Braun, Marina Visconde e Talita Baroni que me ajudaram imensamente no

final dos meus experimentos, pelos momentos de estudo, de desabafo e de alegrias

compartilhados. Vocês se tornaram mais que companheiras de laboratório;

... à todos do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica - LEMC, pelo apoio e

auxílio para a concretização deste trabalho, em especial a Elke Gump, Talita

Rochetti e Paulo Bispo pelo suporte no Real Time;

... às minhas professoras e também “avó e mãe microbiológicas” da PUC-GO, Cláudia

Duque e Edlaine Rodrigues, por plantarem a sementinha da micro no meu coração;

... ao Prof. Dr. José Rodrigues do Carmo Filho, meu primeiro orientador na Iniciação

Científica, por despertar a pesquisadora que existe em mim;

... aos meus amigos, pela compreensão da minha ausência, por vibrarem a cada

vitória e por entenderem e me apoiarem na decisão de vir para São Paulo... por mais

que a distância nos separe, estarão sempre no meu coração;

xi

... às queridas Vanessa Ferreira e Mônica Simon por me estenderem não só a mão,

mas o braço no momento em que mais precisei... não sei como expressar a minha

gratidão pela ajuda que vocês me ofereceram num momento tão delicado;

... ao meu namorado Rafael Teixeira, que passou tantas noites, feriados e finais de

semana no laboratório comigo, sempre me incentivando a seguir em frente com meu

projeto, compreendendo a minha ausência e me acalmando nos momentos em que eu

parecia explodir, por ser meu companheiro de todas as horas e por ser o ombro amigo

sempre que precisei;

... à banca, que gentilmente aceitou meu convite para participar da minha defesa e

que reservou um tempo para estudar e contribuir com o meu trabalho;

... aos funcionários da UNIFESP, do Laboratório Central, médicos, pessoal da

limpeza e ao porteiro Edilson, pelos serviços e ajudas prestados;

... ao meu gatinho Ozzy, que me fez companhia enquanto eu escrevia minha tese;

... e as minhas “bichinhas” bactérias, em especial aos meus “filhinhos” Acinetos que

aprendi a “amar” e principalmente a respeitar esses seres tão pequenos e complexos,

aos quais tive o prazer de estudar seus mecanismos de resistência mais afundo.

xii

SUMÁRIO

ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................... xiv

ÍNDICE DE TABELAS ............................................................................................... xviii

ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................. xix

RESUMO .................................................................................................................... xx

ABSTRACT ................................................................................................................ xxi

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................... 4

2.1. Agente Etiológico ............................................................................................... 4

2.2. Epidemiologia das Infecções Causadas por A. baumannii ................................. 7

2.3. Opções de Tratamento para Infecções Causadas por A. baumannii ................ 10

2.3.1. Ampicilina/Sulbactam ................................................................................. 10

2.3.2. Minociclina ................................................................................................. 11

2.3.3. Tigeciclina .................................................................................................. 12

2.3.4. Polimixinas ................................................................................................. 14

2.3.5. Carbapenens ............................................................................................. 15

2.4. Mecanismos de Resistência aos Carbapenens em A. baumannii ..................... 18

2.4.1. Produção de β-Lactamases ....................................................................... 18

2.4.1.1. β-Lactamases de Espectro Ampliado (ESβLs).....................................19

2.4.1.2. Metalo-β-Lactamases (MβL).................................................................20

2.4.1.3. Cefalosporinase do Tipo AmpC (ADCs)...............................................21

2.4.1.4. Oxacilinases..........................................................................................22

2.4.1.4.1. OXA-23...................................................................................23

2.4.1.4.2. OXA-24/40..............................................................................29

2.4.1.4.3. OXA-51...................................................................................30

2.4.1.4.4. OXA-58...................................................................................30

2.4.1.4.5. OXA-143, OXA-182 e OXA-235 ............................................30

2.4.2. Impermeabilidade de Membrana Externa................................................... 31

2.4.3. Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo ...................................................... 33

2.4.3.1. Sistema AdeABC.......................................................................35

2.4.4. Alteração das Proteínas Ligadoras de Penicilinas (PBPs) ......................... 37

3. OBJETIVOS ............................................................................................................ 39

3.1. OBJETIVO PRINCIPAL .................................................................................... 39

3.2. OBJETIVOS SECUNDÁRIOS .......................................................................... 39

4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 40

xiii

4.1. Amostras Bacterianas ...................................................................................... 40

4.2. Identificação dos Isolados de A. baumannii ...................................................... 42

4.2.1. “Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass

Spectrometry” (MALDI-TOF MS) ......................................................................... 42

4.2.2. Sequenciamento do Gene rpoB ................................................................. 43

4.3. Análise da Similaridade Genética por PFGE .................................................... 45

4.4. “Multilocus Sequence Typing” (MLST) .............................................................. 47

4.5. Testes de Sensibilidade aos Antimicrobianos ................................................... 49

4.5.1. Avaliação Fenotípica da Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo ............... 50

4.6. Pesquisa e Identificação de Genes de Resistência .......................................... 51

4.6.1. Avaliação da Hiperprodução de ADC (AmpC) ............................................ 54

4.7. Avaliação das Proteínas de Membrana Externa por SDS-PAGE ...................... 54

4.8. PCR em Tempo Real (qRT-PCR) para Quantificação da Transcrição do Sistema

de Efluxo AdeABC e das Proteínas de Membrana Externa CarO, 33-36 kDa,

OmpHMP e OmpW ................................................................................................. 55

4.8.1. Extração do RNA Total e Síntese de cDNA ............................................... 55

4.8.2. Quantificação Relativa da Transcrição Gênica ........................................... 56

4.8.3. Análise da Quantificação Relativa da Transcrição Gênica ......................... 58

5. RESULTADOS ....................................................................................................... 60

5.1. Identificação dos isolados bacterianos ............................................................. 60

5.2. Análise da similaridade genética (PFGE) e da ancestralidade (MLST) ............. 60

5.3. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos ...................................................... 65

5.4. Avaliação dos genes codificadores de β-lactamases e a relação desses com a

presença de ISAba1 ................................................................................................ 67

5.5. Avaliação fenotípica da hiperexpressão dos sistemas de efluxo ...................... 72

5.6. Avaliação fenotípica da alteração das proteínas de membrana externa pela

técnica de SDS-PAGE ............................................................................................ 76

5.7. Quantificação da expressão dos genes coficadores de porinas e do sistema de

efluxo AdeABC pela técnica de qRT-PCR ............................................................... 79

6. DISCUSSÃO ........................................................................................................... 81

7. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 100

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 102

xiv

ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABC - ATP Binding Cassette

ADC - Acinetobacter-derived cephalosporinases

AFLP - Amplified Fragment Lenght Polimorfism

AK - Amicacina

AmpC - Cefalosporinase chromosomal

AMP/SUL - Ampicilina/Sulbactam

ApaI - Acetobacter pasteurianus sub. pasteurianus

ARDRA - Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis

ARI - Acinetobacter Resistant to Imipenem

ATCC - American Type Culture Collection

ATP - Adenosina trifosfato

AZT - Aztreonam

BSA - Albumina de soro bovino

BSAC - British Society of Antimicrobial Chemotherapy

C - Citosina

CAZ - Ceftazidima

CC - Complexo Clonal

CCCP - Carbonyl Cyanide m-Chlorophenyl Hydrazone

cDNA - DNA complementar

CESP - Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Serratia marcescens, Providencia

stuartii, Pseudmomonas aeruginosa e Morganella morganii

CHDL - Carbapenem-Hydrolyzing Class D β-Lactamase

CHEF-DR - Contour-Clamped Homogeneous Electric Fields

CIM - Concentração Inibitória Mínima

CIP - Ciprofloxacino

CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute

xv

Ct - Ciclo Threshold

CTX - Cefotaxima

CTX-M - Cefotaximase

Da - Dalton

DHP-1 - Dehidropeptidase-1

DLV - Double Locus Variant

DMT - Drug-Metabolite Transporter

E - Eficiência

EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético

ERIC-PCR - Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus - Polimerase Chain

Reaction

ESβL - β-lactamase de Espectro Ampliado

EU - Clone Europeu

EUCAST - The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

F - Forward

FEP - Cefepima

G - Guanina

GES - Guiana Extended Spectrum

GIM - German Imipenemase

GM - Gentamicina

HMM - High molecular mass

IMP - Imipenemase

IPM - Imipenem

ISAba - Insertion Sequence Acinetobacter baumannii

kDa - Kilodaltons

KPC - Klebsiella pneumoniae carbapenemase

LB - Luria Bertani

LEMC - Laboratório Especial de Microbiologia Clínica

xvi

LEV - Levofloxacino

LMM - Low molecular mass

M - Molar

MALDI-TOF MS - Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass

Spectrometry

MC - Minociclina

MATE - Multidrug and Toxic Compound Extrusion

MDR - Multirresistentes

MER - Meropenem

MFS - Major Facilitador Superfamily

MgCl2 - Cloreto de magnésio

MGTs - Transglicosilases monofuncionais

MH - Müeller-Hinton

MLST - Multilocus Sequence Typing

mM - Milimolar

MRSA - Staphylococcus aureus resistente à meticilina

MTPX - Multiplex

MβL - Metalo-β-lactamase

NaCl - Cloreto de sódio

NDM - Nova Deli metalo-β-lactamase

NMP - 1-(1-naphthylmethyl)-piperazine

OMP - Outer Membrane Protein

OmpHMP - Outer membrane protein Heat-Modified Protein

OXA - Oxacilinase

PaβN - Phenylalanine arginyl β-naphtylamide

pb - Pares de base

PBPs - Proteínas ligadoras de penicilina

PCR - Reação em cadeia da polimerase

xvii

PER - Pseudomonas Extended Resistant

PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis

pH - Potencial Hidrogeniônico

pmol - picomol

PO - Polimixina B

qRT-PCR - Quantificação da transcriptase reversa - reação em cadeia da polimerase

R - Reverse

Rep-PCR - Repetitive Element Palindromic – Polimerase Chain Reaction

RND - Resistance-Nodulation Division

rRNA - RNA ribossômico

SDS-PAGE - Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

SG - Sequence Group

SHV - Sulfhydryl-Variable β-Lactamase

SIM - Seul Imipenemase

SLV - Single Locus Variant

SMR - Small Multidrug Resistance

SPM - São Paulo metalo-β-lactamase

ST - Sequence Type

TBE - Tris-Boreto-EDTA

TEM - Temoniera β-Lactamase

TGC - Tigeciclina

Tm - Temperatura de melting

TPPCl - Cloreto de tetrafenilfosfónio

TSB - Caldo Tríptico de Soja

VEB - β-Lactamase de Espectro Ampliado Vietnamita

VIM - Verona Imipenemase

VRE - Enterococcus resistente à vancomicina

xviii

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1 - Variantes de OXA-23 descritas de acordo com a espécie de isolamento, ano e país de origem............................................................................................................................ 07 Tabela 2. Sequência de oligonucleotídeos das zonas internas e flanqueadoras do gene rpoB para identificação de Acinetobacter spp. de acordo com La Scola e colaboradores (2006)......................................................................................................................................... 44 Tabela 3. Oligonucleotídeos empregados para os sete genes utilizados para a caracterização do MLST, de acordo com Nemec e colaboradores (2008)................................ 48

Tabela 4. Sequência de oligonucleotídeos para identificação dos genes codificadores de -lactamases e sequência de inserção......................................................................................... 51 Tabela 5. Sequência de oligonucleotídeos utilizados para a quantificação dos genes codificadores do sistema de efluxo AdeABC, e dos genes das principais proteínas de membrana externa, pela técnica de qRT-PCR.......................................................................... 57 Tabela 6. Temperatura de melting e eficiência dos oligonucleotídeos utilizados na reação de qRT-PCR....................................…………….............................................................................. 58 . Tabela 7. Distribuição dos isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 de acordo com a região geográfica e os genótipos determinados pelas técnicas de PFGE e MLST.............. 62 Tabela 8. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos entre os isolados de A. baumannii produtores de OXA-23............................................................................................................... 66 Tabela 9. Caracterização das β-lactamases e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos entre os 31 isolados de A. baumannii produtores de OXA-23...................................................

69

Tabela 10. Resultados da CIM para ceftazidima, cefotaxima, imipenem e meropenem dterminadas pela técnica de microdiluição em caldo, realizada na presença e na ausência do inibidor de sistemas de efluxo PAβN.....................................................................................

75

Tabela 11. Perfil das proteínas de membrana externa dos isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 baseando nos géis de SDS-PAGE........................................................

77

Tabela 12. Expressão relativa dos genes codificadores das OMPs OmpW, CarO, Omp33-36 e OmpHMP e da bomba de efluxo AdeB dos isolados clínicos comparados a expressão basal dos mesmos genes na ATCC BAA-1709.........................................................................

80

xix

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 01. Estruturas químicas das moléculas dos carbepenens e de seus precursores................................................................................................................................... 16 Figura 2. Distribuição mundial de OXA-23 em isolados clínicos de A. baumannii resistentes aos carbapenens.......................................................................................................................... 25 Figura 3. Distribuição mundial das variantes de OXA-23 descritas em Acinetobacter spp. e em K. pneumoniae....................................................................................................................... 28 Figura 4. Esquema do sistema de efluxo AdeABC.................................................................... 35 Figura 5. Representação do operon do sistema AdeABC............……………………........……. 36 Figura 6: Distribuição dos 31 isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 apresentando distintos perfis clonais de acordo com a unidade da federação brasileira................................... 41 . Figura 7. Dendrograma do perfil genotípico determinado pela técnica de PFGE dos isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 avaliados neste estudo.…............................................ 61 Figura 8. Árvore filogenética entre os diferentes STs encontrados no presente estudo e os demais STs descritos no mundo até o momento.…………….....................................…............. 64 Figura 9. Géis de SDS-PAGE das proteínas de membrana externa dos diferentes isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 no Brasil.…...................................................................…. 78 Figura 10. Modelo de um complexo clonal.......…...................................................................…. 86

xx

RESUMO

A produção de OXA-23 é o principal mecanismo de resistência aos carbapenens em isolados de A. baumannii no Brasil e surtos causados por esses micro-organismos têm sido reportados em todo o mundo. Embora as cefalosporinas de espectro ampliado (ESCph) não sejam hidrolisadas pelas carbapenemases de classe D, isolados brasileiros de A. baumannii produtores de OXA-23 apresentam altos níveis de resistência a esses antimicrobianos. O presente estudo objetivou avaliar a contribuição da hiperexpressão do sistema de efluxo AdeABC e da hiperprodução de AmpC na resistência aos β-lactâmicos em isolados brasileiros de A. baumannii produtores de OXA-23. Para o estudo foram selecionados 31 isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 de quatorze hospitais privados localizados em sete estados brasileiros e que apresentavam diferentes padrões de PFGE. A identificação dos isolados de A. baumannii foi realizada pelo MALDI-TOF MS e confirmada pelo sequenciamento do gene rpoB. O perfil clonal foi novamente confirmado pela técnica de PFGE e analisado pelo programa “BioNumerics”. A produção de genes codificadores de β-lactamases e sua associação com a presença de ISAba1 foi confirmada por PCR seguido de sequenciamento. O teste de sensibilidade foi realizado pela metodologia de microdiluição em caldo, segundo o CLSI. Para avaliar fenotipicamente a hiperexpressão de sistemas de efluxo, as CIMs para os β-lactâmicos foram comparadas na presença e na ausência do inibidor de sistemas de efluxo PAβN. A ancestralidade dos diferentes clones foi avaliada pela técnica de MLST. O perfil de proteínas de membrana externa foi avaliado por SDS-PAGE. Os níveis de transcrição dos genes adeB, carO, ompA, ompW e omp33-36 foram avaliados pela técnica de qRT-PCR comparando com os resultados obtidos da ATCC BAA-1709 de A. baumannii multissensível. Todos os isolados foram identificados como A. baumannii. Foi observada a presença de ISAba1 localizada a montante dos genes blaOXA-23, blaOXA-51-like e blaAmpC em 100%, 54,8% e 77,4% dos isolados, respectivamente. Um grande número de variantes da CHDL cromossômica do grupo OXA-51 foi verificada entre os isolados brasileiros de A. baumannii, estando a variante estreitamente relacionada ao respectivo padrão de PFGE/ST. Altos níveis de resistência foram observados para ampicillina/sulbactam, ESCph, aztreonam, carbapenens, fluoroquinolonas, aminoglicosídeos e tigeciclina. Somente a polimixina B e a minociclina apresentaram atividade contra os isolados avaliados (CIM90 de 0,5 µg/mL, ambos). Os 31 perfis de PFGE foram agrupados em 12 STs diferentes, dos quais sete apresentaram sequências alélicas únicas. A maioria dos isolados pertencia aos complexos clonais CC79, CC15 e CC1, sendo o ST79 o mais prevalente entre os isolados avaliados (n=12; 38,7%). Os demais STs encontrados foram: ST15 (n=6; 19,4%), ST1 (n=4; 12,9%) e ST162, ST46, ST188, ST189, ST190, ST191, ST192, ST228 e ST299 (n=1; 3,2%, cada). Os isolados apresentando o gene blaAmpC associado a ISAba1 apresentaram altas taxas de resistência às ESCph (ceftazidima, CIMs de 32 a >1024 µg/mL; cefotaxima, CIMs de 256 a >1024 µg/mL), contrastando com os isolados que não apresentavam tal associação (ceftazidima, CIMs de 8 a 128 µg/mL; cefotaxima, CIMs de 16 a 64 µg/mL). Diminuição da CIMs ≥ 2 diluições para meropenem e ceftazidima foi verificado em 80,6% (n=25) e 54,8% (n=17), respectivamente. A hiperexpressão do gene adeB foi observada em 74,2% (n=23) dos isolados, principalmente naqueles isolados pertencentes aos complexos clonais. Por outro lado, foi observada uma diminuição da expressão do gene carO. Apesar disso, o perfil de SDS-PAGE demonstrou uma grande reorganização das proteínas de membrana externa entre os isolados avaliados, destacando-se a ausência de uma porina de 21 kDa, compatível com a OmpW. A resistência às ESCph nos isolados brasileiros de A. baumannii produtores de OXA-23 está relacionada a hiperprodução de AmpC, além disso, a hiperexpressão de sistemas de efluxo contribui na elevação das CIMs para meropenem e ceftazidima. A maioria dos clones de A. baumannii produtores de OXA-23 circulantes no Brasil, pertencem aos principais complexos clonais descritos no mundo e apresentam um fenótipo MDR. A resistência aos β-lactâmicos entre os isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 no Brasil é multifatorial, o que dificulta o seu completo entendimento.

xxi

ABSTRACT

The production of OXA-23 is the main mechanism of carbapenem-resistance among isolates of A. baumannii in Brazil, and outbreaks caused by these microrganisms have been reported worldwide. Although extended-spectrum cephalosporins (ESCph) are not hydrolyzed by the carbapenemases of class D, OXA-23-producing A. baumannii isolated in Brazil show high resistant rates to these antimicrobials agents. The present study aimed to evaluate the contribution of overexpression of efflux pumps AdeABC and overproduction of AmpC to the β-lactams resistance among A. baumannii Brazilian isolates producers of OXA-23. For this study, we selected 31 un-related isolates of A. baumannii producing OXA-23 from fourteen private hospitals located in seven Brazilian states. The identification of the isolates as A. baumannii was performed by MALDI-TOF MS and confirmed by sequencing of the rpoB gene. The genetic relatedness was evaluated by PFGE technique and analyzed by the BioNumerics software. The production of β-lactamase encoding genes and its association with the presence of ISAba1 was confirmed by PCR followed by sequencing. The susceptibility testing was performed by broth microdilution method according to CLSI. To assess the phenotype overexpression of efflux pumps, the MICs for the β-lactams were compared in the presence and absence of the inhibitor efflux pumps, PAβN. The filogenetic relationship among different clones was assessed by MLST. The outer membrane protein profiles were evaluated by SDS-PAGE. Transcription levels of the genes adeB, carO, ompA, ompW and omp33-36 were assessed by qRT-PCR technique compared to those obtained for the ATCC BAA-1709, multi-drug susceptible A. baumannii strain. All isolates were identified as A. baumannii. It was observed the presence of ISAba1 located upstream of the gene blaOXA-23, blaOXA-51-like and blaAmpC in 100%, 54.8% and 77.4% of the isolates, respectively. A large number of variants of the OXA-51 group was found among the A. baumannii Brazilian isolates, which were closely related to the corresponding PFGE pattern/ST. High resistant rates were observed for ampicillin/sulbactam, ESCph, aztreonam, carbapenems, fluoroquinolones, aminoglycosides and tigecycline. Only polymyxin B and minocycline showed activity against these isolates (MIC90, 0.5 μg/mL, for both drugs). The 31 PFGE profiles were grouped into 12 different STs, of which seven had unique allelic sequences. Most isolates belonged to clonal complexes CC79, CC15 and CC1, being ST79 the most prevalent among the isolates (n=12, 38.7%) evaluated. The remaining STs founded were: ST15 (n=6, 19.4%), ST1 (n=4, 12.9%) and ST162, ST46, ST188, ST189, ST190, ST191, ST192, ST228 and ST299 (n=1, 3.2%; each). The isolates presenting the blaAmpC gene associated with ISAba1 showed high resistant rates to ESCph (ceftazidime MICs from 32 to >1024 μg/ml; cefotaxime MICs from 256 to >1024 μg/mL), in contrast to those isolates that did not carry ISAba1 upstream blaAmpC and showed lower ceftazidime (8 to 128 μg/mL) and cefotaxime MICs (16 to 64 μg/mL). A ≥ 2 dilution decrease in the MICs of meropenem and ceftazidime was observed for 80.6% (n=25) and 54.8% (n = 17) of OXA-23-producing Acinetobacter baumannii, respectively. Overexpression of the gene adeB was observed in 74.2% (n=23) of isolates, particularly those isolates belonging to clonal complexes. Moreover, we observed a decrease of carO gene expression in the majority of the isolates. Nevertheless, the profile of SDS-PAGE showed a major reorganization of the outer membrane proteins among isolates, highlighting the absence of a 21 kDa porin, consistent with the OmpW. Resistance to ESCph in A. baumannii Brazilian isolates producers of OXA-23 is related to overproduction of AmpC coupled with the overexpression of efflux pumps, which contribute to the increased MICs for ceftazidime and meropenem. Most of OXA-23-producing A. baumannii clones circulating in Brazil belong to the major clonal complexes described in the world Resistance to β-lactams among isolates of A. baumannii producing OXA-23 in Brazil is multifactorial, which hinders its complete understanding.

INTRODUÇÃO

1

1. INTRODUÇÃO

Acinetobacter spp. são micro-organismos amplamente distribuídos na natureza,

possuindo a característica de se adaptarem a diversos locais e condições que seriam

desfavoráveis para muitos outros micro-organismos (Higgins et al., 2010). Essas

características estão relacionadas ao fato de que isolados de Acinetobacter spp.

necessitam de poucos nutrientes para se manterem metabolicamente ativos, o que os

tornam facilmente adaptados ao ambiente nosocomial (Higgins et al., 2010). Além de

serem intrinsicamente resistentes a diversos antimicrobianos, possuem uma grande

capacidade em adquirir novos genes de resistência, sendo assim, são considerados

patógenos de grande importância clínica, principalmente, no ambiente hospitalar.

Cepas de Acinetobacter spp. multirresistentes (MDR) tem se tornado uma

preocupação mundial. Uma vez instaladas em uma determinada unidade ou, até

mesmo, em todo o hospital, esses micro-organismos podem causar surtos de difícil

controle e erradicação (Villegas & Hartstein, 2003). O fenótipo MDR limita,

consideravelmente, as opções terapêuticas para o tratamento das infecções causadas

por Acinetobacter spp., dentre as quais, se destacam os carbapenens, a tigeciclina, a

ampicilina/sulbactam e as polimixinas (Karageorgopoulos & Falagas, 2008).

Entretanto, na última década, as taxas de resistência aos carbapenens vem

aumentando consideravelmente em todo o mundo.

De acordo com os dados do Programa SENTRY (Gales et al., 2012), a taxa de

resistência aos carbapenens entre as amostras de Acinetobacter spp. isoladas em

centros brasileiros, aumentou 60% em uma década, passando de 12,6%, no período

de 1997 a 1999, para 71,4% no período de 2008 a 2010. A causa desse aumento

pode ser justificada, em parte, pela disseminação de clones produtores da

carbapenemase de classe D OXA-23, não somente no Brasil, mas em todo o mundo

(Perez et al., 2007; Werneck et al., 2011a). Apesar das altas taxas de resistência aos

carbapenens verificadas nos isolados brasileiros de A. baumannii, esses

INTRODUÇÃO

2

antimicrobianos ainda constituem a primeira opção para o tratamento empírico de

infecções causadas por esses micro-organismos, pois se difundem amplamente pelos

tecidos, são bem tolerados e apresentam reações adversas mínimas (Nicolau, 2008).

No Brasil, a produção de OXA-23 é o mecanismo de resistência aos

carbapenens mais frequentemente relatado em isolados clínicos de A. baumannii;

porém, sua produção isolada não afeta, de modo significativo, a atividade dos

carbapenens, fazendo-se necessária a presença da sequência de inserção ISAba1

para aumentar a expressão da mesma e, dessa forma, elevar o grau de resistência a

esses antimicrobianos (Poirel & Nordmann, 2006). Embora a produção de OXA-23

associada à ISAba1 justifique a resistência aos carbapenens nos isolados brasileiros,

o mesmo não ocorre com as altas Concentrações Inibitórias Mínimas (CIMs) para às

cefalosporinas de amplo espectro verificadas nesses isolados (Werneck et al., 2011a;

Gales et al., 2012).

A OXA-23 é uma CHDL (Carbapenem-Hydrolyzing Class D β-Lactamase)

mundialmente disseminada e, portanto, foco de muitos estudos, o que acarreta no

desinteresse em estudar outros mecanismos de resistência aos β-lactâmicos pouco

conhecidos, porém não menos importantes. Vários sistemas de efluxo foram descritos

em A. baumannii e, quando hiperexpressos, conseguem ejetar diferentes classes de

antimicrobianos, contribuindo para o fenótipo MDR. Entretanto, seriam os carbapenens

e as cefalosporinas de amplo espectro ejetados eficientemente para o meio

extracelular? O sistema de efluxo AdeABC é o mais importante e estudado dentre os

sistemas descritos em A. baumannii e estudos anteriores demonstraram, ainda que

indiretamente, que a hiperexpressão desse sistema pode contribuir com a resistência

aos carbapenens, principalmente quando associado à produção de CHDLs (Héritier et

al., 2005a, Héritier et al., 2005b).

O estudo de Peleg e colaboradores (2007a) analisou a ação do inibidor de

sistema de efluxo PAβN (Phenyl-Arginine-β-Naphthylamide) em isolados clínicos de A.

baumannii com elevadas CIMs para tigeciclina, cefepima e ceftazidima. Os autores

INTRODUÇÃO

3

verificaram uma diminuição expressiva das CIMs para esses antimicrobianos na

presença do inibidor, bem como para os carbapenens. No mesmo ano, foi

demonstrado ser o sistema de efluxo AdeABC, o responsável pela resistência a

tigeciclina nesses isolados (Peleg et al., 2007b).

Acredita-se que a associação da hiperexpressão de sistemas de efluxo com a

produção de OXA-23 em A. baumannii poderia aumentar significativamente as CIMs

dos β-lactâmicos, podendo levar à falência terapêutica quando estes forem utilizados

clinicamente. As amostras de Acinetobacter spp. isoladas em hospitais brasileiros

geralmente são resistentes a todos os β-lactâmicos, incluindo as cefalosporinas de

amplo espectro, que não são substratos das CHDLs. Sendo assim, outros

mecanismos presentes concomitantemente, poderiam estar contribuindo com esse

fenótipo, como o aumento da produção de AmpC associado a ISAba1, ou o aumento

da expressão de sistemas de efluxo (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996; Bou &

Martínez-Beltrán, 2000; Corvec et al., 2003; Segal et al., 2004).

A real contribuição dos sistemas de efluxo e/ou da hiperprodução de AmpC na

elevação da CIMs para os carbapenens e para as cefalosporinas de amplo espectro

em isolados brasileiros de A. baumannii produtores de OXA-23 ainda é desconhecida.

Diante do provavável papel dos mecanismos apresentados e da interação dos

mesmos, o presente trabalho teve por objetivo estudar a contribuição do sistema de

efluxo AdeABC e da hiperprodução de AmpC na resistência aos β-lactâmicos em

isolados clínicos de A. baumannii produtores de OXA-23 no Brasil.

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

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2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Agente Etiológico

A história do gênero Acinetobacter começou na Holanda em 1911, onde o

pesquisador Martinus Willem Beijerinck descreveu em uma amostra de solo, o primeiro

micro-organismo originalmente denominado como Micrococcus calco-aceticus

(Beijerinck, 1911). Durante muitos anos, espécies como Micrococcus calco-aceticus,

Alcaligenes hemolysans, Mima polymorpha, Moraxella lwoffii, Herellea vaginicola e

Bacterium anitratum foram classificadas como sendo espécies diferentes. Somente em

1954, Brisou & Prevot (1954) propuseram o gênero Acinetobacter - que em grego

significa bacilo não móvel - para separar as espécies sem motilidade das demais

espécies móveis dentro do gênero Achromobacter a qual pertenciam.

Em 1968, Baumann e colaboradores (1968) fizeram um amplo estudo e

reclassificaram essas espécies, agrupando-as no gênero Acinetobacter, proposto por

Brisou e Prevot, 14 anos antes (Howard et al., 2012). Essas bactérias continham

diversas características bioquímicas em comum, sendo elas: (i) diferentes formas de

apresentação na coloração de Gram, ou seja, bacilos Gram negativos em sua fase

exponencial e morfologia de cocobacilos Gram positivos ou lábeis em sua fase

estacionária, devido a sua resistência à descoloração pelo álcool; (ii) produção de

cápsula por algumas cepas; (iii) assimilação de nitrato; (iv) crescimento somente na

presença de oxigênio; (v) não fastidiosas; (vi) não fermentadoras da glicose; (vii) não

produtoras de oxidase; (viii) produtoras de catalase; (ix) imóveis; (x) não formadoras

de esporos; (xi) não produtoras de pigmentos e (xii) relação G+C em torno de 39 a

47% (Baumann et al., 1968).

Somente em 1971, através do admirável trabalho de Baumann e colaboradores

realizado em 1968, o Subcomitê de Taxonomia de Moraxella e Bactérias Relacionadas

reconheceu o gênero Acinetobacter (Howard et al., 2012). Em 1986, Bouvet & Grimont

propuseram mais quatro novas espécies: A. baumannii, A. junii, A. haemolyticus e A.


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johnsonii e, desde então, novas espécies tem sido descritas. Em 1991, Gerner-Smidt e

colaboradores propuseram um grupo incluindo as espécies de Acinetobacter de maior

importância clínica e que possuíam características fenotípicas semelhantes,

denominando-o “Complexo Acinetobacter calcoaceticus-baumannii”. Esse complexo

inclui as espécies A. calcoaceticus, A. baumannii, A. pittii e A. nosocomialis. Como

possuem características bioquímicas muito semelhantes, a distinção dessas espécies

constitui um grande desafio para os laboratórios clínicos de microbiologia. Entretanto,

com os avanços da biologia molecular, essas quatro espécies conseguem ser bem

diferenciadas. A exceção do A. calcoaceticus, que é comumente encontrado no meio

ambiente, as outras três especies pertencentes ao complexo A. calcoaceticus-

baumannii são frequentemente isoladas no ambiente hospitalar e, portanto, possuem

grande relevância clínica (Espinal et al., 2012).

Atualmente, isolados do gênero Acinetobacter spp. pertencem ao Reino

Bacteria, Filo Proteobacteria, Classe Gammaproteobacteria, Ordem Pseudomonadales

e Familia Moraxellaceae (Rossau et al., 1991; Vaneechoutte et al., 2011). Até o

momento, foram descritas 27 espécies reconhecidas e validadas e mais seis espécies

propostas, mas ainda não reconhecidas pela comunidade internacional (Towner, 2009;

Cayô, 2012). Nos laboratórios de pesquisa é comum identificar essas espécies por

metodologias moleculares, de modo a se obter resultados confiáveis e

discriminatórios. Porém, a implementação dessas técnicas nem sempre são custo-

efetivas na rotina laboratorial.

Em muitos laboratórios de microbiologia, as técnicas bioquímicas manuais para

identificação bacteriana ainda são empregadas. Entretanto, tais técnicas são

demoradas e para algumas bactérias, como no caso do gênero Acinetobacter, não são

discriminatórias o suficiente devido à semelhança catabólica entre suas espécies,

principalmente dentro complexo A. calcoaceticus-baumannii. Tais problemas também

comprometem o uso dos aparelhos automatizados como o Phoenix® (BD, New Jersey,

USA), o MicroScan-WalkAway® (Siemens, Munich, Germany) e o Vitek® (Biomerieux,


6

Marcy l'Etoile, France) na diferenciação das espécies de Acinetobacter spp. (Espinal et

al., 2012).

Recentemente, a técnica “Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – Time

Of Flight Mass Spectrometry” (MALDI-TOF MS) foi desenvolvida para a identifcação

rápida e acurada de micro-organismos (Seng et al., 2009). O MALDI-TOF MS é uma

técnica de proteômica que ioniza proteínas e as identifica pela sua relação

massa/carga e, nos últimos anos, vem sendo empregada na rotina laboratorial por

apresentar boa acurácia na identificação de muitas espécies bacterianas, com uma

ótima relação custo/benefício e, principalmente, pela rapidez na liberação dos

resultados (Seng et al., 2009, Espinal et al., 2012). O MALDI-TOF MS constitui uma

boa metodologia para a identificação do complexo A. calcoaceticus-baumannii desde

que se inclua o espectro de A. nosocomialis em seu banco de dados (Espinal et al.,

2012).

Além do MALDI-TOF MS, uma vasta gama de técnicas moleculares são

utilizadas na identificação e diferenciação das espécies de Acinetobacter spp., dentre

as quais podemos citar: i) a hibridização DNA-DNA que é utilizada na avaliação da

taxonomia para novas espécies descritas (Dijkshoorn & Nemec, 2008); ii) o

sequenciamento da porção 16S do rRNA (Ibrahim et al., 1997); iii) o ARDRA

“Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis” (Vaneechoutte et al., 1995); iv) o

AFLP “Amplified Fragment Lenght Polimorfism” (Janssen et al., 1996); v) a ribotipagem

(Gerner-Smidt et al., 1991), vi) o sequenciamento das regiões espaçadoras

intergênicas da porção 16S-23S do rRNA (Chang et al., 2005) e vii) a análise de

restrição das regiões espaçadoras intergênicas da porção 16S-23S ribossomal

(Dolzani et al., 1995). Além destas, outras técnicas como a análise dos perfis das

proteínas do envelope celular (Dijkshoorn et al., 1987; Dijkshoorn et al., 1990) e a

tipagem do antígeno O por anticorpos monoclonais, constituem outras técnicas

utilizadas para identificação de amostras de Acinetobacter spp. (Pantophlet et al.,

2002).


7

Dentre tantas técnicas descritas, o sequenciamento do gene rpoB, codificador

da porção β da RNA polimerase, é considerado como o mais fidedigno, pois diferencia

não somente as espécies do complexo A. calcoaceticus-baumannii como também as

demais espécies do gênero (Gundi et al., 2009). Esse gene de apenas uma cópia é

altamente variável, apresentando quatro regiões que são altamente discriminatórias,

sendo duas regiões internas (zona 1, 350 pb e zona 2, 450 pb) ao gene rpoB e duas

regiões flanqueadoras variáveis, sendo a primeira de 301 pb a 310 pb e a segunda de

86 pb a 177 pb (La Scola et al., 2006).

2.2. Epidemiologia das Infecções Causadas por A. baumannii

A. baumannii, ao contrário de outras espécies deste gênero, raramente é

encontrado no meio ambiente (Peleg et al., 2008), sendo isolado principalmente no

ambiente nosocomial, como, equipamentos médicos, fômites e colonizando

funcionários e pacientes do hospital (McConnell et al., 2013). O habitat natural de A.

baumannii ainda não é conhecido e, apesar de muito especulado, nenhum estudo

concluiu o seu nicho ecológico até o momento (Peleg et al., 2008). Entretanto, a

sazonalidade parece estar correlacionada à frequência de isolamento de A. baumannii

em amostras clínicas, sendo mais prevalente em climas tropicais, como mostrado no

estudo de Chu e colaboradores (1999) em Hong Kong. Esse estudo relatou que

durante o verão, 53% dos estudantes de medicina e enfermeiras avaliados tiveram sua

pele colonizada por A. baumannii, enquanto no inverno, essa porcentagem reduziu

para 32%. Fora do ambiente hospitalar, um dado interessante foi publicado no estudo

conduzido por La Scola & Raoult (2004), o qual encontrou A. baumannii no corpo de

21% dos Pediculus humanus estudados provenientes de moradores de rua. Eles

concluíram que a alta prevalência desse patógeno em piolhos humanos

eventualmente poderia causar bacteremia nesses indivíduos. Já Berlau e

colaboradores (1999b) estudaram a prevalência de Acinetobacter em vegetais e

constataram que de 177 amostras, 27% continham A. baumannii. Esse dado contradiz


8

com a informação de que A. baumannii raramente é encontrado fora do ambiente

hospitalar. Por outro lado, A. baumannii raramente é encontrado colonizando o corpo

humano, sendo isolado de 0,5% a 3% na pele (Seifert et al., 1997, Berlau et al.,

1999a) e em 0,8% do trato gastrointestinal de humanos saudáveis (Dijkshoorn et al.,

2005).

Embora sua fonte natural ainda permaneça uma incógnita, sabe-se que este é

o principal micro-organismo relacionado a surtos hospitalares, capaz de causar

infecção em diversos sítios corpóreos de pacientes hospitalizados (Peleg et al., 2008).

As infecções mais comumente causadas por A. baumannii serão descritas a seguir.

A pneumonia associada à ventilação mecânica é uma das infecções mais

comuns causada por A. baumannii no ambiente hospitalar e é precedida pela

colonização das vias aéreas (Dijkshoorn et al., 2007), cuja taxa de mortalidade nestes

casos fica entre 40% a 70% (Fagon et al., 1996; Garnacho et al., 2003). A pneumonia

adquirida na comunidade causada por este patógeno é rara e tem sido associada a

fatores predisponentes como alcoolismo ou doença pulmonar obstrutiva crônica.

Nesses casos, a taxa de mortalidade também é alta, variando entre 40% e 60%

(Anstey et al., 1992; Chen et al., 2001; Anstey et al.,2002; Leung et al., 2006).

Embora as queimaduras também sejam um importante sítio de infecção por A.

baumannii, é difícil a diferenciação entre colonização e infecção nesses casos. Além

disso, o tratamento possui uma dificuldade a mais, pois há uma menor penetração do

antimicrobiano nesses locais (McConnell et al., 2013). Durante a guerra do

Afeganistão e Iraque, por exemplo, 22% das infecções causadas por A. baumannii, em

soldados americanos feridos em campo de batalha, tiveram como sítio infeccioso a

pele queimada, sendo que 53% desses isolados eram MDR (Keen et al., 2010). Outro

problema comum em combatentes de guerra é a infecção de pele e partes moles

(Murray et al., 2006; Johnson et al., 2007; Scott et al., 2007; Sebeny et al., 2008). Scott

e colaboradores (2007) coletaram amostras de pele de soldados feridos, do solo e das

áreas de tratamento nos campos de batalha do Iraque, para verificar a presença de A.


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baumannii. Os autores isolaram A. baumannii somente em 0,6% da pele dos pacientes

e em 2% das amostras de solo. Entretanto, esse micro-organismo foi isolado em todas

as áreas de tratamento coletadas, sugerindo que essa era a fonte de contaminação.

Fora do contexto militar, A. baumannii também foi encontrado em feridas de

sobreviventes do tsunami que ocorreu no final de 2004 na Ásia (Garzoni et al., 2005;

Maegele et al., 2005). Osteomielite causada por A. baumannii também é outra

infecção frequente em combatentes de guerra (Davis et al., 2005; Murray et al., 2006;

Johnson et al., 2007; Petersen et al., 2007; Schafer & Mangino, 2008).

Outro quadro infeccioso causado por A. baumannii são as meningites. Nos

últimos anos tem-se observado um aumento dos casos de meningite causada por

esse patógeno, principalmente associada a pacientes submetidos a neurocirurgias

(Siegman-Igra et al., 1993; Katragkou et al., 2006; Cascio et al., 2010). Rodríguez

Guardado e colaboradores (2008) identificaram 51 casos de meningite pós-

neurocirúrgica causadas por A.baumannii em dois hospitais universitários, entre 1990

a 2004, que apresentaram uma elavada taxa de mortalidade (33%). Esses casos

representaram 10,9% de todos os casos de meningites identificados nos dois hospitais

durante o período de estudo. Em um estudo similar, Metan e colaboradores (2007)

avaliaram 28 casos de meningite causada por A. baumannii e observaram uma

mortalidade de 71%. Embora pouco frequentes, casos de meningite por A. baumannii

adquirida na comunidade também já foram relatados (Chang et al., 2000; Taziarova et

al., 2007; Lowman et al., 2008; Ozaki et al., 2009). Outros quadros infecciosos

causados por A. baumannii, ainda que raros, como endocardite associada à prótese

valvar (Olut & Erkek, 2005) e ceratite em paciente submetido à cirurgia ocular (Kau et

al., 2002) também foram relatados.

A habilidade de sobreviver em ambientes desfavoráveis, observada em

isolados clínicos de A. baumannii constitui sua principal característica em relação a

outros Gram negativos e deve-se, em parte, a sua capacidade em formar biofilmes,

resistindo à dissecação (Donlan & Costerton, 2002; Gaddy & Actis, 2009). A


10

dificuldade em erradicar A. baumannii do ambiente hospitalar, torna os surtos

causados por esse patógeno de difícil controle (Wilks et al., 2006).

2.3. Opções de Tratamento para Infecções Causadas por A. baumannii

Diante das características apresentadas, A. baumannii é uma bactéria de difícil

tratamento já que poucos são os antimicrobianos disponíveis clinicamente que

apresentam atividade contra esses micro-organismos na atualidade. Infelizmente,

algumas cepas apresentam resistência a todos os antimicrobianos que serão aqui

abordados.

2.3.1. Ampicilina/Sulbactam

Sulbactam é um inibidor de β-lactamase que possui atividade contra

Acinetobacter spp. (Brauers et al., 2005), pois se liga à proteína ligadora de penicilina

2 (PBP2), uma das enzimas responsáveis pele síntese de peptideoglicano da parede

celular bacteriana (Cayô et al., 2011b). No Brasil, sulbactam é comercializado

juntamente com a ampicilina, porém, apenas o sulbactam apresenta atividade contra

isolados de A. baumannii (Corbella et al., 1998; Brauers et al., 2005).

O tratamento com ampicilina/sulbactam vem sendo descrito como uma

alternativa eficaz em infecções causadas por Acinetobacter spp. (Jiménez-Mejías et

al., 1997, Tuon et al., 2010). Mesmo nos casos de infecções causadas por

Acinetobacter spp. resistentes aos carbapenens, o uso da ampicilina/sulbactam tem

sido preferido ao das polimixinas (Oliveira et al., 2008). Embora a monoterapia não

seja recomendada para os casos de infecções graves (Maragakis & Perl, 2008), a

associação de ampicilina/sulbactam com outros antimicrobianos, como amicacina,

rifampicina ou colistina tem apresentado resultados promissores (Appleman et al.,

2000; Savov et al., 2002; Ko et al., 2004, Kiffer et al., 2005; Tong et al., 2006; Song et

al., 2007; Peleg, 2007c; Shrivastava et al., 2009). O uso de ampicilina/sulbactam é

indicado e eficaz no tratamento de meningites, pneumonia associada à ventilação


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mecânica e bacteremia associada ao uso de cateter (Jiménez-Mejías et al., 1997;

Corbella et al., 1998; Wood et al., 2002, Oliveira et al., 2008).

As principais vantagens desse antimicrobiano são o custo reduzido e a sua boa

tolerabilidade (Jellison et al., 2001; Oliveira et al., 2008). Apesar disso, alguns estudos

tem mostrado um constante aumento na resistência a esse antimicrobiano, como

apresentado no trabalho de Yang e colaboradores (2010), em Taiwan, onde a taxa de

resistência observada foi em torno de 70%. Já Wieczorek e colaboradores (2012)

apresentaram um estudo de resistência in vitro, onde a CIM para sulbactam em

isolados de A. baumannii passou de 0,5 µg/mL para 4 µg/mL, quando os isolados

foram induzidos a 0,9x o valor da CIM inicial. Mesmo não sendo mais expostos ao

sulbactam, a CIM dos isolados de A. baumannii não retornaram ao seu valor original,

sugerindo que o uso do sulbactam poderia favorecer o surgimento de cepas

resistentes, para as quais o tratamento com esse antimicrobiano, mesmo em altas

doses, poderia não ser efetivo.

2.3.2. Minociclina

A minociclina é um derivado da tetraciclina que foi introduzida na década de 60

(Neonakis et al., 2011) e que voltou a ser utilizada pela redução de opções

terapêuticas eficazes e pelo surgimento de cepas de A. baumannii MDR. Seu

mecanismo de ação consiste em completar os ribossomos, impedindo a ligação do

tRNA e, consequentemente, inibir a transcrição da síntese proteica (Chopra et al.,

1992). A minociclina apresenta concentrações sanguíneas e teciduais ideais, boa

penetração no sistema nervoso central e uma menor taxa de resistência comparada à

tetraciclina. Ela apresenta atividade contra micro-organismos Gram positivos e Gram

negativos (Bishburg & Bishburg, 2009), incluindo isolados de A. baumannii (Pei et al.,

2012; Fernández-Cuenca et al., 2013).

Embora poucos estudos descrevam o uso da minociclina, os resultados

demonstram que esse antimicrobiano pode ser uma boa opção terapêutica no


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tratamento de isolados de A. baumannii MDR. Griffith e colaboradores (2008)

relataram o sucesso do tratamento com minociclina em sete de oito casos de ferida

traumática, ocasionada por isolados MDR pertencentes ao complexo A. calcoaceticus-

baumannii. Já Wood e colaboradores (2003), descreveram o tratamento efetivo em

pacientes com pneumonia. Entretanto, algumas cepas de A. baumannii apresentam

resistência a esse antimicrobiano que, aparentemente, possuem dois mecanismos de

resistência: o primeiro seria decorrente dos genes moduladores tetB e otr, específicos

de sistemas de efluxo, responsáveis por fazer a extrusão da tetraciclina e da

minociclina, mas não da tigeciclina (Chopra et al., 1992; Huys et al., 2005a); e o

segundo é a síntese da proteína Tet(M) e Tet(O), que se ligam ao ribossomo,

modificando sua conformação e impedindo a ligação da minociclina, da tetraciclina e

da doxiciclina (Chopra & Roberts, 2001; Ribera et al., 2003).

2.3.3. Tigeciclina

A tigeciclina é um antimicrobiano semissintético da família das glicilciclinas, que

foi sintetizado a partir de modificação na molécula de minociclina. Seu mecanismo de

ação consiste em inibir a síntese proteica da bactéria, ligando-se a subunidade 30S do

ribossomo. Possui atividade contra micro-organismos Gram negativos, incluindo os

isolados produtores de carbapenemases, Gram positivos [incluindo isolados de

Sthaphylococcus aureus resistentes à oxacilina (ORSA) e Enterococcus spp.

resistentes à vancomicina (VRE)] e anaeróbios (Bergeron et al., 1996).

Para este antimicrobiano, não existem critérios de sensibilidade estabelecidos

pelo “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI, 2012), “British Society for

Antimicrobial Chemotherapy” (BSAC, 2010) e “The European Committee on

Antimicrobial Susceptibility Testing” (EUCAST, 2012), para categorizar os isolados de

Acinetobacter spp. (Neonakis et al., 2011). Entretanto, pelo seu valor de CIM baixo, a

tigeciclina atinge baixas concentrações séricas e, as poucas opções de tratamento


13

observadas para isolados de A. baumannii MDR, fazem da tigeciclina um

antimicrobiano oportuno (Peleg et al., 2007a; Neonakis et al., 2011).

Vários estudos foram realizados como intuito de avaliar a eficácia clínica da

tigeciclina em infecções causadas por A. baumannii, já que esse antimicrobiano possui

boa atividade in vitro contra esses isolados (Neonakis et al., 2011). Poulakou e

colaboradores (2009) relataram que, de 15 pacientes infectados com A. baumannii

MDR, 11 obtiveram melhora ou cura com a monoterapia por tigeciclina. Esse resultado

se contrapõe ao estudo de Gallagher & Rouse (2008), no qual os autores relataram

que, dos 28 pacientes com infecção causada por A. baumannii MDR avaliados,

apenas oito obtiveram melhoria ou cura com a monoterapia com tigeciclina. Da mesma

forma, Schafer e colaboradores (2007) retrataram um caso de pneumonia e

bacteremia causado por um isolado de A. baumannii MDR, que veio a desenvolver

resistência a tigeciclina durante o tratamento. Resultado semelhante foi observado por

Reid e colaboradores (2007), que verificaram o aumento da CIM de tigeciclina em um

isolado de A. baumannii ao longo do tratamento de infecção urinária pós-transplante

de rim e fígado. Por essas razões, os autores concluíram que pacientes acometidos

por infecções causadas por A. baumannii MDR, que fazem uso de tigeciclina, devem

ser monitorados quanto ao desenvolvimento de resistência durante o tratamento (Reid

et al., 2007).

A terapia combinada pode constituir uma alternativa para desfavorecer o

desenvolvimento de resistência à tigeciclina. Estudos tem relatado sinergismo das

combinações de tigeciclina com carbapenens, levofloxacino, amicacina ou rifampicina

(Entenza et al., 2009; Lim et al., 2009; Principe et al., 2009). Resultados controversos

da combinação da tigeciclina com a colistina tem sido reportados (Petersen et al.,

2006; Arroyo et al., 2009; Dizbay et al., 2010). Estudos prospectivos ainda são

necessários, incluindo um maior número de pacientes, para melhor definir a real

eficácia da tigeciclina nas infecções causadas por A. baumannii (Neonakis et al.,

2011).


14

2.3.4. Polimixinas

Polimixina B e polimixina E (também denominada colistina) são polipeptídeos

provenientes da bactéria Paenibacillus polymyxa que foram descobertos em 1947

(Girardello, 2012). Seu mecanismo de ação consiste em permeabilizar a parede

celular bacteriana, deslocando as moléculas de cálcio e magnésio, ligadas ao

lipopolissacarídeo bacteriano, o que desestabilizaria os componentes da membrana

celular externa e interna (Hancock, 1997).

Durante muito tempo, a polimixina teve o seu uso restrito devido à sua

toxicidade (Wolinsky & Hines, 1962; Koch-Weser et al., 1970; Gales et al., 2001;

Falagas et al., 2007). Entrentanto, estudos recentes relatam que as polimixinas não

são tão tóxicas como se imaginava (Conway et al., 1997; Kasiakou et al., 2005; Reina

et al., 2005; Falagas et al., 2007) e, devido as restritas opções terapêuticas,

atualmente, esses antimicrobianos são empregados com uma frequência cada vez

maior no tratamento das infecções causadas por bactérias Gram negativas MDR.

As polimixinas apresentam diversas formas de administração, tópica, inalatória

ou parenteral (Karageorgopoulos & Falagas, 2008; Landman et al., 2008). Elas são

utilizadas para tratar infecções de corrente sanguínea, feridas, infecção do trato

urinário (Gounden et al., 2009), pneumonias e meningites causadas por micro-

organismos Gram negativos MDR (Karageorgopoulos & Falagas, 2008). Entretanto, o

relato do fenômeno de heterorresistência que ocorre quando subpopulações

geneticamente idênticas são mais resistentes que o clone original é preocupante

(Perez et al., 2007), já tendo sido reportado em isolados de A. baumannii (Li et al.,

2006). No estudo de Li e colaboradores (2006) foi observado que de 16 isolados, 15

apresentavam heterorresistência, indicando que esse fenômeno pode ser frequente.

Felizmente ainda são raros os relatos de resistência às polimixinas (Gales et

al., 2001; Gales et al., 2006) e muitos estudos tem demonstrado sucesso no

tratamento de infecções causadas por A. baumannii utilizando antimicrobianos dessa

classe (Levin et al., 1999; Michalopoulos et al., 2005b; Holloway et al., 2006; Kallel et


15

al., 2007; Falagas et al., 2010). Nos casos de isolados resistentes aos carbapenens, o

tratamento de primeira escolha é aquele que emprega as polimixinas (Garnacho-

Montero et al., 2003; Michalopoulos et al., 2005a; Matthaiou et al., 2008).

2.3.5. Carbapenens

Em 1967, com o surgimento de isolados produtores de β-lactamases e a

ineficiência da penicilina contra esses agentes, a indústria Beecham Pharmaceuticals

(London, UK) começou um estudo para encontrar um inibidor de β-lactamase

proveniente de fonte natural (Basker, 1982). Apenas em 1976, foi isolado em várias

culturas de Streptomyces olivaceus, o ácido olivânico, que não foi considerado apenas

um inibidor de β-lactamase, mas também um antimicrobiano com um espectro mais

amplo do que outros β-lactâmicos disponíveis naquela época. Devido a sua pouca

penetração na célula bacteriana e a sua instabilidade química, esse composto teve o

seu desenvolvimento interrompido (Brown et al, 1976; Butterworth et al., 1979; Hood et

al., 1979). Em paralelo, pesquisadores da Merck, Sharp and Dohme Research

Laboratories (Harlow, UK), se voltavam para a descoberta de antimicrobianos que

bloqueavam a síntese de peptideoglicano e analisavam um novo antimicrobiano obtido

de culturas de Streptomyces cattleya que foi, posteriormente, nomeado como

tienamicina. Coincidentemente, esse composto possuía o mesmo núcleo

carbapenêmico do ácido olivânico, mas se diferenciava quanto à estrutura química

(Albers-Schonberg et al., 1978; Kahan et al., 1979). Anos mais tarde, foi desenvolvido

o imipenem, cuja molécula precursora foi a tienamicina, que teve o início da sua

utilização clínica em 1985 (Miyadera et al., 1983; Papp-Wallace et al., 2011). Desde

então, novas moléculas foram sendo desenvolvidas e aprimoradas e, atualmente,

existem seis carbapenens para uso clínico que se diferem pela sua estrutura

molecular, como apresentado na Figura 1. No Brasil, somente o ertapenem, o

imipenem e o meropenem estão disponíveis para uso clínico.


16

1 2

3 4 5

6 7 8

Figura 1. Estruturas químicas das moléculas dos carbepenens e de seus precursores

(Figura obtida de Papp-Wallace et al., 2011). 1: ácido olivânico; 2: tienamicina; 3:

imipenem; 4: meropenem; 5: ertapenem; 6: doripenem; 7: panipenem, 8: biapenem.

Os carbapenens, assim como todos os β-lactâmicos, possuem efeito

bactericida, pois inibem a síntese da parede celular. O anel β-lactâmico é um análogo

esterioquímico do terminal D-alanina-D-alanina, se ligando às PBPs da bactéria, que

são enzimas responsáveis pela síntese de peptídeoglicano. Uma vez ocorrida essa

ligação, é observada uma lenta hidrólise do anel β-lactâmico, impedindo, dessa forma,


17

que as PBPs sintetizem o peptideoglicano, principal composto da parede celular

(Zapun et al., 2008; Drawz & Bomono, 2010).

Os carbapenens são os antimicrobianos utilizados como primeira opção

terapêutica nas infecções causadas por A. baumannii, por possuirem um amplo

espectro de ação, que engloba tanto bactérias Gram negativas como Gram positivas e

por apresentarem boa tolerabilidade e eficácia (Papp-Wallace et al., 2011). Os

carbapenens mais utilizados no Brasil são o imipenem, meropenem e ertapenem e

algumas observações a respeitos desses compostos devem ser consideradas: (i) o

imipenem, primeiro carbapenem descrito, é degradado pela enzima dehidropeptidase-

1 (DHP-1) e, por isso, é administrado juntamente com a cilastatina, um inidor dessa

enzima (Zhanel et al., 2007); (ii) o meropenem não é tão potente quanto o imipenem

na ação contra A. baumannii, mas não é uma regra geral, pois varia de acordo com a

cepa (Oliver et al., 2004); e (iii) o ertapenem tem um espectro restrito e não possui

atividade contra isolados de P. aeruginosa e Acinetobacter spp. (Oliver et al., 2004).

Altas taxas de resistência aos carbapenens verificadas entre os isolados de A.

baumannii tem sido descritas em todo o mundo (Poirel & Nordmann, 2006; Peleg et

al., 2008). Os principais mecanismos de resistência aos carbapenens descritos nesse

micro-organismo são: (i) a produção de carbapenemases do tipo OXA, principalmente

a OXA-23 associada ao elemento de inserção ISAba1, OXA-58 associada aos

elementos de inserção ISAba2, ISAba3 e ISAba18 e OXA-24/40 (Poirel & Nordmann,

2006; Turton et al., 2006); (ii) perda ou redução da porina CarO (29kDa) (Mussi et al.,

2005); (iii) redução da expressão da PBP2 (Fernández-Cuenca et al., 2003a) e (iv) a

hiperexpressão do sistema de efluxo AdeABC (Marqué et al., 2005). Todos esses

mecanismos podem estar presentes no mesmo isolado, uma característica muito

comum em cepas MDR de A. baumannii, que será discutida posteriormente.

Na tentativa de combater infecções mais graves, a terapia combinada surge

como uma importante alternativa. Entretanto, o surgimento de micro-organismos

resistentes é um risco que deve ser levado em consideração. Para tratar isolados de


18

A. baumannii MDR, várias opções de terapia combinada tem sido propostas

(Rodríguez-Hernández et al., 2000; Ermertcan et al., 2001; Fernández-Cuenca et al.,

2003b; Wareham et al., 2006; Kattan et al., 2008; Song et al., 2009), mas nenhuma

mostrou-se ser totalmente eficaz.

2.4. Mecanismos de Resistência aos Carbapenens em A. baumannii

Como descrito anteriormente, A. baumannii é um micro-organismo peculiar por

apresentar características importantes de sobrevivência em ambientes hostis e por

apresentar grande capacidade em adquirir diversos mecanismos de resistência,

muitas vezes associados. Serão apresentados a seguir os quatro mecanismos

descritos, até o momento, que conferem resistência aos β-lactâmicos em isolados

clínicos de A. baumannii.

2.4.1. Produção de β-Lactamases

As β-lactameses são enzimas cromossomais ou plasmidiais que hidrolisam o

anel β-lactâmico (Bush et al., 1995). Essas enzimas são produzidas por bactérias

Gram positivas que as secretam para o meio extracelular e por bactérias Gram

negativas, que as armazenam em seu espaço periplasmático sendo, portanto,

estrategicamente mais eficientes (Livermore, 1993). A capacidade dessas enzimas de

conferirem mais resistência aos β-lactâmicos ou não, depende de sua localização, da

sua cinética, das condições físico-químicas (Livermore, 1995), da quantidade de

enzima produzida, da habilidade em hidrolisar o anel β-lactâmico e da velocidade com

que o antimicrobiano penetra na célula bacteriana (Bush et al.,1995).

Devido a grande diversidade bioquímica e molecular das β-lactamases

encontradas, em 1980, Ambler propôs classificá-las em quatro classes de acordo com

suas sequências de aminoácidos, sendo elas: classe A - serino β-lactamases,

incluindo as β-Lactamases de Espectro Ampliado (ESβL), penicilinases e

carbenicilinases; classe B - Metalo-β-Lactamases (MβL); classe C - cefalosporinases


19

cromossomais e plasmidiais do tipo AmpC; e classe D - oxacilinases (Ambler, 1980).

Posteriormente, Bush e colaboradores (1995) atualizaram a classificação de Bush

(1989a,b,c) que por sua vez, foi uma atualização de Sykes (1982). A classe molecular

de Ambler foi incorporada a essa nova classificação que é baseada nas características

da enzima, substratos específicos e perfil de inibição por inibidores da β-lactamase. A

classificação ocorrida no ano de 1995 foi revisada para a inclusão de novas β-

lactamases não descritas anteriormente (Bush & Jacoby, 2010). Cada uma das

classes será detalhada a seguir.

2.4.1.1. β-Lactamases de Espectro Ampliado (ESβLs)

As ESβLs pertencem à classe A de Ambler (Ambler, 1980) e ao grupo 2be de

Bush (Bush & Jacoby, 2010). Essas enzimas possuem em seu sítio ativo, um éster de

serina que hidrolisa penicilinas, cefalosporinas de amplo espectro e aztreonam e são

inibidas pelos inibidores de β-lactamases, como o ácido clavulânico, o sulbactam e o

tazobactam (Bush & Jacoby, 2010). Entretanto, como os genes que codificam as

ESβLs geralmente estão localizados em plasmídeos, muitas vezes, os isolados

produtores dessas enzimas apresentam resistência cruzada à outras classes de

antimicrobianos, como os aminoglicosídeos, a tetraciclina, o cloranfenicol e a

sulfametoxazol/trimetoprim. Isso acontece, porque os genes que conferem resistência

a esses compostos também são carreados pelos mesmos plasmídeos que carreiam os

genes codificadores de ESβLs (Winokur et al., 2001; Turner, 2005).

Embora as ESβLs sejam encontradas em abundância nas enterobactérias,

apenas CTX-M-2, CTX-M-15, CTX-M-43, PER-1, PER-2, PER-7, TEM-92, TEM-150,

SHV-5, e VEB-1, já foram descritas em A. baumannii (Vahaboglu et al., 1997; Poirel et

al., 2003; Nagano et al., 2004; Celenza et al., 2006; Pasterán et al., 2006; Endimiani et

al., 2007; Naas et al., 2007; Shakil et al., 2010; Bonnin et al., 2011a, Bonnin et al.,

2011b).


20

Outro subgrupo da classe A é o 2f, onde estão inseridas as β-lactamases que

hidrolisam os carbapenens. Essas enzimas possuem resíduos de serina em seu sítio

ativo e são sensíveis aos inibidores das serino-β-lactamases, como o ácido clavulânico

e o tazobactam (Bush & Jacoby, 2010). As enzimas do tipo GES e KPC são as

principais representantes desse grupo. As carbapenemases do tipo GES raramente

são descrita em Acinetobacter spp., e até o momento, GES-11, GES-12 e GES-14

foram relatadas nesse micro-organismo em áreas geográficas específicas (Moubareck

et al., 2009; Bogaerts et al., 2010; Bonnin et al., 2011a). Já as carbapenemases do

tipo KPC, comumente encontrada em isolados de K. pneumoniae, são mundialmente

disseminadas e causadoras de inúmeros surtos, inclusive no Brasil (Hirsch & Tam,

2010). Entretanto, os representantes desse subgrupo foram raramente descritos em

cepas de A. baumannii, sendo relatados KPC-2, KPC-3, KPC-4 e KPC-10 (Robledo et

al., 2010).

2.4.1.2. Metalo-β-Lactamases (MβL)

Na classe B de Ambler estão inseridas as MβL que utilizam íons Zn2++ como

cofator e, por isso, são inibidas por agentes quelantes como o EDTA (Walsh et al.,

2005). As MβL hidrolisam todos os β-lactâmicos, exceto o aztreonam (Walsh et al.,

2005). De acordo com a classificação de Bush (Bush & Jacoby, 2010), existem três

subgrupos, sendo o subgrupo B1 o de maior importância clínica, composto por

enzimas adquiridas que já foram descritas em isolados de A. baumannii (Queenan &

Bush, 2007; Cornaglia et al., 2011). Essas enzimas estão, em sua grande maioria,

localizadas em elementos genéticos móveis denominados integrons de classe 1, onde

estão inseridos os genes cassetes que as codificam. Por sua vez, os integrons podem

estar inseridos tanto no plasmídeo como no cromossomo bacteriano (Walsh et al.,

2005).

Em seu artigo de revisão, Cornaglia e colaboradores (2011) relataram que já

foram descritas, em cepas de A. baumannii isoladas em diferentes países, as


21

seguintes MβLs: IMP-1, IMP-2, IMP-4, IMP-5, IMP-8, IMP-10, VIM-1, VIM-2, VIM-3,

VIM-4, VIM-11, SIM-1 e NDM-1. Recentemente, foram descritas a NDM-2 nos

Emirádos Árabes (Ghazawi et al., 2012) e a GIM-1 na Coréia (Hong et al., 2012).

2.4.1.3. Cefalosporinase do Tipo AmpC (ADCs)

As enzimas do tipo AmpC pertencem a classe C de Ambler (Ambler, 1980) e ao

grupo 1 de Bush (Bush & Jacoby, 2010). Essas enzimas hidrolisam com eficiência as

penicilinas e as cefamicinas e, com menor eficiência, o aztreonam e as cefalosporinas

de amplo espectro. Entretanto, os carbapenens e as cefalosporinas de quarta geração

não são, geralmente, hidrolisados por essa enzima (Ni et al., 2005; Jacoby, 2009). O

gene que codifica a β-lactamase do tipo AmpC pode estar localizado tanto no

cromossomo quanto no plasmídeo (Philippon et al., 2002; Jacoby, 2009). As enzimas

AmpCs cromossomais estão presentes em diversas bactérias, mas, principalmente,

naquelas incluídas no grupo CESP (Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Serratia

marcescens, Providencia stuartii, P. aeruginosa e Morganella morganii), onde tem a

sua produção induzida na presença de β-lactâmicos (Bush et al., 1995).

Para induzir a expressão da AmpC é necessário que os três genes reguladores

(ampD, ampG e ampR) estejam presentes no genoma bacteriano (Kuga et al., 2000).

Antimicrobianos como o imipenem e a cefoxitina são considerados fortes indutores da

produção dessa enzima (Jones, 1998). Em A. baumannii, essa enzima também é

cromossomal e intrínseca, porém, a indução não ocorre de modo efetivo devido à

ausência do gene ampR. Dessa foram, a AmpC é somente expressa em níveis basais,

não hidrolisando as cefalosporinas de amplo espectro em A. baumannii (Bou &

Martínez-Beltrán, 2000). Entretanto, quando o elemento de inserção ISAba1 está

inserido a montante do gene blaAmpC, ocorre a hiperexpressão dessa enzima

conferindo resistência às cefalosporinas de amplo espectro (Boo et al., 2009; Lin et al.,

2010).


22

Rodríguez-Martínez e colaboradores (2010) denominaram uma nomenclatura

específica para a AmpC em Acinetobacter, chamada de ADC (Acinetobacter-Derived

Cephalosporinases), pois apresentam um único ancestral comum e se distanciam

muito das AmpCs descritas em outros micro-organismos (Hujer et al., 2005). A

primeira ADC descrita em A. baumannii foi a ADC-7, que hidrolisa fortemente

ceftazidima e cefotaxima, mas não hidrolisa carbapenens (Hujer et al., 2005), sendo a

última descrita, a ADC-68 (KC866352.1). A hiperprodução de ADC associada à perda

de porina e/ou à hiperexpressão de sistemas de efluxo pode levar a diminuição da

sensibilidade aos carbapenens (Bradford et al., 1997; Jacoby, 2009).

2.4.1.4. Oxacilinases

As oxacilinases (OXAs) pertencem a classe D de Ambler (Ambler, 1980) e ao

grupo 2 de Bush (Bush & Jacoby, 2010). São chamadas assim por terem a capacidade

de hidrolisar a oxacilina e a cloxacilina e por hidrolisar, consideravelmente, as

aminopenicilinas e as carboxipenicilinas. Essas enzimas são fortemente inibidas, in

vitro, pelo cloreto de sódio (Poirel et al., 2010) e apresentam resíduo de serina em seu

sítio ativo como as enzimas das classes A e C de Ambler (Poirel et al., 2010).

Na subdivisão de Bush (Bush & Jacoby, 2010), as oxacilinases são

classificadas em três subgrupos, sendo eles: 2d - OXAs de espectro limitado, capazes

de hidrolisar somente a oxacilina e a cloxacilina, comumente encontradas em

enterobactérias (Bush & Jacoby, 2010); 2de - OXAs de espectro ampliado, capazes de

hidrolisar oxiaminocefalosporinas, cefepima e cefotaxima, comumente encontradas em

P. aeruginosa (Aubert et al., 2001; Bush & Jacoby, 2010); e 2df - carbapenemases do

tipo OXA ou CHDLs, frequentemente encontradas em A. baumannii. As CHDLs

hidrolisam fracamente os carbapenens e os genes que as codificam podem estar

localizados tanto no cromossomo como em plasmídeos (Bush et al., 1995; Walther-

Rasmussen & Høiby, 2006; Bush & Jacoby, 2010). Por apresentarem a capacidade de

hidrolisar os carbapenens, constituem o grupo de oxacilinases de maior importância.


23

Já foram descritos sete subtipos de CHDLs em todo o mundo, sendo elas:

OXA-23, OXA-24/40, OXA-51, OXA-58, OXA-143, OXA-182 e OXA-235 (Brown &

Amyes, 2006; Walther-Rasmussen & Høiby, 2006; Higgins et al., 2009; Kim et al.,

2010; Poirel et al., 2010, Higgins et al., 2013).

2.4.1.4.1. OXA-23

A OXA-23 foi inicialmente descrita em 1985 na cidade de Edimburgo - Escócia,

em um isolado de A. baumannii resistente ao imipenem, proveniente de hemocultura

(Paton et al., 1993). Inicialmente, foi denomindada ARI-1 “Acinetobacter Resistant to

Imipenem” e, posteriormente, por possuir similaridade menor que 40% com as outras

enzimas pertencentes à classe D de Ambler (Ambler, 1980), passou a ser denominada

OXA-23 (Donald et al., 2000), sendo o primeiro grupo de CHDL descrita.

Em um estudo conduzido por Poirel e colaboradores (2008) foi identificado o

gene blaOXA-23 no cromossomo de isolados sensíveis aos carbapenens de

Acinetobacter radioresistans, considerada uma espécie comensal presente na pele de

pacientes internados. Os autores concluíram que A. radioresistens constitui o

reservatório natural do gene que codifica a OXA-23, o qual foi, posteriormente,

transferido para A. baumannii. O gene codificador dessa enzima foi disseminado

através da sequência de inserção ISAba1 mediado por plasmídeo proveniente de um

A. baumannii. O plasmídeo teria se inserido no cromossomo de A. radioresistans, se

transposto, mobilizando as regiões a montante e a jusante do gene blaOXA-23 no

cromossomo de A. radioresistens. A estrutura gerada formou assim uma estrutura

semelhante a um transposon e, ao mesmo tempo, conferia expressão aumentada ou

hiperexpressão da OXA-23. O plasmídeo carreando o gene blaOXA-23 foi, então,

transferido para um isolado de A. baumannii e, dessa forma, disseminado para outros

isolados.

A OXA-23 é uma carbapenemase mundialmente disseminada, presente em

mais de 50 países. Por essa razão é a oxacilinase mais estudada em Acinetobacter


24

spp., principalmente em A. baumannii, salvo a exceção de um caso de OXA-23

descrito em Proteus mirabilis, proveniente de um surto ocorrido na França (Bonnet et

al., 2002). A Figura 2 mostra a distribuição de OXA-23 em isolados de A. baumannii

no mundo.


25

Figura 2 - Distribuição mundial de OXA-23 em isolados clínicos de A. baumannii resistentes aos carbapenens. Legenda: AMÉRICA DO

NORTE [Canadá (Mataseje et al., 2012); Estados Unidos (Doi et al., 2007); México (Higgins et al., 2010)]; AMÉRICA CENTRAL [Porto Rico

(Higgins et al., 2010)]; AMÉRICA DO SUL [Argentina (Merkier et al., 2008); Brasil (Dalla-Costa et al., 2003); Chile (Higgins et al., 2010);

Colômbia (Villegas et al., 2007); Venezuela (Higgins et al., 2010)]; ÁFRICA [África do Sul (Segal et al., 2005b); Argélia (Mugnier et al.,


26

2010); Egito (Mugnier et al., 2010); Ilha de Reunião (Mugnier et al., 2010); Líbia (Mugnier et al., 2010); Madagascar (Andriamanantena et al.,

2010); Tunísia (Hammami et al,. 2011)]; EUROPA [Alemanha (Kohlenberg et al., 2009); Áustria (Higgins et al., 2010); Bélgica (Bogaerts et

al., 2008); Bulgária (Stoeva et al., 2008); Escócia (Paton et al., 1993); Espanha (Higgins et al., 2010); França (Héritier et al., 2005a); Grécia

(Higgins et al., 2010); Hungria (Higgins et al., 2010); Inglaterra (Turton et al., 2005); Irlanda (Higgins et al., 2010); Itália (Mendes et al.,

2009b); Polônia (Higgins et al., 2010); Portugal (Higgins et al., 2010); Rep. Tcheca (Krizova et al., 2012); Romênia (Bonnin et al., 2011c);

Suécia (Karah et al., 2011); Suíça (Higgins et al., 2010)]; ÁSIA [Bahrein (Mugnier et al., 2010); China (Wang et al., 2003); Coréia (Jeon et al.,

2005); Emirados Árabes Unidos (Mugnier et al., 2008); Hong Kong (Mendes et al., 2009a); Índia (Mendes et al., 2009a); Irã (Feizabadi et al.,

2008); Iraque (Kusradze et al., 2011); Israel (Higgins et al., 2010); Japão (Kouyama et al., 2012); Kuwait (Al-Sweih et al., 2012); Paquistão

(Higgins et al., 2010); Cingapura (Afzal-Shah et al., 2001); Tailândia (Mendes et al., 2009a); Taiwan (Lu et al., 2009); Turquia (Meric et al.,

2008); Vietnã (Mugnier et al., 2010)]; OCEANIA [Austrália (Higgins et al., 2010); Nova Caledônia (Le Hello et al., 2008); Polinésia Francesa

(Naas et al., 2005)].


27

Vários estudos têm relatado variantes da OXA-23, incluindo uma variante

descrita em K. pneumoniae na Austrália. Até o momento, foram relatadas 13 variantes

de OXA-23 (Tabela 1), concentradas principalmente no sudeste da Ásia e, dessas,

mais de 50% foram descritas na Tailândia, como pode ser observado na Figura 3.

Tabela 1 - Variantes de OXA-23 descritas de acordo com a espécie de isolamento,

ano e país de origem.

Variante da OXA-23 Espécie Ano País Referência

OXA-27 A. baumannii 2001 Cingapura Afzal-Shah et al., 2001

OXA-49 A. baumannii 2003 China AY288523

OXA-73 K. pneumoniae 2006 Austrália AY762325

OXA-133 A. radioresistans 2009 Índia Mendes et al., 2009a

OXA-146 A. baumannii 2009 China FJ194494

OXA-165 A. baumannii 2010 Tailândia HM488986







OXA-225 A. baumannii 2012 Alemanha JN638887


28

Figura 3. Distribuição mundial das variantes de OXA-23 descritas em Acinetobacter spp. e em K. pneumoniae.


29

A OXA-23, assim como a maioria das CHDLs, hidrolisam fracamente os

carbapenens e, para que o gene que a codifica seja hiperexpresso, é necessária a

presença de um elemento de inserção a montante do gene, geralmente a ISAba1

(Poirel & Nordmann, 2006). No estudo de Héritier e colaboradores (2005a) foi

analisada a eficiência dos três principais grupos de CHDLs, OXA-23, OXA-24/40 e

OXA-58 frente aos carbapenens. Os autores observaram que quando a CHDL possuia

um elemento de inserção a montante do gene (ISAba1 para OXA-23 e ISAba3 para

OXA-58), o valor da CIM para os carbapenens aumentava significativamente. Cepas

transformantes que possuiam o plasmídeo pFER ou pMAD, naturalmente produtores

de OXA-23 ou OXA-58, foram mais resistentes aos carbapenens que os

transformantes com plasmídeos recombinates pOXA-23 e pOXA-58.

2.4.1.4.2. OXA-24/40

A segunda CHDL descrita em A. baumannii foi a OXA-24, identificada por Bou

e colaboradores (2000a) na Espanha, em 1997. Sua sequência é idêntica à OXA-40

(Lopez-Otsoa et al., 2002) e, por muitos autores, é denominada OXA-24/40. É a

terceira CHDL mais disseminada no mundo e, atualmente, possui seis variantes (OXA-

25, OXA-26, OXA-72, OXA-139, OXA-160 e OXA-207), sendo a OXA-72 a única

variante descrita no Brasil (Werneck et al., 2011a). Uma das principais características

dessa enzima é que não está associada à sequência de inserção para aumentar a

expressão de seu gene, como verificado para as CHDLs OXA-23, OXA-51 e OXA-58.

Sendo assim, as carbapenemases do grupo OXA-24/40 são as CHDLs mais potentes

encontradas em A. baumannii (Poirel et al., 2010). O processo de mobilização dessas

enzimas ocorre por um processo único entre as CHDLs, por meio de recombinação

homóloga (Poirel et al., 2010). Além disso, a OXA-24/40 já foi descrita em P.

aeruginosa na Espanha (Sevillano et al., 2009).


30

2.4.1.4.3. OXA-51

A terceira CHDL descrita em A. baumannii foi identificada pela primeira vez em

dois isolados clínicos de A. baumannii em 1994 na Argentina (Brown et al., 2005). É

uma CHDL que hidrolisa fracamente os carbapenens e necessita de uma sequência

de inserção, geralmente ISAba1 ou ISAba9, a montante do seu gene para aumentar

sua eficiência na resistência aos carbapenens (Figueiredo et al., 2009). A OXA-51 é

naturalmente encontrada em isolados de A. baumannii (Héritier et al., 2005b) e, por

muito tempo, a presença desse gene em cepas de Acinetobacter spp. foi utilizada

como teste presuntivo para a identificação de A. baumannii. Entretanto, a presença do

gene blaOXA-51-like em um isolado de Acinetobacter spp. não é mais preditivo de A.

baumannii, uma vez que esse gene foi encontrado em um plasmídeo carreado por um

isolado clínico de A. nosocomialis (Lee et al., 2009). Atualmente, existem mais de 65

variantes de OXA-51distribuídas pelo mundo (http://www.lahey.org/Studies/).

2.4.1.4.4. OXA-58

A OXA-58 foi a quarta CHDL descrita em A. baumannii e é, também, a segunda

mais disseminada no mundo. Foi identificada pela primeira vez em 2003 na França

(Poirel et al., 2005) e possui atualmente três variantes, sendo elas a OXA-96, a OXA-

97 e a OXA-164 (http://www.lahey.org/Studies/). Assim como as variantes de OXA-51 e

de OXA-23, as CHDLs do grupo da OXA-58 necessitam de uma sequência de

inserção a montante do gene que a codifica para aumentar a sua expressão e assim,

conferir resistência aos carbapenens. A OXA-58 pode estar associada a diferentes

sequências de inserção como a ISAba1, ISAba2, ISAba3 e ISAba18 (Poirel &

Nordmann, 2006).

2.4.1.4.5. OXA-143, OXA-182 e OXA-235

Recentemente, três novos grupos de CHDLs foram descritas em A. baumannii.

A OXA-143, descrita em isolados de A. baumannii no Brasil em 2004, possui uma

http://www.lahey.org/Studies/

http://www.lahey.org/Studies/


31

identidade de 88% de sequência de aminoácidos com a OXA-24/40. Essa enzima

apresenta apenas uma variante descrita, a OXA-231, na cidade de Londrina, Paraná,

em 2012 (Gionco et al., 2012). Assim como a OXA-24/40, também não necessita de

uma sequência de inserção para aumentar a expressão de seu gene, embora o

contexto genético do gene blaOXA-143-like não seja o mesmo do gene blaOXA-24/40-like

(Higgins et al., 2009; Gionco et al., 2012). A OXA-182 foi identificada em 2007 na

Coréia do Sul e não apresenta nenhuma variante até o momento. Possui uma

identidade maior que 80% de sequências de aminoácidos com a OXA-24/40 e, assim

como essa, também não necessita de uma sequência de inserção para aumentar a

expressão de seu gene (Kim et al., 2010). A OXA-235 foi identificada nos Estados

Unidos e no México entre 2005 a 2009. Possui uma identidade de 85% de sequência

de aminoácidos com a OXA-134 (uma CHDL descrita em A. lwoffii) e apresenta duas

variantes, a OXA-236 e a OXA-237, ambas descritas nos Estados Unidos. Esse

mesmo estudo mostrou que o gene blaOXA-235 está alocado entre duas ISAba1, sendo

esse elemento de inserção necessário tanto para sua mobilização como para o

aumento da sua expressão (Higgins et al., 2013).

2.4.2. Impermeabilidade de Membrana Externa

Porinas são proteínas de membrana externa ou (“Outer Membrane Proteins” -

OMPs), que formam canais, permitindo o transporte de moléculas hidrofílicas de baixo

peso molecular para dentro e para fora da célula bacteriana (Vila et al., 2007).

Variações estruturais ou diminuição da expressão das porinas, em resposta a

presença de antimicrobianos, são estratégias de sobrevivência que muitas bactérias

desenvolveram. As porinas podem significar um importante fator no desenvolvimento

da resistência contra os antimicrobianos (Vila et al., 2007). Como descrito no trabalho

de Sato e Nakae (1991), a permeabilidade da membrana externa de A. baumannii é

duas a sete vezes menor que em P. aeruginosa. O pequeno número e tamanho das

porinas em A. baumannii poderia explicar a diminuição da permeabilidade da


32

membrana externa (menos que 5%), quando comparada a outros bacilos Gram

negativos. Esse fato poderia auxiliar na resistência instrínseca a diversos

antimicrobianos verificado neste micro-organismo (Obara & Nakae, 1991). Vários

estudos avaliando amostras de A. baumannii resistentes aos carbapenens,

observaram modificação na estrutura ou na perda de porinas (Limansky et al., 2002;

Dupont et al., 2005; Mussi et al., 2005; Tomás et at., 2005).

Através da análise da sequência de aminoácidos, foi possível detectar que as

estruturas das porinas em Gram negativos são semelhantes, apresentando ausência

de regiões de resíduos hidrofóbicos, carga total ligeiramente negativa, baixo índice de

instabilidade, conteúdo elevado de glicina e ausência de resíduos de cisteína (Vila et

al., 2007). As proteínas OmpHMP, OmpW, CarO, 33-36 kDa e OprD-like são OMPs

descritas em isolados de A. baumannii e que teriam um papel importante na

resistência aos carbapenens nesse micro-organismo. A OmpHMP (“Heat-Modifiable

Protein”) é uma proteína monomérica de 35,6 KDa e uma das OMPs mais importantes.

Possui homologia com outras proteínas monoméricas, como a OmpA em

Enterobactérias e a OprF em Pseudomonas spp. (Nitzan et al., 1999; Gribun et al.,

2003). Essa OMP também pode ser denominada OmpAAb em Acinetobacter spp.

(Sugawara & Nikaido, 2012).

A OmpW é uma proteína monomérica pequena de 22 kDa homóloga à OprG

da família Pseudomonadaceae (Siroy et al., 2006). Pode estar relacionada à

resistência a colistina em mutantes de A. baumannii (Vila et al., 2007) e à ceftriaxona

em amostras de Salmonella typhimurium (Hong et al., 2006). No intuito de se conhecer

sobre a contribuição da OmpW na resistência aos carbapenens, Tiwari e

colaboradores (2012) avaliaram a proteômica da OmpW em cepas resistentes de A.

baumannii em comparação a um controle sensível (ATCC 19606). Uma diminuição da

expressão da OmpW nas amostras resistentes aos carbapenens em relação a ATCC

foi detectada.


33

A CarO é uma porina de 29 kDa que, quando ausente em isolados de A.

baumannii não produtores de carbapenemase, pode estar associada a resistência ao

imipenem (Limansky et al., 2002). Por outro lado, o estudo publicado por Mussi e

colaboradores (2005) demonstrou que a inativação do gene carO por um elemento de

inserção, levava a perda dessa porina e, consequentemente, à resistência tanto ao

imipenem como ao meropenem. Foi verificado ainda que isoformas modificadas dessa

porina não transportavam eficientemente os carbapenens, em comparação a isoforma

selvagem (Vashist et al., 2010).

Outras duas porinas estão relacionadas à resistência aos carbapenens em

isolados de A. baumannii: a Omp33-36 kDa que na verdade possui 31 kDa (Tomás et

al., 2005) e uma porina de 43 kDa, homóloga à OprD (D2) de P. aeruginosa, chamada

de OprD-like (Dupont et al., 2005). Embora não tenha sido observado nenhum sítio de

ligação específico para os carbapenens na CarO (Siroy et al., 2005), a OprD-like seria

um canal específico para esses compostos (Vila et al., 2007).

2.4.3. Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo

Os sistemas de efluxo estão presentes em todos os tipos de células,

protegendo-as dos efeitos tóxicos de substâncias químicas. A membrana externa das

bactérias Gram negativas age como uma barreira, limitando a entrada de agentes

nocivos à célula bacteriana. Os sistemas de efluxo expulsam tais agentes do interior

da célula (Vila et al., 2007). Até o momento, seis famílias de efluxo foram descritas por

Poole (2002), tanto em bactérias Gram positivas quanto em bactérias Gram negativas:

ABC “ATP Binding Cassette”, MFS “Major Facilitador Superfamily”, SMR “Small

Multidrug Resistance”, MATE “Multidrug and Toxic Compound Extrusion”, DMT “Drug-

Metabolite Transporter” e RND “Resistance-Nodulation Division”.

Os sitemas de efluxo do tipo ABC são transportadores de multidrogas

dependentes de ATP como fonte de energia para ejetar os antimicrobianos do interior


34

das células. Os membros dessa família raramente estão envolvidos com fenótipo de

resistência aos antimicrobianos em bactérias Gram negativas (Poole, 2002).

A família MFS transporta grupos específicos de antimicrobianos, como a

tetraciclina (tetA e tetB), a minocilina e o cloranfenicol (tetB e cmlA) (Martí et al., 2006;

Vila et al., 2007; Coyne et al., 2011). A família SMR contém o sistema de efluxo AbeS.

A inativação do gene regulador abeS confere um maiore nível de resistência ao

cloranfenicol, às fluoroquinolonas, à eritromicina e à novobiocina. Além disso, esse

sistema também confere resistência aos corantes e detergentes (Coyne et al., 2011).

A família MATE, contém o sistema de efluxo AbeM que utiliza dois mecanismos

de geração de energia: a força próton motriz e o gradiente de íons de sódio (Piddock,

2006). No entanto, esse sistema utiliza com maior frequência a força próton motriz

para ejetar os antimicrobianos da célula bacteriana (Su et al., 2005). A hiperexpressão

desse sistema confere um aumento, maior que quatro vezes, na CIM para

norfloxacino, ofloxacino, ciprofloxacino, gentamicina, triclosan e brometo de etídio.

Além disso, o mesmo sistema aumenta em duas vezes a CIM para canamicina,

eritromicina, cloranfenicol, cloreto de tetrafenilfosfónio (TPPCl) e trimetoprim (Su et al.,

2005). A família DMT ainda é pouco estudada, mas parece estar mais associada à

expulsão de metabólitos do interior da célula bacteriana (Zakataeva et al., 2006).

A família RND é, provavelmente, a mais estudada por estar relacionada à

resistência aos β-lactâmicos, uma das classes de antimicrobianos mais utilizadas.

Essa família utiliza a força próton motriz para expulsar os antimicrobianos da célula.

Ela contém o sistema de efluxo AdeABC, o mais importante dentre os demais

membros dessa família em A. baumannii e que será melhor abordado no item 2.4.3.1.

Além do sistema AdeABC, outros representantes dessa família foram descritos. O

sistema AdeFGH, que é regulado pelo gene adeG, confere resistência às

fluoroquinolonas, ao cloranfenicol, ao trimetoprim, à clindamicina e confere uma

diminuição da sensibilidade às tetraciclinas, à tigeciclina e ao sulfametoxazol (Coyne

et al., 2010a; Magnet et al., 2001; Marchand et al., 2004; Coyne et al., 2011). O


35

sistema AdeIJK leva à resistência intrínseca às cefalosporinas, ao aztreonam, às

fluoroquinolonas, à tetraciclinas, às lincosamidas, à rifampicina, ao cloranfenicol, ao

trimetoprim, à novobiocina e ao ácido fusídico (Damier-Piolle et al., 2008; Coyne et al.,

2010b) e, recentemente, seu gene regulador, o adeN, foi descoberto e codifica o

regulador transcricional TetR (Rosenfeld et al., 2012).

2.4.3.1. Sistema AdeABC

O sistema de efluxo AdeABC é o mais importante em A. baumannii. É

composto pelo sistema de três proteínas (AdeA, proteína de fusão, AdeB, componente

trans-membrana, ou seja, a bomba propriamente dita e o AdeC, a proteína de

membrana externa), como mostrado na Figura 4.

Figura 4. Esquema do sistema de efluxo AdeABC. Fonte:

http://www.zsyy.com.cn/alfb_Show.asp?id=2485&Nclass=28&N=N.

A hiperexpressão desse sistema confere resistência, principalmente, aos

aminoglicosídeos, aos β-lactâmicos, às fluoroquinolonas, às tetraciclinas, à tigeciclina,

aos macrolídeos, ao cloranfenicol e ao trimetoprim (Magnet et al., 2001; Héritier et al.,

2005a). Cefepima, cefpiroma e cefotaxima são os β-lactâmicos mais afetados e sofrem

pouco impacto pelos outros sistemas dessa família. O sistema AdeABC é regulado por

dois genes, adeR (resposta regulatória) e adeS (sensor quinase) (Magnet et al., 2001).

Mutações nos genes adeRS são responsáveis pela hiperexpressão do sistema

http://www.zsyy.com.cn/alfb_Show.asp?id=2485&Nclass=28&N=N


36

AdeABC, conferindo resistência às classes de antimicrobianos descritas

anteriormente. Quando um dos dois genes é inativado, a sensibilidade aos

antimicrobianos é observada, pois a proteína AdeR funciona como um ativador

transcricional (Magnet et al., 2001; Marchand et al., 2004; Coyne et al., 2010b; Coyne

et al., 2011). Transposição de uma cópia de ISAba1 dentro do gene adeS, também

pode levar a hiperexpressão desse sistema, como observado em amostras clínicas no

trabalho de Ruzin e colaboradores (2007). O operon do sistema AdeABC está

representado na Figura 5.

Figura 5. Representação do operon do sistema AdeABC.

Um estudo in vitro com inibidores de sistemas de efluxo como o “carbonyl

cyanide m-chlorophenylhydrazone” (CCCP), “1-(1-naphthylmethyl)-piperazine” (NMP)

e “phenyl-arginine-beta-naphthylamide” (PAβN), mostraram resultados controversos e

diferenças nas atividades dos carbapenens (Bou et al., 2000b; Quale et al., 2003;

Pournaras et al., 2006). A hiperexpressão do sistema AdeABC, provavelmente,

contribui para a resistência aos carbapenens, mas outros mecanismos podem estar

envolvidos, como por exemplo, o estresse osmótico (Coyne et al., 2011). O sistema

AdeABC está presente em muitos isolados de A. baumannii (Bratu et al., 2008; Chen

et al., 2009; Hujer et al., 2006; Huys et al., 2005a; Nemec et al., 2007; Srinivasan et al.,

2009) e parece estar presente apenas em isolados clínicos (Huys et al., 2005b). A

hiperexpressão desse sistema já foi descrita in vivo, como sendo responsável pela

resistência à tigeciclina (Peleg et al., 2007a) e ao ciprofloxacino (Higgins et al., 2004).

adeS adeR adeA adeB adeC


37

2.4.4. Alteração das Proteínas Ligadoras de Penicilinas (PBPs)

As PBPs são enzimas que possuem uma origem evolutiva comum e catalisam

a síntese de peptídeoglicano, principal componente da parede celular bacteriana.

Essas proteínas estão associadas à morfogênese e à divisão celular (Sauvage et al.,

2008). São classificadas em dois grupos, de acordo com o seu peso molecular

aparente pela técnica de SDS-PAGE, pelas suas sequências de aminoácidos e suas

funções enzimáticas e celulares: (i) HMM - PBPs de alto peso molecular, subdividida

em duas classes: classe A, PBPs com atividade de transpeptidase e glicosiltranferase

(Bertsche et al., 2005; Born et al., 2006); classe B, PBPs com atividade somente de

transpeptidase (Den Blaauwen et al., 2003; Piette et al.,2004); (ii) LMM - PBPs de

baixo peso molecular ou de classe C que são D,D-carboxipeptidases e/ou

endopeptidases, envolvidas na divisão celular, na maturação do peptideoglicano e

reciclagem da parede celular (Ghosh et al., 2008). As transglicosilases monofuncionais

ou MGTs estão presentes em algumas bactérias. Essas proteínas tem um único

domínio de glicosiltranferase similar á classe A das PBPs, porém, sua função ainda

não é conhecida (Spratt et al.,1996; Cayô et al., 2011b).

Os β-lactâmicos atuam mimetizando o terminal D-Ala-D-Ala, atuando como

inibidores suicidas ao se ligar covalentemente às PBPs (Zapun et al., 2008). Tal

ligação leva à desestabilização da parede da célula bacteriana, levando à lise celular

(Wilke et al., 2005). Dessa forma, mutações nas PBPs levam à resistência aos β-

lactâmicos (Zapun et al., 2008). Em um estudo conduzido por Obara & Nakae (1991),

avaliaram as PBPs de A. calcoaceticus sensíveis a imipenem detectando seis tipos

diferentes de PBPs no gel de SDS-PAGE que foram deletadas. Amostras que eram

resistentes à cefoxitina, à ceftazidima ou à cefoperazona, apresentaram alteração na

expressão das PBPs e na redução da expressão das porinas.

No estudo conduzido por Cayô e colaboradores (2011b), sete genes de PBPs

(PBP1a, PBP1b, PBP2, PBP3, PBP5/6, PBP6b, PBP7/8) e um gene de MGT (MgtA)

foram descritos em isolados de A. baumannii, mostrando a diversidade e


38

complexidade dessas enzimas. Na presença de alternativas eficientes, tais como a

produção de CHDLs e/ou a perda de porinas, a pressão seletiva dos β-lactâmicos

sobre as PBPs em A. baumannii, pode ser insuficiente para selecionar mutações que

estariam diretamente envolvidas na resistência sobre esses antimicrobianos. Por outro

lado, é possível que outros mecanismos complexos associados à regulação de genes

codificadores de PBPs, bem como eventos pós-transcricionais, poderiam causar

resistência aos β-lactâmicos nesse patógeno (Cayô et al., 2011b).

Em 2011, um estudo realizado por Yun e colaboradores (2011) avaliou a

regulação proteômica de isolados de A. baumannii resistentes ao imipenem sob

condições de estresse causado por diferentes antimicrobianos. Os autores

observaram que, na presença de imipenem, ocorre um aumento dos níveis de

transcrição dos genes codificadores da PBP1a, PBP3, PBP5/6, dos sistemas de efluxo

AdeABC e AdeJIK, e da AmpC. Além disso, foi observada uma redução da expressão

das OMPs OmpHMP e OmpW, demonstrando a complexa associação de mecanismos

de resistência em isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenens.

OBJETIVOS

39

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO PRINCIPAL

Avaliar a contribuição da hiperexpressão do sistema de efluxo AdeABC e da

hiperprodução de AmpC na resistência aos β-lactâmicos em isolados clínicos

de A. baumannii produtores de OXA-23 no Brasil.

3.2. OBJETIVOS SECUNDÁRIOS

Verificar a ancestralidade das amostras de A. baumannii produtoras de OXA-23

no Brasil;

Correlacionar à ancestralidade e os padrões genéticos de isolados de A.

baumannii descritos no mundo, com os diferentes clones e subclones de A.

baumannii descritos no Brasil;

Detectar fenotipicamente a hiperexpressão de sistemas de efluxo utilizando o

inibidor PAβN;

Associar o nível de expressão do gene adeB aos seus respectivos grupos

clonais e perfis de sensibilidade correspondentes;

Correlacionar a hiperprodução de AmpC associado à presença de ISAba1 com

a resistência às cefalosporinas de amplo espectro;

Avaliar o perfil das proteínas de membrana externa, correlacionando o perfil de

SDS-PAGE com os resultados de expressão da qRT-PCR.

MATERIAL E MÉTODOS

40

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Amostras Bacterianas

Em um estudo prévio publicado por Gales e colaboradores (2011) foi avaliada a

atividade do doripenem frente a uma coleção de 806 isolados clínicos Gram negativos,

provenientes de infecção do trato respiratório inferior, infecção de corrente sanguínea

e de infecção intra-abdominal. Nesse estudo, um total de 103/806 isolados (12,78%)

foi identificado como sendo Acinetobacter spp. Os isolados foram obtidos em 18

hospitais privados com mais de 200 leitos localizados em oito estados brasileiros de

quatro regiões geográficas distintas. Inicialmente, no estudo conduzido por Werneck e

colaboradores (2011a) foi realizada uma avaliação da produção de CHDLs nesses

isolados, no qual foi verificado que 76/103 (73,78%) eram produtores de OXA-23.

Além disso, no mesmo estudo foi observada uma alta diversidade genética entre os

isolados produtores de OXA-23, sendo descritos 16 clones e 15 subclones (Werneck

et al., 2011a).

Para a avaliação do impacto do sistema de efluxo AdeABC e da hiperprodução

de AmpC na resistência aos β-lactâmicos em isolados clínicos brasileiros de A.

baumannii produtores de OXA-23, foi selecionado um representante de cada grupo

clonal descrito por Werneck e colaboradores (2011a), incluindo os subclones,

totalizando assim 31 isolados de A. baumannii. A Figura 6 representa a distribuição

dos 31 isolados de A. baumannii selecionados para o presente estudo, de acordo com

a unidade da federação.

MATERIAL E MÉTODOS

41

Figura 6: Distribuição dos 31 isolados de A. baumannii produtores de OXA-23

apresentando distintos perfis clonais de acordo com a unidade da federação brasileira.

Todos os isolados foram retirados do Banco de Micro-organismos do

Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC), onde estavam armazenados a -

20ºC em criotubos contendo TSB com 15% de glicerol. Os isolados foram repicados

em ágar Base Columbia (Oxoid, Basingstoke, UK) acrescido de 5% de sangue de

carneiro, para verificar sua viabilidade e pureza e incubados a 35ºC±2ºC por 24 horas.

Em seguida, os isolados foram repicados em ágar MacConkey (Oxoid, Basingstoke,

UK), e novamente incubados a 35ºC±2ºC por 24 horas.

MATERIAL E MÉTODOS

42

4.2. Identificação dos Isolados de A. baumannii

4.2.1. “Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass

Spectrometry” (MALDI-TOF MS)

Após o subcultivo dos 31 isolados de A. baumannii que estavam armazenados

no banco de micro-organismos, todos os isolados tiveram sua identificação

inicialmente realizada pela metodologia MALDI-TOF MS, utilizando o espectrômetro de

massa Microflex LT e o software MALDI Biotyper 2.0 (Bruker Daltonics,

Massachusetts, USA). A extração das proteínas totais de cada isolado foi realizada de

acordo com as normas do fabricante (Bruker Daltonics, Massachusetts, USA), como

se segue: em um tubo de 1,5 mL, uma alça de 1 µL contendo colônias bacterianas, foi

diluída em 300 µL de água destilada estéril. Em seguida, foi adicionado 900 µL de

etanol absoluto (Carlo Erba, Arese, IT). Esta mistura foi cuidadosamente agitada e

centrifugada a 13.000 rpm durante 2 minutos. O sobrenadante foi descartado e o

precipitado ressuspenso vigorosamente com 50 µL de ácido fórmico a 70% (Sigma-

Aldrich, St. Louis, USA) e misturado com 50 µL de acetonitrila pura (Sigma-Aldrich, St.

Louis, USA). Esta solução foi centrifugada a 13.000 rpm durante 2 minutos e 30 µL do

sobrenadante foi armazenado a -20°C, para posterior análise pelo aparelho.

Para a identificação das amostras clínicas, 1 µL do extrato proteico foi pipetado

em triplicata, numa placa de aço inoxidável, reutilizável, contendo 96 regiões

demarcadas para inoculação das amostras, fornecida pelo fabricante. O inóculo foi

deixado à temperatura ambiente para secagem e posteriormente adicionado 1 µL da

matriz [500 mg/mL de ácido alfa-4-ciano-hidroxicinamico (Bruker Daltonics,

Massachusetts, USA)] diluída em uma solução de ácido trifluoroacético a 2,5%

(Acetonitrila 50%, água 50% e ácido trifluoroacético 2,5%), e novamente deixado à

temperatura ambiente para secagem. Como calibrante, foi utilizado o extrato proteico

da cepa Escherichia coli DH5α. Após o processamento das amostras e do calibrante, a

placa foi inserida no equipamento para realização da identificação bacteriana.

MATERIAL E MÉTODOS

43

A identificação pela técnica do MALDI-TOF MS é baseada de acordo com o

valor do “score” liberado pelo aparelho. Um valor ≥ 2,3 indica que a identificação do

gênero e da espécie é confiável; entre 2,0 a 2,29 indica que a identificação do gênero

é confiável e da espécie é provável; e entre 1,7 a 1,9 indica que a identificação do

gênero é provável. Quando os valores de “score” são inferiores a 1,69 o aparelho

reporta como micro-organismo não identificado, pois não reconhece o perfil proteico

armazenado em seu banco de dados, devendo a amostra ser novamente testada.

Somente foi considerada a identificação com score ≥ 2,3 para o presente estudo.

4.2.2. Sequenciamento do Gene rpoB

Após a análise pelo MALDI-TOF MS, as amostras tiveram sua identificação

confirmada pelo sequenciamento do gene rpoB, codificador da subunidade β da RNA

polimerase, como descrito por La Scola e colaboradores (2006) e validado

posteriormente por Gundi e colaboradores (2009). Quatro regiões, sendo duas

internas e duas que flanqueavam o gene rpoB, foram padronizadas para a

identificação das diferentes espécies do gênero Acinetobacter (La Scola et al., 2006;

Gundi et al., 2009). Os oligonucleotídeos utilizados neste estudo estão descritos na

Tabela 2. Para esse estudo, foram amplificadas as duas regiões internas ao gene

rpoB, utilizando os primers Ac969F e Ac1598R, produzindo um amplicon de 800 pb.

MATERIAL E MÉTODOS

44

Tabela 2. Sequência de oligonucleotídeos das zonas internas e flanqueadoras do

gene rpoB para identificação de Acinetobacter spp. de acordo com La Scola e

colaboradores (2006).

Região Oligonucleotídeos Sequência 5´-3’ Tamanho do fragmento

(pb)

Tm (°C)

Zona 1

Ac969 F TAYCGYAAAGAYTTGAAAGAAG

350

49,7

Ac1093 R

CMACACCYTTGTTMCCRTGA

55,2

Zona 2

Ac1055 F

GTGATAARATGGCBGGTCGT

450

55,5

Ac1598 R

CGBGCRTGCATYTTGTCRT

57,1

rplL

AcintLB F

GAAGARCTTAAGAMDAARCTTG

301-310

60

AcintLB R

CGTTTCTTTTCGGTATATGAGT 60

rpoC

AcintBC F

GTTCTTTAGGTATCAACATTGAA

86-177

60

AcintBC R

GACGCAAGACCAATACGRAT 59

Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL foi adicionado 350 μL de água Milli-

Q® estéril (Billerica, MA, EUA) e em seguida, diluídas de 3 a 5 colônias bacterianas

previamente isoladas (item 4.1). As reações em cadeia da polimerase (PCR) foram

preparadas em fluxo laminar, contendo master-mix (“GoTaq Green Master Mix”,

Promega, Madison, EUA), água estéril (Water, Molecular Biology Grade, Eppendorf

AG, Hamburg, Alemanha) e oligonucleotídeos (Invitrogen, Carlsbad, EUA). A PCR foi

realizada em Termociclador Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)

com desnaturação inicial a 94°C por 10 minutos, seguida por 35 ciclos de

desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento dos oligonucleotídeos a 48°C por

30 segundos e extensão das fitas a 72°C por 1 minuto e uma extensão final a 72°C

por 10 minutos.

Os fragmentos gerados pela PCR foram purificados com o “Kit PCR CleanUp”

(Qiagen, Hilden, Germany) e submetidos ao sequenciamento utilizando 2 µL de

MATERIAL E MÉTODOS

45

“BigDye Terminator v 3.1” (Applied Biosystems, Warrington, UK), diluído em 6 µL de

“Buffer Big Dye Terminator 5x” (Applied Biosystems, Warrington, UK), adicionado a 1

µL do oligonucleotídeo diluído a 3,2 pmol e 5 µL de DNA purificado a 75-100 ng. A

reação foi completada com água ultrapura para a obtenção de um volume final de 20

µL. As condições de ciclagem foram: desnaturação do DNA a 95°C por 1 minuto;

anelamento dos oligonucleotídeos a 50°C por 30 segundos e extensão das fitas a

60°C por 3 minutos. O sequenciamento foi realizado no aparelho 3500 Genetic

Analyzer (Applied Biosystems, Warrington, UK). As sequências de DNA obtidas e as

sequências proteicas derivadas foram analisadas utilizando o programa “Lasergene

Software Package” (DNAStar, Madison, EUA) e então, comparadas com as

sequências depositadas no “GenBank” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).

Como descrito por Gundi e colaboradores (2009), um isolado foi considerado

como pertencente a uma determinada espécie do gênero Acinetobacter quando a

homologia de sequência foi superior a 98%. Caso algum isolado apresentasse alta

homologia para mais de uma espécie, as duas regiões flanqueantes ao gene rpoB

(Tabela 2) (La Scola et al., 2006) seriam utilizadas com o objetivo de se chegar à

identificação final.

4.3. Análise da Similaridade Genética por PFGE

A relação genética entre os isolados de A. baumannii pertencentes aos 16

clones e 15 subclones selecionados para o estudo, foi confirmada pela técnica de

PFGE. As amostras foram incubadas por 18 horas em 3 mL de caldo TSB (Oxoid,

Basingstoke, UK) e, então, centrifugadas por 15 minutos a 3.000 rpm. O sobrenadante

foi desprezado e o precipitado, contendo as células bacterianas, diluído em 1 mL de

solução salina, homogeneizado e transferido para tubo de microcentrífuga

previamente pesado. Os tubos foram centrifugados por 1 minuto a 12.000 rpm e o

sobrenadante removido. O sedimento bacteriano foi diluído em solução salina, na

proporção 1:1 entre o volume de diluente e o peso do material obtido pela

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/

MATERIAL E MÉTODOS

46

centrifugação. Esse último valor foi calculado pela subtração do peso do tubo vazio

pelo peso do tubo contendo o precipitado de células. Após minuciosa

homogeneização, 7 L da suspensão bacteriana foi transferida para outro tubo

contendo 300 L de tampão TEN (Tris 1 M pH 7,0; Tris base 1 M pH 8,0, EDTA 0,5 M

pH 7,0, EDTA 0,5 M pH 8,0, NaCl 4 M e água destilada) e, então, 340 L de agarose

“low melting” 2% (Invitrogen, Eragny, France) foi adicionado e homogeneizado a esta

mistura, sendo colocada em moldes (Bio-Rad Laboratories, Califórnia, USA) para a

formação de blocos de agarose.

Depois de solidificados, os blocos de agarose foram incubados a 37°C, por no

mínimo 5 horas em solução EC [Tris base 1M pH 7,0, Tris base 1 M pH 8,0, EDTA 0,5

M pH 7,0, EDTA 0,5 M pH 8,0, NaCl, N-lauril sarcosil, Brij 58 (Sigma-Aldrich, St. Louis,

USA), deoxicolato de sódio e água destilada] juntamente com 200 L de lisozima

(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) por amostra. Após a incubação dos blocos de

agarose, os reagentes foram aspirados e os blocos lavados duas vezes com 2 mL de

CHEF-TE (Tris 1 M pH 7,0; Tris base 1 M pH 8,0, EDTA 0,5 M pH 7,0, EDTA 0,5 M pH

8,0 e água destilada) por 30 minutos à temperatura ambiente. O tampão CHEF-TE foi

removido e substituído por 2 mL de solução ES (EDTA 625 mM pH 9,3 e N-lauril

sarcosil 5%) e 100 L de proteinase K (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) a 20 mg/mL. As

amostras foram incubadas por 12 horas a 50°C. Após o tratamento com proteinase K,

foram realizadas quatro lavagens com CHEF-TE por 60 minutos cada e, então,

armazenadas a 5°C.

Para a digestão do DNA bacteriano, os blocos de agarose foram incubados

inicialmente por quatro vezes de 60 minutos cada, com 200 L de DNS (Tris base 1 M

pH 8,0, MgCl2 1 M e água destilada) à temperatura ambiente. O DNS foi então

substituído por 50 L do “tampão de enzima de restrição” (Tampão NEB 10x, BSA e

água) (Uniscience, São Paulo, Brazil) e, em seguida, os blocos de agarose foram

incubados por 60 minutos a 5°C. Após a incubação, este tampão foi substituído

MATERIAL E MÉTODOS

47

novamente por 50 L do “tampão de enzima de restrição” contendo 3 L da enzima

ApaI e incubado por 60 minutos a 5°C. Após este período, os blocos de agarose foram

incubados a 25°C por 12 a 18 horas para a clivagem do DNA.

Após a digestão enzimática do DNA, a eletroforese de campo pulsado foi

realizada em gel de agarose 1% (Invitrogen, Eragny, France) com TBE 0,5X (Tris base

ácido bórico EDTA e água destilada), no sistema CHEF-DR II (Bio-Rad Laboratories,

California, USA) à temperatura de 14oC e utilizando corrente elétrica de 200 Volts

(6V/cm) com switch time inicial de 5 e final de 35 segundos durante 19 horas. O gel foi

corado com brometo de etídio 10 mg/mL e fotografado sob iluminação ultravioleta em

Transiluminador (Bio-Rad Laboratories, California, USA). O gel foi analisado por

inspeção visual, utilizando os critérios de Tenover e colaboradores (1995) e pelo

programa Bionumerics, para avaliar a similaridade genética entre os isolados.

4.4. “Multilocus Sequence Typing” (MLST)

Para a determinação do “Sequence Typing” (ST) dos 31 isolados clínicos de A.

baumannii produtores de OXA-23, foi realizada a técnica de MLST do Institut Pasteur,

publicada por Nemec e colaboradores (2008). Cada amostra foi submetida à

amplificação e ao sequenciamento parcial dos sete genes padronizados para o gênero

Acinetobacter spp. (cpn60, fusA, gltA, pyrG, recA, rplB e rpoB), utilizando os

oligonucleotídeos descritos previamente (Nemec et al., 2008), como mostrado na

Tabela 3.

MATERIAL E MÉTODOS

48

Tabela 3. Oligonucleotídeos empregados para os sete genes utilizados para a

caracterização do MLST, de acordo com Nemec e colaboradores (2008).

Oligonucleotídeo Sequência 5’ – 3’ Tamanho do

fragmento (pb) Condição de

corrida

cpn60 F

ACTGTACTTGCTCAAGC

405

94° 2 min

94° 30 seg 50° 30seg 72° 30 seg

72° 5 min

35x

cpn60 R

TTCAGCGATGATAAGAAGTGG

fusA F

ATCGGTATTTCTGCKCACATYGAT

633

fusA R

CCAACATACKYTGWACACCTTTGTT

gltA F

AATTTACAGTGGCACATTAGGTCCC

483

gltA R

GCAGAGATACCAGCAGAGATACACG

pyrG F

GGTGTTGTTTCATCACTAGGWAAAGG

297

pyrG R

ATAAATGGTAAAGAYTCGATRTCACCMA

recA F

CCTGAATCTTCYGGTAAAAC

372

recA R

GTTTCTGGGCTGCCAAACATTAC

rplB F

GTAGAGCGTATTGAATACGATCCTAACC

330

rplB R

CACCACCACCRTGYGGGTGATC

rpoB F

GGCGAAATGGC(AGT)GA(AG)AACCA

456 rpoB R

GA(AG)TC(CT)TCGAAGTTGTAACC

As sequências de DNA obtidas, foram analisadas utilizando o programa

“Lasergene Software Package” (DNAStar, Madison, EUA) e, então, as sequências

para cada um dos sete genes avaliados, foram depositadas em conjunto por isolado

avaliado, diretamente na página do MLST do Institut Pasteur, França

(http://www.pasteur.fr/cgi-bin/genopole/PF8/mLstdbnet.pl?page=allseq&file=acin_profiles.xmL),

a fim de se obter os respectivos alelos e, consequentemente, o número do ST (Nemec

et al., 2008; Diancourt et al., 2010). Para as sequências que não tiveram seus alelos

determinados pelo site, os eletroferogramas dos respectivos alelos foram enviados ao

http://www.pasteur.fr/cgi-bin/genopole/PF8/mlstdbnet.pl?page=allseq&file=acin_profiles.xml

MATERIAL E MÉTODOS

49

curador do site, juntamente com os dados epidemiológicos exigidos para a obtenção

do número do novo alelo e do respectivo ST.

4.5. Testes de Sensibilidade aos Antimicrobianos

Todos os 31 isolados de A. baumannii tiveram sua concentração inibitória

mínima (CIM) obtida para os 14 antimicrobianos selecionados para o estudo, pela

técnica de microdiluição em caldo, seguindo as recomendações do CLSI M7-A9 (CLSI,

2012). Foram testados os seguintes antimicrobianos: ampicilina/sulbactam,

cefotaxima, ceftazidima, cefepima, aztreonam, imipenem, meropenem, ciprofloxacina,

levofloxacina, amicacina, gentamicina, minociclina, tigeciclina e polimixina B. Todos os

sais de antimicrobianos foram obtidos da Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis,

USA).

As soluções estoque dos antimicrobianos testados foram preparadas, em

concentrações 20 vezes superiores às concentrações finais, obtidas ou alcançadas

nas placas de microdiluição em caldo, e armazenadas a -70ºC até o seu

processamento. A partir da solução estoque, foram realizadas duas diluições de 1:20,

até a obtenção da maior diluição a ser testada. A partir desta, foram realizadas

diluições seriadas, das quais, 100 μL foi dispensado na placa de microdiluição. As

placas foram armazenadas em freezer -70°C até a realização dos testes.

Após o crescimento bacteriano em placas de ágar MacConkey (Oxoid,

Basingstoke, UK) por 24 horas, com auxílio de uma alça de semeadura, foi preparado

um inóculo na escala 0,5 de McFarland em 5 mL de caldo Müeller-Hinton (MH) (Oxoid,

Basingstoke, UK), para obtenção de uma concentração bacteriana em torno de 1,5 x

108 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL. Uma alíquota 132 μL da suspensão a

0,5 de McFarland foi transferida para um tubo contendo 19.868 μL caldo MH (Oxoid,

Basingstoke, UK) para a obtenção de uma concentração bacteriana final em torno de 5

x 105 UFC/mL. Após a homogeneização, 100 μL dessa suspensão bacteriana foi

inoculada em cada poço da placa de microdiluição em caldo, implicando assim, em

MATERIAL E MÉTODOS

50

uma diluição de 1:2 do inóculo bacteriano e das concentrações de antimicrobianos

testadas. A concentração final de bactérias em cada poço da placa de microdiluição

em caldo foi de aproximadamente 2,5 x 105 UFC/mL.

A seguir, as placas foram incubadas a 35°C±2ºC, em aerobiose por 20 a 24

horas. A leitura das placas de microdiluição em caldo foi realizada visualmente. A CIM

foi considerada como a menor concentração do antimicrobiano capaz de inibir

completamente o crescimento bacteriano. Os resultados foram interpretados de

acordo com os pontos de corte estabelecidos pelo CLSI (2012), exceto para a

tigeciclina, onde foram utilizados os pontos de corte sugeridos por Jones e

colaboradores (2007). Para o controle de qualidade dos testes de sensibilidade, foram

utilizadas as cepas “American Type Culture Collection” (ATCC®) E. coli ATCC® 25922,

P. aeruginosa ATCC® 27853, E. coli ATCC® 35218 e S. aureus ATCC® 29213.

4.5.1. Avaliação Fenotípica da Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo

Inicialmente, para verificar se a concentração a ser utilizada do inibidor nos

testes de sensibilidade não seria capaz de inibir o crescimento bacteriano, o que

poderia influenciar nos resultados, os 31 isolados foram inoculados em placas de ágar

Müeller-Hinton (Oxoid, Basingstoke, UK) a uma suspensão de 0,5 de McFarland,

contendo discos com as concentrações de 10 μg/mL, 15 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL e

100 μg/mL do inibidor e, então, incubados a 35°C±2ºC por 24 horas, para posterior

avaliação do crescimento bacteriano. Optou-se por utilizar a concentração de 15

μg/mL, pois não existe um valor padronizado da concentração do inibidor para este

teste.

Para a avaliação fenotípica da hiperexpressão dos sistemas de efluxo, as CIMs

foram determinadas para os antimicrobianos β-lactâmicos ceftazidima, cefotaxima,

imipenem e meropenem, como descrito no item 4.5, na ausência e na presença do

inibidor de sistemas de efluxo, fenilalamida arginina β-nafitilamida - PAβN (Sigma-

Aldrich, St Louis, EUA), em concentrações fixas de 15 μg/mL. Uma diminuição da CIM

MATERIAL E MÉTODOS

51

≥ 2 diluições na presença do PAβN comparada a CIM do antimicrobiano sozinho foi

considerada indicativa da hiperexpressão de sistemas de efluxo.

4.6. Pesquisa e Identificação de Genes de Resistência

Todos os 31 isolados de A. baumannii tiveram a produção de OXA-23,

confirmada pela técnica de PCR multiplex descrita por Woodford e colaboradores

(2006). A presença de OXA-143 foi confirmada por PCR convencional, usando os

oligonucleotídeos descritos por Higgins e colaboradores (2009), como descritos na

Tabela 4. Os demais genes codificadores de β-lactamases, também foram avaliados

neste estudo, e os respectivos oligonucleotídeos utilizados para a amplificação destes

genes estão mostrados na Tabela 4.

Tabela 4. Sequência de oligonucleotídeos para identificação dos genes codificadores

de -lactamases e sequência de inserção.

Oligonucleotídeo Sequência 5’-3’ Tamanho do fragmento

(pb)

Tm (°C)

Referência

Pré-TEM F

GTATCCGCTCATGAGACAATA

955

51,7

Bermudes et al., 1999

Pré-TEM R

TCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTG

52,6

MTPX SHV F

CTTGACCGCTGGGAAACGG

200

59,0

Laboratório Alerta

MTPX SHV R

AGCACGGAGCGGATCAACGG

62,6

MTPX CTX-M 1,2 F

ATGTGCAGYACCAGTAA

512

49,3

Laboratório Alerta

MTPX CTX-M 1,2 R

CGCTGCCGGTTTTATCSCCC

61,6

MTPX CTX-M-8 F

AACRCRCAGACGCTCTAC

333

55,0

Laboratório Alerta MTPX CTX-M-8 R

TCGAGCCGGAASGTGTYAT

57,6

MTPX CTX-M-14 F

GGTGACAAAGAGARTGCAACGGAT

876

58,6

Laboratório Alerta MTPX CTX-M-14 R

TTACAGCCCTTCGGCGATGA

58,9

MTPX GES F

AGCAGCTCAGATCGGTGTTG

750 57,5

MATERIAL E MÉTODOS

52

MTPX GES R

CCGTGCTCAGGATGAGTTG

55,8 Laboratório Alerta

MTPX SPM F

CTAAATCGAGAGCCCTGCTTG

798

55,6

Mendes et al., 2007b

MTPX SPM R

CCTTTTCCGCGACCTTGATC

56,3

MTPX IMP F

GAATAG(A/G)(A/G)TGGCTTAA(C/T)TCTC

188

49,2


MTPX IMP R

CCAAAC(C/T)ACTA(G/C)GTTATC

45,5

MTPX VIM F

GTTTGGTCGCATATCGCAAC

382

54,8


MTPX VIM R

AATGCGCAGCACCAGGATAG

58,0

MTPX GIM F

TCAATTAGCTCTTGGGCTGA

72

54,9

Mendes et al., 2007b MTPX GIM R

CGGAACGACCATTTGAATGG

54,3

MTPX SIM F

GTACAAGGGATTCGGCATCG

569

55,9


MTPX SIM R

TGGCCTGTTCCCATGTGAG

57,5

Pré-NDM F

GGCGTTAGATTGGCTTACACC

1146

56,1

Laboratório Alerta

Pré-NDM R

CTGGGTCGAGGTCAGGATAG

56,4

KPC F

TCGCTAAACTCGAACAGG

785

51,9

Bratu et al., 2005

KPC R

TTACTGCCCGTTGACGCCCAATCC

63,7

MTPX OXA-1 F TATCTACAGCAGCGCCAGTG

601

60,0

Laboratório Alerta

MTPX OXA-1 R TGCACC AGTTTTCCC ATACA 60,0

MTPX OXA-2 F CGATAGTTGTGGCAGACGAA

504

60,0

Laboratório Alerta MTPX OXA-2 R TCTTTGCACGCAGTATCCAG 60,0

MTPX OXA-10 F GTCTTTCGAGTACGGCATTA

720

52,1

Laboratório Alerta MTPX OXA-10 R

ATTTTCTTAGCGGCAACTTAC

51,2

MTPX OXA-18 F ATGCAACGGAGCCTGTCC

109

66,8

Laboratório Alerta MTPX OXA-18 R GGCAGGGTGTTGAGGAACT 57,8

MTPX OXA-23 F

GATCGGATTGGAGAACCAGA

501

54,0

Woodford et al., 2006

MTPX OXA-23 R

ATTTCTGACCGCATTTCCAT

52,5

MATERIAL E MÉTODOS

53

MTPX OXA-24 F

GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA

246

54,9


MTPX OXA-24 R

AGTTGAGCGAAAAGGGGATT

54,5

MTPX OXA-51 F

TAATGCTTTGATCGGCCTTG

353

53,3


MTPX OXA-51 R

TGGATTGCACTTCATCTTGG

53,0

MTPX OXA-58 F

AAGTATTGGGGCTTGTGCTG

599

55,6


MTPX OXA-58 R

CCCCTCTGCGCTCTACATAC

57,2

Pré-OXA-143 F

AGTTAACTTTCAATAATTG

825

40,1

Higgins et al., 2009

Pré-OXA-143 R

TTGGAAAATTATATAATCCC

42,3

OXA-69 F CTAATAATTGATCTACTCAAG

975

52,0

Héritier et al., 2005b

OXA-69 R

CCAGTGGATGGATGGATAGATTATC

52,0

Pré-AmpC F

GCGCCGTGAATTCTTAAGTG

2740

60,7

Este estudo

Pré-AmpC R

AATAATGCCATTCGCTTTAATTG 59,4

ISAba 1 F

GTCAGTTGCACTTGGTCG

1091 53,9 Este estudo

Em fluxo laminar, uma solução mãe foi preparada contendo “GoTaq® Green

Master Mix” (Promega, Madison, USA), água estéril e oligonucleotídeos a 20 mM

(Invitrogen, Eragny, France). Após leve agitação, 19 μL da mistura foi transferido para

cada tubo de reação, que continha 1 μL de uma suspensão da bactéria a ser testada

(item 4.2.2). As condições de termociclagem para cada um dos oligonucleotídeos

foram realizadas conforme publicado previamente pelos respectivos autores (Tabela

4). Após a amplificação do DNA, a revelação do produto foi feita em eletroforese em

gel de agarose (Invitrogen, Eragny, France) a 2%, contendo brometo de etídio a 2,5

mg/mL, imerso em TBE à 0,5X. A visualização foi feita sob luz ultravioleta em

transiluminador (Bio-Rad Laboratories, California, USA). Os produtos de PCR foram

purificados e sequenciados, como descritos anteriormente no item 4.2.2.

MATERIAL E MÉTODOS

54

4.6.1. Avaliação da Hiperprodução de AmpC (ADC)

Para a avaliação da hiperprodução de AmpC entre os isolados de A. baumannii

produtores de OXA-23, foi pesquisada a presença da sequência de inserção ISAba1,

responsável pela hiperexpressão da β-lactamase cromossômica, a montante do gene

blaADC-like por PCR. Para isso, foram utilizados os primers ISAba1.F (5’-

GTCAGTTGCACTTGGTCG-3’) e ADC.R (5’-TGCAAGGCAAGGTTACCACT-3’). A

visualização de um fragmento de 780 pb indicou a presença da ISAba1 a montante do

gene blaADC.

4.7. Avaliação das Proteínas de Membrana Externa por SDS-PAGE

Para verificar possíveis alterações no perfil das proteínas de membrana

externa dos isolados clínicos de A. baumannii produtores de OXA-23, estes foram

submetidos à técnica de SDS-PAGE. Os isolados foram cultivados em 15 mL de caldo

LB (Oxoid, Basingstoke, UK) a 37°C, sob agitação, por 24 horas. Os inóculos foram

centrifugados a 4.000 rpm, por 15 minutos e a 4°C. O sedimento bacteriano foi então

ressuspenso em 1 mL de tampão Tris-Mg (Tris 10 mM; MgCl2 5 mM), pH 7,3 e

sonicado por cinco ciclos de 30 segundos. Em cada ciclo, a sonicação é interrompida

por um segundo a cada cinco segundos. Após essa etapa, foi realizada outra

centrifugação a 5.000 rpm, por 5 minutos e a 4°C. O sobrenadante foi transferido para

outro tubo e centrifugado novamente por 30 minutos, a 17.000 rpm e a 4°C. O

sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 800 μL de sarcosil a

2% e incubado por 30 minutos em temperatura ambiente. Transcorrido esse período,

foi realizada uma nova centrifugação de 30 minutos, a 17.000 rpm e a 4°C. O

sedimento foi então, lavado com tampão Tris-Mg (Tris 10 mM; MgCl2 5 mM), pH 7,3 e

centrifugado por 30 minutos, a 17.000 rpm e a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o

sedimento, correspondente à porção da membrana externa, foi ressuspenso em 40 μL

MATERIAL E MÉTODOS

55

do tampão Tris-Mg (Tris 10 mM; MgCl2 5 mM), pH 7,3. O extrato proteico foi

armazenado a -20°C até sua utilização.

Para a calibração da curva e, subsequente quantificação dos extratos proteicos

foi utilizado o reagente de Bradford (Bio-Rad Laboratories, California, USA), acrescido

de albumina de soro bovino nas concentrações 100, 50, 25, 12,5 6,25 e 3,125 µg/mL

para obtenção da curva de calibração, utilizando o espectrofotômetro digital “NanoVue

Plus Spectrophotometer” (GE Healthcare, Canadá). Após a quantificação das

proteínas pelo método de Bradford, as concentrações dos extratos proteicos foram

igualadas, levando-se em consideração a menor concentração identificada, em

tampão de amostra “Laemmi Sample Buffer” (Bio-Rad Laboratories, California, USA) e

aquecida a 100ºC por 5 minutos. Um total de 20 µL do extrato proteico foi adicionado

ao gel de poliacrilamida a 17%. A eletroforese foi realizada a uma voltagem de 180 V

por 50 minutos. O “Precision Plus Protein™ Dual Color Standards” (Bio-Rad

Laboratories, California, USA), foi utilizado como marcador de peso molecular.

4.8. PCR em Tempo Real (qRT-PCR) para Quantificação da Transcrição do

Sistema de Efluxo AdeABC e das Proteínas de Membrana Externa CarO,

33-36 kDa, OmpHMP e OmpW

A técnica de qRT-PCR foi utilizada para quantificar a transcrição relativa do

gene adeB, que compõe o sistema de efluxo AdeABC, e dos genes codificadores das

proteínas de membrana externa 33-36kDa, CarO, OmpHMP e OmpW que estão

envolvidas no aumento da resistência aos carbapenens.

4.8.1. Extração do RNA Total e Síntese de cDNA

Os isolados foram cultivados em 20 mL de Caldo LB (Oxoid, Basingstoke, UK)

a 37°C, sob agitação, até atingirem a fase logarítmica de crescimento, correspondente

à absorbância de 0,5 a 0,6 a um comprimento de onda de 600 nm em

espectrofotômetro BioMate 5, ThermoSpectronic (Thermo Fisher Scientific, Delaware,

MATERIAL E MÉTODOS

56

USA). Um mililitro da cultura bacteriana foi adicionado a 1 mL de RNA Protect Bacteria

Reagent (Qiagen, Hilden, Germany), homogeneizado por completo em vórtex e

incubado por 5 minutos em temperatura ambiente. Transcorrido esse período, foi

realizada uma centrifugação por 10 minutos a 12.000 rpm em temperatura ambiente.

O RNA foi então, extraído a partir do sedimento bacteriano resultante, utilizando o

“RNeasy Mini Kit” (Qiagen, Hilden, Germany), de acordo com as recomendações do

fabricante. Para retirada de resíduos de DNA bacteriano foi realizado um tratamento

com “DNAse Free-RNAse Set” (Qiagen, Hilden, Germany), durante a extração do

RNA. O RNA total foi quantificado no espectrofotômetro digital “NanoVue Plus

Spectrophotometer” (GE Healthcare, Canadá).

A reação de transcriptase reversa foi realizada utilizando 30 ng de RNA de

cada amostra, com “High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit” (Applied

Biosystems, Warrington, UK), de acordo com as recomendações do fabricante. A

reação foi incubada por 10 minutos a 25°C, seguido por 120 minutos a 37ºC, em

Termociclador Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany). O cDNA foi

armazenado em freezer -80°C até sua utilização.

4.8.2. Quantificação Relativa da Transcrição Gênica

O cDNA, preparado a partir da extração de RNA das amostras clínicas de A.

baumannii (item 4.8.1), foi submetido à reação de qRT-PCR, utilizando sequências de

oligonucleotídeos (Invitrogen, Eragny, France) específicos para cada gene que

compõe o sistema de efluxo e proteínas de membrana externa, mostrados na Tabela

5.

MATERIAL E MÉTODOS

57

Tabela 5. Sequência de oligonucleotídeos utilizados para a quantificação dos genes

codificadores do sistema de efluxo AdeABC, e dos genes das principais proteínas de

membrana externa, pela técnica de qRT-PCR.

Oligonucleotídeo Sequência 5’ - 3’ Tamanho do

fragmento (pb) Referências

33-36 kDa F GAAGCTGGTGCAATGTTG

196 Pereira, 2009

33-36 kDa R TAGTGCCATCGATGTTGC

CarO F

GCAATGGCAGATGAAGC

111 Pereira, 2009

CarO R TAAAGCACCACCGTAACC

OmpHMP F

CTCTTGCTGGCTTAAACG

254 Pereira, 2009

OmpHMP R TGTGTGACCTTCGATACG

OmpW F

TTAGCATCAGCAGGTTGG

120 Pereira, 2009

OmpW R TATTGGTATCGGGGCAAC

AdeB F

GGATTATGGCGACAGAAGGA

106 Pereira, 2009

AdeB R AATACTGCCGCCAATACCAG

16S F

CAGCTCGTGTCGTGAGATGT

150 Pereira, 2009

16S R CGTAAGGGCCATGATGACTT

As reações de qRT-PCR foram realizadas em triplicata, utilizando 12,5 μL de

“Platinum SyBR Green qPCR” (Invitrogen, Eragny, France), adicionado de 0,5 μL de

cada oligonucleotídeo a uma concentração de 10 µM (Invitrogen, Eragny, France). À

mistura, foi adicionado 3 μL de cDNA e 8,5 μL de água ultrapura, para obtenção de um

volume final de 25 μL. A reação de PCR foi realizada no equipamento 7500 Real Time

PCR System (Applied Biosystems, Warrington, UK). As condições de termociclagem

foram: 2 minutos a 50°C, seguidos de 10 minutos a 95°C e 45 ciclos de 15 segundos a

95°C e 1 minuto a 60°C.

MATERIAL E MÉTODOS

58

4.8.3. Análise da Quantificação Relativa da Transcrição Gênica

Para a determinação da eficiência de cada oligonucleotídeo testado, foi

realizada uma curva de desnaturação “melting curve,” utilizando um extrato de DNA a

partir de um inóculo bacteriano do isolado ATCC 19606, na escala 0,5 de McFarland.

Desse inóculo inicial, foi realizada uma diluição seriada de 1:10 até a diluição de 10-8,

como mostrado na Tabela 6.

Tabela 6. Temperatura de melting e eficiência dos oligonucleotídeos utilizados na

reação de qRT-PCR.

Oligonucleotídeos Temperatura de

Melting °C Eficiência (%) Slope

Concentração do inóculo

OmpW

78,3 124,2 -2,851 10

-1-10

-8

OmpHMP

81,1 117,45 -2,964 10

-1-10

-8

CarO

79,3 119,4 -2,93 10

-1-10

-8

AdeB

77,9 125,7 -2,828 10

-1-10

-8

16s

84,3 112,1 -3,063 10

-1-10

-8

Todas as reações de qRT-PCR foram realizadas em triplicata e o gene

codificador da porção 16S ribossomal foi utilizado como gene de referência para a

normalização da transcrição dos genes alvo. A eficiência das reações de amplificação

dos genes estudados foi determinada de acordo com a fórmula E = (10-1/slope -1) x

100, onde “slope” representa a inclinação da reta no gráfico de regressão linear das

médias dos valores de Ct, observadas nas três replicatas das reações de qRT-PCR

para as diluições seriadas do extrato do isolado ATCC BAA-1709.

Ct “Ciclo Threshold” é considerado o ciclo em que foi detectada fluorescência

durante a amplificação da reação de qRT-PCR, acima do limite basal de fluorescência

observado no início da reação. Como parâmetro para identificação de hiperexpressão

MATERIAL E MÉTODOS

59

de efluxo, foi considerado 40 vezes acima do limite basal da cepa controle ATCC BAA-

1709 A. baumannii.

RESULTADOS

60

5. RESULTADOS

5.1. Identificação dos isolados bacterianos

Todos os 31 isolados selecionados para o presente estudo foram identificados

como sendo A. baumannii pela técnica de MALDI-TOF MS, com score superior a 2,3.

Esse resultado foi posteriormente confirmado pelo sequenciamento da região interna

do gene rpoB, a qual apresentou homologia de 99% com as sequências padrão de A.

baumannii depositadas no GenBank.

5.2. Análise da similaridade genética (PFGE) e da ancestralidade (MLST)

Após a confirmação da espécie, todos os isolados de A. baumannii tiveram o

seu perfil genético confirmado pela técnica de PFGE, sendo observada uma

variabilidade genética entre os isolados brasileiros de A. baumannii produtores de

OXA-23. A análise dos géis de PFGE, a partir do dendrograma obtido utilizando o

programa BioNumerics (Figura 7) e Tenover e colaboradores (1995), demonstrou a

presença de 16 padrões e 15 padrões relacionados distribuídos nos 14 hospitais

privados localizados em sete estados diferentes, como mostrado na Tabela 7.

Nenhum padrão clonal específico pode ser relacionado a uma determinada instituição

ou região geográfica, exceto pelo padrão D, que foi encontrado apenas no Rio de

Janeiro. Dentro de um mesmo hospital, vários padrões de A. baumannii produtores de

OXA-23 podem estar circulando durante um mesmo período de tempo (Hospital 2 no

Rio de Janeiro e Hospital 12 em Porto Alegre). Por outro lado, isolados com padrões

relacionados foram encontrados em diferentes hospitais localizados em áreas

geográficas distintas (padrões I e J).

RESULTADOS

61

Figura 7. Dendrograma do perfil genotípico determinado pela técnica de PFGE dos

isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 avaliados neste estudo.

RESULTADOS

62

Tabela 7. Distribuição dos isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 de acordo

com a região geográfica e os genótipos determinados pelas técnicas de PFGE e

MLST.

Isolado Hospital Cidade UF Perfil clonal (PFGE)

MLST

Alelos ST

cpn60 fusA gltA pyrG recA rplB rpoB

14.11 Hospital 1 Belo Horizonte MG A 3 2 2 1 2 4 8 189

12.25 Hospital 2 Rio de Janeiro RJ B 40 3 2 4 7 2 4 228

12.30 Hospital 2 Rio de Janeiro RJ C 1 3 6 1 3 4 4 188

12.01 Hospital 2 Rio de Janeiro RJ D 3 2 2 2 2 4 8 162

10.07 Hospital 3 Rio de Janeiro RJ D1 5 1 2 2 2 4 8 299

19.57c Hospital 4 São Luís MA E 5 35 39 2 3 1 5 192

15.07 Hospital 5 Porto Alegre RS F 26 2 2 2 29 4 5 79

14.37 Hospital 1 Belo horizonte MG G 1 1 1 1 5 1 1 1

17.10 Hospital 6 Blumenau SC H 1 1 1 1 5 1 1 1

7.33 Hospital 7 São Paulo SP H1 1 1 1 1 5 1 1 1

17.06 Hospital 6 Blumenau SC H2 1 1 1 1 5 1 1 1

1.43 Hospital 8 São Paulo SP I 6 6 8 2 3 5 4 15

18.02 Hospital 9 Curitiba PR I1 6 6 8 2 3 5 4 15

14.06 Hospital 1 Belo Horizonte MG I2 6 6 8 2 3 5 4 15

17.04 Hospital 6 Blumenau SC I3 6 8 8 2 3 5 4 15

17.34 Hospital 6 Blumenau SC I4 6 6 8 2 3 5 4 15

18.30 Hospital 9 Curitiba PR I5 6 6 8 2 3 5 4 15

18.28 Hospital 9 Curitiba PR J 26 2 2 2 29 4 5 79

3.14 Hospital 10 São Paulo SP J1 26 2 2 2 29 4 5 79

5.14 Hospital 11 São Paulo SP J2 26 2 2 2 29 4 5 79

10.05 Hospital 3 Rio de Janeiro RJ J3 26 2 2 2 29 4 5 79

15.46 Hospital 5 Porto Alegre RS J4 26 2 2 2 29 4 5 79

16.28 Hospital 12 Porto Alegre RS K 26 2 2 2 29 4 5 79

7.31 Hospital 7 São Paulo SP K1 26 2 2 2 29 4 5 79

13.30 Hospital 13 Belo horizonte MG L 26 2 2 2 29 4 5 79

10.13 Hospital 3 Rio de Janeiro RJ L1 26 2 2 2 29 4 5 79

11.13 Hospital 14 Rio de Janeiro RJ M 26 2 2 2 29 4 5 79

12.06 Hospital 2 Rio de Janeiro RJ M1 26 2 2 2 29 4 5 79

16.31 Hospital 12 Porto Alegre RS N 6 35 8 1 5 5 36 191

16.11 Hospital 12 Porto Alegre RS O 5 12 11 2 14 9 14 46

16.19 Hospital 12 Porto Alegre RS P 1 2 2 2 11 4 5 190

RESULTADOS

63

A relação filogenética entre os diferentes padrões e padrões relacionados de A.

baumannii produtores de OXA-23 no Brasil também foi avaliada através da técnica de

MLST (Tabela 7). Os resultados obtidos demonstram 12 STs diferentes entre os 31

isolados avaliados. O ST mais prevalente foi o ST79, que foi encontrado em 12

isolados (38,7%) presentes em dez hospitais brasileiros, localizados em Porto Alegre,

Curitiba, São Paulo, Rio de Janeiro e Minas Gerais e que apresentavam cinco perfis

de PFGE distintos (F, J, K, L e M). O ST15 foi o segundo mais frequente, encontrado

em seis isolados, todos pertencentes ao padrão I, presentes em quatro hospitais

localizados em Belo Horizonte, São Paulo, Blumenau e em Curitiba. O ST1 foi o

terceiro mais prevalente, sendo encontrado em quatro isolados que apresentavam dois

perfis de PFGE diferentes, localizados em hospitais de Belo Horizonte, Blumenau e

São Paulo. Dois isolados encontrados nas cidades de Porto Alegre e do Rio de

Janeiro, apresentaram dois STs (ST46 e ST162, respectivamente) já depositados no

banco de MSLT do “Institut Pasteur”, mas pouco frequentes em nosso meio. Por outro

lado, sete isolados incluídos em sete perfis de PFGE distintos, apresentaram

sequências alélicas únicas e, portanto, foram classificados como novos STs (ST188 ao

ST192, ST228 e ST299). Esses novos STs foram encontrados nas cidades do Rio de

Janeiro, Porto Alegre, Belo Horizonte e em São Luís. Dentre esses, dois isolados do

Rio de Janeiro, relacionados clonalmente (padrões D e D1), apresentaram dois STs

diferentes devido a mutações nos alelos dos genes cpn60 e fusA.

RESULTADOS

64

Figura 8. Árvore filogenética entre os diferentes STs encontrados no presente estudo e os demais STs descritos no mundo até o momento. Legenda:

números em rosa, STs identificados no estudo; pontos em azul, complexos clonais; pontos em verde, STs descritos até o momento; pontos isolados,

“singletons”; dois ou mais pontos verdes interligados, amostras geneticamente correlacionada (eBURST realizado dia 31/05/2013).

RESULTADOS

65

O ST79 está inserido dentro do CC79 e no SG3, como mostrado na Figura 8.

Outros três STs encontrados no presente estudo, também fazem parte do CC79, que

incluem o ST162, ST189 (um SLV [“Single Locus Variant”] do ST162) e o ST190 (a

DLV [“Double Locus Variant”] do ST79). Sendo assim, quase metade (48.39%,

n=15/31) dos isolados brasileiros de A. baumannii produtores de OXA-23 avaliados

neste estudo pertecem ao CC79. Embora o ST299 tenha sido classificado como

“singleton”, ele é um DLV do ST162 e, portanto, está relacionado ao CC79. Entretanto,

como não existe um ST apresentando um SLV entre o ST299 e o ST162, ele não pode

ser incluído no CC79. O ST15 (n=6) e o ST1 (n=4) pertencem, respectivamente, ao

CC15/SG7 e ao CC1/SG2, dois importantes grupos clonais epidêmicos e

multirresistentes disseminados pelo mundo. O ST46, ST188 e o ST228 estão

correlacionados aos ST149, ST250 e ST25, respectivamente. A inclusão desses três

alelos no banco de dados do MLST permitiu a criação de novos grupos clonais

chamados SG20 (ST188 e ST250), SG21 (ST228 e ST25) e SG28 (ST46 e ST149).

Os novos STs, ST191 e ST192 não apresentaram relação genética com nenhum ST

descrito e, portanto, foram classificados como “singletons”.

5.3. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos

O perfil de sensibilidade para os 14 antimicrobianos testados pela técnica de

microdiluição em caldo demonstrou que, os diferentes padrões de A. baumannii

produtores de OXA-23 circulantes no país apresentam fenótipo MDR, como mostrado

na Tabela 8. Embora as cefalosporinas de amplo espectro não sejam hidrolisadas

pelas CHDLs, os isolados brasileiros produtores de OXA-23 apresentam altas taxas de

resistência a esses antimicrobianos, com CIM50 variando de 128 µg/mL para cefepima

a 1024 µg/mL para ceftazidima. Entretanto, apesar da ceftazidima ser a cefalosporina

menos potente contra isolados brasileiros de A. baumannii foi a que apresentou as

menores taxas de resistência (48,4%), ainda que o número de isolados com

resistência intermediária tenha sido alto (38,7%). Como era esperado, as taxas de

RESULTADOS

66

resistência aos carbapenens foram altas (98,8% para imipenem e meropenem). Altas

taxas de resistência foram também observadas para as fluoroquinolonas, embora o

levofloxacino tenha sido oito vezes mais potente in vitro que o ciprofloxacino (CIM50, 16

µg/mL e CIM50, 128 µg/mL, respectivamente). Altos percentuais de resistência foram

detectados para ambos compostos (83,9% e 96,8%, respectivamente). Entre os

aminoglicosídeos, a gentamicina foi 16 vezes mais potente que a amicacina (CIM50, 8

µg/mL e CIM50, 128 µg/mL, respectivamente) e apresentou menores taxas de

resistência (41,9% e 74,2% respectivamente).

Tabela 8. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos entre os isolados de A.

baumannii produtores de OXA-23.

Antimicrobianos CIM (µg/mL) % por categoria

b

CIM50 CIM90 Intervalo S I R

β-lactâmicos

Ampicilina/Sulbactam 128/64 128/64 32/16 - 128/64 0 0 100

Ceftazidima 1024 >1024 8 - >1024 3,2 38,7 48,4

Cefotaxima 512 1024 16 - >1024 0 16,1 83,9

Cefepima 128 256 64 - 1024 0 0 100

Aztreonama 256 >256 16 - >256 - - -

Imipenem 32 64 8 - 64 0 3,2 96,8

Meropenem 32 64 8 - 64 0 3,2 96,8

Fluoroquinolonas

Ciprofloxacina 128 >256 0,5 - >256 3,2 0 96,8

Levofloxacina 16 32 ≤0,25 - 128 3,2 12,9 83,9

Aminoglicosídeos

Gentamicina 8 >1024 ≤0,5 - >1024 45,2 12,9 41,9

Amicacina 128 512 2 - >512 22,6 3,2 74,2

Tetraciclinas

Minociclina 0,125 0,5 0,06 - 4 100 0 0

Glicilciclinas

Tigeciclina 4 16 0,5 - 16 12,9 38,7 48,4

Lipopeptídeos

Polimixina B ≤0,25 0,5 ≤0,25 - 1 100 0 0

a. Não existem pontos de corte para aztreonam para isolados de A. baumannii (CLSI, 2012); b.

Legenda: S, sensível; I, intermediário e R, resistente.

RESULTADOS

67

Ampicilina/sulbactam, uma das poucas opções terapêuticas utilizadas no

tratamento de infecções por isolados de A. baumannii MDR, mostrou-se não ser ativa

frente aos isolados brasileiros produtores de OXA-23 (100% de resistência). O mesmo

foi observado para tigeciclina, onde somente 12,9% dos isolados de A. baumannii

avaliados neste estudo apresentaram sensibilidade a esse antimicrobiano (CIM50, 4

µg/mL). Dentre os 14 antimicrobianos testados, somente minociclina (CIM50, 0,125

µg/mL) e polimixina B (CIM50, ≤0,25 µg/mL) demonstraram ter excelente atividade

contra os isolados de A. baumannii produtores de OXA-23, que foram 100% sensíveis

a estes antimicrobianos.

5.4. Avaliação dos genes codificadores de β-lactamases e a relação

desses com a presença de ISAba1

A pesquisa dos principais genes codificadores de β-lactamases foi realizada

para todos os isolados de A. baumannii e os resultados apresentados na Tabela 9.

Não foram detectados genes codifidores de ESβLs nos isolados de A. baumannii

produtores de OXA-23 avaliados neste estudo. Somente foi encontrado o gene blaTEM-1

codificador de uma β-lactamase de espectro restrito em 14 isolados (45,2%),

principalmente nos isolados pertencentes ao ST79 (padrões de PFGE F, J, K, L e M) e

em apenas um isolado do ST228 (padrão B). O sequenciamento total do gene blaOXA-

23-like para todos os 31 isolados avaliados no presente estudo, demonstrou que a

variante OXA-23 continua sendo a CHDL mais prevalente nesta coleção, não tendo

sofrido mutações ao longo dos anos. Além disso, todos os padrões produtores de

OXA-23 avaliados neste estudo, apresentam a sequência de inserção ISAba1

associada ao gene blaOXA-23, aumentando, consequentemente, a sua expressão.

Apesar da grande maioria dos isolados de A. baumannii produtores de OXA-23

apresentarem CIMs altas para imipenem e meropenem (CIMs ≥ 16 µg/mL), o isolado

17.10 (padrão H) apresentou CIM de 8 µg/mL para esses antimicrobianos. Quando foi

comparado o conteúdo genético de -lactamases entre amostras que eram

RESULTADOS

68

geneticamente relacionadas, mas que apresentavam CIMs diferentes para os

carbapenens, nenhuma diferença foi encontrada.

Como esperado, o gene blaAmpC foi encontrado em todos os isolados avaliados

e a sua associação com a ISAba1 foi verificada em 80,6% dos casos (n=25/31). A

maioria dos isolados apresentando ISAba1 a montante do gene blaAmpC (23/25, 92%)

são os isolados incluídos nos principais complexos clonais disseminados em nosso

país, CC1, CC15 e CC79. Os seis isolados que não apresentaram ISAba1 associado a

essa cefalosporinase cromossômica eram representantes de padrões de PFGE

minoritários (padrão O/ST46, padrão C/ST188, padrão A/ST189, padrão P/ST190,

padrão N/ST191 e padrão E/ST192), encontrados principalmente na cidade de Porto

Alegre (Tabela 7). Embora o ST190 seja relacionado ao CC79, o isolado incluído

nesse ST não apresentou a ISAba1 associada ao gene blaAmpC. Entretanto, o padrão

D/ST162, incluído no CC79 e o seu padrão relacionado D1/ST299, um “singleton”,

apresentaram ISAba1 inserida a montante da AmpC, além do padrão B/ST228,

representante do SG21. Todos os isolados que apresentaram ISAba1 a montante do

gene blaAmpC apresentaram altos níveis de resistência às cefalosporinas de amplo

espectro (ceftazidima, CIMs de 32 a >1024 µg/mL; cefotaxima, CIMs de 256 a >1024

µg/mL). Ao contrário, os isolados cujo gene blaAmpC não estava associado a este

elemento de inserção, apresentaram CIMs menores (ceftazidima, CIMs de 8 a 16

µg/mL; cefotaxima, CIMs de 16 a 32 µg/mL), com exceção do isolado 16.31 (padrão

N/ST191) que apresentou CIMs elevadas para ambas às cefalosporinas (ceftazidima,

CIM 128 µg/mL; cefotaxima, CIM 64 µg/mL). Embora tenha sido observada uma

pequena diferença das CIMs para aztreonam, quando comparado os dois grupos para

as amostras que possuíam e não possuíam a ISAba1 a montante da AmpC, (CIMs de

64 a > 256 µg/mL e CIMs de 16 a 64 µg/mL), respectivamente, essa diferença foi mais

discreta quando comparadas com CIMs de ceftazidima e cefotaxima. As CIMs para

cefepima, a princípio, parecem não ter sido influenciadas pela presença ou ausência

de ISAba1.

RESULTADOS

69

Tabela 9. Caracterização das β-lactamases e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos entre os 31 isolados de A. baumannii produtores de

OXA-23.

Isolado PFGE ST β-lactamasesa

Antimicrobianos (CIM, µg/mL)b,c

AMP/SUL CAZ CTX FEP AZT IPM MER AK GM CIP LEV TGC MC PO

14.11 A 189 AmpC, OXA51, OXA-23+ISAba1 128/64 16 32 128 64 32 32 4 4 16 4 8 0,06 ≤0,25

12.25 B 228 AmpC+ISAba1, TEM-1, OXA-64, OXA-23+ISAba1 64/32 256 512 256 256 32 32 64 8 128 16 4 4 ≤0,25

12.30 C 188 AmpC, OXA-51, OXA-23+ISAba1 128/64 8 32 256 64 32 32 2 64 256 16 4 0,25 ≤0,25

12.01 D 162 AmpC+ISAba1, OXA-51, OXA-23+ISAba1 128/64 >1024 512 128 >256 64 64 512 ≤0,5 >256 4 8 0,13 ≤0,25

10.07 D1 299 AmpC+ISAba1, OXA-51+ISAba1, OXA-23+ISAba1 64/32 256 512 128 >256 64 32 512 16 >256 64 8 0,25 ≤0,25

19.57c E 192 AmpC, OXA-95, OXA-23+ISAba1 64/32 8 16 64 16 32 16 256 8 128 8 4 0,06 0,5

15.07 F 79 AmpC+ISAba1, TEM-1, OXA-65+ISAba1, OXA-23+ISAba1 128/64 >1024 >1024 256 256 32 32 256 >1024 128 16 8 0,25 1

14.37 G 1 AmpC+ISAba1, OXA-69, OXA-23+ISAba1 128/64 64 256 256 64 16 32 128 >1024 64 16 8 0,5 0,5

17.10 H 1 AmpC+ISAba1, OXA-69+ISAba1, OXA-23+ISAba1 32/16 32 128 128 >256 8 8 64 >1024 256 16 16 0,25 ≤0,25

7.33 H1 1 AmpC+ISAba1, OXA-69, OXA-23+ISAba1 64/32 128 256 512 32 16 16 512 >1024 >256 128 16 0,25 ≤0,25

17.06 H2 1 AmpC+ISAba1, OXA-69+ISAba1, OXA-23+ISAba1 64/32 32 256 128 64 32 32 128 >1024 256 16 16 0,25 ≤0,25

RESULTADOS

70

1.43 I 15 AmpC+ISAba1, OXA-51, OXA-23+ISAba1 128/64 >1024 512 128 256 64 32 64 1 256 8 4 0,25 ≤0,25

18.02 I1 15 AmpC+ISAba1, OXA-51+ISAba1, OXA-23+ISAba1 128/64 >1024 1024 64 128 64 32 2 2 256 8 4 0,13 0,5

14.06 I2 15 AmpC+ISAba1, OXA-51-LIKE, OXA-23+ISAba1 64/32 >1024 1024 64 128 32 32 64 1 32 8 4 0,13 ≤0,25

17.04 I3 15 AmpC+ISAba1, OXA-51+ISAba1, OXA-23+ISAba1 256/128 1024 512 128 128 64 64 32 1 256 4 4 0,13 ≤0,25

17.34 I4 15 AmpC+ISAba1, OXA-51+ISAba1, OXA-23+ISAba1 64/32 >1024 1024 64 128 64 32 128 1 128 8 4 0,25 ≤0,25

18.30 I5 15 AmpC+ISAba1, TEM-1, OXA-51+ISAba1, OXA-23+ISAba1 128/64 1024 512 128 128 64 32 16 >1024 128 32 16 0,25 0,5

18.28 J 79 AmpC+ISAba1, TEM-1, OXA-65+ISAba1, OXA-23+ISAba1 128/64 128 1024 256 128 64 32 16 ≤0,5 128 16 4 0,5 ≤0,25

3.14 J1 79 AmpC+ISAba1, TEM-1, OXA-65+ISAba1, OXA-23+ISAba1 64/32 >1024 1024 128 256 64 32 256 16 256 8 8 0,13 ≤0,25

5.14 J2 79 AmpC+ISAba1, TEM-1, OXA-65+ISAba1, OXA-23+ISAba1 128/64 1024 1024 128 >256 64 32 128 128 128 16 16 1 ≤0,25

10.05 J3 79 AmpC+ISAba1, TEM-1, OXA-65+ISAba1, OXA-23+ISAba1 64/32 1024 1024 128 >256 32 32 512 4 256 8 8 0,13 ≤0,25

15.46 J4 79 AmpC+ISAba1, TEM-1, OXA-65+ISAba1, OXA-23+ISAba1 64/32 >1024 1024 128 >256 32 32 >512 4 256 16 4 0,13 ≤0,25

16.28 K 79 AmpC+ISAba1, TEM-1, OXA-51-LIKE, OXA-23+ISAba1 128/64 64 256 512 64 64 64 64 128 128 8 2 0,5 0,5

7.31 K1 79 AmpC+ISAba1, TEM-1, OXA-65+ISAba1, OXA-23+ISAba1 128/64 1024 1024 128 256 64 32 16 2 64 16 8 0,5 ≤0,25

13.30 L 79 AmpC+ISAba1, TEM-1, OXA-65+ISAba1, OXA-23+ISAba1 128/64 1024 256 128 256 64 32 64 1 64 8 2 0,13 ≤0,25

10.13 L1 79 AmpC+ISAba1, TEM-1, OXA-65+ISAba1, OXA-23+ISAba1 128/64 >1024 >1024 256 256 32 32 >512 8 >256 16 4 0,13 0,5

11.13 M 79 AmpC+ISAba1, TEM-1, OXA-65+ISAba1, OXA-23+ISAba1 128/64 1024 1024 256 >256 32 32 256 4 256 16 8 0,13 ≤0,25

RESULTADOS

71

12.06 M1 79 AmpC+ISAba1, TEM-1, OXA-65+ISAba1, OXA-23+ISAba1 256/128 >1024 >1024 1024 >256 32 32 256 8 >256 8 8 0,13 ≤0,25

16.31 N 191 AmpC, OXA-51, OXA-23+ISAba1 128/64 128 64 128 256 64 32 256 ≤0,5 128 8 4 0,13 0,5

16.11 O 46 AmpC, OXA-318, OXA-23+ISAba1 64/32 8 32 64 32 64 64 128 32 0,5 ≤0,25 1 0,13 ≤0,25

16.19 P 190 AmpC, OXA-242, OXA-23+ISAba1 64/32 8 32 64 32 32 32 4 16 16 4 0,5 0,06 ≤0,25

a. Em azul estão incluídas as cefalosporinases cromossômicas do tipo AmpC (ADC) intrínseca de A. baumannii, em roxo estão incluídas as β-lactamases de

espectro restrito do tipo TEM-1, em laranja estão incluídas as CHDLs cromossômicas e intrínsecas de A. baumannii pertencentes ao grupo das OXA-51, em

vermelho estão incluídas as CHDLs adquiridas de A. baumannii pertencentes ao grupo das OXA-23, a presença de ISAba1 adiante das β-lactamases do tipo

AmpC, OXA-51-like e OXA-23 estão assinaladas em negrito; b. Legenda: AMP/SUL, ampicilina/Sulbactam; CAZ, ceftazidima; CTX, ceftriaxona; FEP,

cefepima; AZT, aztreonam; IPM, imipenem; MER, meropenem; AK, amicacina; GM, gentamicina; CIP, ciprofloxacina; LEV, levofloxacina; TGC, tigeciclina;

MC, minociclina; PO, polimixina B; c. As CIMs para as cefalosporinas de amplo espectro em negrito representam os isolados que não possuem ISAba1 a

montante do gene blaAmpC.

RESULTADOS

72

Um total de sete variantes diferentes de oxacilinases pertencentes ao grupo

das CHDLs cromossômicas do tipo OXA-51 e intrínsecas de A. baumannii foram

verificadas nos 31 isolados avaliados no estudo, sendo elas: OXA-51, OXA-64, OXA-

65, OXA-69, OXA-95, OXA-242 e OXA-318. Duas outras variantes do grupo OXA-51,

encontradas nos isolados 14.06 (padrão I2/ST15) e 16.28 (padrão K/ST79) ainda não

tiveram a sua nomenclatura definitiva determinada e, portanto, foram referidas como

OXA-51-like. Novos sequenciamentos estão sendo realizados no momento, para

confirmar a caracterização de uma nova variante presente nesses isolados. De um

modo geral, isolados de A. baumannii pertencentes a um mesmo ST, tenderam a

apresentar a mesma variante de OXA-51, como a OXA-51 no ST15, a OXA-65 no

ST79 e a OXA-69 no ST1. O mesmo não ocorreu entre amostras que apresentavam

STs incluídos em um mesmo complexo clonal, como é o caso do ST162 e do ST189,

incluídos no CC79, e cujos isolados apresentaram a variante OXA-51, se diferindo do

ST79 que apresenta a variante OXA-65. Da mesma forma, o isolado que apresentava

o ST190, também incluído no CC79, carreia uma nova variante nomeada OXA-242.

Para os demais isolados que apresentaram STs diferentes formando SGs ou não

(“singletons”), apresentaram, de um modo geral, variantes diferentes daquelas

verificadas nos CCs, como a OXA-64 (padrão B/ST228/SG21), a OXA-95 (padrão

E/ST192/“singleton”) e a nova variante OXA-318 (padrão O/ST46/SG28). A presença

de ISAba1 a montante das CHDLs do grupo da OXA-51 foi mais relacionada aos

complexos clonais, principalmente a OXA-65 nos isolados apresentando o ST79. Por

outro lado, não foi identificada ISAba1 a montante do gene blaOXA-51-like nas amostras

de A. baumannii incluídas em STs minoritários.

5.5. Avaliação fenotípica da hiperexpressão dos sistemas de efluxo

A avaliação fenotípica do impacto dos sistemas de efluxo na resistência às

cefalosporinas de amplo espectro e aos carbapenens foi realizada através da

avaliação da redução das CIMs para esses antimicrobianos, na presença do inibidor

RESULTADOS

73

de sistemas de efluxo PAβN. Os resultados obtidos estão incluídos na Tabela 10. No

presente estudo, não foi considerada significativa a diminuição de apenas uma diluição

na CIM para qualquer um dos quatro β-lactâmicos testados na presença do inibidor, já

que tal diferença entre dois testes dilucionais poderia ser consequente à variabilidade

inter testes intrínseca à técnica laboratorial. Em 17/31 (54,8%) isolados de A.

baumannii apresentaram diminuição da CIM para ceftazidima ≥ 2 diluições na

presença do PAβN, principalmente naqueles isolados apresentando altos níveis de

resistência (CIM ≥ 1024 µg/mL). Por outro lado, os isolados sensíveis ou com

resistência intermediária à ceftazidima (CIM ≤ 16 µg/mL), não apresentaram

diminuição significativa na CIM na presença do PAβN. O isolado 16.31 que

apresentava altos CIMs para ceftazidima e cefotaxima no teste com o inibidor,

apresentou diminuição da CIM para ceftazidima de 128 µg/mL para 16 µg/mL. De

modo contrário, os sistemas de efluxo parecem não ter impacto na ejeção da

cefotaxima, já que somente quatro amostras apresentaram diminuição significativa da

CIM, podendo outros mecanismos de resistência, em conjunto, estarem associados ao

aumento da CIM, ou até mesmo mecanismos desconhecidos.

Resultados semelhantes também foram observados quando se avaliou o

impacto dos sistemas de efluxo na elevação das CIMs para imipenem e meropenem.

Para imipenem, uma diminuição significativa foi observada somente em 9/31 isolados

(29%), demonstrando um papel secundário na resistência a esse antimicrobiano em

isolados de A. baumannii produtores de OXA-23. Por outro lado, os sistemas de efluxo

demonstram ser importantes na elevação da CIMs para meropenem em isolados de A.

baumannii com esse fenótipo, já que foi observada uma dimuição significativa na CIMs

em 80,6% (25/31) dos isolados testados. Desses, 18 isolados deixaram de ser

resistentes e passaram a apresentar resistência intermediária (CIM, 8 µg/mL) e quatro

se tornaram sensíveis ao meropenem (CIM, 4 µg/mL). Dentre os nove isolados que

apresentaram diminuição significativa na CIM para imipenem, apenas dois mudaram

RESULTADOS

74

de categoria de sensibilidade, apresentando resistência intermediária a esse

antimicrobiano (CIM, 8 µg/mL).

RESULTADOS

75

Tabela 10. Resultados da CIM para ceftazidima, cefotaxima, imipenem e meropenem

dterminadas pela técnica de microdiluição em caldo, realizada na presença e na

ausência do inibidor de sistemas de efluxo PAβN.

Isolado PFGE Antimicrobianos (CIM, µg/mL)a,b

CAZ CAZ+PAβNc CTX CTX+PAβN IPM IMP+PAβN MER MER+PAβN

14.11 A 16 8 32 32 32 16 32 8

12.25 B 256 64 512 256 32 16 32 16

12.30 C 8 8 32 32 32 16 32 8

12.01 D >1024 512 512 512 64 32 64 16

10.07 D1 256 128 512 256 64 32 32 16

19.57c E 8 4 16 16 32 8 16 4

15.07 F >1024 256 >1024 512 32 16 32 8

14.37 G 64 16 256 128 16 16 32 8

17.10 H 32 16 128 128 8 8 8 4

7.33 H1 128 64 256 128 16 8 16 4

17.06 H2 32 8 256 128 32 16 32 8

1.43 I >1024 512 512 512 64 16 32 8

18.02 I1 >1024 512 1024 512 64 16 32 8

14.06 I2 >1024 512 1024 512 32 16 32 8

17.04 I3 1024 512 512 512 64 64 64 16

17.34 I4 >1024 512 1024 512 64 32 32 16

18.30 I5 1024 512 512 512 64 32 32 16

18.28 J 128 64 1024 256 64 16 32 8

3.14 J1 >1024 512 1024 1024 64 16 32 8

5.14 J2 1024 512 1024 512 64 16 32 4

10.05 J3 1024 256 1024 512 32 16 32 8

15.46 J4 >1024 256 1024 512 32 16 32 8

16.28 K 64 32 256 128 64 32 64 16

7.31 K1 1024 256 1024 512 64 16 32 4

13.30 L 1024 256 256 256 64 16 32 8

10.13 L1 >1024 512 >1024 1024 32 16 32 8

11.13 M 1024 512 1024 1024 32 8 32 8

12.06 M1 >1024 256 >1024 512 32 16 32 8

16.31 N 128 16 64 32 64 32 32 16

16.11 O 8 8 32 32 64 32 64 8

16.19 P 8 8 32 32 32 32 32 8

a. Legenda: CAZ, Ceftazidima; CTX, Ceftriaxona; IPM, Imipenem; MER, Meropenem; b. A

concentração do inibidor utilizada nos testes foi de 15 µg/mL; c. Estão em negrito as amostras

cujas CIMs que apresentaram uma diminuição ≥ 2 diluições na presença do inibidor de sistema

de efluxo.

RESULTADOS

76

5.6. Avaliação fenotípica da alteração das proteínas de membrana externa

pela técnica de SDS-PAGE

O perfil de proteínas de membrana externa para os 31 isolados de A.

baumannii produtores de OXA-23 avaliados nesse estudo, estão demonstrados na

Tabela 11, baseando-se na análise visual dos géis de SDS-PAGE incluídos na Figura

9. Os resultados obtidos demonstraram uma alta variabilidade no perfil de proteínas de

membrana externa entre os isolados clínicos de A. baumannii produtores de OXA-23

no Brasil. Ainda que essa variação tenha sido independente do padrão genético

apresentado pelo isolado, foi possível observar que a maioria dos isolados (28/31) não

apresentaram uma banda de 21 kDa compatível com a OmpW. As proteínas de 29

kDa e 31 kDa, compatíveis com as porinas CarO e Omp33-36 relacionadas à

resistência aos carbapenens, apresentaram perfis variáveis. O isolado 17.10 (marcado

em cinza na tabela) foi o único isolado a apresentar todas as bandas com tamanhos

de 21 kDa, 29 kDa, 31 kDa, 35,6 kDa e 42 kDa, compatíveis com as OMPs OmpW,

CarO, Omp33-36, OmpHMP e OprD, respectivamente. Coincidentemente, esse

isolado apresentava resistência intermediária a imipenem e meropenem (CIMs de 8

µg/mL).

RESULTADOS

77

Tabela 11. Perfil das proteínas de membrana externa dos isolados de A. baumannii

produtores de OXA-23 baseando nos géis de SDS-PAGE.

Isolado PFGE

CIM (µg/mL)

Proteínas de Membrana Externaa

- OmpWc Omp25 CarO 33-36 OmpHMP OprD

IPM MER 18 kDab 21 kDa 25 kDa 29 kDa 31 kDa 35,6 kDa 42 kDa

14.11 A 32 32 (-) (+) (+) (-) (-) (+) (-)

12.25 B 32 32 (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+)

12.30 C 32 32 (+) (-) (+) (-) (+) (+) (+)

12.01 D 64 64 (+) (-) (+) (-) (+) (+) (+)

10.07 D1 64 32 (+) (-) (-) (+) (+) (+) (-)

19.57c E 32 16 (+) (-) (-) (+) (+) (+) (-)

15.07 F 32 32 (+) (-) (-) (+) (+) (+) (+)

14.37 G 16 32 (+) (-) (-) (+) (+) (+) (+)

17.10 H 8 8 (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+)

7.33 H1 16 16 (+) (-) (+) (-) (+) (+) (+)

17.06 H2 32 32 (+) (-) (+) (+) (+) (+) (+)

1.43 I 64 32 (+) (-) (+) (+) (+) (+) (+)

18.02 I1 64 32 (+) (-) (+) (+) (+) (+) (+)

14.06 I2 32 32 (+) (-) (+) (+) (+) (+) (+)

17.04 I3 64 64 (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-)

17.34 I4 64 32 (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-)

18.30 I5 64 32 (-) (-) (+) (-) (-) (+) (-)

18.28 J 64 32 (+) (-) (-) (+) (+) (+) (+)

3.14 J1 64 32 (+) (-) (-) (+) (+) (+) (+)

5.14 J2 64 32 (+) (-) (-) (+) (+) (+) (+)

10.05 J3 32 32 (+) (-) (-) (+) (+) (+) (+)

15.46 J4 32 32 (+) (-) (+) (-) (+) (+) (+)

16.28 K 64 64 (+) (-) (-) (+) (+) (+) (+)

7.31 K1 64 32 (+) (-) (+) (+) (+) (+) (+)

13.30 L 64 32 (+) (-) (-) (+) (+) (+) (+)

10.13 L1 32 32 (+) (-) (-) (+) (+) (+) (+)

11.13 M 32 32 (+) (-) (+) (+) (+) (+) (+)

12.06 M1 32 32 (+) (-) (+) (+) (+) (+) (+)

16.31 N 64 32 (+) (-) (+) (+) (+) (+) (+)

16.11 O 64 64 (+) (-) (+) (+) (+) (+) (+)

16.19 P 32 32 (+) (-) (-) (+) (+) (+) (-)

ATCC 19606 - - - (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+)

a. Legenda: (-) - ausência de banda no gel, (+) - presença de banda no gel com expressão

semelhante à ATCC, (+), - presença de banda no gel com expressão inferior à ATCC, (+)-

presença de banda no gel com tamanho inferior a ATCC. b. Os pesos em kDa para cada OMP

foram estimados baseados no padrão de peso molecular aplicada em cada gel separadamente.

c. prováveis OMPs correspondentes ao tamanho da proteína encontrada no gel de SDS-PAGE.

RESULTADOS

78

A B

C D

Figura 9. Géis de SDS-PAGE

das proteínas de membrana

externa dos diferentes isolados

de A. baumannii produtores de

OXA-23 no Brasil. A ATCC

19606 de A. baumannii foi

utilizada como controle

sensível.

RESULTADOS

79

Outro resultado importante foi a alteração no tamanho das bandas das

proteínas de 25 kDa e 35,6 kDa, compatíveis com as OMPs Omp25 e OmpHMP,

proteínas que não estão relacionadas à resistência aos carbapenens, em dois e dez

isolados de A. baumannii, respectivamente.

5.7. Quantificação da expressão dos genes codificadores de porinas e do

sistema de efluxo AdeABC pela técnica de qRT-PCR

As amostras de A. baumannii foram submetidas à metodologia de qRT-PCR

para a quantificação da expressão dos genes ompW, carO, omp33-36, ompHMP e

adeB. Os valores dos níveis de expressão foram obtidos comparando com a cepa

ATCC BAA-1709 de A. baumannii, que apresenta sensibilidade a todos os β-

lactâmicos, e estão incluídos na Tabela 12. De acordo com os resultados obtidos, a

grande maioria do isolados (23/31, 74,2%) de A. baumannii produtores de OXA-23 no

Brasil, hiperexpressam o sistema de efluxo AdeABC, quando comparados à cepa

ATCC BAA-1709. Embora os níveis de expressão tenham variado de acordo com o

padrão de PFGE, foi possível observar que os padrões que estão incluídos nos

complexos clonais CC79, CC15 e CC1 tendem a hiperexpressar mais esse o sistema,

principalmente os isolados pertencentes ao ST1. Apesar disso, não foi possível

correlacionar o aumento da expressão desse sistema de efluxo a um fenótipo de

resistência. Por outro lado, os resultados do qRT-PCR demonstraram que quase todos

os isolados clínicos (30/31, 96,8%) expressavam menos a porina CarO, quando

comparados a cepa ATCC. Resultado semelhante foi observado para a OmpHMP e a

Omp33-36 em 14 e 15 dos 31 (45,2%) isolados clínicos avaliados respectivamente.

Entretanto, a diminuição da OmpW somente foi observada em quatro isolados

(12,9%).

RESULTADOS

80

Tabela 12. Expressão relativa dos genes codificadores das OMPs OmpW, CarO,

Omp33-36 e OmpHMP e do sistema de efluxo AdeB dos isolados clínicos comparados

a expressão basal dos mesmos genes na ATCC BAA-1709.

Isolado PFGE ST Expressão Relativa

adeB ompHMP ompW carO omp33-36

14.11 A 189 43 1,5 8,4 0,6 15.564

12.25 B 228 129 1,4 11,5 0,4 0,2

12.30 C 188 0,5 0,7 7,6 0,4 0,1

12.01 D 162 4 1,2 28,5 0,5 3.013

10.07 D1 299 6 1,3 4,8 0,3 8.143

19.57c E 192 3.434 1,3 4,2 0,1 8.090

15.07 F 79 1.462 1 14,1 0,4 94,3

14.37 G 1 4.336 387 14,1 0,5 3.181

17.10 H 1 5.196 0,7 10 0,2 7.559

7.33 H1 1 11.226 1,3 16,7 0,4 3.743

17.06 H2 1 177.010 0,7 13,2 0,5 2.942

1.43 I 15 1.320 0,8 0,8 0,3 0,005

18.02 I1 15 1.234 0,3 1,2 0,5 0,2

14.06 I2 15 666 0,8 9,6 0,3 3,7

17.04 I3 15 738 0,5 0,5 0,3 0,3

17.34 I4 15 841 0,5 0,6 0,3 0,5

18.30 I5 15 3.314 1 1,2 0,5 1,4

18.28 J 79 0,3 0,8 7,5 0,4 1,4

3.14 J1 79 1.362 1,4 9,4 0,5 0,009

5.14 J2 79 1.495 1 12,2 0,9 0,02

10.05 J3 79 1.416 1,2 15,7 0,6 0,05

15.46 J4 79 4.090 0,7 10,31 0,5 1,1

16.28 K 79 4 1,4 18,63 0,9 1,4

7.31 K1 79 1.642 0,9 7,4 0,2 0,02

13.30 L 79 0,6 1 0,7 0,2 0,8

10.13 L1 79 1.430 1,1 14,3 0,7 0,2

11.13 M 79 2.221 2 27,6 2,6 1,3

12.06 M1 79 1.916 1,2 12,9 0,7 0,1

16.31 N 191 1,3 0,5 0,1 0,3 0,4

16.11 O 46 299 0,8 14 0,7 5,3

16.19 P 190 9 0,9 3,1 0,5 0,8

ATCC BAA-1709 - - 1 1 1 1 1

DISCUSSÃO

81

6. DISCUSSÃO

Desde a sua primeira descrição na Escócia em 1985 (Scaife et al., 1995), a

CHDL OXA-23 tornou-se um dos principais mecanismos de resistência aos β-

lactâmicos em isolados clínicos de A. baumannii (Mugnier et al., 2010), inclusive surtos

causados por esses micro-organismos têm sido reportados em várias partes do mundo

(Zhou et al., 2007; Calhoun et al., 2008; Stoeva et al., 2008; Carvalho et al., 2009). Um

estudo conduzido por Mugnier e colaboradores (2010) que avaliou cepas de A.

baumannii produtoras de OXA-23 isoladas em diferentes países, demonstrou que o

gene blaOXA-23 podia estar inserido em diferentes contextos genéticos, que incluem os

transposons Tn2007, Tn2008 e, principalmente, o Tn2006, além da ISAba1. Eles

também observaram que o gene blaOXA-23 associado ao Tn2006, pode estar localizado

tanto no cromossomo como em plasmídeos. Os autores concluíram que a alta

variabilidade genética observada entre os isolados de A. baumannii produtores de

OXA-23 pode dificultar o controle da sua disseminação inter e intra-hospitalar.

No Brasil, a OXA-23 é a principal carbapenemase encontrada em isolados de

A. baumannii e a sua disseminação pelos hospitais brasileiros alcançou um nível

epidêmico. A primeira descrição dessa CHDL no Brasil ocorreu, em 2003, na cidade

de Curitiba (Dalla-Costa et al., 2003). Nesse estudo os autores avaliaram oito

amostras clínicas de A. baumannii resistentes aos carbapenens isoladas em dois

hospitais da capital paranaense, em 1999. Após a realização do PFGE, verificou-se a

presença de um mesmo clone e a presença de OXA-23, que até aquele momento não

havia sido detectada em nosso país. Desde então, este clone vem se disseminando e

se diversificando pelo Brasil (Carvalho et al., 2009; Martins et al., 2009; Corrêa et al.,

2012).

Em 2009, Carvalho e colaboradores realizaram um estudo no qual avaliaram

96 amostras de A. baumannii resistentes ao imipenem coletadas em oito hospitais do

Rio de Janeiro, no período de 2006 a 2007. Todos os isolados eram produtores de

DISCUSSÃO

82

OXA-23 e diferente do estudo de Dalla-Costa e colaboradores (2003), foram

observados a presença de cinco clones. No mesmo ano, Martins e colaboradores

(2009) avaliaram um surto ocorrido em 2007, na cidade de Porto Alegre causado por

isolados de A. baumannii produtores de OXA-23. Os autores do estudo também

constataram uma maior variabilidade genética entre as 53 amostras avaliadas (cinco

padrões de PFGE). Esses dois estudos são importantes, porque demonstraram que a

OXA-23 era a carbapenemase mais frequente e disseminada entre isolados de A.

baumannii no Brasil. Embora em estudo anterior tivesse descrito a presença da MβL

IMP-1 em isolados de A. baumannii em um hospital da cidade São Paulo (Gales et al.,

2003), posteriormente ficou demonstrado que a presença dessa MβL estava restrita

aos hospitais da grande São Paulo (Sader et al., 2005; Tognim et al., 2006; Mendes et

al., 2007a).

Em 2010, Schimith e colaboradores (2010) avaliaram a evolução temporal de

isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 na cidade de Curitiba. Este estudo

demonstrou que o clone inicialmente descrito, em 1999, por Dalla-Costa e

colaboradores (2003), persistiu no hospital de Curitiba até 2004, quando então, foi

substituído por outros dois clones que prevaleceram nos anos seguintes. No mesmo

estudo, foi verificada uma alta mortalidade (45,2%) entre os pacientes que

apresentaram infecções por isolados de A. baumannii produtores de OXA-23,

principalmente nos casos de pneumonia relacionada à ventilação mecânica (Schimith

et al., 2010). Resultados similares foram obtidos por Carneiro e colaboradores (2010)

que avaliaram 172 amostras de A. baumannii isolados em um hospital de Londrina. Os

autores também observaram uma alta frequência de pneumonia relacionada à

ventilação mecânica associada a altas taxas de mortalidade (52,9%). No mesmo

estudo, ficou demonstrado o papel do ambiente nosocomial na disseminação de cepas

MDR de A. baumannii, uma vez que foi comprovado pela análise do PFGE que o

padrão genético das cepas isoladas dos leitos da UTI era idêntico às cepas que

estavam causando infecção nos pacientes internados na mesma unidade hospitalar.

DISCUSSÃO

83

Os dados obtidos com os estudos de 2009 e 2010 demonstraram uma mudança

drástica no perfil clonal dos isolados brasileiros de A. baumannii produtores de OXA-

23 (Carvalho et al., 2009; Martins et al., 2009; Carneiro et al., 2010; Schimith et al.,

2010), o que contribuiria para o sucesso desse patógeno nos hospitais do nosso país.

Em 2011, Furtado e colaboradores também relataram altas taxas de

mortalidade (61,9%) entre os casos de infecção causada por isolados de A. baumannii

produtores de OXA-23 em uma UTI de um hospital da cidade de São Paulo, inclusive

superiores àquelas descritas por Schimith e colaboradores (2010). No mesmo ano,

Ferreira e colaboradores (2011) relataram a presença de OXA-23 em isolados de A.

baumannii recuperados de águas residuais de três hospitais localizados em Porto

Alegre, demonstrando o papel do esgoto hospitalar na perpetuação de patógenos e

genes de resistência no meio ambiente, os quais poderiam se estabelecer como

reservatórios naturais. No mesmo ano, dois estudos demonstraram que a dinâmica da

resistência aos carbapenens no Brasil era mais complexa do que se imaginava

(Antonio et al., 2011; Werneck et al., 2011b). No estudo de Antonio e colaboradores

(2011), foi relatada a alta prevalência de OXA-143 em isolados de A. baumannii no

estado de São Paulo, demonstrando que a OXA-23 não era a única CHDL prevalente

em nosso país. Até esse momento, pouco se sabia sobre a frequência de OXA-143 no

Brasil, mesmo essa CHDL tendo sido descrita dois anos antes em isolados de

Acinetobacter spp. coletados de uma UTI brasileira, em 2004 (Higgins et al., 2009). Já

no estudo conduzido por Werneck e colaboradores (2011b), foi questionado se a

prevalência de OXA-143 poderia ser maior em hospitais públicos da cidade de São

Paulo do que em hospitais privados, como verificado por Antonio e colaboradores

(2011). Os autores também demonstram que em hospitais privados, a OXA-23 era a

carbapenemase mais frequente, e encontrava-se disseminada em isolados brasileiros

de A. baumannii. Estes autores também reportaram que o perfil genético destes

isolados era altamente diversificado, superior inclusive ao verificado nos estudos

publicados anteriormente.

DISCUSSÃO

84

Embora pouco se saiba sobre a prevalência de OXA-143 em muitos estados

brasileiros, estudos recentes demonstram que essa CHDL está restrita à região

sudeste do país, principalmente nos estados de São Paulo e Minas Gerais (Mostachio

et al., 2012). Em um estudo retrospectivo, em que foram avaliadas amostras de

Acinetobacter spp. coletadas por um período de 18 anos em um hospital da cidade de

São Paulo, demonstrou que a OXA-143 era mais antiga do que se pensava, tendo sido

encontrada em um isolado de 1995 (Cayô et al., 2011a). O mais interessante é que o

primeiro isolado produtor de OXA-23 descrito no estudo somente foi encontrado em

2003, quase uma década após o aparecimento da OXA-143 na instituição. Apesar

disso, os isolados produtores de OXA-23 se disseminaram rapidamente nos anos que

se seguiram, tornando-se a principal carbapenemase responsável pela resistência aos

carbapenens naquela instituição (Cayô et al., 2011a). Esses dados mostraram a

grande adaptabilidade dos isolados produtores de OXA-23 ao ambiente nosocomial, o

que em parte, justifica seu sucesso em manterem-se por longos períodos neste

ambiente e causando surtos de difícil controle. Estudos mais recentes comprovam a

alta prevalência de OXA-23 em isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenens

em diferentes estados no Brasil (Corrêa et al., 2012; Gales et al., 2012; Martins AF et

al., 2012; Martins N et al., 2012).

No presente estudo, foram avaliados 31 isolados de A. baumannii produtores

de OXA-23 provenientes de 14 hospitais privados localizados em sete estados

brasileiros e representativos dos principais padrões genéticos e padrões relacionados

descritos no estudo de Werneck e colaboradores (2011b). Os 16 padrões de PFGE e

15 padrões relacionados demonstraram o alto grau de diversificação que os isolados

brasileiros de A. baumannii produtores de OXA-23 alcançaram, bem diferente daquele

perfil monoclonal descrito 10 anos antes por Dalla-Costa e colaboradores (2003). A

análise do padrão genético desses isolados, nos mostra que em um mesmo hospital,

vários clones podem estar circulando ao mesmo tempo. Além disso, isolados

relacionados clonalmente foram encontrados em diferentes hospitais, o que demonstra

DISCUSSÃO

85

uma transmissão intra-hospitalar e uma evolução subsequente desses clones, de

forma distinta, em cada instituição. Essa grande variabilidade clonal entre os isolados

de A. baumannii produtores de OXA-23 tem sido relatada por diferentes estudos em

vários hospitais brasileiros nos últimos quatro anos (Carvalho et al., 2009; Martins et

al., 2009; Carneiro et al., 2010; Schimith et al., 2010; Ferreira et al., 2011; Furtado et

al., 2011).

Atualmente, duas metodologias de MLST são utilizadas para a avaliação da

ancestralidade de cepas de A. baumannii, se diferenciando basicamente em alguns

genes utilizados (Bartual et al., 2005; Nemec et al., 2008). A grande dificuldade na

interpretação dos resultados do MLST para A. baumannii está no fato de que cada

website curador responsável pelos respectivos bancos de dados nomeiam os STs de

forma distinta. Apesar disso, os STs obtidos podem ser correlacionados, e a melhor

maneira de conseguir essa correlação, é por meio do sequenciamento dos dois

esquemas de genes para ambas as metodologias. O estudo de Stietz e colaboradores

(2013) correlaciona os principais complexos clonais descritos pelas duas metodologias

e disseminados no mundo, demonstrando que o CC92, CC113 e CC103 de acordo

com Bartual e colaboradores (2005), correspondem aos complexos clonais CC2, CC79

e CC15 de Nemec e colaboradores (2008), respectivamente.

Para auxiliar na compreensão do mapa de filogenia, apresentado na Figura 8,

alguns conceitos importantes serão definidos a seguir. Cada padrão genético e seu

padrão relacionado obtidos pela técnica de PFGE correspondem, geralmente, a um

mesmo ST, que podem estar inseridos ou não em um Complexo Clonal (CC) e a um

“Sequence Group” (SG). Determina-se complexo clonal, o número do ST que está no

centro de um grupo, pois foi o primeiro ST encontrado (A exemplo da Figura 10, o ST4

está inserido no CC1, pois o ST1 foi o primeiro a ser reportado).

DISCUSSÃO

86

Figura 10: Modelo de um complexo clonal.

Fonte: http://eburst.mlst.net/v3/instructions/3.asp.

Quando um isolado bacteriano apresenta uma mutação em um alelo em

comparação ao ST anteriormente descrito, ele é denominado “Single Locus Variant

(SLV)”. Já se ele apresenta duas mutações em relação ao primeiro ST descrito, ele é

denominado “Double Locus Variant (DLV)”. Um “Singleton” é um ST que não está

inserido em um complexo clonal e, portanto, não possui “parentesco” com nenhum ST

anteriormente descrito, como exemplificado na Figura 10 pelo ST12. O SG é definido

pelo “eBURST”, quando a análise de todas as amostras é feita, separando-se em

grupos de ordem decrescente de quantidade de STs correlacionadas e não possui,

necessariamente, o mesmo número do complexo clonal. O SG será sempre variável e

um complexo clonal pode não pertencer sempre a um mesmo SG, pois conforme

novos STs vão sendo incorporados aos complexos clonais, o número de STs dentro

desses complexos aumenta, podendo um complexo clonal antes chamado de SG2,

passar a ser chamado de SG1, pois o SG1 apresenta agora, uma maior quantidade de

STs que o SG2. Amostras correlacionadas com dois ou mais STs, mas que não

formam um CC, também formam um SG.

As sequências alélicas obtidas para os setes genes dos 31 isolados de A.

baumannii produtores de OXA-23 avaliados no presente estudo, foram comparadas

com as sequências já existentes no banco de dados do MLST do “Institut Pasteur”

(http://www.pasteur.fr/cgi-bin/genopole/PF8/mlstdbnet.pl?page=download_profiles&file=acin_profiles.xml). A partir

Singleton . ST12

http://eburst.mlst.net/v3/instructions/3.asp

http://www.pasteur.fr/cgi-bin/genopole/PF8/mlstdbnet.pl?page=download_profiles&file=acin_profiles.xml

DISCUSSÃO

87

dessa comparação foi possível a obtenção da árvore filogenética (Figura 8), feita

através do site http://eburst.mlst.net, a qual permite verificar a relação de

ancestralidade entre os diferentes clones/STs e seus respectivos CCs em todo o

mundo.

Vários estudos demonstram que os clones europeus EU-I, EU-II e EU-III são os

mais disseminados em todo o mundo, principalmente na Europa e Ásia (Turton et al.,

2007; Towner et al., 2008; Mugnier et al., 2010; Diancourt et al., 2010; Fu et al., 2010).

No Brasil, há um estudo relatando que 70% das amostras de A. baumannii produtores

de OXA-23 isoladas em hospitais do Rio de Janeiro foram semelhantes ao clone EU-II

(Grosso et al., 2011). Estes clones europeus correspondem aos complexos clonais

CC1, CC2 e CC3, respectivamente pela metodologia, de Nemec (Krizova et al., 2011;

Mezzatesta et al., 2012). No Brasil, os STs mais disseminados são o ST1/CC1,

ST15/CC15 e ST79/CC79 (Mugnier et al., 2010, Grosso et al., 2011; Martins et al.,

2013; Coelho-Souza et al., 2013). Os dados obtidos no presente estudo corroboram

com a literatura, uma vez que a maioria dos isolados de A. baumannii produtores de

OXA-23 avaliados pertencem ao ST79, seguido do ST15 e do ST1. O ST79,

juntamente dos ST162, ST189 e ST190 fazem parte do CC79, um dos principais

complexos clonais descritos, sendo reportado também na Argentina (Stietz et al.,

2013). Esses dados demonstram que os principais clones brasileiros de A. baumannii

circulantes fazem parte de clones mundialmente disseminados. Além disso, foi

possível observar a inclusão de novos STs, demonstrando a provável transmissão do

gene blaOXA-23 para amostras com genótipos distintos. Embora nenhum padrão clonal

específico possa ser relacionado a uma determinada instituição no presente estudo, foi

possível observar que, dentro de um mesmo hospital, vários padrões de PFGE de A.

baumannii produtores de OXA-23 podem estar circulando ao mesmo tempo. Além

disso, isolados com padrões relacionados foram encontrados em diferentes hospitais

localizados em áreas geográficas distintas, sugerindo que possa ter ocorrido a

http://eburst.mlst.net/

DISCUSSÃO

88

transmissão inter-hospitalar destes clones, os quais posteriormente se diferenciaram

geneticamente de maneira gradual.

Outro dado importante é que os principais padrões de A. baumannii

disseminados mundialmente apresentam um fenótipo MDR, o que torna o panorama

ainda mais preocupante (Mugnier et al., 2010; Grosso et al., 2011; Martins et al., 2013;

Coelho-Souza et al., 2013; Stietz et al., 2013). Quando avaliamos os dados de

sensibilidade aos antimicrobianos entre os 31 isolados avaliados no estudo,

verificamos altas taxas de resistência a quase todos os antimicrobianos testados no

isolados brasileiros. Somente a minociclina e a polimixina B, apresentaram atividade

frente aos isolados de A. baumannii produtores de OXA-23. Embora o uso da

minociclina tenha caído em desuso devido à introdução de agentes antimicrobianos

mais potentes (Neonakis et al., 2011), a sua concentração sérica/tecidual ideal e sua

notável penetração no sistema nervoso central, aliado ao aumento de infecções por

isolados de A. baumannii MDR, fez com que esse antimicrobiano voltasse a ganhar

destaque (Bishburg & Bishburg, 2009; Neonakis et al., 2011). Os relatos na literatura,

ainda que escassos, têm demonstrado resultados animadores para o tratamento de

infecções de pele (Griffith et al., 2008) e pneumonia (Wood et al., 2003; Griffith et al.,

2008) causadas por A. baumannii. Infelizmente, a minociclina na sua formulação

endovenosa, não é comercializada para uso clínico no Brasil.

As polimixinas (B e E/Colistina) apresentam uma atividade bactericida contra

isolados de A. baumannii, e as taxas de resistência tem se mantido relativamente

baixas, variando, em média, de 1,7% a 3% entre isolados de Acinetobacter spp.

(Gales et al., 2006; Souli et al., 2006; Gales et al., 2011). A excelente atividade das

polimixinas frente a isolados MDR de A. baumannii tem sido comprovada por

diferentes estudos, que comprovam que esse antimicrobiano, em muitos casos, é uma

das únicas opções disponíveis para o tratamento de infecções causadas por esse

micro-organismo (Levin et al., 1999; Kallel et al., 2007; Griffith et al., 2008; Bishburg &

Bishburg, 2009; Falagas et al., 2010, Rossi, 2011). Embora casos de resistência a

DISCUSSÃO

89

esses compostos sejam raros em isolados de A. baumannii, Ko e colaboradores

(2007) relataram uma taxa de 27,9% de resistência à polimixinas nos 214 isolados de

A. baumannii avaliados em dois hospitais sul-coreanos (Ko et al., 2007). Além da

monoterapia, estudos têm demonstrado que o uso das polimixinas em associação com

carbapenens, quinolonas e aminoglicosídeos no tratamento de infecções causadas por

isolados de A. baumannii MDR, apresentaram resultados promissores (Yoon et al.,

2004; Tan et al., 2007; Pankuch et al., 2008).

Todos os isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 avaliados no

presente estudo apresentaram resistência à ampicilina/sulbactam. Apesar de ser

comercializado no Brasil juntamente com a ampicilina, o sulbactam, que é um inibidor

de β-lactamase com uma estrutura semelhante aos β-lactâmicos, é o que possui

atividade contra isolados de A. baumannii, porque se liga à PBP2 (Zavascki et al.,

2010). Altas taxas de resistência ao sulbactam também foram observadas em algumas

regiões geográficas, ainda que inferiores às observadas no presente estudo, variando

de 46,7% na Espanha (Fernández-Cuenca et al., 2004) a 70% em Tawain (Yang et al.,

2010). Apesar dos resultados desanimadores apresentados por esses estudos, alguns

autores obtiveram excelentes resultados utilizando esse antimicrobiano como opção

terapêutica para o tratamento de infecções causadas por A. baumannii (Levin et al.,

2002; Levin et al., 2003; Levin, 2003; Levin et al., 2008; Oliveira et al., 2008). Outro

fator que pode ter influenciado na resistência a esse antimicrobiano, são os pontos de

cortes inadequados para essas amostras, que poderiam ser revisados.

Levin e colaboradores (2003) observaram uma taxa de cura de 67,5% ao

tratarem 40 pacientes com infecções por A. baumannii MDR, principalmente infecção

de corrente sanguínea e pneumonia, com ampicilina/sulbactam. Em outro estudo, o

mesmo grupo de autores avaliou retrospectivamente, o desfecho clínico de pacientes

com infecções por Acinetobacter spp. resistentes aos carbapenens que haviam

recebido terapia com polimixina B ou ampicilina/sulbactam (Oliveira et al., 2008). Os

autores observaram que a resposta clínica à ampicilina/sulbactam foi superior àquela

DISCUSSÃO

90

apresentada pela polimixina no tratamento de A. baumannii MDR. Neste estudo, foi

também evidenciado que o uso de polimixina B era um fator independente de

mortalidade, apresentando alto valor de “Acute Physiological and Chronic Health

Evaluation II” - APACHE II (Oliveira et al., 2008). Devido aos resultados encorajadores,

recomenda-se que para infecções causadas por isolados de A. baumannii sensíveis à

ampicilina/sulbactam, deve-se priorizar esse antimicrobiano como opção terapêutica

(Neonakis et al., 2011). Além disso, alguns estudos sugerem que, para cepas MDR, o

ideal é utilizar a ampicilina/sulbactam combinada a outras drogas como à amicacina, à

rifampicina e/ou à colistina (Appleman et al., 2000; Savov et al., 2002; Ko et al., 2004,

Kiffer et al., 2005; Tong et al., 2006; Song et al., 2007; Peleg, 2007c; Maragakis & Perl,

2008, Shrivastava et al., 2009). Foi também demonstrado que o custo do tratamento

com ampicilina/sulbactam é significativamente menor quando comparado com

imipenem/cilastatina (1.500 dólares - imipenem-cilastatina vs 500 dólares -

ampicilina/sulbactam, p=0.004) (Jellison et al., 2001). A desvantagem no uso do

sulbactam seria o fato de que em muitos países, como o Brasil, somente existe a

formulação de sulbactam associada à ampicilina (proporção de 2:1

ampicilina/sulbactam).

Os dados de sensibilidade para tigeciclina entre os isolados de A. baumannii

produtores de OXA-23 foram desencorajadores, o que compromete o uso desse

antimicrobiano. Embora o uso da tigeciclina para o tratamento de infecções causadas

por A. baumannii seja “off-label”, as CIMs relativamente baixas (CIM50 0,5-1 mg/L e

CIM90 1-2 mg/L) obtidas em diferentes estudos, tornaram o uso desse antimicrobiano

atraente contra A. baumannii (Reinert et al., 2007; Garrison et al., 2009; Schimith et al.,

2010, Fernandéz-Canigia & Dowzicky, 2012, Zarrilli et al., 2012, Ergin et al., 2013,

Froment et al., 2013). Entretanto, apesar da boa atividade in vitro contra isolados de A.

baumannii MDR, a eficácia clínica da tigeciclina continua a ser controversa

(Karageorgopoulos et al., 2008; Gallagher & Rouse, 2008). Além disso, a resistência a

tigeciclina em A. baumannii ocorre pela hiperexpressão de sistemas de efluxo,

DISCUSSÃO

91

principalmente o sistema AdeABC, presente no cromossomo desse micro-organismo

(Peleg et al., 2007b), o que demonstra uma predisposição em adquirir naturalmente

resistência a esse antimicrobiano. Talvez as altas CIMs observadas para tigeciclina no

presente estudo possam ser justificadas pela hiperexpressão do sistema de efluxo

AdeABC verificado para quase todos os isolados nos testes de qRT-PCR.

Ainda que a maioria dos isolados de A. baumannii produtores de OXA-23

apresentaram resistência à amicacina, 45,2% dos isolados ainda mantém

sensibilidade à gentamicina. Vários estudos relatam a baixa atividade dos

aminoglicosídeos contra A. baumannii, geralmente associada à presença de metilases

em seu genoma (Doi & Arakawa, 2007; Zhou et al., 2010, Aghazadeh et al., 2013).

Assim como mostrado por estudos prévios (Perez et al., 2007; Gales et al., 2012), os

isolados de A. baumannii apresentaram altos níveis de resistência às fluoroquinolonas.

Embora a produção de OXA-23 justifique a resistência aos carbapenens

observada nos isolados de A. baumannii avaliados no estudo, o mesmo não se aplica

às cefalosporinas de espectro ampliado que não são hidrolisadas por essas β-

lactamases (Bush & Jacoby, 2010; Poirel et al., 2010). Nenhum gene codificador de

ESβL, dentre aqueles pesquisados, foi encontrado nos isolados brasileiros de A.

baumannii produtores de OXA-23 que pudesse justificar a resistência às

cefalosporinas de espectro ampliado. Embora as ESLs sejam muito prevalentes em

enterobactérias, raramente são descritas em isolados de A. baumannii (Vahaboglu et

al., 1997; Poirel et al., 2003; Nagano et al., 2004; Celenza et al., 2006; Pasterán et al.,

2006; Endimiani et al., 2007; Naas et al., 2007; Shakil et al., 2010; Bonnin et al.,

2011a, Bonnin et al., 2011b), o que corrobora com os nossos resultados. Somente a β-

lactamase de espectro restrito TEM-1 foi identificada nos isolados de A. baumannii

produtores de OXA-23. A presença dessa enzima já foi descrita em estudos prévios

com frequências que variaram de 18% a 71% (Ben et al., 2011; Manageiro et al.,

2012). No estudo conduzido por Ben e colaboradores (2011), os autores aplicaram um

teste de regressão multivariada e concluíram que a coprodução de OXA-23 (p=0,004 e

DISCUSSÃO

92

OR=10,52) e TEM-1 (p=0,005 e OR=6,14) é um bom preditor de resistência a

imipenem em isolados de A. baumannii.

Em isolados de A. baumannii, a expressão da AmpC cromossômica, que é

intrínseca dessa espécie, não é induzida pelo fato de que neste micro-organismo o

gene ampR está ausente, sendo, portanto, expressa em níveis basais, e, dessa forma,

não confere resistência às oximinocefalosporinas (Bou & Martínez-Beltrán, 2000).

Entretanto, a resistência às oximinocefalosporinas em A. baumannii está geralmente

relacionada à hiperprodução de AmpC, quando a sequência de inserção ISAba1 está

inserida a montante deste gene, conferindo um promotor forte (Boo et al., 2009; Lin et

al., 2010). Como era de se esperar, todos os isolados avaliados no presente estudo

apresentavam o gene blaAmpC e 25 dos 31 isolados apresentavam a ISAba1 a

montante do gene. Esses isolados possuíam altos níveis de resistência às

cefalosporinas de amplo espectro. Por outro lado, os seis isolados que não

apresentavam essa associação mostravam CIMs mais baixos para às cefalosporinas

de amplo espectro, demonstrando o papel da hiperprodução de AmpC na resistência a

esses antimicrobianos em isolados de A. baumannii produtores de OXA-23. A

importância da ISAba1 foi ressaltada em estudos prévios, demonstrando, inclusive, a

presença dessa sequência de inserção em determinados STs, principalmente,

naqueles mais prevalentes (Lin et al., 2010; Ben et al., 2011).

A presença de sequências de inserção, principalmente da ISAba1, permitiu ao

A. baumannii controlar a expressão gênica de maneira única. A grande vantagem está

no grande número de cópias dessas sequências ao longo do genoma de A. baumannii

(Segal et al., 2005a), aumentando a expressão ou inativando vários genes

codificadores de β-lactamases como a AmpC (Ben et al., 2011), a OXA-51 (Lopes et

al., 2012a), a OXA-23 (Lee et al., 2011) e a OXA-58 (Lopes et al., 2012b), e da porina

CarO (Mussi et al., 2005). Outro ponto importante do presente estudo foi a alta

frequência de ISAba1 a montante dos genes blaAmpC, blaOXA-51-like e blaOXA-23

concomitantemente nos isolados pertencentes aos CC79, CC15 e CC1. A

DISCUSSÃO

93

hiperprodução de todos esses genes contribui para os altos valores de CIMs para os

β-lactâmicos verificados nesses clones.

As CHDLs hidrolisam fracamente os carbapenens, sendo necessária a

presença de uma sequência de inserção para aumentar a expressão da maioria

dessas enzimas (Bush et al., 1995; Poirel & Nordmann, 2006; Walther-Rasmussen &

Høiby, 2006; Figueiredo et al., 2009, Bush & Jacoby, 2010). Embora cinco isolados

apresentassem ISAba1 a montante do gene blaOXA-51-like, não foi possível predizer o

impacto dessa associação na resistência aos carbapenens, já que todos os isolados

apresentaram também a ISAba1 a montante do gene blaOXA-23, o que logo justificaria a

resistência aos carbapenens. Apesar disso, vários estudos que avaliaram isolados de

A. baumannii resistentes aos carbapenens, que não carreavam genes codificadores de

nenhuma carbapenemase adquirida, concluíram que o gene blaOXA-51-like associado a

ISAba1 também está relacionado ao fenótipo de resistência aos carbapenens nesses

isolados (Héritier et al., 2006; Turton et al., 2006; Segal et al., 2007, Evans et al.,

2013).

Sistemas de efluxo são transportadores expressos em qualquer célula viva,

protegendo-as dos efeitos tóxicos de substâncias químicas orgânicas (Vila et al.,

2007). Esses sistemas podem ser específicos para um determinado substrato ou

podem transportar uma gama de compostos estruturalmente diferentes (Piddock,

2006; Coyne et al., 2011). Dessa forma, o fenótipo MDR está frequentemente

associado à hiperexpressão desses sistemas, já que reduzem, ao mesmo tempo, o

acúmulo de muitos antimicrobianos no interior da bactéria (Piddock, 2006; Vila et al.,

2007; Coyne et al., 2011). Embora esses sistemas possam conferir diminuição da

sensibilidade a muitos antimicrobianos, nem sempre essa diminuição resulta em

resistência (Piddock, 2006).

No presente estudo não foi considerado significativa a diminuição de apenas

uma diluição na CIM para qualquer um dos quatro β-lactâmicos testados na presença

do inibidor, já que tal diferença entre dois testes dilucionais poderia ser consequente à

DISCUSSÃO

94

variabilidade atribuída à própria técnica de sensibilidade utilizada. Sendo assim, neste

estudo, as CIMs para ceftazidima e, principalmente, para meropenem diminuíram (≥ 2

diluições) na presença do inibidor de sistemas de efluxo PAβN. Além disso, o isolado

que apresentava CIMs elevadas para ceftazidima e cefotaxima, mesmo sem

apresentar ISAba1 associada a AmpC, apresentou uma diminuição da CIM para

ceftazidima de 128 µg/mL para 16 µg/mL, mas não para cefotaxima. Esses dados

demonstram um possível impacto da hiperexpressão dos sistemas de efluxo na

resistência à ceftazidima em isolados que não hiperproduzem a AmpC e no aumento

dos níveis de resistência ao meropenem em isolados que produzem OXA-23. Dados

similares foram obtidos por Peleg e colaboradores (2007b) que avaliaram a influência

do inibidor PAβN nas CIMs para diferentes antimicrobianos. Embora eles tenham

enfatizado a diminuição das CIMs para tigeciclina na presença do inibidor, a CIMs para

meropenem, imipenem e ceftazidima decresceram consideravelmente, o mesmo não

ocorrendo para cefepima. Apesar disso, naquele estudo, os isolados avaliados eram

sensíveis aos carbapenens, com CIMs que variavam de 0,06 a 4 µg/mL,

demonstrando que os sistemas de efluxo contribuem na elevação da CIMs, ainda que

não sejam capazes de tornar os isolados resistentes aos carbapenens. Ainda que de

forma mais discreta, as CIMs para imipenem também diminuíram de duas a três

diluições. Ao contrário, no estudo conduzido por Hou e colaboradores (2012) que

relataram uma diminuição das CIMs para imipenem de 4 a 32 vezes em isolados de A.

baumannii resistentes a esse composto, o mesmo não foi verificado nos isolados

sensíveis a imipenem. Eles observaram também um aumento de 4, 3 e 11 vezes na

expressão das bombas adeB, AdeJ e AdeM.

Os dados de qRT-PCR demonstraram uma hiperexpressão do sistema de

efluxo AdeABC entre os isolados brasileiros de A. baumannii produtores de OXA-23,

principalmente naqueles isolados que estão incluídos nos três principais complexos

clonais disseminados em nosso país (CC79, CC15 e CC1). Esse aumento da

expressão pode ser um dos responsáveis pelo fenótipo MDR verificado entre os

DISCUSSÃO

95

isolados brasileiros, contribuindo, principalmente, na elevação das CIMs verificadas

para tigeciclina nesse grupo amostral. Além disso, é importante lembrar que outros

sistemas de efluxo da Família RND já foram descritos em isolados de A. baumannii, e

que poderiam estar contribuindo na ejeção de ceftazidima e meropenem, como

verificado no teste fenotípico com o PAβN (Coyne et al., 2011).

Os resultados obtidos até o momento na literatura sugerem que o sistema

AdeABC esteja relacionado à resistência ao meropenem, mas não ao imipenem em

isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 que tiveram o gene adeB deletado

(Wong et al., 2009). Provavelmente, somente a hiperexpressão do sistema AdeABC

não seja suficiente para causar altos níveis de resistência aos carbapenens,

necessitando da associação de outros mecanismos (Coyne et al., 2011). No estudo

conduzido por Yoon e colaboradores (2013) verificou-se uma alta frequência de

hiperexpressão do sistema de efluxo AdeABC em isolados MDR de A. baumannii. Os

autores associaram essa hiperexpressão a mutações nos genes regulatórios adeR e

adeS.

Uma grande variedade de oxacilinases do grupo das OXA-51 foi descrita entre

os isolados de A. baumannii produtores de OXA-23. De um modo geral, a variante de

OXA-51 produzida está relacionada ao ST. Apesar disso, isolados apresentando perfil

de PFGE relacionados podem sofrer mutações no gene blaOXA-51-like, originado novas

variantes, como observado no presente estudo. Uma alta variabilidade de oxacilinases

intrínsecas em A. baumannii já foi relatada previamente, demonstrando que tais

enzimas variam conforme o padrão de PFGE (Héritier et al., 2005a). Essa estreita

correlação entre a variante de OXA-51 e seu padrão de PFGE, permitiu a Zander e

colaboradores (2012) correlacionar a variante ao perfil clonal obtido pelo DiversiLab,

de modo que os autores concluíram que a tipagem baseada no sequenciamento dos

genes blaOXA-51-like, demonstra ser uma promissora ferramenta na caracterização

molecular de isolados de A. baumannii e identificar as principais linhagens clonais

disseminadas no mundo. Como as variantes de OXA-51 variam conforme o padrão

DISCUSSÃO

96

clonal, o estudo de Ikonomidis e colaboradores (2007) realizado na Grécia,

demonstrou uma baixa variabilidade de oxacilinases pertencentes a esse grupo,

provavelmente em consequência a uma menor variabilidade de padrões observada

entre os isolados de A. baumannii naquele país.

Embora a presença do gene blaOXA-51-like, intrínseco do cromossomo de A.

baumannii, tenha sido detectado em todos os isolados avaliados no presente estudo, a

disseminação desse gene mediada por plasmídeos para outras espécies de

Acinetobacter não-baumannii em Taiwan (Lee et al., 2012), comprometeu a utilização

desse gene como prova presuntiva de identificação para A. baumannii. Apesar disso,

os nossos resultados indicam que todos os isolados produtores de OXA-51 foram

identificados como sendo A. baumannii pelo sequenciamento do gene rpoB, indicando

que em nosso meio, o uso do gene blaOXA-51-like ainda é um bom teste para diferenciar

os isolados como sendo baumannii de não-baumannii. Outro dado importante, foi a

excelente correlação entre os resultados obtidos pelo MALDI-TOF e o sequenciamento

do gene rpoB.

Acredita-se que o tamanho pequeno e o limitado número de porinas em

Acinetobacter spp. seja o responsável pela resistência intrínseca aos antimicrobianos

observada neste micro-organismo (Vila et al., 2007). O conceito que se tinha sobre a

permeabilidade de A. baumannii foi em parte confirmado por um interessante estudo

publicado recentemente (Sugawara & Nikaido, 2012). Nesse estudo, foi observado que

a permeabilidade da membrana externa de A. baumannii para cefalotina e cefaloridina

era 100 vezes menor do que a permeabilidade observada para a E. coli K12,

demonstrando que naturalmente A. baumannii apresenta uma baixa permeabilidade

de membrana externa (Sugawara & Nikaido, 2012). Além disso, foi observado que

embora a OmpA, também conhecida como OmpHMP (36,5 kDa), apresente uma

capacidade mínima de formar poros, houve uma diminuição de duas a três vezes na

permeabilidade para cefalotina e cefaloridina quando o gene ompA foi deletado

(Sugawara & Nikaido, 2012). Os autores concluem que a baixa permeabilidade dessa

DISCUSSÃO

97

porina aliada à hiperexpressão de β-lactamases intrínsecas, como as CHDLs do

cluster OXA-51 e as cefalosporinases do tipo ADC/AmpC, e de sistemas de efluxo,

poderiam ser essenciais para os altos níveis de resistência intrínseca observado para

muitos antimicrobianos em isolados clínicos de A. baumannii (Sugawara & Nikaido,

2012).

Ainda que sejam poucos os estudos que avaliaram o papel das porinas na

resistência aos carbapenens em A. baumannii, os dados obtidos mostraram que essas

proteínas desempenham um papel importante na resistência aos carbapenens

(Limansky et al., 2002; Dupont et al., 2005; Mussi et al., 2005; Tomás et al., 2005).

Sendo assim, Limansky e colaboradores (2002) demonstraram que a resistência ao

imipenem em um isolado de Acinetobacter spp. não produtor de carbapenemase,

estava associada à perda de uma proteína de 29 kDa, designada CarO. Resultado

semelhante foi observado por um estudo conduzido por Mussi e colaboradores (2005),

no qual foi demonstrado que a resistência ao imipenem e ao meropenem em A.

baumannii também estava associada a perda dessa porina, pela inativação do gene

carO por uma IS. Recentemente, outros dois estudos, comparando a proteômica de

isolados sensíveis e resistentes de A. baumannii, observaram alterações estruturais na

CarO, principalmente nas estruturas primárias e quartenárias dessa porina (Siroy et

al., 2006; Vashist et al., 2010). Foi também observado que as isoformas alteradas não

transportavam eficientemente os carbapenens como a porina “selvagem” (Vashist et

al., 2010). Dessa forma, isolados de A. baumannii resistentes, provavelmente,

alterariam a CarO de modo a diminuir a entrada do carbapenem na célula bacteriana.

Da mesma forma, outras duas porinas foram descritas relacionadas à resistência aos

carbapenens em A. baumannii: uma proteína chamada 33-36 kDa (Tomás et al.,

2005), com um tamanho estimado de 31 kDa, e outra de 43 kDa, que demonstra

homologia peptídica com a OprD (D2) de P. aeruginosa (Dupont et al., 2005). Como

nenhum sítio de ligação ao imipenem pode ser detectado na CarO, acredita-se que

esta porina seja um canal inespecífico de entrada para os carbapenens (Siroy et al.,

DISCUSSÃO

98

2005), enquanto a proteína de 43 kDa (OprD-like) seria o canal específico para estes

antimicrobianos (Vila et al., 2007).

Outra porina descrita em A. baumannii é a OmpW (21 kDa), que demonstra

uma alta homologia com a OmpW de E. coli e P. aeruginosa. Embora sua função em

A. baumannii ainda não esteja bem esclarecida, Vila e colaboradores (2007)

observaram uma diminuição in vitro da expressão dessa porina em mutantes de A.

baumannii resistentes à colistina (Vila et al., 2007). Entretanto, Tiwari e colaboradores

(2012) avaliando a proteômica de isolados de A. baumannii resistentes aos

carbapenens, observaram uma diminuição da expressão de OmpW, comparada com a

cepa ATCC 19606 de A. baumannii sensível aos carbapenens. Ainda que em estudo

similar, Siroy e colaboradores (2005) não tenham observado alteração na expressão

da OmpW, eles relataram a presença de pelo menos quatro isoformas diferentes

dessa OMP no gel de SDS-PAGE (Siroy et al., 2006). Vashist e colaboradores (2010)

também observaram a presença de isoformas de OmpW e, em decorrência desse

achado, os autores inferiram que era possível que a OmpW, sendo uma porina

pequena, fosse importante para realizar a função de transporte na ausência ou

alteração das porinas principais em isolados resistentes de A. baumannii (Vashist et

al., 2010).

É importante ressaltar que a análise de géis de proteínas de membrana externa

pela técnica de SDS-PAGE é sempre relativa, por apresentar diferentes fatores

durante a realização da técnica que podem alterar o perfil das bandas proteicas.

Apesar do protocolo utilizado no presente estudo objetivar diminuir a influência desses

fatores, a presença de formas aberrantes da mesma proteína em isolados clínicos de

A. baumannii, faz com que elas apresentem tamanhos diferentes no gel de SDS-

PAGE (Siroy et al., 2006; Vashist et al., 2010), tornando a análise do gel para esse

micro-organismo uma tarefa complexa. Ainda assim, o SDS-PAGE continua sendo

uma técnica útil para avaliar o perfil de OMPs em bacilos Gram negativos resistentes

aos carbapenens (Limansky et al., 2002; Dupont et al., 2005; Mussi et al., 2005;

DISCUSSÃO

99

Tomás et al., 2005). Sendo assim, a análise dos géis de SDS-PAGE demonstrou um

perfil de OMPs variável entre os isolados de A. baumannii produtores de OXA-23,

apresentando proteínas com tamanhos alterados compatíveis com a OmpHMP e a

Omp25, duas proteínas, cuja importância na resistência aos carbapenens ainda

permanece desconhecida. Talvez essas alterações sejam uma ação compensatória

nessas proteínas de modo a contrabalancear a pressão seletiva dos β-lactâmicos

sobre as proteínas utilizadas por esses compostos para atravessar a membrana

externa bacteriana, como a CarO, Omp33-36 e OprD (Vashist et al., 2010). Além

disso, para a maioria dos isolados analisados, não foi verificado uma OMP de

aproximadamente 21 kDa compatível com a OmpW. Entretanto, comparando os dados

de expressão obtidos pela técnica de qRT-PCR, verificou-se que a porina OmpW

continuava a ser expressa nos isolados clínicos. O peso molecular muito similar entre

as proteínas importantes e relacionadas à resistência aos carbapenens pode ter

dificultado a análise visual do gel, já que as OMPs OmpW (21 kDa), Omp25 (25 kDa),

CarO (29 kDa) e Omp33-36 (31 kDa) estão incluídas em uma faixa de peso molecular

de apenas 10 kDa.

Os resultados obtidos com o presente estudo demonstraram a complexidade

envolvida na resistência aos β-lactâmicos em isolados brasileiros de A. baumannii

produtores de OXA-23. Vários são os mecanismos que podem estar expressos ou

reprimidos ao mesmo tempo elevando as CIMs. Talvez uma das grandes vantagens

evolutivas que permitiram a esses micro-organismos o sucesso alcançado no

ambiente hospitalar seja a presença de diferentes sequências de inserção no seu

genoma, promovendo um controle da expressão gênica com o menor gasto energético

possível. Essa característica é única entre os micro-organismos patogênicos e,

embora alarmante, torna essa bactéria ainda mais fascinante.

CONCLUSÃO

100

7. CONCLUSÃO

A hiperexpressão do sistema de efluxo AdeABC contribuiu com o aumento nos

níveis de resistência principalmente ao meropenem e à ceftazidima;

A presença de ISAba1 a montante do gene blaAmpC poderia justificar os altos

níveis de resistência às cefalosporinas de amplo espectro encontradas neste

estudo;

Uma alta diversidade de STs foi verificada nesses isolados, demonstrando uma

diversificação ao longo dos anos;

A maioria dos isolados brasileiros de A. baumannii incluídos no CC79, CC15 e

CC1 apresentam ISAba1 a montante dos genes blaAmpC, blaOXA-51-like e blaOXA-23

em contraposição a maioria dos isolados não inseridos em um Complexo

Clonal;

A maioria dos isolados brasileiros está relacionada aos ST79, ST15 e ST1

incluídos nos CC79, CC15 e CC1, respectivamente, sendo estes os mais

disseminados pelo Brasil;

O ST1, inserido no CC1, está relacionado ao EU-I, um dos mais disseminados

no mundo;

Um grande número de variantes pertencentes ao grupo das CHDLs

cromossômicas e intrínsecas de A. baumannii foi observado nos isolados,

variando de acordo com o padrão de PFGE;

CONCLUSÃO

101

Altos níveis de expressão do sistema de efluxo AdeABC foram verificados na

maioria dos isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 quando

comparados a cepa ATCC BAA-1907 multisensível;

Os altos níveis de expressão do gene adeB se correlacionam, em sua maioria,

ao ST1, ST15 e ST79, sendo o ST, onde estão incluídos os padrões G e H, os

que mais hiperexpressam;

Não foi possível correlacionar o alto nível de expressão do sistema de efluxo

aos altos níveis de resistência aos antimicrobianos;

Somente a minociclina e a polimixina B apresentaram excelente atividade

frente aos isolados de A. baumannii produtores de OXA-23;

A presença de ISAba1 à montante da AmpC está relacionada aos altos níveis

de resistência às cefalosporinas de terceira geração, no entanto, isolados que

não possuem a ISAba1 à montante da AmpC, apresentaram menor taxa de

resistência aos antimicrobianos de uma forma geral,

Uma complexa organização do perfil de proteínas de membrana externa foi

observada entre os isolados avaliados no estudo, demonstrando que a

impermabilidade de membrana é um fator considerável.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

102

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