CRISPR/Cas9: passo-a-passo do desenho do gRNA

Irene Yan

ireneyan@usp.brwww.crispricbusp.wordpress.com

LABORATÓRIO DE EMBRIOLOGIA MOLECULAR DE VERTEBRADOSDept Biologia Celular e do Desenvolvimeneto ICB USP

Afinal, o que é CRISPR?Para ler papers

Quero usar mas não faço BiomolReagentes prêt-à-porter

Vou desenhar meus próprios gRNAs!Benchling

1.O que é o sistema CRISPR e como ele funciona

2.Variações da enzima Cas9 e suas aplicações

3.Os elementos necessários para experimento CRISPR/Cas9• Deleção • Recombinação

4.Desenho experimental

Genscript

CRISPR significa “Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats” e originalmente foi identificado como parte do sistema de defesa bacteriano

https://sciencebasedmedicine.org/the-promise-of-crispr/

É um sistema simples que permite a identificação e edição de alvos genômicos através de um gRNA (guide RNA)

Non-homologous End Joining Homology Directed Repair

https://www.ucl.ac.uk/cancer/research/scientific-facilities-and-services/cancer-genomics-engineering-facility/crispr

O SISTEMA CRISPR/Cas9 NECESSITA DE:

•Nuclease Cas9•crRNAde 20nt- complementar ao sítio a ser clivado e determinado pelo usuário•trcRNA- RNA estrutural que encaixa o crRNA na nuclease

Tamanho do genoma humano: 3.0 ×109 bpProbabilidade de uma sequência de 20bp: 1 em 1012

gRNA

gRNA

Existem outras nucleases que podem alterar o genoma em alvos-específicos, mas CRISPR é o mais popular.

siRNA ou CRISPR? Depende do seu objetivo

Boettcher, M. and McManus, M. T. (2015). Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol. Cell 58, 575–585.

Front. Genet., 24 September 2015 | https://doi.org/10.3389/fgene.2015.00300

Targets different splice forms Transfection is easier

siRNA ou CRISPR? Depende do seu objetivo

Doesn t́Transfection is harder

1.O que é o sistema CRISPR e como ele funciona

2.Variações da enzima Cas9 e suas aplicações

3.Os elementos necessários para experimento CRISPR/Cas9

As diversas aplicações do sistema Cas9/CRISPR são variações da utilização da capacidade “achar”.

As diversas aplicações do sistema Cas9/CRISPR são variações da utilização da capacidade “achar”.

Indel

Inserção ou substituição

Deleção ou rearranjo

Ativação gênica

Modificação Epigenômica

Microscopia

Nat Biotechnol. 2014 April ; 32(4): 347–355

As diversas aplicações que surgem do Cas9 e seus variantes:

SCIENCE

SCIENCE

1.O que é o sistema CRISPR e como ele funciona

2.Variações da enzima Cas9 e suas aplicações

3.Os elementos necessários para experimento CRISPR/Cas9• Deleção • Recombinação

4.Desenho experimental

https://sciencebasedmedicine.org/the-promise-of-crispr/

É um sistema simples que permite a identificação e edição de alvos genômicos através de um gRNA (guide RNA)

Development 2018 145: dev160333

Cada evento de edição gera produtos distintos que variam de deleções a substutições.

https://www.ucl.ac.uk/cancer/research/scientific-facilities-and-services/cancer-genomics-engineering-facility/crispr

O SISTEMA CRISPR/Cas9 NECESSITA DE:

•Nuclease Cas9•crRNAde 20nt- complementar ao sítio a ser clivado e determinado pelo usuário•trcRNA- RNA estrutural que encaixa o crRNA na nuclease

Tamanho do genoma humano: 3.0 ×109 bpProbabilidade de uma sequência de 20bp: 1 em 1012

gRNA

gRNA

https://www.ucl.ac.uk/cancer/research/scientific-facilities-and-services/cancer-genomics-engineering-facility/crispr

Condições para elaboração do crRNA de 20nt:

1. Estar próximo de um sítio PAM (Protospacer Adjacent Motif): NGG2. Ter um baixa probabilidade de reconhecimento off-target*

Tamanho do genoma humano: 3.0 ×109 bpProbabilidade de uma sequência de 20bp: 1 em 1012

CONHECENDO SEU PLASMÍDEO

Produz:1mRNA que codifica: Cas9-(peptídeo 2A)-GFP1gRNA

GFP

Produz:1) gRNA2) Cas9-(peptídeo 2A)-GFP

E este? Tem tudo?

PROBLEMA :Não há sequência PAM perto da região que quero editar.

E, caso não haja um PAM tradicional, existem variantes de Cas9 que usam PAM alternativos

www.addgene.org

1.O que é o sistema CRISPR e como ele funciona

2.Variações da enzima Cas9 e suas aplicações

3.Os elementos necessários para experimento CRISPR/Cas9• Deleção • Recombinação

4.Desenho experimental

https://sciencebasedmedicine.org/the-promise-of-crispr/

Recombinação homólogaPode ser usada para:• Adicionar epítopos (FLAG, HA)• Mutação pontual

Para adição de dominios/proteínas ao genoma, a RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA deve ocorrer depois da ação de Cas9

Ineficiente1%-10%(maior na fase S)

Eficiente >50%

O HDR pode ser usado para mutações pontuais ou fusão de epítopos

Precisa do:

gRNA

Inserto* (e.g. troca de bases, FLAG, GFP)

Braços de homologia

10-100pb do sítio da quebraComprimento de 40-800pb (depende do tamanho do inserto a se incorporado

2. Recombinação

1. Corte

Transfecção

• Cotransfecção de:• Plasmídeo de corte (Cas9 + gRNA)• Plasmídeo de recombinação (braços de

homologia e elemento a ser inserido)

Verificar transfecção

• GFP• RFP

Seleção da recombinação

• Puromicina

• Mais eficaz quando usa 2 gRNA• Edição de tamanho controlado• Mais específico (menos off-targets)• Melhor para recombinações

Schaeffer, S.M., & Nakata, P.A. (2015). Plant science : an

international journal of experimental plant biology, 240, 130-42.

O uso da Cas9 nickase (Cas9 D10A)

Ran, F. A.et al. (2013)Cell 154, 1380–1389.

O uso da Cas9D10A em conjunto com diversas gRNAs aumenta a eficácia e espeficidade da HDR

Cas9 para ativação e inativação de transcrição

Neste caso, o gRNA reconhece a região promotora

1.O que é o sistema CRISPR e como ele funciona

2.Variações da enzima Cas9 e suas aplicações

3.Os elementos necessários para experimento CRISPR/Cas9• Deleção • Recombinação

4.Desenho experimental

• Transfecção e• Seleção

• Clones únicos• Genotipagem

• qPCR para marcadores

www.genecopeia.com

a b

CRISPR com corte duplo/ double nickase

No sítio genômico do Scrt2

Estratégia de remoção de SCRATCH2 do genoma de células-tronco: Edição dupla

QUE REGIÃO PROTEICA EDITAR?Alinhamento de proteínas

A REGIÃO GENÔMICA É EXCLUSIVA?BLAST de exons

Desenho do gRNA

Desenho dos primers para validação

Tatiane Kanno

O plasmídeo pX330-eGFP contém :•FLAG-Cas9/CRISPR, •GFP e •sítio de clonagem do gRNA•Resistência a Puromicina

O desenho dos gRNAs foram feitos pelo crispr.mit.edu

As sugestões de gRNAs são classificadas de acordo com o índice de off-target (fora-de-alvo)

a b

No sítio genômico do Scrt2

Estratégia de remoção de SCRATCH2 do genoma de células-tronco: edição dupla

a

b

http://crispr.mit.edu/

Foram transfectados 2 plasmídeos, cada um contendo um gRNA distinto (a e b)

O plasmídeo pX330-eGFP contém o Cas9/CRISPR, GFP e sítio de clonagem do gRNA

GF

PF

LA

G-C

as9

Thiago M. Sanches

Pool

A deleção de SCRATCH2 (150pb) foi confirmada por PCR genômico

Tatianne Kano

… e qPCR

Tatianne Kano

SCRATCH EXON 2 HOMOLOGY ARM

EXON 2 HOMOLOGY ARM

SCRATCH EXON 2 HOMOLOGY ARM

Sequência genômica

Sequência doadora no pFETCH

Genoma modificado

O Cas9 nesta situação é usado para gerar uma quebra na região em que a recombinação deve ocorrer.

SCRATCH- Neomycin Resistance

Financeiro:

Para um laboratório que já faz Biologia Molecular e transfecção celular: • BbsI: USD 172• gRNA (dois oligos) : R$300• Plasmídeo peX330: USD 65• Midiprep• Enzimas de restrição• Método de delivery (transfecção)

Tempo:

•Clonagem (1-2 semana)• PCR de colônia (primers U6 e gRNA)e Sequenciamento (1 semana)

•Transfecção e seleção de clones (2-3 semanas)•Ampliação das colônias (variável)•Validação (1-2 semanas)

QUAL O CUSTO DO PROCEDIMENTO?

http://www.sbg.org.br/livraria-sbg

www.addgene.org

www.GenScript.com