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11/20/2017
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Prof.(a) Juliana Moraes
Crescimento/Multiplicação
SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL
Instituto Federal de Alagoas - Campus Piranhas
ENGENHARIA AGRONÔMICA
Piranhas
2017
Fatores influenciadores
Fatores
Físicos
Temperatura pH
Químicos
Nutrientes
Crescimento microbiano
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FATORES FÍSICOS
Crescimento microbiano
TEMPERATURA
Faixa de temperatura de Crescimento (máxima e mínima)
Temperatura ótima de crescimento
Classificação:
Psicrófilos
crescem em baixas temperaturas crescem a 0 °C
temperatura ótima 15 °C
Psicrotróficos –
crescem em baixas temperaturas crescem a 0 °C
temperatura ótima 20 a 30 °C
Mesófilos
crescem em temperaturas moderadas
Maioria dos microrganismos deteriorantes e patógenos
Temperatura ótima entre 25 e 40 °C Crescimento microbiano
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Crescimento microbiano
Termófilos
crescem em altas temperaturas
Temperatura ótima entre 50 e 60 °C
Hipertermófilos ou termófilos extremos
crescem em temperaturas muito altas
Temperatura ótima de 80°C ou mais
Crescimento microbiano
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Crescimento microbiano
pH
Bactérias = A maioria crescem em pH perto da neutralidade 6,5 e 7,5.
Poucas bactérias crescem abaixo de pH 4,0
Bactérias acidófilas – resistentes a pH ácidos.
Fungos = maioria crescem em pH mais baixos do que os requeridos pelas
bactérias, geralmente entre 5,0 e 6,0.
Formação de ácido = metabolismo microbiano
Meios de cultivos adicionados de tampões (peptona e aminoácidos) par
controlar a acidez do meio e evitar inibição dos microrganismos.
Crescimento microbiano
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Pressão osmótica
Obtenção de nutrientes a partir da água
Composição da célula: 80 a 90% de água
Pressão osmótica (entrada e saída de solvente da célula)
Ambiente hipertônicos
plasmólise celular: perda de água do meio intracelular e separação da membrana plasmática (MB) e parede celular (PC)
Ambiente hipotônicos
Lise celular: entrada de água do meio extra para o intracelular podendo gerar ruptura da membrana em celular com paredes celulares mais frágeis.
Separação MB e PC – impedem o crescimento (multiplicação) microbiana.
Conservação de alimentos (adição de solutos/sais)
Halófilos extremos – adaptados as altas concentração de sais para o crescimento
Halófilos obrigatórios: requerem altas concentrações de sais (alguns até 15% a 30%)
Halófilos facultativos: suportam concentrações de até 2%
Crescimento microbiano
Crescimento microbiano
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FATORES QUÍMICOS
Crescimento microbiano
Crescimento microbiano
Nutrientes
Nitrogênio
Enxofre
Fósforo Carbono
Elementos traços
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Oxigênio
Crescimento microbiano
Classificação de acordo com o crescimento na concentração de oxigênio do meio:
AERÓBIOS
Fazem uso do oxigênio para a produção de energia / Alto rendimento
energético
AERÓBIOS ESTRITOS OU OBRIGATÓRIO: somente sobrevivem em ambientes
contendo oxigênio
ANAERÓBIOS
Produção de energia na ausência de oxigênio / Baixo rendimento energético
ANAERÓBIO FACULTATIVO: somente sobrevivem tanto em ambientes
contendo oxigênio como em ambientes que possuem oxigênio (vantagem
evolutiva)
ANAERÓBIOS ESTRITOS OU OBRIGATÓRIOS: somente sobrevivem em
ambiente ausentes de oxigênio.
Crescimento microbiano
ANAERÓBIO AEROTOLERANTES
São anaeróbios, porém conseguem crescem na presença de
oxigênio.
MICROAERÓFILOS
Crescem em concentrações de oxigênio menores que a
concentração normal do ar atmosférico (17%).
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Crescimento microbiano
Crescimento microbiano
O crescimento na presença de oxigênio produz formas
moleculares do oxigênio toxicas.
• Forma molecular de oxigênio que energizada e por isso tornou-se altamente reativa.
Oxigênio Singlet
• Superóxido-dismutase (SOD)
• Neutralização dos radicais
Radicais superóxidos
• Catalase
• Neutralização dos peróxidos
Peróxido de hidrogênio
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BIOFILMES
Crescimento microbiano
Biofilme
Crescimento microbiano
Forma de vida de células microbianas:
Planctônicas: vida livre
Sésseis: vida em comunidade
Células cobertas por uma camada extracelular de polissacarídeos (Matriz)
A matriz é compostas por água, proteínas, carboidratos e acido nucléicos.
Comunicação entre as células da comunidade - quorum sensing
(comunidade biológica funcional organizada).
Adesão em superfícies bióticas e abióticas
Célula planctônica
Adesão (reversível)
Biofilme Biofilme maduro
(irreversível)
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Biofilmes
Crescimento microbiano
Benefícios
Tratamento de resíduos
Sistema digestório de ruminantes
Malefícios
Risco de saúde pública
Danos de tubulações industriais
A vida em comunidade oferece aos microrganismos que compõem o biofilme 1.000 x
mais resistência a antibióticos e agentes sanitizantes.
Crescimento microbiano
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Crescimento microbiano
Crescimento microbiano
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Crescimento microbiano
Fatores orgânicos de crescimento
Crescimento microbiano
Os compostos orgânicos essenciais que um organismo é incapaz de sintetizar são conhecidos como fatores orgânicos de crescimento.
Eles devem ser obtidos diretamente do ambiente.
Muitas bactérias podem sintetizar suas próprias vitaminas e não dependem de fontes externas.
Contudo, algumas bactérias não possuem as enzimas necessárias para a síntese de certas vitaminas que são para elas fatores orgânicos de crescimento.
Outros desses fatores requeridos por certas bactérias são aminoácidos, purinas e pirimidinas.
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MEIO DE CULTURA
Crescimento microbiano
Conceitos
Crescimento microbiano
Meio de cultura ou meio de cultivo: mistura de nutrientes orgânicos e
inorgânicos utilizados para observar o crescimento microbiano em
laboratório.
Inóculo: quantidade de microrganismos adicionados no meio de cultivo
para o crescimento
Cultura: microrganismos que crescem em um meio de cultivo após a
manutenção em condições ambientais adequada.
Usados para identificar, identificar e enumerar microrganismos de interesse
Estéril: livre de microrganismos
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Classificação – forma
Crescimento microbiano
MEIOS DE CULTURA SÓLIDOS
Contém agente solidificante: ágar
Ágar: é um polissacarídeo complexo derivado de uma alga marinha,
Características:
Poucos micro-organismos podem degradar o ágar, o que permite que
ele permaneça solido.
Se liquefaz a cerca de 100°C (o ponto de ebulição da agua) e ao
nível do mar ele permanece liquido ate a temperatura diminuir até
cerca de 40°C.
MEIOS DE CULTURA LÍQUIDOS
Não possui agente solidificante: ágar
Para utilização no laboratório, o ágar mantido em banho-maria a 50°C. Nessa
temperatura, ele não destrói a maioria das bactérias quando adicionado sobre elas.
Crescimento microbiano
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Classificação – composição
Crescimento microbiano
MEIOS DE CULTURA COMPLEXOS
aquele cuja composição exata e conhecida. Para um quimio-heterotrofico, o meio
quimicamente definido deve conter fatores de crescimento orgânicos que servem
como fonte de carbono e energia.
MEIOS DE CULTURA QUIMICAMENTE DEFINIDOS
feitos de nutrientes como extratos de leveduras, de carnes ou de plantas, ou
produtos de digestão destas ou de outras fontes. A composição química exata varia
um pouco de acordo com o lote.
Classificação – finalidades
Crescimento microbiano
MEIOS DE CULTURA SELETIVOS
São elaborados para impedir o crescimento de bactérias indesejadas´e
favorecer o crescimento dos micro-organismos de interesse
MEIOS DE CULTURA DIFERENCIAIS
facilitam a diferenciação das colônias de um micro-organismo desejado
em relação a outras colônias crescendo na mesma placa. De maneira
similar, culturas puras de micro-organismos tem reações identificáveis
com meios diferenciais em tubos ou placas.
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Isolamento
OBTENÇÃO DE CULTURA PURA
Crescimento Microbiano
método de esgotamento por estrias
Crescimento microbiano
OBJETIVO: obter colônias isoladas
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Crescimento microbiano
Crescimento microbiano
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Crescimento microbiano
Crescimento microbiano
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Crescimento microbiano
Crescimento microbiano
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Crescimento microbiano
Crescimento microbiano
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Crescimento microbiano
Crescimento microbiano
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PRSERVAÇÃO DE CULTURAS BACTERIANAS
Crescimento microbiano
Crescimento microbiano
Congelamento
- 50 °C a - 95°C
Liofilização (congelamento e sublimação)
– 54 °C a -72 °C
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CRESCIMENTO DE CULTURA BACTERIANAS
Crescimento microbiano
Divisão celular
Crescimento microbiano
Divisão binária
Brotamento***
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Crescimento microbiano
Tempo de Geração
Crescimento microbiano
Tempo necessário para uma célula se dividir, ou mesmo, sua população
duplicar.
O tempo de geração é influenciado:
Tempo
Temperatura
Condições ambientais
Características da própria espécie
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Crescimento microbiano
Representação logarítmica
Crescimento microbiano
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Fases de Crescimento
Crescimento microbiano
Fase LAG ou Fase de adaptação
Período de pouca ou nenhuma divisão
podendo durar de uma hora a vários dias.
Durante esse tempo, contudo, as células não estão dormentes. A
população microbiana passa por um período de intensa atividade
metabólica, envolvendo principalmente a síntese de enzimas e varias
moléculas.
Fase LOG ou fase exponencial de crescimento
as células começam a se dividir e entram em um período de crescimento,
ou aumento logarítmico.
A reprodução celular e mais ativa durante esse período, e o tempo de
geração atinge um valor constante.
Momento de maior atividade metabólica,.
Crescimento microbiano
FASE ESTÁCIONÁRIA
Se a fase de crescimento continua sem controle, ocorre a formação de um
grande numero de células.
Na realidade, isso não ocorre. No final do crescimento, a velocidade de
reprodução se reduz, o numero de mortes microbianas é equivalente ao
numero de células novas, e a população se estabiliza.
A causa da interrupção do crescimento exponencial não e sempre clara. O
esgotamento dos nutrientes, o acumulo de resíduos e mudanças no pH
danosas a célula podem ser os motivos.
FASE DE MORTE OU DECLÍNIO
O numero de mortes finalmente ultrapassa o numero de células novas
formadas.
Essa fase continua ate que a população tenha diminuído para uma
pequena fração da população da fase anterior ou morre totalmente.
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Crescimento microbiano
Medidas de crescimento microbiano
Crescimento microbiano
Quantificação de uma população normalmente é registrada como o
numero de células por mililitro de liquido ou grama de material solido.
Como as populações bacterianas geralmente são muito grandes, a maioria
dos métodos de contagem tem como base enumerações diretas ou indiretas
de amostras pequenas; um calculo determina depois o tamanho total da
população.
Enumeração Indireta Direta
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Crescimento microbiano
Enum
era
ção d
ireta
Contagem em placas
Diluições seriadas
Incorporação em placas a espalhamento em
placas
Filtração
Numero mais provável
(NMP)
Microscópica direta
Contagem em placas
Crescimento microbiano
Vantagem: mede o numero de células viáveis.
Desvantagem: são necessárias 24 horas ou mais para que colônias visíveis sejam formadas.
Unidade Formadora de colônia (UFC)
Quando uma contagem em placas e feita, é importante que somente um numero limitado de colônias se desenvolva na placa.
Quando muitas colônias estão presentes, algumas células são reprimidas e não podem se desenvolver (imprecisão na contagem).
Para evitar imprecisão: contagem de placas com somente 25 a 250 colônias (FDA – recomendação)
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Diluições seriadas
Crescimento microbiano
Plaqueamento
Crescimento microbiano
Métodos de incorporação em
placa
Sinônimos:
Plaqueamento por profundidade
Plaqueamento “pour plate”
Método de espalhamento em
placa
Sinônimos:
Plaqueamento em superfície
Plaqueamento “Spread-plate”
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Filtração
Crescimento microbiano
Aplicado quando o numero de bactérias são muito pequenos (lagos e
correntes de água).
Crescimento microbiano
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Numero mais provável (NMP)
Crescimento microbiano
Principio estatístico:
quanto maior o numero de bactérias em uma amostra, maior será o numero de
diluições necessárias para reduzir a densidade ate um ponto no qual mais nenhuma
bactéria esteja presente nos tubos de diluição seriada.
O MNP fornece somente uma estimativa de 95% de probabilidade de a
população bacteriana estar em uma faixa determinada e que o MNP
obtido e estatisticamente o numero mais provável.
Crescimento microbiano
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Crescimento microbiano
Contagem microscópica direta
Crescimento microbiano
Técnica: Um volume conhecido de uma suspensão bacteriana e colocado em uma área definida da lâmina microscópica.
Uma lamina especialmente desenvolvida chamada de contador de células Petroff-Hausser
0,01 mL (10 µL) é adicionado na lâmina
Adição de corante
Observação em microscópio (lente objetiva de 100x)
Contagem de diferentes regiões da lâmina,
Calcular média de bactérias por campo observado
Calculo do número de bactérias no centímetro quadrado
MÉDIA DE BACT./ CAMPO x 100 (correção do inoculo 0,01 mL)
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Crescimento microbiano
Crescimento microbiano
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Crescimento microbiano
Enum
era
ção Ind
ireto
Turbidimetria
Atividade metabólica
Peso Seco
Turbidimetria
Crescimento microbiano
Uma maneira de monitorar o crescimento bacteriano. A medida que as
bactérias se multiplicam em um meio liquido, o meio se torna turvo ou
opaco com as células.
O instrumento utilizado para medir a turbidez é um espectrofotômetro (ou
calorímetro). No espectrofotômetro, um feixe de luz passa através de uma
suspensão de bactérias ate um detector fotossensível.
Com o aumento do numero de bactérias, menos luz atingira o detector. Essa
alteração da luz será registrada na escala do instrumento como
porcentagem de transmissão. Também será registrada a expressão
logarítmica chamada de absorbância (algumas vezes denominada
densidade ótica, ou DO)
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Crescimento microbiano
Atividade metabólica
Crescimento microbiano
Esse método assume que a quantidade de um produto
metabólico determinado, como um acido ou CO2, e
diretamente proporcional ao numero de bactérias presentes.
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Peso Seco
Crescimento microbiano
Uma das melhores maneiras de medir o crescimento de
organismos filamentosos e pelo peso seco.
Procedimento:
1. Remoção do meio de crescimento
2. Filtragem (remoção de outros materiais)
3. Dissecação
4. Pesagem
Obrigada pela atenção!
Juliana Moraes
Crescimento microbiano