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UE9 Agents infectieux Pr Hedi MAMMERI Le 24/01/218 de 14h30 à 15h30 Ronéotypeur : BOUGHZALA Ryan Ronéoficheur : PERNOUD Hélène

COURS 4 : STRUCTURE, CLASSIFICATION ET GENETIQUE DES BACTERIES

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I) Strucure d’une bactérie II) Classification des bactéries III) Génome bactérien et mécanisme de variabilité génétique

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I/ STRUCTURE D’UNE BACTERIE

1) Définition

- Une bactérie est une cellule procaryote : son ADN n’est pas enveloppé et elle ne contient qu’un seul chromosome (libre, soluble dans le cytoplasme) PAROI :

- La bactérie est également caractérisée par sa paroi qui se situe au-dessus de la membrane cytoplasmique. C’est une structure rigide qui va solidifier l’enveloppe de la bactérie. - Cette paroi est constituée d’un enchevêtrement de structures glucidiques et peptidiques = peptidoglycane. Ce dernier est assemblé par des enzymes comme la transpeptidase, carboxypeptidase, transglycosylase. C’est enzymes sont aussi connues sous le nom de PLP (protéines liant les pénicillines) et sont des cibles d’antibiotiques (βlactamines) - La synthèse de la paroi commence dans le cytoplasme, se continue dans la membrane plasmique et se termine au niveau périplasmique

GRAM + GRAM -

SHEM

A

STR

UC

UTR

E

Peptidoglycane EPAIS Membrane cytoplasmique

Membrane externe (constituée de phospholipides

et lipopolysaccharides) Peptidoglycane MINCE Membrane plasmique

CA

RA

CTE

RIS

TIQ

UES

- Les lipopolysaccharides sont des molécules à l’extérieur de la bactérie qui contiennent une molécule appelée le Lipide A (qui est une endotoxine) et une structure antigénique : l’antigène O qui sert dans certains cas au sérotypage de la bactérie - Les Bactéries GRAM- contiennent des protéines qui forment des canaux, les porines qui permettent le passage de certains antibiotiques dans la bactérie, mais aussi le passage de certains nutriments

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2) Coloration GRAM

1) On commence par colorer les bactéries avec du violet de gentiane qui pénètre à l’intérieur et colore le cytoplasme et ses constituants en bleu a ce stade toutes les bactéries sont colorées en bleu/violet 2) On décolore ensuite les bactéries dont la parodie est mince avec de l’alcool GRAM - pénètre à l’intérieur de la bactérie et décolore le violet de gentiane GRAM + le peptidoglycane forme une barrière et empêche l’alcool de pénétrer.

La bactérie reste bleue 3) Etape de contre-coloration : on utilise de la Fushine qui est un colorant rouge pénètre à l’intérieur des cellules devenues transparentes au cours de l’étape précédente (GRAM -) et les colore en rouge. Pour les GRAM+ le bleu l’emporte sur le rouge, elles restent donc bleues

3) Structures pariétales

particulières

- Les Mycoplasmes (ex : Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum) ne possèdent pas de peptidoglycane ils ne sont donc pas colorés par la coloration de Gram et naturellement résistants aux βlactamines - Les Mycobactéries (ex : Mycobacterium tuberculosis) possèdent une structure de paroi très particulière, caractérisée par trois couches : le peptidoglycane, l'arabinogalactane et les acides mycoliques. La couche d’acides mycolique forme une sorte de cire hydrophobe au-dessus de la bactérie qui empêche la coloration de GRAM. Cette couche permet une résistance à l’alcool et aux acides. On met a profit cette résistance pour la coloration de Ziehl Neelsen.

COLORATION DE ZIEHL NEELSEN 1) On colore les bactéries avec de la Fushine à chaud toutes les bactéries deviennent rouges 2) Décoloration grâce à une solution d’alcool et d’acide Les mycobactéries vont être résistance à l’action de cette solution donc elles ne seront pas décolorées (elles restent rouges). A l’inverse les bactéries standards vont être sensible à l’action de l’alcool, la Fushine va disparaitre et les bactéries vont devenir transparentes 3) Etape de contre-coloration : on utilise du bleu de méthylène les bactéries qui étaient devenues transparentes à l’étape précédente se colorent en bleu et les mycobactéries restent rouge

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4) Structures inconstantes (Pas toujours

exprimées chez toutes les bactéries)

La capsule

- Enveloppe qui peut entourer la paroi de certaines bactéries, généralement de nature polysaccharidique. - Elle forme une grosse enveloppe qui a un rôle protecteur contre la phagocytose. - La capsule est antigénique (antigène K) elle est utilisée pour synthétisée les vaccins. Ces morceaux de capsule (antigènes) sont aussi utilisés pour le diagnostic des infections : lorsque la bactérie infecte le patient il va par la suite y avoir une lyse de bactérie. Elle libère sa capsule qui se retrouve ensuite dans le sang et dans les urines. Ces morceaux de capsule sont détectables dans le sang, c’est ce qu’on appelle la recherche d’antigénurie et cequi permet le diagnostic de certaines infections (comme les infections à pneumocoque ou recherche de Legionella Pneumophila = pneumopathie)

Cils ou flagelles

- Ce sont des structures protéiques. - Elles constituent les organes de locomotion : permettent aux bactéries de se déplacer dans l’organisme - Selon la disposition des flagelles on distingue 3 types de bactéries : Monotriches (un seul flagelle polaire), Lophotriches (une touffe de flagelles à une extrémité de la

bactérie) Péritriches (flagelles répartis sur toute la surface de la bactérie).

- Les flagelles = Antigène H (sert au sérotypage de certaines bactéries (ex : les salmonelles), souvent en combinaison avec le sérotypage de l’Ag O)

Les pili ou fimbriae

De nombreuses bactéries à Gram négatif possèdent des courts appendices de surface = pili (de pilus = poil), ou fimbriae (frange). On en distingue deux catégories :

Les pili communs Les pili sexuels - Disposés régulièrement à la surface de la bactérie. - Ils sont constitués par la polymérisation d'une même sous-unité polypeptidique, la piline, associés à des polypeptides mineurs dont l'adhésine.

- Plus longs mais en nombre plus restreint (1 à 4) que les pilis communs. - Ils ne sont pas codés par les chromosomes mais par les plasmides

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- L'adhésine peut interagir avec un récepteur à la surface des cellules eucaryotes et permet donc la fixation de la bactérie sur les cellules eucaryotes l’adhésine a un rôle dans le pouvoir pathogène des bactéries

- Ils jouent un rôle essentiel la conjugaison : permet le passage d’ADN extra chromosomique (plasmide) de la cellule donatrice à la cellule réceptrice

Les spores

- Dans des conditions hostiles de croissance, une spore se forme à l'intérieur de la bactérie : c’est un système de résistance bactérienne. - La spore est une cellule bactérienne au repos : apparition de la spore dans le cytoplasme de la bactérie, qui elle meurt. Replacée dans des conditions favorables, la spore germe et redonne une bactérie identique à celle qui lui a donné naissance.

II/ CLASSIFICATION DES BACTERIES - La classification des êtres vivants peut être hiérarchisée : Règne : Bacteria Embranchement (phylum) : Firmicutes Classe : Bacilli Ordre : Bacillales Famille : Staphylococcaceae - On désigne les bactéries par leur genre et espèce. - A l’intérieur d’une même espèce, il est possible de distinguer des souches et des clones. Souche = sous division d’une espèce Clone = population descendant d’une même souche

Genre : Staphylococcus Espèce : Aureus

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Différentes classifications des bactéries :

Phylogénétique En fonction de la coloration GRAM

En fonction du type respiratoire

- 12 groupes de bactéries d’après l’analyse de leur ARN ribosomal 16S et 23S : Firmicutes, Chlamydiae, Chlorobiaceae, Actinobacteria, Planctomycetes, Spirochaetes, Fusobacteria, Cyanobacteria, Thermophilic, Acidobacteria, Proteobacteria. - En comparant cet ARN on peu tracer un arbre phylogénétique qui permet de voir le lien de parenté ce certaines espèces entre elles - Cette classification n’est pas forcément bien adapté à la pathologie

- Ces différences de coloration et les différences de forme (bacille ou cocci) sont à l’origine de la classification des bactéries dans le domaine médical : principale classification en bactériologie clinique - Cette classification a un intérêt dans le traitement probabiliste : c’est le traitement que l’on donne au patient sans connaitre l’identité de la bactérie et sans connaitre son antibiogramme. L’antibiothérapie probabiliste, c’est le pari que l’on fait pour traiter au mieux le patient lorsque l’on commence à connaitre quelques éléments utiles comme la coloration de GRAM

- Les bactéries aérobies strictes ne se développent qu’en présence d’oxygène (ex : Pseudomonas aeruginosa). Elles ne peuvent pas vivre sans oxygène - Les bactéries microaérophiles se développent mieux ou exclusivement lorsque la pression partielle en oxygène est inférieure à celle de l’air (ex : Campylobacter jejuni). - Les bactéries anaérobies strictes ne se développent qu’en l’absence totale d’oxygène, l’énergie est produite par voie fermentative (ex : Bacteroides fragilis). Ces bactéries ne supportent pas l’oxygène car ne peuvent pas détoxifier les radicaux libres oxygénés. - Les bactéries anaérobies aéro-tolérantes : Ces bactéries produisent leur énergie par voie fermentative, exclusivement. Cependant, ils possèdent les enzymes permettant de détoxifier les radicaux libres oxygénés (ex : les streptocoques et les entérocoques) supportent la présence d’O - Les bactéries aéro-anaérobies facultatives L’énergie provient de la chaîne respiratoire et de la voie fermentative (ex : entérobactéries et staphylocoques).

En fonction de la température optimale de croissance

En fonction de leur source de Carbonne

En fonction de leur exigence nutritionnelle

- Bactéries mésophiles : température maximale de croissance proche de celle du corps humain (37°C) (ex : Escherichia coli). - Bactéries thermophiles : température optimale de croissance comprise entre 45°C et 70°C (ex : Thermus aquaticus) - Bactéries psychrophiles : température optimale de croissance comprise entre 10°C et 15°C. - Bactéries psychrotropes : bactéries dont la température optimale de croissance est proche de celles des bactéries mésophiles, mais qui peuvent se développer aussi à basse température.

- Les bactéries autotrophes peuvent synthétiser par photosynthèse des molécules organiques à partir du CO2 atmosphérique - Les bactéries hétérotrophes dégradent les substances hydrocarbonées (comme les sucres, les acides etc..) pour en tirer leur source de carbone et leur énergie.

- Les bactéries prototrophes = bactéries non exigeantes. Sont capables de proliférer dans un milieu de base milieu non enrichis (ex : Escherichia coli) - Les bactéries auxotrophes = bactéries exigeantes qui nécessitent des milieux de culture enrichis de facteurs de croissance (ex : Haemophilus influenzae)

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III/ GENOME BACTERIEN ET MECANISME DE VARIABILITE GENETIQUE

1) Définitions

- Génome bactérien : le génome de la bactérie comporte la molécule d’ADN chromosomique (permanant) non enveloppée, soluble dans le cytoplasme ainsi que les plasmides (transitoires) qui sont des éléments génétiques mobiles (somme des gènes bactériens) - Les plasmides correspondent au matériel génétique extra chromosomique. Ils sont indispensables à la bactérie lorsqu’elle est au contact d’antibiotiques, ils apportent des mécanismes de résistance. A l’inverse quand la bactérie n’est pas au contact d’antibiotiques, elle se débarrasse de ses plasmides - Génotype : Toutes les informations codées par le génome bactérien - Phénotype : La somme des caractères observés provenant de l’expression du génotype.

2) Les mutations

( permettent le transfert

vertical d’un nouveau

caractère)

- Définition: C’est un changement qui affecte la séquence nucléotidique soit au niveau du chromosome soit au niveau du plasmide - Stabilité : Transmission à la descendance - Une mutation dans un gène toutes les 10^7 à 10^9 divisions cellulaires. Elles sont dues à des erreurs commises par l’ADN polymérase lors de la réplication. Les mutations sont rares, spontanées, imprévisibles. Les nouveaux gènes résultant d’une mutation sont appelés allèles.

LES MUTATIONS A L’ECHELLE MOLECULAIRE - Mutations par substitution, addition ou délétion de bases nucléotidiques : Substitution: ex : A G Addition: ATCG ATGCG

(modification du cadre de lecture) Délétion: ATGCG--> ATCG

(modification du cadre de lecture) - Les mutations peuvent être : Silencieuses Létales (protéine tronquée) Intermédiaires (se traduit par un

changement d’acide aminé)

3) Le transfert

d’information génétique (transfert

horizontal) :

transformation conjugaison transposition

LA TRANSFORMATION

C’est un transfert passif d’ADN nu dans une cellule bactérienne. L’ADN qui est introduit dans la bactérie provient d’une cellule morte. Il est libéré sous forme bicaténaire dans le milieu extérieur. 1ère étape : Fixation covalente de l’ADN à un complexe protéique membranaire : le "Transformasome" 2ème étape : Fragmentation de l'ADN (nucléases), destruction d’un brin d’ADN. 3ème étape : Entrée de l'ADN simple brin dans la bactérie 4ème étape : Devenir de l'ADN simple brin transformant dans la bactérie.

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Devenir de l’information génétique échangée par transformation naturelle : - Pour que le processus de transformation soit durable il faut qu’il y ait une recombinaison homologue entre les brins d’ADN introduit et le génome de la souche réceptrice (nécessité de larges homologies entre l'ADN exogène et endogène). Une fois que le brin d’ADN se trouve dans le cytoplasme, il va reconnaitre une séquence qui est homologue à sa propre séquence et va par homologie remplacer la séquence d’ADN sauvage (ADN naturel) qui se trouve sur le chromosome de la bactérie. - En général l’ADN provient de la même espèce bactérienne ou d’une espèce bactérienne très proche. - L’exemple type que l’on peut évoquer pour la transformation est celui du pneumocoque (Streptococcus Pneumoniae). C’est une bactérie qui est très sensible aux pénicillines. 30 à 40% ont des résistances acquises aux pénicillines et aux βlactamines grâce au phénomène de transformation le pneumocoque reçoit notamment de l’ADN du Streptococcus Mitis mort - Cela créer un nouveau gène que l’on appelle gène mosaïque qui est en partie constitué du fragment d’ADN initial sauvage et du fragment d’ADN provenant de la cellule morte. Ce nouveau gène va coder pour une nouvelle protéine : quand il s’agit des PLP, on obtient des PLP hybrides qui ont pour caractéristique de moins bien lier les pénicillines. La bactérie sera donc moins sensible à l’action des antibiotiques (mécanisme de résistance)

LA CONJUGAISON (La sexualité des bactéries)

Définition : Processus qui implique un transfert unidirectionnel d’ADN (plasmide) d’une cellule donatrice à une cellule réceptrice, par un mécanisme requérant un contact spécifique : formation d’un pont cytoplasmique. Les plasmides sont des moléculaire bicaténaire circulaire capable d’autoréplication dans la cellule. - Leur caractère conjugatif ou mobilisables : Certains plasmides sont conjugatifs ils possèdent des gènes TRA permettant la

formation du pili sexuel et le transfert réplicatif. Plasmides mobilisables : Ils empruntent le pili synthétisé grâce à un autre

plasmide qui réside dans la même cellule.

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- Plusieurs étapes : Synthèse du pili sexuel par la cellule

donatrice Fixation du pili sur une cellule réceptrice

(sur des sites spécifiques) Raccourcissement du pili Transfert réplicatif du brin d’ADN de la

cellule donatrice vers la cellule réceptrice. Puis un nouveau brin d’Adn est resynthétisé dans la cellule donatrice : c’est un phénomène qui permet de conserver le plasmide

Le brin monocaténaire qui se retrouve dans la cellule réceptrice va servir de matrice à la synthèse d’un nouveau brin d’ADN

phénomène qui permet l’extension, la dissémination d’un plasmide (et non pas un simple transfert) qui va être conservé par les cellules donatrices et acquis par les cellules réceptrices

LA TRANSPOSITION - C’est un mécanisme permettant la mobilisation de fragments d’ADN entre deux supports génétiques différents (ex : entre un plasmide et un chromosome) caractérisé par des structures génétiques particulières : les transposons. - Les transposons sont classés en fonction de leur capacité à s’autorépliquer et à se transférer par conjugaison. On distingue 3 grandes familles de transposons : Les transposons composites (les plus fréquents) Les transposons de type Tn3 Les transposons conjugatifs (transposons possédant des gènes TRA)

- Le mécanisme d’action des transposons composites repose sur une structure de base : la séquence d’insertion (IS) qui code pour une enzyme que l’on appelle Transposase. Cette enzyme va permettre le déplacement de la séquence d’insertion sur un nouvel élément génétique - Comment ces IS peuvent permettre le déplacement de gènes de résistance ? On a un fragment d’ADN sur un chromosome, une IS (ici à droite) qui se fixe sur le chromosome et une seconde IS qui se fixe sur le chromosome (à gauche du fragment d’ADN d’intérêt) on obtient alors un transposon composite qui va pouvoir se détacher grâce à l’action de transposases et permet mobiliser le fragment d’ADN se trouvant entre les deux copies d’IS. Si ce fragment d’ADN contient des gènes de résistance, le transposon composite va pouvoir les transférer sur un nouveau support d’ADN (transfert d’un plasmide sur le chromosome)

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4) Système de capture des gènes : les intégrons

- C’est un mécanisme permettant la mobilisation de gènes dans des structures génétiques particulières : les intégrons - Il existe plusieurs classes d’intégrons. Les plus répandus sont les intégrons de classe 1. Ils se caractérisent par le gène int1 qui code pour une intégrase. Cette enzyme catalyse l’intégration des gènes cassettes circulaires, mobiles (solubles dans le cytoplasme de la bactérie) dans l’intégron au niveau du site de recombinaison attI. cela forme une structure qui contient plusieurs gènes de résistances au sein d’une même structure génétique

5) La transduction

et la conversion lysogénique

- Définition : Transfert d'ADN bactérien d'une bactérie à une autre par l'intermédiaire d'un bactériophage ( ce sont des virus qui vont infecter les bactéries) - Processus essentiellement intra spécifique (échange d'ADN entre des bactéries d'une même espèce) Plusieurs types de transductions : La conversion lysogénique : le bactériophage va infecter la bactérie et va

transmettre son matériel génétique dans la bactérie, et quelque fois ce matériel va s’intégrer dans le chromosome de la bactérie sans la tuer. Ce gène peut apporter un facteur de virulence à la bactérie (exemple de la diphtérie)

La transduction généralisée : le bactériophage infecte la bactérie bactérie meurt Fragmentation du génome bactérien au cours de la réplication virale

(nucléases virales ou non spécifiques). Les particules encapsident de l'ADN bactérien. Formation de particules transductrices infectieuses capables d'injecter l'ADN

bactérien dans une autre cellule. Devenir de l'ADN transduit : remplacement allélique

Transduction abortive : Les gènes transférés ne sont pas intégrés dans le

chromosome perte de l ’information génétique au cours des divisions cellulaires

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