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COPOLÍMERO DE FUMARATO- QUITOSANO ENTRECRUZADO DIRIGIDO
COMO SCAFFOLDS PARA INGENIERIA DE TEJIDO OSTEO-CARTILAGINOSO
M. L. Lastra1, 2, M. S. Molinuevo1, M. S. Cortizo2
1 Laboratorio de Investigación en Osteopatías y Metabolismo Mineral (LIOMM), Fac. de Cs. Exactas, UNLP, 47 y 115, La Plata, Argentina.
2 Grupo Macromoléculas, Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas (INIFTA), Dpto. de Química, Fac. Cs. Exactas, UNLP, CCT- La Plata,
CONICET CC 16, Suc. 4. La Plata, Bs. As., Argentina. e-mail: [email protected]
RESUMEN
La ingeniería de tejidos pretende recrear el ambiente adecuado para promover el
comportamiento de las células apropiadas para la regeneración de tejidos.
Lesiones osteocondrales son difíciles de restaurar sin la ayuda de un “scaffold”
debido a la complejidad de este tejido. Una condición necesaria para el uso de
estos materiales es la velocidad de degradación que debe estar en línea con el
tiempo necesario para la reparación del tejido, la capacidad de absorción de agua
y una necesaria baja toxicidad. Previamente, hemos preparado un “scaffold” de un
copolímero de fumarato entrecruzado con quitosano, y hemos demostrado que
este andamio permite el crecimiento y la diferenciación de las células
osteoprogenitoras. En este trabajo se evaluó la tasa de degradación, propiedades
de hinchamiento y la posible respuesta inflamatoria de este biomaterial
entrecruzado. Nuestros resultados sugieren que el “scaffold” entrecruzado
fumarato/ quitosano sería útil en la regeneración de la ingeniería de tejidos
osteocondral ya que es capaz de incorporar agua, se degrada lentamente con el
tiempo y presenta baja citotoxicidad.
Palabras claves: ingeniería de tejidos, copolímeros fumáricos, quitosano, cartílago,
hueso.
9º Congresso Latino-Americano de Orgãos Artificiais e Biomateriais13º Congresso da Sociedade Latino Americana de Biomateriais, Orgãos Artificiais e Engenharia de Tecidos - SLABO
24 a 27 de Agosto de 2016, Foz do Iguaçu, PR
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INTRODUCCIÓN
La zona de interfase entre el tejido óseo y el cartilaginoso de un hueso se
denomina tejido osteocondral. Esta zona se encuentra altamente organizada y
juega un papel crítico en el mantenimiento del hueso. La naturaleza avascular del
cartílago es la razón de la pobre capacidad de regeneración después de lesiones
o enfermedades degenerativas (1). Cuando existen daños en este tejido, a
menudo se requieren procedimientos quirúrgicos para la regeneración de las
lesiones e incluso en algunos casos es necesario el uso de algún material para
promover la regeneración del tejido.. El diseño de un biomaterial adecuado para la
reparación de un tejido específico puede ser modulada por la selección apropiada
de los comonomeros y/o mezcla con otro biomaterial. Entre los polímeros
estudiados, el quitosano presenta gran interés debido a su alta biocompatibilidad y
baja toxicidad; sin embargo, sus propiedades mecánicas débiles y la tasa de
degradación no controlada han llevado al diseño de materiales compuestos entre
polímeros sintéticos y naturales.
Desde hace varios años nuestros grupos trabajan en ingeniería de tejidos,
habiendo desarrollado y caracterizado matrices poliméricas de origen natural y
sintético para promover el proceso de reparación ósea (2-5). Hemos estudiado
previamente nuevas matrices preparadas por entrecruzamiento de un copolímero
de fumarato con quitosano, encontrando que presentan una buena
biocompatibilidad con células osteoprogenitoras de la médula ósea y condrocitos
primarios. En el presente trabajo estudiaremos la degradación, el swelling y la
citotoxicidad de estos biomateriales, que han sido previamente caracterizados.
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El copolímero (PVF) de acetato de vinilo (AcV) y fumarato de diisoproplilo (FIP) se
obtuvo por una síntesis en masa empleando energía de microondas siguiendo una
metodología previamente desarrollada (6).
Con el objetivo de introducir grupos hidrófilos en la cadena macromolecular
principal del copolímero y mejorar su compatibilidad con el quitosano se sometió el
copolímero a una reacción de hidrolisis básica (7). El producto de este
procedimiento se designa como PVFH.
Preparación de las membranas
Se preparó una mezcla 50% p/p de quitosano (CHI) (Sigma Aldrich, high molecular
weight) y el copolímero previamente sintetizado (PVFH). Para lo cual se preparan
soluciones de los polímeros en ácido acético y se vierten en moldes, donde se
dejan a temperatura ambiente hasta evaporación completa del solvente. La
mezcla se entrecruza por incorporación de bórax in situ, según la metodología
descripta por Sreedhar (8). Así las membranas se obtienen por el método de
solvent casting. Por último la película se seca bajo vacío hasta peso constante.
Estudio de degradación enzimática
Para la degradación enzimática, los scaffolds (conteniendo o no bórax para fines
comparativos) previamente pesados a seco (w0), se colocan , en 10 ml de una
solución estéril de PBS (pH 7,4) conteniendo lipasa 115 U/L (EC 3.1.1.3,
Pseudomonas sp., Sigma) e incubándolos a 37°C durante diferentes períodos de
tiempo (7, 15 y 45 días), cambiando el medio cada semana. Para cada condición
experimental se ensayaron un mínimo de cuatro muestras. A los distintos tiempos
evaluados, las muestras se lavan con agua destilada, se secan en vacío a
temperatura ambiente y se pesan en estado seco (wd). La degradación se evalúa
con la pérdida porcentual de peso (% weight loss) empleando la siguiente fórmula:
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MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención del copolímero
0
0 100
w
wwloss weight%
d (A)
Estudio de swelling
Para obtener el máximo swelling y la capacidad de absorción de agua de las
matrices, éstas se pesan en estado seco (w0), se sumergen en una solución salina
de buffer fosfato (PBS, pH 7,4) a 37°C y a intervalos regulares de tiempo se retiran
las muestras, y se pesan en estado húmedo (w). El swelling porcentual de la
membrana (%Sw) se define como:
0
0 100
w
)ww(S% w
(B)
Con el fin de tener conocimientos sobre el proceso de transporte de agua a través
de los scaffolds, se utilizó la siguiente ecuación para analizar el proceso de
hinchamiento:
nt tkW
W
(C)
Donde k es una constante característica del sistema, que depende de las
características estructurales del polímero y su interacción con el disolvente, n es el
exponente swelling, que describe el mecanismo de transporte de agua en la
membrana, mientras que Wt y W∞ representan la cantidades de agua absorbida en
el momento t y en el tiempo de equilibrio, respectivamente (9). Representando
gráficamente log (Wt/W∞) versus log t, a partir de los datos experimentales
tomados hasta 60% de la swelling máximo, se puede obtener de la pendiente el
valor de n, mientras que k se obtiene de la intercepción con el eje de la ordenada.
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La citotoxicidad de los scaffolds se evaluó mediante la medición de la producción
de óxido nítrico (NO) y la interleuquina-1β (IL1β) utilizando un modelo de
macrófagos RAW264.7 en cultivo. Resumidamente, los macrófagos se cultivaron
con los scaffolds o directamente sobre las placas de cultivo (condición control) en
DMEM sin rojo fenol suplementado con 5% de suero fetal bovino y antibióticos
(100 U/mL penicilina y 100 g/mL estreptomicina) en atmósfera humificada con 5%
CO2 a 37ºC. Se recogieron los sobrenadantes después de 24 h, 48 y 72 horas y se
evaluó la producción de NO por el ensayo de Griess (10). La producción IL-1β se
midió en el medio después de 2, 7 y 13 días de incubación mediante kit de ELISA
(BD OptEIA™ mouse IL-1β ELISA, ELISA set).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los estudios de cinética de degradación en presencia de la enzima lipasa
muestran un aumento lineal en la pérdida de peso, con un máximo de degradación
de aproximadamente 10% después de 45 días de incubación (Fig 1). Sin embargo,
en esta figura puede observarse que inicialmente la degradación es
significativamente menor en las matrices entrecruzadas con bórax (PVFH/CHI/B)
que en aquellas que no se entrecruzaron (PVFH/CHI) (Fig 1). Se sabe que el
quitosano es susceptible de ser degradado in vivo por la lipasa al actuar sobre los
residuos acetilados (11). Nuestros resultados muestran que la presencia de bórax
en la preparación de los scaffolds disminuye la capacidad de degradación
enzimática, lo que sería un indicio de que el entrecruzamiento disminuiría la
exposición de los residuos de quitosano suceptibles de degradarse. Por otro lado,
el hecho que inicialmente el scaffold entrecruzado se degrade menos permitiría a
las células poder colonizar la matriz y desarrollarse de manera adecuada para
reparar la lesión
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Estudio de citotoxicidad con macrófagos
FIGURA 1. Estudio de degradación enzimática. Los scaffolds con (PVFH-CHI-B) y sin
bórax (PVFH-CHI) fueron incubados en presencia de lipasa a 37°C durante diferentes
períodos de tiempo. *p<0.05 vs PVFH-CHI, n=5.
A continuación, se evaluó la cinética de hinchamiento (swelling) de los scaffolds
en solución de PBS pH 7.4 a 37 °C (Figura 2). En esta figura se puede observar
que el grado de hinchamiento aumenta con el tiempo, hasta un cierto punto en el
que se hace constante, este equilibrio se alcanza dentro de 30 minutos;
observando un swelling máximo de aproximadamente 300%. Este valor nos
indicaría que el scaffold entrecruzado con bórax se comporta como un hidrogel.
Durante el proceso de hinchamiento las moléculas de agua difunden hacia el
interior de la matriz del polímero actuando como plastificantes y promueven la
relajación de las cadenas macromoleculares. Como se mencionó anteriormente, la
cinética de este proceso puede ser analizada mediante el modelo de Fick
(ecuación C) con el fin de determinar el parámetro n. El recuadro dentro de la
figura 2 muestra el gráfico de regresión lineal de la fracción de agua absorbida a
tiempos cortos de acuerdo con la ecuación (C); la pendiente de esta curva nos
permite calcular el valor de n que es igual a 0.809. Este resultado sugiere que el
mecanismo de transporte de agua dentro del scaffold se produce por un proceso
de difusión “no Fickiano”, probablemente con una difusión de agua rápida en
comparación con la relajación de la cadena macromolecular.
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FIGURA 2. Swelling. Scaffold PVFH-CHI-B estudiado en PBS pH 7.4 a 37°C.
Uno de los requisitos de los materiales empleados en ingeniería de tejidos es que
presenten nula o baja toxicidad. Previamente se ha descripto que los macrófagos
tienen la capacidad de reaccionar a cuerpos extraños que producen mediadores
de la inflamación, tales como IL-1β y NO, y por lo tanto representan un buen
modelo para investigar la citotoxicidad de los biomateriales. Así, investigamos si
nuestros scaffolds tienen efecto citotóxico empleando macrófagos murinos
(RAW264.7) en cultivo y evaluando la producción de NO y IL-1β durante diferentes
tiempos de incubación. Nuestros resultados muestran que no existe un aumento
significativo en la producción de NO ni de IL-1β (Tabla 1 y 2, respectivamente)
después de que las células se incubaron sobre los scaffolds en comparación con
la condición control (placas de cultivo estándar). Aunque hubo un aumento en la
secreción de la citoquina en función del tiempo de cultivo, se encontró que este
aumento no presenta diferencias estadísticas entre la condición control y la
condición de estudio (células creciendo sobre el scaffolds PVFH-CHI-B),
demostrando que la combinación de estos dos materiales entrecruzados por
utilización de bórax no generó ningún tipo de toxicidad.
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Tabla 1. Producción de NO determinada por la reacción de Griess con RAW264.7.
NO [nmol/ml]
24hs 48hs 72hs
Control 0,014 ± 0,017 0,262 ± 0,074 0,096 ± 0,041
PVFH-CHI-B 0,034 ± 0,034 0,389 ± 0,148 0,035 ± 0,023
Los resultados son expresados como la media ± SEM, n=6.
Tabla 2.Producción de IL-1β determinada por kit ELISA con RAW264.7.
IL-1β [pg/ml]
2 día 7 días 15 días
Control 0.33 ± 0.31 1.57 ± 0.31 1.11 ± 0.20
PVFH-CHI-B 0.28 ± 0.05 1.92 ± 0.37 1.78 ± 0.26
Los resultados son expresados como la media ± SEM, n=3.
CONCLUSIONES
En conclusión, hemos desarrollado un biomaterial basado en un copolímero de
acetato de vinilo –fumarato de diisopropilo entrecruzado con quitosano para ser
empleado en ingeniería de tejido. Este biomaterial entrecruzado puede ser
considerado un hidrogel basándonos en su comportamiento de swelling. Por otra
parte, hemos demostrado que este scaffold presenta baja citotoxicidad y podría
degradarse lentamente para cumplir los requisitos de reparación de tejido
osteocondral. Estos resultados, junto con los previamente publicados, sobre su
buena biocompatibilidad, sugieren que las matrices entrecruzadas generan
scaffolds prometedores para ser empleados en ingeniería de tejido cartilaginoso,
aunque se requieren aun estudios in vivo para asegurar su eficacia.
REFERENCES
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FUMARATE COPOLYMER – CHITOSAN CROSSLINKED SCAFFOLD
DIRECTED TO OSTEOCHONDRAL TISSUE ENGINEERING
ABSTRACT
Tissue engineering aims to recreate the native environment to promote the
appropriate cell behaviour for tissue regeneration. Osteochondral lesions are
difficult to restore without the aid of a scaffold because of the complexity of this
tissue. One necessary condition for the use of these materials is the degradation
rate that must be in line with the time needed for tissue repair, water absorption
capacity and the needed of low toxicity. We have previously prepared a scaffold by
cross-linking fumarate copolymer and chitosan and we have demonstrated that this
scaffold allowed growth and differentiation of osteoprogenitor cells. In this work we
evaluated the degradation rate, swelling properties and the possible inflammatory
response of this cross-linked biomaterial. Our results suggested that cross-linked
fumarate/chitosan based scaffold would be useful in the regeneration of
osteochondral tissue engineering since it is able to incorporate water, degrades
slowly with time and presented low cytotoxicity.
Key-words: tissue engineering, fumarate copolymer, chitosan, cartilage, bone.
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