cromatografia 5 ocimum

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE FARMCIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS

ESTUDO QUMICO E AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE

CH-VERDE BRASILEIRO (Camellia sinensis var. assamica) Cultivar IAC-259

SAMUEL TAKASHI SAITO

Porto Alegre, 2007

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE FARMCIA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS

ESTUDO QUMICO E AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE

CH-VERDE BRASILEIRO (Camellia sinensis var. assamica) Cultivar IAC-259

Dissertao apresentada por Samuel Takashi Saito

para obteno do GRAU DE MESTRE em

Cincias Farmacuticas

Orientadora: Prof. Dra. Ana Maria Bergold Co-orientadora: Prof. Dra. Grace Gosmann

Porto Alegre, 2007

Dissertao apresentada ao Curso de Ps-Graduao em Cincias

Farmacuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e aprovada em

27.04.2007, pela Comisso Examinadora constituda por:

Profa. Dra. Edna Sayuri Suyenaga

Centro Universitrio Feevale

Profa. Dra. Elfrides Eva Scherman Schapoval

Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS

Prof. Dr. Jos ngelo da Silveira Zuanazzi

Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS

S158e Saito, Samuel Takashi Estudo qumico e avaliao da atividade antioxidante de ch-verde

brasileiro (Camellia sinensis var. assamica) cultivar IAC-259/ Samuel Takashi Saito Porto Alegre : UFRGS, 2007. - xxiv, 112p.: il., tab.

Dissertao (mestrado). UFRGS. Faculdade de Farmcia. Programa

de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas. 1.Ch-verde brasileiro. 2. Camellia sinensis. 3. Validao: mtodos

analticos. 4. Cromatografia lquida de alta eficincia. 5. Atividade antioxidante. 6. Catequinas. 7. Cafena. 8. Theaceae. I. Bergold, Ana Maria. II. Gosmann, Grace. III. Ttulo.

CDU: 615.2.011:582.823

Bibliotecria responsvel: Margarida Maria Cordeiro Fonseca Ferreira, CRB 10/480

Os procedimentos experimentais deste trabalho foram realizados:

no LAPPS Laboratrio de Produo de Padres Secundrios, no Laboratrio

de Fitoqumica e no Laboratrio da Central Analtica do Programa de Ps-

Graduao em Cincias Farmacuticas da Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, assim como, no Laboratrio de Biofsica do Centro de

Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e no Laboratrio

do Centro de Pesquisas em Cincias Mdicas ULBRA, aos quais eu

expresso meus sinceros agradecimentos.

Vernica,

minha esposa e minha flor,

sempre minha companheira

para o que der e o que for.

AGRADECIMENTOS

Deus que me deu esta oportunidade e este desafio para conquistar.

s professoras Dra. Ana Maria Bergold e Dra. Grace Gosmann pela orientao,

pelo incentivo, ateno e pelo exemplo de profissionalismo.

Ao LAPPS Laboratrio de Produo de Padres Secundrios, por oferecer

toda infra-estrutura necessria para o desenvolvimento e validao deste

trabalho.

A Central Analtica-FACFAR/UFRGS pela utilizao do liofilizador.

Industria de Ch Ouro-Preto/SP pelo fornecimento das matrias-primas.

Aos professores Dr. Pedro Eduardo Frehlich, Dr. Jarbas Alves Montanha e Dr.

Jos Carlos Germani, pelo convvio e pronto auxlio quando necessrio.

Ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas (PPGCF) da

UFRGS, pela oportunidade.

Aos meus pais, pelo apoio incondicional, sempre.

A minha irm Dirce pelo incentivo nos momentos difceis e tambm nos bons,

pelo abrao e pelas oraes; tambm a minha cunhada Jlia por ter vindo da

Bahia dar aquela fora minha esposa no perodo do mestrado. Com vocs

divido a alegria desta conquista.

Aos professores Dr. Marc Franois Ritcher e Dra. Jenifer Saffi do Programa de

Ps-Graduao em GT-ULBRA pela colaborao.

viii

Aos meus amigos e colegas (atuais e antigos) do LAPPS: Alexandre

Xandeco, Andra, Carolina, Eliane, Inara, Laura, Letcia, Lcia, Lus Liscano,

Marquinhos, Sirlei, Tiaguinho, Rochele e aos colegas do Laboratrio de

Fitoqumica: Juli, Simone e Ana, por tornarem o local de trabalho aprazvel.

Dinara, ao Renato e o restante do pessoal do Laboratrio de Biofsica do

Centro de Biotecnologia da UFRGS pela disponibilizao dos equipamentos

para fazer o ensaio enzimtico.

ix

SUMRIO

LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................... xiii

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................. xvii

LISTA DE TABELAS ............................................................................................. xix

RESUMO................................................................................................................ xxiii

ABSTRACT ...........................................................................................................

xxiv

1 INTRODUO.................................................................................................... 01

2 OBJETIVOS........................................................................................................ 2.1 Objetivo geral................................................................................................... 2.2 Objetivos especficos.......................................................................................

05 07 07

3 REVISO............................................................................................................ 3.1 Descrio da planta.......................................................................................... 3.2 Constituio qumica........................................................................................ 3.3 Atividade antioxidante...................................................................................... 3.4 Atividade quimiopreventiva e antitumoral......................................................... 3.5 Atividade antidiabtica..................................................................................... 3.6 Outras atividades farmacolgicas.................................................................... 3.7 Toxicidade, efeitos adversos e superdosagem................................................ 3.8 Mtodos de extrao e de quantificao de componentes qumicos.............. 3.9 Mtodos de avaliao da atividade antioxidante in vitro..................................

08 10 10 12 13 14 15 16 16 19

4 MATERIAS E MTODOS................................................................................... 4.1 Substncias qumicas, reagentes e equipamentos.......................................... 4.2 Matria vegetal................................................................................................. 4.3 Obteno do extrato liofilizado......................................................................... 4.3.1 Obteno do extrato liofilizado pelo sistema 1.............................................. 4.3.2 Obteno do extrato liofilizado pelo sistema 2.............................................. 4.3.3 Obteno do extrato liofilizado pelo sistema 3.............................................. 4.4 Obteno da amostra atravs da decoco assistida...................................... 4.5 Determinao simultnea das catequinas e cafena em ch-verde brasileiro por cromatografia lquida de alta eficincia............................................................ 4.5.1 Condies do sistema................................................................................... 4.5.1.1 Condies cromatogrficas........................................................................ 4.5.1.2 Fase mvel (FM) e soluo de diluio (SD)............................................. 4.5.1.3 Decoctos de ch-verde.............................................................................. 4.6 Validao da metodologia CLAE-DAD............................................................. 4.6.1 Adequabilidade do sistema cromatogrfico.................................................. 4.6.2 Preparo das curvas-padro........................................................................... 4.6.2.1 Preparo das misturas das substncias qumicas de referncia................. 4.6.3 Preparo das amostras................................................................................... 4.6.4 Exatido........................................................................................................

22 24 25 26 26 27 28 28 29 29 29 29 29 30 30 31 31 32 32

x

4.6.4.1 Preparo das solues amostra e soluo-me das substncias qumicas de referncia.......................................................................................................... 4.6.5 Preciso........................................................................................................ 4.6.6 Especificidade............................................................................................... 4.6.7 Limite de deteco........................................................................................ 4.6.8 Limite de quantificao................................................................................. 4.6.9 Robustez....................................................................................................... 4.7 Atividade antioxidante in vitro........................................................................... 4.7.1 Mtodo fotocolorimtrico do DPPH.............................................................. 4.7.2 Mtodo enzimtico do sistema hipoxantina/xantina oxidase........................ 4.7.2.1 Preparo da soluo reagente em tampo fosfato (pH 6,5)........................ 4.7.2.2 Reao enzimtica..................................................................................... 4.7.2.3 Anlise por CLAE-DAD.............................................................................. 4.7.2.4 Apresentao dos resultados.....................................................................

32 34 34 34 34 35 35 35 39 39 40 40 40

5 RESULTADOS E DISCUSSO.......................................................................... 5.1 Rendimento dos extratos liofilizados................................................................ 5.2 Determinao simultnea das catequinas e cafena nas amostras de ch-verde, por CLAE-DAD............................................................................................ 5.2.1 Desenvolvimento do mtodo......................................................................... 5.2.2 Identificao dos compostos por CLAE-DAD................................................ 5.2.2.1 Espectros UV das substncias qumicas de referncia............................. 5.2.2.2 Anlise do tempo de reteno.................................................................... 5.2.2.3 Adio da substncia de referncia na amostra........................................ 5.2.2.4 Comparao dos espectros UV e ndice de similaridade........................... 5.3 Validao.......................................................................................................... 5.3.1 Adequabilidade do sistema cromatogrfico.................................................. 5.3.2 Linearidade.................................................................................................... 5.3.3 Preciso........................................................................................................ 5.3.4 Exatido........................................................................................................ 5.3.5 Especificidade............................................................................................... 5.3.6 Limite de deteco........................................................................................ 5.3.7 Limite de quantificao................................................................................. 5.3.8 Robustez....................................................................................................... 5.4 Teores de catequinas e cafena encontrados nos chs-verde brasileiro......... 5.5 Teores de catequinas e cafena encontrados nos extratos liofilizados............ 5.5.1 Anlise estatstica entre os sistemas............................................................ 5.6 Atividade antioxidante in vitro........................................................................... 5.6.1 Mtodo fotocolorimtrico do DPPH.............................................................. 5.6.1.1 Correlao das amostras de ch-verde brasileiro com a atividade antioxidante............................................................................................................ 5.6.2 Mtodo enzimtico do sistema xantina oxidase/hipoxantina........................

41 43 44 44 46 47 47 49 50 54 54 56 57 57 59 60 61 61 62 63 68 70 70 75 78

6 CONCLUSES................................................................................................... 86

7 REFERNCIAS................................................................................................... 90

8 ANEXOS ............................................................................................................ 98

xi

ANEXO 1: Tabelas complementares

ANEXO 2: Artigo publicado na Revista Chromatography

LISTA DE ABREVIATURAS

- seletividade

ACN acetonitrila

AcOEt acetato de etila

AG cido glico

ANOVA anlise de varincia

C catequina

CAF - cafena

CE50 concentrao efetiva para se obter 50% do mximo da atividade

estimada em 100%

CG - galato de catequina

CVB-P ch-verde brasileiro colhido na primavera

CVB-V ch-verde brasileiro colhido no vero

DAD detector de arranjo de diodos

DP desvio padro

DPR desvio padro relativo

DPPH radical 1,1-difenil-2-picrilidrazila

EC epicatequina

EACI1A Extrato liofilizado de amostra comercial importada (marca 1) e obtido

pelo sistema 1

EACI2A Extrato liofilizado de amostra comercial importada (marca 2) e obtido

pelo sistema 1

EACN1A Extrato liofilizado de amostra comercial nacional (marca 1) e obtido

pelo sistema 1


pelo sistema 1


pelo sistema 1

ECVB-P1A - Extrato liofilizado de CVB-P1 e obtido pelo sistema 1

ECVB-P1B - Extrato liofilizado de CVB-P1 e obtido pelo sistema 2

ECVB-P1C - Extrato liofilizado de CVB-P1 e obtido pelo sistema 3


xiv






ECVB-V1A - Extrato liofilizado de CVB-V1 e obtido pelo sistema 1

ECVB-V1B - Extrato liofilizado de CVB-V1 e obtido pelo sistema 2

ECVB-V1C - Extrato liofilizado de CVB-V1 e obtido pelo sistema 3


ECVB-V2B - Extrato liofilizado de CVB-V2 e obtido pelo sistema 2

ECVB-V2C - Extrato liofilizado de CVB-V2 e obtido pelo sistema 3


ECVB-V3B - Extrato liofilizado de CVB-V3 e obtido pelo sistema 2;

ECVB-V3C - Extrato liofilizado de CVB-V3 e obtido pelo sistema 3;

ECG galato de epicatequina

EGC galato de galocatequina

EGCG galato de epigalocatequina

e.p.m. erro padro da mdia

ERO espcies reativas ao oxignio

EtOH etanol

GC - galocatequina

GCG galato de galocatequina

k fator de reteno

Me2CO - acetona

MeOH metanol

N eficincia da coluna (nmero de pratos terico)

NI no informado

NPK adubo composto por nitrognio:fsforo:potssio

Rs Resoluo

SD Soluo de Diluio

SIDA sndrome da imunodeficincia adquirida

SNK Student-Newman-Keuls

SQR substncia qumica de referncia

T fator de cauda

xv

TFA cido trifluoractico

TR tempo de reteno

P Polaridade do solvente

p.a. pr anlise

QEAA quantidade equivalente em cido ascrbico

VIH vrus da imunodeficincia humana

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Principais componentes presentes em Camellia sinensis............

11

Figura 2 Estrutura molecular do radical DPPH..........................................

19

Figura 3 Esquema da gerao de espcies reativas ao oxignio (ERO) no sistema hipoxantina/xantina oxidase.........................................................

20

Figura 4 Grfico representando o rendimento mdio com os respectivos e.p.m. (n=13) da extrao do ch-verde brasileiro pelos trs sistemas selecionados..................................................................................................

44

Figura 5 Cromatograma das SQR...............................................................

46

Figura 6 Espectro UV de cada pico referente ao cromatograma da Fig. 5.

48

Figura 7 Cromatograma das SQR sobreposto com ECVB-V1A.................

49

Figura 8 Cromatograma da amostra ECVB-V1A na concentrao de 2002 g/ml sobreposto com a mesma amostra com adio das SQR..........

50

Figura 9 Sobreposio dos espectros de SQR de cafena com quatro espectros da amostra de tempo de reteno prximos da cafena...............

51

Figura 10 Espectro da SQR de epigalocatequina sobreposto com espectro do pico de TR = 6,11 min da amostra.............................................

51

Figura 11 Espectro da SQR de catequina sobreposto com espectro do pico de TR = 7,80 min da amostra.................................................................

51

Figura 12 Sobreposio dos espectros de SQR de epicatequina com espectros com tempo de reteno prximos na amostra..............................

52

Figura 13 Espectro da SQR de galato de epigalocatequina sobreposto com espectro do pico de TR = 14,50 min da amostra...................................

52

Figura 14 Espectro da SQR de galato de galocatequina sobreposto com espectro do pico de TR = 21,37 min da amostra...........................................

53

Figura 15 Espectro da SQR de galato de epicatequina sobreposto com espectro do pico de TR = 32,15 min da amostra...........................................

53

Figura 16 Espectro do radical DPPH em soluo metanlica (169,9 M) com seus mximos: 1 515 nm e 2 323,5 nm............................................

70

Figura 17- Espectro do DPPH (169,9 M) reduzido por EGCG (8,32 g/ml) com seu mximo de absoro em 323 nm.........................................

71

xviii

Figura 18 Correlao entre teor de galato de epicatequina e atividade antioxidante....................................................................................................

76

Figura 19 Correlao entre teor de galato de epigalocatequina e atividade antioxidante.....................................................................................

76

Figura 20 Correlao entre teor de catequinas totais e atividade antioxidante....................................................................................................

77

Figura 21 Correlao entre teor de epigalocatequina e atividade antioxidante....................................................................................................

77

Figura 22 Correlao entre teor de epicatequina e atividade antioxidante.

78

Figura 23 Correlao entre teor de catequina e atividade antioxidante......

78

Figura 24 Cromatograma do controle positivo............................................

80

Figura 25 Cromatograma do controle positivo obtido pelo mtodo proposto por OWEN e colaboradores (2000), a 325 nm................................

80

Figura 26 Cromatograma da amostra tratada com ch-verde sobreposto com controle positivo......................................................................................

80

Figura 27 Cromatograma do branco (amostra no-tratada sem enzima), no comprimento de onda de 325 nm..............................................................

81

Figura 28 Cromatograma do controle positivo pelo mtodo isocrtico.......

81

Figura 29 Cromatograma da amostra tratada com ch-verde em 325 nm sobreposto com a mesma amostra em 280 nm.............................................

82

Figura 30 A: Sobreposio dos cromatogramas das amostras tratadas com EGCG em vrias concentraes; B: sobreposio dos cromatogramas das amostras tratadas com AG em vrias concentraes. Leitura em 325 nm.........................................................................................

82

Figura 31 Cromatograma do controle positivo sobreposto com vrios cromatogramas das amostras tratadas com extrato liofilizado de ch-verde

83

Figura 32 Mecanismo proposto por FURUKAWA e colaboradores (2003) do dano oxidativo induzido por EGCG na presena de metais de transio.

84

Figura 33 Modelo proposto por AZAM e colaboradores (2004) na formao de quinonas mediado por Cu II......................................................

85

xix

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Resumo dos mtodos utilizados para a determinao simultnea de componentes do ch-verde por cromatografia lquida de alta eficincia.....

18

Tabela 2 Especificaes das substncias qumicas utilizadas......................

24

Tabela 3 Datas das colheitas do ch-verde brasileiro e seu respectivos cdigos..............................................................................................................

25

Tabela 4 Cdigo, procedncia e descrio das amostras comerciais...........

26

Tabela 5 Condies experimentais do mtodo isocrtico por CLAE.............

29

Tabela 6 Concentrao final de cada soluo, em g/ml, utilizadas para construo da curva padro com cinco pontos................................................

32

Tabela 7 Concentrao final de cada componente, em g/ml, presente nas solues A, AA1 e AA2......................................................................................

33

Tabela 8 Concentrao final de cada substncia de referncia, em g/ml, utilizadas no estudo da atividade antioxidante in vitro......................................

36

Tabela 9 Concentrao final de cada extrato liofilizado extrado pelo sistema 1, em g/ml, utilizadas no estudo da atividade antioxidante in vitro....

36

Tabela 10 Concentrao final de cada extrato liofilizado obtido pelo sistema 2, em g/ml, utilizados no estudo da atividade antioxidante in vitro....

37

Tabela 11 Concentrao final de cada extrato liofilizado obtido pelo sistema 3, em g/ml, utilizados no estudo da atividade antioxidante in vitro....

37

Tabela 12 Concentrao final de cada extrato liofilizado das amostras comerciais obtido pelo sistema 1, em g/ml, utilizados no estudo da atividade antioxidante in vitro............................................................................

38

Tabela 13 Absoro no UV e identidade dos picos do cromatograma da Figura 6.............................................................................................................

46

Tabela 14 ndice de similaridade de cada espectro do pico analisado da amostra frente ao respectivo espectro da substncia qumica de referncia...

54

Tabela 15 Dados obtidos (TR, rea e DPR) durante os testes para adequabilidade do sistema cromatogrfico......................................................

55

Tabela 16 Valores mdios obtidos na avaliao dos parmetros de Rs, k, a, T e N nas solues das SQR, obtidos durante a realizao dos testes para adequabilidade do sistema cromatogrfico..............................................

55

Tabela 17 Resultados obtidos no estudo da linearidade (P < 0,05) das curvas-padro...................................................................................................

56

xx

Tabela 18 Valores experimentais obtidos na determinao da repetibilida-de e da preciso intermediria do mtodo........................................................

57

Tabela 19 Valores experimentais obtidos na determinao da exatido do mtodo..............................................................................................................

58

Tabela 20 ndice de pureza do pico cromatogrfico obtido atravs da curva de pureza para cada componente....................................................................

60

Tabela 21 Limite de deteco para cada substncia de interesse................

60

Tabela 22 Limite de quantificao para cada substncia de interesse.........

61

Tabela 23 Avaliao da robustez do mtodo.................................................

65

Tabela 24 Composio (teor % DP) dos componentes majoritrios das decoces assistidas de ch-verde brasileiro..................................................

65

Tabela 25 Teores % (mg/100mg) DP (DPR) encontrados nos extratos liofilizados de ch-verde brasileiro obtidos pelo sistema 1...............................

66


66


67

Tabela 28 Teores % (mg/100mg) DP (DPR) encontrados nos extratos liofilizados de amostras comerciais de ch-verde obtidos pelo sistema 1........

67

Tabela 29 Anlise estatst. de eficincia entre os sistemas. ANOVA(SNK)..

68

Tabela 30 Relao dos teores de EGCG/CAF nos extratos liofilizados, por sistema de extrao..........................................................................................

69

Tabela 31 Relao dos teores de ECG/CAF nos extratos liofilizados, por sistema de extrao..........................................................................................

69

Tabela 32 Relao dos teores de (ECG +EGCG)/CAF nos extratos liofilizados, por sistema de extrao.................................................................

69

Tabela 33 Dados das curvas-padro do DPPH e das SQR..............................

71

Tabela 34 Dados das curvas-padro dos extratos liofilizados de ch-verde brasileiro obtidos pelo sistema 1.......................................................................

71


72

xxi


72

Tabela 37 Dados das curvas-padro dos extratos liofilizados de amostras comerciais de ch-verde obtido pelo sistema 1..............................................

72

Tabela 38 CE50 das substncias analisadas e seus respectivos va lores equivalentes a 1 g de cido ascrbico..............................................................

74

Tabela 39 Correlao CE50 (DPPH) versus teor de cada componente do ch-verde e teste de significncia (t-Student P < 0,05)....................................

75

Tabela 40 Dados relativos linearidade do mtodo para o cido glico, por CLAE-DAD em 280 nm...............................................................................

100

Tabela 41 Dados relativos linearidade do mtodo para a catequina por CLAE-DAD em 280 nm.....................................................................................

100

Tabela 42 Dados relativos linearidade do mtodo para a cafena por CLAE-DAD em 280 nm.....................................................................................

100

Tabela 43 Dados relativos linearidade do mtodo para a epicatequina por CLAE-DAD em 280 nm...............................................................................

101

Tabela 44 Dados relativos linearidade do mtodo para o galato de epicatequina por CLAE-DAD em 280 nm.........................................................

101

Tabela 45 Dados relativos linearidade do mtodo para a epigalocatequina por CLAE-DAD em 280 nm..................................................

101

Tabela 46 Dados relativos linearidade do mtodo para o galato de epigalocatequina por CLAE-DAD em 280 nm..................................................

102

Tabela 47 Dados relativos linearidade do mtodo para o galato de galocatequina por CLAE-DAD em 280 nm.......................................................

102

xxii

Tabela 48 ANOVA das reas absolutas determinadas para a obteno da curva padro do cido glico, por CLAE-DAD em 280 nm...............................

102

Tabela 49 ANOVA das reas absolutas determinadas para a obteno da curva padro da catequina, por CLAE-DAD em 280 nm..................................

102

Tabela 50 ANOVA das reas absolutas determinadas para a obteno da curva padro da cafena, por CLAE-DAD em 280 nm......................................

103

Tabela 51 ANOVA das reas absolutas determinadas para a obteno da curva padro da epicatequina, por CLAE-DAD em 280 nm.............................

103

Tabela 52 ANOVA das reas absolutas determinadas para a obteno da curva padro do galato de epicatequina, por CLAE-DAD em 280 nm.............

103

Tabela 53 ANOVA das reas absolutas determinadas para a obteno da curva padro da epigalocatequina, por CLAE-DAD em 280 nm......................

103

Tabela 54 ANOVA das reas absolutas determinadas para a obteno da curva padro do galato de epigalocatequina, por CLAE-DAD em 280 nm.......

104

Tabela 55 ANOVA das reas absolutas determinadas para a obteno da curva padro do galato de galocatequina, por CLAE-DAD em 280 nm..

104

Tabela 56 Valores experimentais obtidos na quantificao do DPPH para avaliao da atividade antioxidante, por espectrofotometria no visvel............

104

xxiii

RESUMO

Estudo qumico e avaliao da atividade antioxidante de

ch-verde brasileiro (Camellia sinensis var. assamica) Cultivar IAC-259

O ch-verde brasileiro, obtido a partir das partes areas de Camellia

sinensis var. assamica, teve sua produo recentemente implantada no Brasil

devido ao emergente consumo. As principais atividades farmacolgicas

atribudas a esta planta esto relacionadas atividade antioxidante,

quimiopreventiva e antitumoral. Neste trabalho foi desenvo lvido e validado

mtodo por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) para avaliar o perfil

dos constituintes majoritrios [galato de epigalocatequina (EGCG),

epigalocatequina, cafena, galato de epicatequina (ECG) e epicatequina] do

ch-verde brasileiro coletado na primavera e vero, e utilizando diferentes

sistemas de extrao. A resposta foi linear na faixa de 37-185 g/ml para

cafena, 99-500 g/ml para EGC, 20-100 g/ml para catequina, 30-150 g/ml

para epicatequina, 150-800 g/ml para EGCG, 20-105 g/ml para galato de

galocatequina e 40-205 g/ml para ECG (r > 0,9999 para todos os compostos).

Foi, tambm, avaliada a atividade antioxidante in vitro atravs do mtodo

fotocolorimtrico do DPPH e do mtodo enzimtico da hipoxantina/xantina

oxidase. Todos os sistemas de extrao testados e seus respectivos extratos

liofilizados apresentaram rendimento superior a 30%, sendo que o melhor

sistema teve rendimento mdio de 36,29%, e se mostrando mais eficiente na

extrao de EGCG e ECG. As amostras do vero apresentaram melhor

atividade antioxidante em comparao s da primavera. Os teores dos

componentes ECG e EGCG foram os nicos que correlacionaram com a

atividade antioxidante in vitro (DPPH). A anlise estatstica no mostrou

diferena significativa ( = 0,05) nos teores de catequinas totais entre as

estaes primavera e vero.

Palavras-chave: Camellia sinensis, ch-verde brasileiro, validao, CLAE,

extrato liofilizado, atividade antioxidante, catequinas, cafena.

xxiv

ABSTRACT

Components study and antioxidant activity evaluation of

Brazilian green tea (Camellia sinensis var. assamica IAC-259 cultivar)

The Brazilian green tea, produced from Camellia sinenis var. assamica, have

been cultivated in Brazil recently because the rise at its consumption. The main

pharmacological activities attributed to this plant are related to antioxidant

activity as chemopreventive and anti-cancer agent. Herein, a new HPLC

method was developed and validated to evaluate the profile of the major

Brazilian green tea constituents [epigallocatechin gallate (EGCG),

epigallocatechin, caffeine, epicatechin gallate (ECG) and epicatechin] between

spring and summer, using different extraction systems. The response was linear

over a range of 37-185 g.mL-1 for caffeine, 99-500 g.mL-1 for

epigallocatechin, 20-100 g.mL-1 for catechin, 30-150 g.mL-1 for epicatechin,

150-800 g.mL-1 for EGCG, 20-105 g.mL-1 for gallocatechin gallate and 40-

205 g.mL-1 for ECG (r > 0.9999 for all compounds). Likewise, the in vitro

antioxidant activity was evaluated using DPPH assay and

hipoxanthine/xanthine oxidase assay. The extractors systems to produce the

freeze-drying extract had presented yield up of 30%. The best system an

average yield of 36.26% showed more efficient to extract EGCG and ECG. The

summer samples presented better antioxidant activity when compared with

spring samples. Only ECG and EGCG contents presented correlation with in

vitro antioxidant activity (DPPH assay). The statistic analysis did not show

significant difference ( = 0.05) in total catechin content between spring and

summer seasons.

KEY WORDS: Camellia sinensis, Brazilian green tea, validation, HPLC, freeze-

drying extract, antioxidant activity, catechins , caffeine.

1. INTRODUO

3

A palavra ch, que no Brasil tem conotao de bebida feita a partir de infuso ou

decoco de vegetais, tem no oriente (por exemplo: Japo) a atribuio ao nome

popular de Camellia sinensis desde tempos remotos. Este fato foi observado pela

existncia de um kanji (ideograma chins) prprio para planta. Neste trabalho, a

palavra ch ser usada de forma semelhante ao oriente, ou ser, quando

necessrio, indicado o tipo de ch (preto, verde, etc.).

O ch a segunda bebida mais consumida no mundo, perdendo apenas para a

gua. Sendo tambm umas das maiores fontes alimentares de flavonides (RIJKEN

et al., 1996).

O ch-verde um produto obtido a partir de Camellia sinensis em que suas

folhas e brotos recebem tratamento trmico para inativao de suas enzimas (em

especial as polifenolases) aps sua colheita seguido de enrolagem (rolling) ou

fragmentao (comminution) e secagem (KIRK-OTHMER,1983; BRUNETON,

1996; SABU et al., 2002). Esta estabilizao por tratamento trmico preserva os

polifenis encontrados naturalmente na planta fresca. Muitos destes, em especial as

catequinas, tm se destacado no meio cientfico por apresentarem atividades

antioxidante, quimiopreventiva, anticarcinognica, antiinflamatria, antilipmica

(RIJKEN et al., 1996; SATO e MIYA TA, 2000; GOSSLAU e CHEN, 2004),

antidiabtica (ANDERSON e POLANSKY, 2002; SABU et al.,2002), antimicrobiana

(HAMILTON-MILLER, 1995 e 2001) e antiviral (KAWAI et al., 2003).

O cultivo da Camellia sinensis no Brasil est mais restrito ao Vale do Ribeira-SP

por possuir condies climticas mais favorveis. Suas colheitas so feitas de

agosto a maio, com apenas dois meses de interrupo que normalmente ocorre nos

meses de junho e julho, aps a sua poda, antes do inverno. O intervalo entre

colheitas de 7 a 10 dias em pleno vero (janeiro) chegando a 20 ou mais dias em

agosto (IAC-CIIAGRO, 2005). O Instituto Agronmico de Campinas (IAC)

desenvolveu dois cultivares de chs catalogados como IAC-250 e IAC-259 (1968),

sendo que este ltimo possui como caracterstica a alta produtividade (IAC, 2005).

Muitos fatores podem influenciar de forma significativa a composio do ch,

como sua variedade, estao em que foi colhido, idade da folha, clima e tcnicas de

4

cultivo (PERVA-UZUNALIC et al., 2005). Assim sendo, chs cultivados em diferentes

reas geogrficas apresentaro diferenas significativas na sua composio qumica

(FERNNDEZ et al., 2002; LIN et al.,2003), o que pode ser aplicado aos teores de

catequinas, cafena e minerais no ch-verde. Tambm, os teores de catequinas em

extratos dependem principalmente da tecnologia utilizada na extrao, mtodo de

concentrao e conservao (BONOLI et al.,2003).

Os polifenis do ch-verde e do ch-preto tm importante valor na indstria

alimentcia e tambm para uso medicinal (PAN et al., 2003), surgindo recentemente

mais e mais aplicaes para os extratos de ch. Com o aumento na demanda de

extratos de chs surge a necessidade de mtodos para controle de qualidade na

determinao de catequinas tanto em extratos como na matria-prima (WANG et al.,

2000).

Considerando-se que o consumo do ch-verde brasileiro tem aumentado em

nosso Pas, cabe destacar a importncia da anlise referente composio qumica

e sua atividade antioxidante da planta cultivada em solo nacional, tendo em vista

as diferenas edficas (tipo e composio do solo) e climticas existentes, visto que

somente h estudos sobre as atividades teraputicas e os teores de catequinas nos

chs importados.

5

2. OBJETIVOS

7

2.1 Objetivo geral

- Avaliar a composio qumica e a atividade antioxidante do ch-verde

brasileiro, produzido a partir da variedade assamica (cultivar IAC-259) cultivada no

Vale do Ribeira, SP.

2.2 Objetivos especficos:

- Propor mtodo de extrao para produo de extrato de ch-verde brasileiro

com melhor relao galato de epigalocatequina (EGCG)/cafena;

- Desenvolver mtodo analtico por CLAE e valid-lo para controle de qualidade

da decoco e extratos de ch-verde;

- Verificar a composio de extratos de ch-verde brasileiro obtidos por diversos

sistemas de extrao;

- Comparar os teores de catequinas das amostras de ch-verde brasileiro

colhidas no vero/primavera com a de alguns chs importados, atravs de CLAE;

- Testar a atividade antioxidante in vitro dos extratos desenvolvidos, assim como

de seus componentes majoritrios.

8

3. REVISO

10

3.1 Descrio da planta

A Camellia sinensis (L.) O. Kuntze uma pequena rvore, muito ramosa,

pertencente famlia Theaceae (Ternstroemiaceae) originria do oriente. Seu

habitat natural ao sul do rio Yangtze e ao leste da Provncia Zhejiang na China at

Assam-Burma ao oeste, incluindo Tailndia e Vietn. Seu tamanho pode chegar de

1-6 metros de altura quando adulta com uma cobertura de 60 cm a 4 m de dimetro

(HUANG, 1993; BOWN, 1995; BRUNETON, 1996).

As folhas so verdes, incompletas, simples, glabras ou ligeiramente pubescentes

na pgina inferior ao longo da nervura principal, normalmente coriceas,

peninrveas, elpticas ou lanceoladas e de modo geral serrilhadas nas bordas; com

filotaxia alterna e pecolo pequeno. As suas folhas mais jovens e os gomos, parte da

planta utilizada na produo de ch, so cobertos por um fino indumento branco e

sedoso que mais tarde vem a desaparecer. este indumento que origina o nome

dado ao gomo terminal: pekoe, da palavra chinesa pak-ko que significa cabelo ou

penugem (BOWN, 1995; BRUNETON, 1996; PDR, 2000; FERRARA et al., 2001).

3.2 Constituio qumica

As folhas no fermentadas contm cerca de 15-25% de protenas, 5% de

glicdeos, 30% de polifenis, 1-5% de alcalides [cafena 2,9-4,2% (Fig. 1), teofilina

0,02-0,04%, teobromina 0,15-0,2%], vitaminas: C, B1, B2 e K e minerais como flor

(130-160 mg/kg), potssio, magnsio, clcio, ferro, mangans e fsforo entre outros

(HUANG, 1993; BRUNETON, 1996; PDR, 2000; FERRARA et al., 2001).

No ch-verde as catequinas representam 90% do total dos flavonides - sendo

que 20-30% das catequinas podem estar na forma oxidada - e 10% de flavonis

(RIJKEN et al. 1996; HIGDON e FREI, 2003). As catequinas totais perfazem de 20-

30% do peso seco do ch (WANG et al., 2000); dentre estes se destacam: galato de

epigalocatequina (EGCG) de 1,2-18,8%, epigalocatequina (EGC) de 0,1-5,5%,

epicatequina (EC) de 0,19-2% e traos (

11

OH

OH

OH

CO

O

OR2

OH

OH

R1

OH

HO

O

OG

OH

OH

OH

OH

HO

cafena (CAF)galoil (G)

(-)-galato de epigalocatequina (EGCG): R1=OH, R2=G(-)-epigalocatequina (EGC): R1=OH, R2=H(-)-galato de epicatequina (ECG): R1=H, R2=G(-)-epicatequina (EC): R1=R2=H

(-)-galato de galocatequina (GCG)

O

OH

OH

OH

OH

HO

(+)-catequina (C)

N

N

NH3C

O

CH3

O CH3

N

Figura 1 Principais componentes presentes em Camellia sinensis.

A quantidade normalmente encontrada de polifenis numa infuso de ch-verde

de aproximadamente 60 mg/g de folhas de ch, variando de 9 at 117 mg/g

dependendo da procedncia deste ch (DALLUGE e NELSON, 2000).

Ainda em relao constituio qumica dos componentes do ch foram

encontrados derivados do cido cafico, como o cido clorognico, entre outros;

tambm flavonides insolveis em gua como quercetina, canferol e miricetina; e

linalol como leo voltil (PDR, 2000) e, tambm, um aminocido encontrado nesta

planta e em um tipo de cogumelo (Xerocomus badius): L-teanina (cido ?-etilamino-

L-glutmico) que constitui cerca de 1-2% do peso seco das folhas do ch (JUNEJA

et al.,1999).

12

3.3 Atividade antioxidante

A atividade antioxidante tem sido ressaltada por diversos autores como sendo

uma das principais propriedades farmacolgicas do ch-verde (RIJKEN et al., 1996).

Ratos alimentados com uma dieta rica em protena (18% de casena e 0,75% de

adenina [p/p]), suplementados com uma mistura de catequinas ou EGCG,

excretaram menor quantidade de metilguanidina na urina, que um marcador

indireto do dano renal pelo radical hidroxila (OH). Num estudo em humanos, o

consumo de um litro de ch por dia diminuiu a concentrao de dialdedo malnico e

8-hidroxideoxiguanosina urinria, aps consumir o ch por uma semana. E a

suplementao de catequinas do ch-verde reduziu significantemente a

concentrao plasmtica hidroperxido de fosfatidilcolina aps 60 minutos da

ingesto (RIJKEN et al., 1996).

TOIT e colaboradores (2001) compararam a atividade antioxidante de frutas,

vegetais e chs mensurando seu equivalente em vitamina C, atravs do mtodo

fotocolorimtrico que utiliza o radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH) para

quantificar a capacidade seqestradora de radical (RSC), e observaram que a

atividade antioxidante de duas xcaras de ch-verde, na concentrao de 120-140

g/ml de catequinas, equivale capacidade antioxidante de 400 mg de vitamina C.

Em estudo realizado com 45 amostras de vrios tipos de chs (ch-preto, ch-

vermelho1 e ch-verde), comercializados na Espanha, propondo dosear os

componentes que possuem atividade antioxidante como Cr, Mn, Se, Zn e

catequinas, foi constatado que dentre os tipos de chs estudados o ch-verde o

que apresentou maiores quantidades de catequinas, especialmente galato de

epigalocatequina (EGCG) e epigalocatequina (EGC) (CABRERA et al., 2003).

Na Itlia, a atividade antioxidante relativa do ch-verde e de outros chs

disponveis no mercado foi avaliada utilizando-se um mtodo recentemente

desenvolvido (biosensor da superxido dismutase) onde se utiliza um eletrodo para

1 Ch semi -fermentado conhecido na China como ch Oolong.

13

medir a atividade do catalisador (enzima) de forma indireta, quantificando o perxido

de hidrognio formado durante a dismutao do radical superxido que foi gerado

durante a reao enzimtica da hipoxantina/xantina oxidase. Neste ensaio foi obtido,

em ordem decrescente, o seguinte resultado para atividade antioxidante: ch-verde

> ch-preto com limo > ch-preto com pssego > ch-preto com leite > ch-preto

descafeinado > ch de camomila (CAMPANELLA, BONANNI e TOMASSETTI,

2003).

3.4 Atividade quimiopreventiva e antitumoral

Quimiopreveno o uso de agentes qumicos naturais ou sintticos, incluindo

suplementos nutricionais ou suplementos base de ervas, para prevenir doenas,

em oposio ao uso de quimioterpicos onde frmacos, na maioria, sintticos, so

usados para remover ou aliviar os sintomas das doenas. O conceito de

quimiopreveno, embora usado no oriente por milhares de anos, no havia

ganhado reconhecimento cientfico no ocidente at recentemente (GOSSLAU e

CHEN, 2004).

A American Association for Cancer Research tem aceitado que a

quimiopreveno uma alternativa vivel para o controle do cncer. Sugere-se que

o mecanismo pelo qual os quimiopreventivos poderiam auxiliar no controle do cncer

esto relacionados ao controle da apoptose celular. Isto poderia ser mediado

mitocondrialmente pela ativao de fatores pr-apoptticos como procaspases,

citocromo C, Apaf-1, endonuclease-G e fator indutor de apoptose, aps injria

celular (GOSSLAU e CHEN, 2004).

EGCG e outras catequinas do ch mostraram primeiramente serem apoptticos

em clulas humanas linfides leucmicas e clulas humanas de carcinoma. A dose

de EGCG capaz de induzir a apoptose nestas clulas ficou entre 20 a 100 M, e o

tempo de curso variou de 10 a 30 h (GOSSLAU e CHEN, 2004).

O consumo dirio de ch tem mostrado efeitos preventivos em relao s

doenas crnicas causadas por fatores nutricionais e pelo cigarro. Em estudo

realizado em ratos tratados com 4-(metilnitrosamina)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK),

14

uma nitrosamina do cigarro, verificou-se a supresso da formao de 8-

hidroxideoxiguanosina (8-OHdG), um marcador do dano oxidativo do DNA, assim

como a inibio de desenvolvimento de cncer de pulmo em relao ao grupo

controle, quando concomitantemente foram tratados com extrato do ch

(WEISBURGER e CHUNG, 2002).

Estudos de National Institute of Environmental Health Sciences, da

Universidade de Rochester, Nova Iorque, demonstraram que o EGCG e a

epigalocatequina (EGC) presentes no ch-verde anulam a ao dos receptores aril-

hidrocarboneto. Esse receptor um fator de transcrio ligante-dependente que

pode ser ativado por numerosos compostos sintticos ou naturais de estrutura

qumica diversa, tais como hidrocarbonetos aromticos policclicos, indis e

flavonides. Tem papel essencial na ativao de genes causadores de cncer, em

ratos e tambm em clulas humanas (PALERMO et al., 2003).

3.5 Atividade antidiabtica

ANDERSON e POLANSKY (2002) verificaram em ensaio epididimal em clulas

adiposas que o ch consumido normalmente (sache de 2 g infuso em 237 mL de

gua quente por 5 min.) potencializou a atividade da insulina, sendo que a maior

atividade foi atribuda ao EGCG, seguido por ECG, taninos e teaflavinas.

As catequinas do ch tm mostrado serem capazes de inibir enzimas que

hidrolisam carboidratos, inclusive a -amilase. Uma mistura de catequinas de ch-

verde se mostrou efetiva na supresso do aumento do nvel de glicose e de insulina

plasmtica em ratos, aps ingesto de carboidratos (ANDERSON e POLANSKY,

2002).

SABU e colaboradores (2002) avaliaram a atividade antidiabtica, em ratos,

nos quais o diabetes foi induzido por aloxano, e verificaram que aps tratamento

com polifenis de ch-verde por 15 dias, estes apresentaram uma reduo de 29 e

44%, respectivamente, nos nveis de glicose srica quando tratados com 50 e 100

mg/kg de polifenis. Devido ao aloxano produzir no animal radicais livres, o que

causa a injria no pncreas, outros parmetros relacionados ao estresse oxidativo

15

foram avaliados, entre eles: os nveis de superxido dismutase (SOD), glutationa

reduzida (GSH), catalase, peroxidao lipdica (LP) e glutationa peroxidase (GSH-

Px) verificando que apenas os nveis de GSH e SOD aumentados. Consta na

literatura (SABU et al., 2002 e BABU et al., 2006) que diabticos tm seus nveis de

GSH diminudos e que o aumento dos nveis deste, com conseqente inibio da

LP, possa ser devido aos polifenis do ch-verde.

3.6 Outras atividades farmacolgicas

HAMILTON-MILLER (1995) relatou estudo feito por TODA e colaboradores.

(1989)2 em que foi verificado que o extrato de ch foi bacteriosttico ou bactericida

frente bactrias Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella

typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Shigella flexneri, Shigella

dysenteriae e Vibrio spp. Mais tarde estes mesmos pesquisadores3 verificaram que

uma concentrao idntica a encontrada na bebida (em torno de 3 mg/ml em

resduo seco) inibiu crescimento de S. aureus oxacilina resistente.

O uso de ch-verde pode ser benfico na preveno de cries (PDR, 2000). Isto

sugerido devido ao efeito bactericida sobre Streptococcus mutans e S. sobrinus,

preveno da aderncia da bactria no dente, inibio da glicosil transferase e

inibio das amilases bacterianas e humanas (HAMILTON-MILLER, 2001).

Cientistas da Universidade de Tquio, Japo, descobriram que o EGCG impede

que as protenas do VIH-1 se conectem nas molculas CD4 das clulas T-helper

que o primeiro passo da infeco pelo VIH. Isto poderia ser muito til para a

criao de novos medicamentos para o tratamento da SIDA, baseados em modelos

moleculares do EGCG (KAWAI et al., 2003; NANCE e SHEARER, 2003).

2 TODA, M.; OKUBO, S.; HYOSHI, R.; SHIMAMURA, T. The bactericidal activity of tea and coffee, Lett. Appl. Microbiol., v.8, p.123-5, 1989 apud HAMILTON-MILLER, J.M.T. Minirewiew: Antimicrobial Properties of Tea (Camellia sinensis L.). Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.39, n.11, p.2375-7, 1995. 3 TODA, M.; OKUBO, S.; HYOSHI, R.; SHIMAMURA, T. Antibacterial and bactericidal activites of tea extracts and catechins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Jpn. J. Bacteriol., v.46, p.839-45, 1991 apud HAMILTON-MILLER, J.M.T. Minirewiew: Antimicrobial Properties of Tea (Camellia sinensis L.). Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.39, n.11, p.2375-7, 1995.

16

3.7 Toxicidade, efeitos adversos e superdosagem

A suspenso da venda de extrato hidroalcolico de ch-verde na Frana e na

Espanha, por suspeita de hepatoxicidade do mesmo, levou pesquisadores da

Alemanha, Frana e Sua a verificarem a toxicidade do extrato de ch-verde e seus

constituintes em culturas de hepatcitos de ratos. Concluram que o mesmo possui

baixa toxicidade in vitro (SCHMIDT et al., 2005).

Efeitos indesejveis podem ocorrer em pessoas que possuem o estmago

hipersensvel principalmente devido ao cido clorognico e aos taninos.

Hiperacidose, irritao gstrica, reduo do apetite, assim como constipao ou

diarria, podem ocorrer com o intenso uso do ch. Mas estes efeitos indesejveis

podem ser geralmente evitados atravs da adio de leite ao ch (PDR, 2000).

Superdosagem, atravs da quantidade correspondente a 300 mg de cafena, ou

5 xcaras de ch, podem levar inquietao, tremor e aumento da excitabilidade

reflexa, sendo os primeiros sinais de toxicidade: vmito e espasmo abdominal;

entretanto no se consegue chegar a uma dose fatal apenas bebendo o ch (PDR,

2000).

3.8 Mtodos de extrao e de quantificao de componentes qumicos

Vrios mtodos de extrao tm sido propostos, visando a otimizar a extrao de

flavonides e cafena do ch (WANG et al., 2000; ZUO et al., 2002; PAN et al., 2003;

NISHITAMI e SAGESAKA, 2004; YAO et al., 2004; SHARMA et al., 2005; PERVA-

UZUNALIC et al., 2005; CHAN et al., 2007).

PAN e colaboradores (2003), estudando quatro sistemas de solventes e quatro

tipos de extrao, concluram que a extrao assistida por microondas, seguida por

ultra-som, foi a que extraiu maiores quantidades de polifenis e cafena. PERVA-

UZUNALIC e colaboradores (2005) obtiveram mxima eficincia de extrao em

gua quando as folhas foram extradas a 80 C por 20-30 minutos quando

comparados a outras temperaturas de extrao (60, 70, 85, 95 e 100 C) e entre

diferentes tempos de extrao (0 240 min). Tambm foi observado por estes

17

autores que entre 35 a 60 minutos a eficincia da extrao, em 80 C, caa

abruptamente.

Entre os solventes orgnicos utilizados na literatura que foram considerados

eficientes para a extrao do ch pode-se mencionar acetona, metanol, etanol e

acetonitrila usados normalmente em mistura com gua. Destes, a acetonitrila

usada apenas para solues extratoras com fins de anlise da composio da

planta, no sendo usada para produo de extratos (GOTO et al., 1996; ZUO et al.,

2002 e PAN et al., 2003). Tcnicas mais recentes como extrao assistida por ultra-

som, extrao lquida pressurizada, extrao assistida por microondas, extrao por

fludo supercrtico e extrao por gua supercrtica tem sido empregadas visando a

diminuir o tempo de extrao, bem como a quantidade de solvente empregado

(HAWTHORNE et al., 2000; PAN et al., 2003; PRES et al., 2006).

Anlises utilizando cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) e Eletroforese

Capilar (EC) so as tcnicas mais citadas para separao, identificao e

quantificao de catequinas, sendo a cromatografia lquida em fase reversa com

deteco UV o mtodo de escolha utilizado por vrios autores (GOTO et al., 1996;

BRONNER e BEECHER, 1998; DALLUGE e NELSON, 2000; ZUO et al., 2002;

SHARMA et al.,2005).

Os trabalhos consultados utilizam em geral CLAE com coluna C-18 em fase

reversa e deteco por UV. HOEFLER e COGGON (1976)4 descreveram pela

primeira vez o mtodo pelo qual haviam identificado cinco catequinas (C, EGC, EC,

EGCG e ECG) diretamente da infuso de ch-verde. Sua separao foi pobre em

resoluo, mas representou um significante avano em relao identificao e

doseamento das catequinas do ch-verde. Desde este experimento, at em torno de

1996, no houve muito avano no mtodo de doseamento at que GOTO e

colaboradores (1996) desenvolveram um mtodo capaz de separar oito catequinas

contidas naturalmente no ch, utilizando CLAE com coluna C-18 de fase reversa.

Este mtodo utilizou um gradiente com a fase mvel composta por gua, acetonitrila

e cido fosfrico, onde a concentrao de cada componente era modificada em

4 HOEFLER, A.C.; COGGON, P. Journal of Chromatography, v.129, p.460, 1976 apud DALLUGE, J.J.; NELSON, B.C. Determination of tea catechins. Journal of Chromatography A, v.881, p.411-24, 2000.

18

relao ao tempo total de anlise, sendo necessrio o controle da temperatura. Com

este estudo foi possvel verificar que em 85 amostras comercialmente disponveis,

as 4 catequinas de maior concentrao no ch eram EGC, EGCG, EC e ECG

(GOTO et al., 1996).

Na Tabela 1 encontra-se um resumo dos mtodos por CLAE, utilizados para

determinao simultnea de componentes, em especial as catequinas, do ch-

verde.

Tabela 1 Resumo dos mtodos utilizados para determinao simultnea de componentes do ch-

verde por cromatografia lquida de alta eficincia.

COMPOSTOS

COLUNA

FASE MVEL

DETECO

AUTOR

Ac. glico; (+)-GC;

(-)-EGC; (+)-C;

CAF; (-)-EGCG;

(-)-EC; (-)-GCG;

(-)-ECG

Kingsorb C-18

(150 x 4,6 mm, 5

m)

MeOH: H2O: c.

ortofosfrico (20:79,9:0,1

V/V)

Ultravioleta em

210 nm

Wang et al., 2000

CAF; (-)-EGCG;

(-)-EGC; (+)-C; (-)-

EC; (-)-ECG

Cosmosil 5C18-

MS (250 x 4,6

mm, 5m)

MeOH: H2O: c. frmico

(19,5: 82,5: 0,3 V/V)

Ultravioleta em

280 nm

Lin et al., 2003

(-)-EGCG; (-)-EGC;

(-)-ECG; (-)-EC; (-)-

GCG; (-)-GC; (-)-CG;

(+)-C

Wakosil-II 5C18

HG (150 x 3,0

mm, 5 m)

(A) H2O: MeOH: c.

fosfrico (85:15:0,1 V/V)

(B) H2O: MeOH: EtOAc:

ac. fosfrico (85: 15: 1: 0,1

V/V)

Ultravioleta em

280 nm

Nishitami e

Sagesaka, 2004

(+)-C; (-)-EC; (-)-

EGC; (-)-EGCG; (-)-

ECG; CAF; AG;

teobromina; teofilina

Lichrocart C-18

(250 x 4,0 mm, 5

m)

(A) ACN

(B) gua cida (c.

ortofosfrico 0,1%)

Ultravioleta em

210 nm

Sharma et al.,

2005

CAF; (-)-EGC; (+)-C;

(-)-EC; (-)-EGCG;

(-)-ECG

XTerra C-18 (100

x 3,9 mm, 3,5 m)

(A) H2O: ACN: TFA

(919:80:1 V/V)

(B) H2O:ACN:MeOH:

TFA (699:270:30:1 V/V)

Ultravioleta em

280 nm

Neilson et al., 2006

CAF; (+)-C; (-)-EC;

(-)-EGCG

Lichrosorb C-18

(150 x 4,6 mm, 5

m)

H2O: MeOH: ACN: EtOAc:

c. actico glacial

(89:6:1:3:1 V/V)

Ultravioleta em

280 nm

Saito et al., 2006

19

DALLUGE e colaboradores (1998) em estudo de reprodutibilidade das

metodologias descritas na literatura para separao das quatro principais catequinas

(EGC, EC, EGCG e ECG) verificaram que muitas no eram reprodutveis, quando

modificados alguns parmetros de coluna como as suas especificaes (tipo e

formato da slica) e o fabricante.

3.9 Mtodos de avaliao da atividade antioxidante in vitro

Muitos dos estudos de atividade antioxidante in vitro de compostos especficos

ou de extratos so conduzidos utilizando o radical estvel DPPH 2,2-difenil-1-

picril-hidrazila (Fig. 2) em soluo metanlica (BRAND-WILLIAMS et al., 1995; TOIT

et al., 2001; TREVISAN et al., 2006; CHAN, LIM e CHEW, 2007).

N

NNO2 NO2

NO2 Figura 2 - Estrutura molecular do radical DPPH (C18H12N5O6) PM 394,3

(BRAND-WILLIAMS, 1995).

Esta tcnica se baseia na quantificao do DPPH pela sua absortividade molar

entre 515-517 nm na forma de radical. Quando o DPPH reduzido, seja por um

antioxidante ou por outro radical, esta absoro se extingue sendo proporcional a

sua concentrao, conforme mostrado na equao:

DPPH + AH DPPHH + A

DPPH + R DPPHR

Esquema da reao radicalar do DPPH sendo reduzido por (AH) antioxidante ou outro radical livre

(R) (BRAND-WILLIAMS, 1995)

20

OWEN e colaboradores (1996) desenvolveram mtodo por CLAE para

quantificao da formao de radicais hidroxila pela determinao de cidos di-

idroxibenzicos, utilizando o sistema enzimtico hipoxantina/xantina oxidase. Este

sistema conhecido por produzir o on superxido e perxido de hidrognio durante

a hidroxilao da hipoxantina (Fig. 3). Quando o ferro quelado includo neste

sistema, o superxido reduz o ferro III para ferro II e o ferro II-quelado tambm reage

com o perxido de hidrognio para formar o altamente reativo radical hidroxila (OH).

Na tcnica por CLAE, se utiliza o par inico hidrxido de tetrabutilamnio como

reagente e o cido saliclico como composto aromtico apropriado para a

quantificao dos radicais hidroxilas. Neste sistema, os principais produtos

resultantes so o cido 2,5-diidroxibenzico e o cido 2,3-diidroxibenzico na

proporo de 5:1.

Outro mtodo proposto para avaliar a atividade antioxidante in vitro, se baseia na

quantificao, por CLAE, de derivados hidroxilados do cido saliclico obtidos aps o

ataque de espcies reativas de oxignio (ERO), quando adicionados na amostra os

reagentes hipoxantina/xantina oxidase e Ferro III em tampo fosfato pH = 6,5

(OWEN, 2000). OH

O2

H2O

FeIII (50:M)/EDTA (500:M)O2 O2 FeII/EDTA

H2O2 FeII/EDTA FeIII/EDTA OH OH

OH

COOH

cido saliclico (2 mM)

OH

COOH

OH2,3-DHBA

OH

HO

xantina

H2O2

O2

H2O

O2 FeIII/EDTA

FeII/EDTA

O2 FeII/EDTA

OHOHFeIII/EDTA

OH

COOH

HO2,5-DHBA

OH

HO

OH

cido rico

hipoxantina(300M)

xantina oxidase (18mU)

Figura 3 Esquema da gerao de espcies reativas ao oxignio (ERO) no sistema

hipoxantina/xantina oxidase (OWEN et al., 2000).

21

No Brasil ainda existem poucos estudos feitos com Camellia sinensis. SAKAI

(1997) pesquisou em sua tese de doutorado a influncia da adubao NPK em

culturas de ch no Vale do Ribeira, SP. Em trabalho de dissertao, o teor de flor

nos chs industrializados de Camellia sinensis no Brasil foi avaliado, verificando-se

que este se assemelhava aos da literatura, concluindo que isto poderia ter um

significado positivo na sade bucal de seus consumidores (SANTORO e

GUIMARES, 1997). SILVA (2003) avaliou em sua dissertao, a influncia da

extrao assistida por ultra-som na determinao de Al, Ca, Mg e Mn em chs: Ilex

paraguariensis, Camellia sinensis e Cymbopogan citratus. SAITO e colaboradores

(2006) desenvolveram um mtodo para quantificao de EGCG, EC, C e CAF em

chs colhidos em diversas estaes do ano (primavera, vero e outono) no Vale do

Ribeira, porm este trabalho careceu de doseamentos de outras catequinas

importantes no ch-verde como o ECG e EGC.

22

4. MATERIAIS E MTODOS

24

4.1 Substncias qumicas, reagentes e equipamentos

As substncias de referncia para validao do mtodo analtico por CLAE, bem

como para avaliar a atividade antioxidante in vitro foram adquiridas, conforme a

Tabela 2.

Tabela 2 Especificaes das substncias qumicas utilizadas.

Substncia Pureza Procedncia Lotes

cido ascrbico p.a. 99,7% Merck 5199238

cido etilenodiaminotetractico (Titriplex) NI Merck 9748259

cido glico NI Merck K18362930

cido saliclico p.a. 99,8% Vetec 950408

cafena anidra p.a. 99,9% Nuclear 01071211

(+)-catequina 98% Sigma 072K1568

cloreto frrico p.a. 97-102% Synth 50966

2,2-difenil-1-picrilidrazila 90% Sigma 51K1419

(-)-epicatequina NI Sigma 072K2630

(-)-epigalocatequina 98% Sigma 104K0963

085K1630

fosfato de potssio dibsico p.a. 98% Vetec 047785

fosfato de potssio monobsico p.a. 99% Merck 6390744

(-)-galato de epicatequina 98% Sigma 054K1530

035K1468

(-)-galato de epigalocatequina 95% Sigma 084K1719

(+)-galato de galocatequina 98% Sigma 104K1020

035K1396

hipoxantina NI Sigma 042K0978

xantina oxidase (0,5 U/mg de protena) NI Sigma 075K0325

Os solventes para extrao foram de grau p.a., Vetec (metanol), Nuclear

(etanol, acetona), gua desmineralizada pH 5,0~6,0 e os de grau CLAE, Merck

(metanol), Vetec (acetato de etila) e gua obtida por sistema Milli-Q Plus

(Millipore).

Foi utilizado para extrao assistida por ultra-som sonicador Thornton modelo

T50. A centrifugao dos extratos foi feita em centrfuga Janetzki K23. Para

25

concentrao e extrao da parte orgnica do extrato lquido utilizou-se evaporador

rotatrio Bchi modelo R-114 com banho-maria modelo B-480. Para produo do

extrato liofilizado utilizou-se liofilizador modular Edwards modelo Modulyo 4K. Para

pesagem das substncias qumicas de referncia utilizou-se balana analtica

SARTORIUS modelo MC410S e para pesagem das amostras e reagentes, utilizou-

se balana analtica OHAUS modelo AS200. As anlises de CLAE foram realizadas

em cromatgrafo a lquido Shimadzu LC-10AD vp, detector de arranjo de diodos

(DAD) SPD-M10A vp, central de controle SCL-10A vp, desgaseificador DGU-14A. As

anlises por espectrofotometria foram realizadas em espectrofotmetro Shimadzu

UV-1602PC. Para realizao do ensaio enzimtico utilizou-se termoagitador

Eppendorf modelo termomixer 5437. A centrifugao dos micro-tubos da reao

enzimtica para avaliao da atividade antioxidante foi feita em centrfuga Eppendorf

modelo 5415.

4.2 Matria vegetal

O ch-verde brasileiro processado (estabilizado e seco) foi obtido junto aos

produtores do Vale do Ribeira-SP que cultivam a Camellia sinensis var. assamica

(cultivar IAC-259) e foi coletado nas estaes de primavera e vero entre 2005 e

2006.

Tabela 3 Datas das colheitas do ch-verde brasileiro e seu respectivo cdigo.

Safra Data da Colheita Cdigo

Primavera

05/10/2005 CVB-P1

17/10/2005 CVB-P2

05/11/2005 CVB-P3

Vero

01/02/2005 CVB-V1

16/01/2006 CVB-V2

01/03/2006 CVB-V3

Tambm foram ensaiadas duas amostras comerciais de ch-verde importadas,

procedentes do Japo e 3 amostras comerciais nacionais. Todas obtidas no

mercado local.

26

Tabela 4 Cdigo, procedncia e descrio das amostras comerciais.

Cdigo Procedncia Descrio

ACN1 So Miguel Arcanjo,SP Ch-verde nacional tipo banch torrado

ACN2 Taquara, RS Ch-verde nacional sem especificao

ACN3 Nova Santa Rita, RS Ch-verde nacional sem especificao

ACI1 Shizuoka, Japo Ch-verde importado tipo sench5

ACI2 Kioto, Japo Ch-verde importado tipo banch6 (com mais talos e galhos)

4.3 Obteno do extrato liofilizado

4.3.1 Obteno do extrato liofilizado pelo sistema 1

Para obteno do extrato liofilizado pelo sistema 1, pesaram-se 2,5 g de ch-

verde, previamente modo em moinho-de-facas, em erlenmeyer e adicionaram-se

100 ml de gua aquecida a 80 oC e manteve-se sob agitao mecnica por 20

minutos em chapa de aquecimento, com variao de temperatura de 2 oC.

Em seguida, a soluo foi centrifugada em 3500 rpm (2000 g) por 5 min; o

sobrenadante foi filtrado a vcuo por papel filtro, em kitasato e funil de bchner. O

resduo foi lavado trs vezes com 5 ml de gua. O filtrado foi armazenado em

recipiente de vidro e congelado 20 oC para liofilizao.

Aps serem liofilizados, os extratos foram pesados e armazenados em

dessecador, protegido da luz, at serem analisados por CLAE.

Codificaram-se os extratos da seguinte forma:

ECVB-V1A - Extrato liofilizado de CVB-V1 e obtido pelo sistema 1;



ECVB-P1A - Extrato liofilizado de CVB-P1 e obtido pelo sistema 1;

5 Ch mais popular do Japo. Feito dos brotos e das folhas mais tenras a cada rebento. 6 Ch feito da segunda colheita aps terem sido colhidas as brotaes para fazer o sench.

27



EACN1A Extrato liofilizado de amostra comercial nacional (marca 1) e

obtido pelo sistema 1;





EACI1A Extrato liofilizado de amostra comercial importada (marca 1) e


EACI2A Extrato liofilizado de amostra comercial importada (marca 2) e

obtido pelo sistema 1.


Para obteno do extrato liofilizado pelo sistema 2, pesaram-se 5 g de ch-

verde brasileiro em erlenmeyer e adicionaram-se 100 ml gua-acetona (1:1, V/V) e

submeteu-se a banho de ultra-som por 30 minutos.

Em seguida, procedeu-se do mesmo modo que para o sistema 1.







ECVB-P1B - Extrato liofilizado de CVB-P1 e obtido pelo sistema 2;



28


Para obteno do extrato liofilizado pelo sistema 3, pesaram-se 5 g de ch-

verde brasileiro em erlenmeyer e adicionaram-se 100 ml gua-etanol (75:25 V/V) e

colocou-se em banho de ultra-som por 30 minutos.

Em seguida, procedeu-se do mesmo modo que para o sistema 1.







ECVB-P1C - Extrato liofilizado de CVB-P1 e obtido pelo sistema 3;



4.4 Obteno da amostra atravs da decoco assistida

Para o preparo da amostra atravs de decoco assistida, pesaram-se 2,5 g

de ch-verde, previamente modo em moinho-de-facas, em erlenmeyer e

adicionaram-se 100 ml de gua Milli-Q aquecida a 80 oC e manteve-se sob

agitao mecnica por 20 minutos em chapa de aquecimento com variao de

temperatura de 2 oC.

Em seguida, a soluo foi centrifugada em 3500 rpm (2000 g) por 5 min; o

sobrenadante foi filtrado a vcuo por papel filtro, em kitasato e funil de bchner. O

resduo foi lavado trs vezes com 5 ml de gua Milli-Q. Adicionaram-se 200 l de

cido actico glacial para estabilizar as catequinas e completou-se o volume at 100

ml com gua Milli-Q. Diluiu-se a amostra na proporo de 1:1 do decocto com

gua Milli-Q.

29

4.5 Determinao simultnea das catequinas e cafena em ch-verde brasileiro

por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE).

4.5.1 Condies do sistema

4.5.1.1 Condies cromatogrficas

Cada soluo foi filtrada por membrana hidroflica 0,22 m e injetada em triplicata

no cromatgrafo seguindo as condies cromatogrficas descritas na Tabela 5.

Tabela 5. Condies experimentais do mtodo isocrtico por CLAE.

Caracterstica Descrio

Fase Mvel H2O pH 2,25 0,03: MeOH: AcOEt (850:130:22,5 V/V)

Coluna fase reversa C-18 Gemini Phenomenex (150 x 4,6 mm DI, partcula esfrica de 5 m, poro 110 ? )

Fluxo da fase mvel 1,7 ml/min.

Comprimento de onda 280 nm

Volume de injeo 20 l

Temperatura de anlise 25 3 C

4.5.1.2 Fase mvel (FM) e soluo de diluio (SD)

A fase mvel foi preparada acidificando a gua ultrapura (Milli-Q) com cido

fosfrico at pH 2,25 0,03; sendo que 850 ml desta soluo aquosa foram

misturados com 130 ml de metanol e 22,5 ml de acetato de etila, constituindo, assim

a fase mvel. Utilizou-se a fase mvel como diluente (SD) para as substncias

qumicas de referncia (SQR) e os extratos.

4.5.1.3 Decoctos de ch-verde

Para anlise dos decoctos de ch-verde, utilizou-se as mesmas condies

cromatogrficas descritas para os extratos secos, item 4.5.1.1. Filtrou-se a amostra

em membrana 0,22 m antes de ser injetada no cromatgrafo.

30

4.6 Validao da metodologia CLAE-DAD

Para a validao da metodologia desenvolvida por CLAE-DAD foram avaliados

os parmetros de linearidade, preciso, exatido, especificidade (pureza do pico),

robustez, limite de deteco e de quantificao. A preciso e a exatido do mtodo

foram avaliadas utilizando solues diludas de extratos de ch-verde, enquanto que

a linearidade, o limite de deteco e o limite de quantificao foram determinados

utilizando soluo da mistura das SQR.

A especificidade foi avaliada atravs da anlise de pureza de cada pico da

amostra utilizando detector de arranjo de diodos (DAD) e confirmando atravs dos

tempos de reteno de cada SQR.

Foram tambm avaliados os parmetros para adequabilidade do sistema

cromatogrfico.

4.6.1 Adequabilidade do sistema cromatogrfico

Foram avaliados os parmetros de repetibilidade das injees, eficincia da

coluna (N), resoluo (Rs), fator de reteno (k) e fator de cauda (T).

A repetibilidade das injees foi verificada nas solues contendo a mistura

das SQR utilizada para preciso intra-dia, preparadas conforme descrito no item

4.6.2.1. Foram calculados os desvios padro relativos (DPR) dos tempos de

reteno e das reas absolutas dos cromatogramas para cada analito. Foram

tambm avaliados, nessas solues, os parmetros de N, Rs, k e T.

Os testes de adequabilidade do sistema cromatogrfico foram efetuados com

trs replicatas de injees, tanto para soluo de referncia como para a soluo

amostra.

Os critrios para aceitao dos resultados obtidos nos ensaios para

adequabilidade do sistema cromatogrfico, foram os preconizados (BRASIL, 2003;

31

USP 29; ICH Q2(R1), 2005) e os mesmos foram avaliados durante todo o

desenvolvimento deste trabalho.

4.6.2 Preparo das curvas-padro

Para cada substncia de interesse, construiu-se uma curva-padro com cinco

diferentes concentraes. Cada ponto da curva foi injetado em triplicata ou at

obteno de um desvio padro relativo aceitvel, conforme as condies descritas

no item 4.5.1.

A curva padro de cada substncia qumica de referncia (SQR) foi realizada

em trs dias diferentes, e com as reas mdias dos cromatogramas obtidas nos

diferentes dias, um grfico foi construdo para cada substncia, plotando-se os

resultados de rea versus concentrao (g/ml). Foram calculados, para cada SQR,

o coeficiente de correlao e a equao da reta da curva padro. Esta, para cada

substncia, foi determinada atravs do estudo de regresso linear, pelo mtodo dos

mnimos quadrados, e validada pela anlise de varincia (ANOVA).

4.6.2.1 Preparo da mistura das substncias qumicas de referncia

Para a obteno de cada soluo-me, foram pesados, separadamente, em

balana analtica exatamente as seguintes quantidades das substncias qumicas de

referncia (SQR) 1,10 mg de cido glico (AG), 1,09 mg de catequina (C), 1,98 mg

de cafena (CAF), 1,65 mg de epicatequina (EC), 2,18 mg de galato de epicatequina

(ECG), 5,28 mg de epigalocatequina (EGC), 8,31 mg de galato de epigalocatequina

(EGCG) e 1,11 mg de galato de galocatequina (GCG). Diluram-se, separadamente,

as SQR pesadas em balo volumtrico de 10 ml, com a soluo de diluio (SD).

Cada soluo-me foi diluda em cinco diferentes concentraes que foram

utilizadas na obteno da respectiva curva-padro, com o auxlio de micropipeta. A

diluio e a concentrao final de cada SQR esto apresentadas na Tabela 6.

32

Tabela 6 Concentrao final de cada soluo, em g/ml, utilizadas para construo da curva padro com 5 pontos.

Pontos 1 2 3 4 5

Volume da soluo-me das SQR (l) 300 700 900 1100 1500

Volume de diluente (SD) (l) 1300 900 700 500 100

Con

cent

ra

o fin

al (

g/m

l)

cido glico (AG) 20,6 48,1 61,9 75,6 103,1

catequina (C) 20,4 47,7 61,3 74,9 102,2

cafena (CAF) 37,1 86,6 111,4 136,1 185,6

epicatequina (EC) 30,9 72,2 92,8 113,4 154,7

galato de epicatequina (ECG) 40,9 95,4 122,6 149,9 204,4

epigalocatequina (EGC) 99,0 231,0 297,0 363,0 495,0

galato de epigalocatequina (EGCG) 155,8 363,6 467,4 571,3 779,1

galato de galocatequina (GCG) 20,8 48,6 62,4 76,3 104,1

4.6.3 Preparo das amostras

As solues-amostra foram preparadas pesando exatamente cerca de 50,0

mg dos extratos liofilizados e dissolvendo-os em balo volumtrico de 20 ml com

soluo de diluio (SD). Os bales foram submetidos a banho com ultra-som por 5

minutos e aps as solues foram filtradas em membrana de 0,45 m antes de

serem injetadas no CLAE.

4.6.4 Exatido

A exatido do mtodo foi verificada pela adio de quantidades conhecidas

das SQR na amostra ECVB-V1A, de forma a obter a amostra acrescida de menor

concentrao e a amostra acrescida de maior concentrao.

O ensaio para cada amostra acrescida (AA) foi realizado em dois dias

diferentes, sendo cada uma analisada em triplicata, conforme condies descritas no

item 4.5.1.

4.6.4.1 Preparo das solues amostra e soluo-me das substncias qumicas de

referncia.

Diluram-se as substncias qumicas de referncia em soluo diluente (SD)

de mesma composio da fase mvel, de forma a obter soluo contendo

33

exatamente 110 g/ml de cido glico, 109 g/ml de catequina, 198 g/ml de

cafena, 165 g/ml de epicatequina, 218 g/ml de galato de epicatequina, 528 g/ml

de epigalocatequina, 831 g/ml de galato de epigalocatequina e 111 g/ml de galato

de galocatequina.

Para o preparo da soluo de ECVB-V1A, foram pesados exatamente 100,1

mg do extrato em balo volumtrico de 20 ml e diludos com soluo de diluio

para se obter a concentrao de 5005 g/ml.

Transferiram-se alquotas de 1000 l da soluo de ECVB-V1A para seis

tubos de ensaio de 5 ml. Separaram-se 2 tubos para amostra (A), dois tubos para

amostra acrescida de menor concentrao (AA1) e dois tubos para amostra

acrescida de maior concentrao (AA2). Nos tubos denominados A adicionaram-se

1,5 ml de SD com o auxlio de uma micropipeta. Nos tubos denominados AA1 foram

adicionados 1 ml de SD e 500 l de soluo-me de SQRs. Nos tubos denominados

AA2 foram adicionados 500 l de SD e 1 ml de soluo-me de SQR. Conforme

Tabela 7.

Tabela 7 Concentrao final de cada componente, em g/ml, presente nas solues A, AA1 e AA2. Amostra (A) AA1 AA2

Volume da soluo de ECVB-V1A adicionado (l) 1000 1000 1000

Volume de soluo-me de SQR (l) 0 500 1000

Volume de SD (l) 1500 1000 500

Concentrao final do extrato (g/ml) 2002 2002 2002

Con

cent

ra

o fin

al

adic

iona

do (

g/m

l)

cido glico (AG) 22 44

catequina (C) 21,8 43,6

cafena (CAF) 39,6 79,2

epicatequina (EC) 33 66

galato de epicatequina (ECG) 43,6 87,2

epigalocatequina (EGC) 105,6 211,2

galato de epigalocatequina (EGCG) 166,2 831

galato de galocatequina (GCG) 22,2 44,4

34

4.6.5 Preciso

A preciso do mtodo foi verificada na amostra ECVB-V1A atravs de nove

ensaios completos, sendo realizados trs ensaios por dia e analisados em triplicata.

Da amostra ECVB-V1A, trs alquotas foram retiradas, contendo exatamente cerca

de 40 mg e solubilizadas com a soluo de diluio em bales volumtricos de 10,

15 e 20 ml, respectivamente. As solues foram filtradas em membrana de 0,45 m

antes de serem analisadas por CLAE. Este procedimento foi realizado em trs

diferentes dias e os resultados foram expressos em desvio padro relativo (DPR).

4.6.6 Especificidade

A especificidade foi determinada em todas as amostras analisadas,

preparadas conforme item 4.6.3, atravs da determinao da pureza dos picos

cromatogrficos, com a utilizao do equipamento descrito no item 4.1.

4.6.7 Limite de deteco (LD)

O limite de deteco, para cada substncia de interesse foi estimado

calculando-se a partir dos dados obtidos da equao da reta da curva padro, pela

equao:

bDP

LD]3,3.[

=

Onde:

DP = desvio padro do intercepto

b = inclinao da reta

4.6.8 Limite de quantificao (LQ)

O limite de quantificao, para cada substncia de interesse foi estimado

calculando-se a partir dos dados obtidos da equao da reta da curva padro, pela

equao:

35

bDP

LQ]10.[

=

Onde:

DP = desvio padro do intercepto

b = inclinao da reta

4.6.9 Robustez

A robustez do mtodo foi avaliada atravs das seguintes alteraes:

Variao do pH da fase mvel (pH 2,25 ? 2,30);

Comprimento de onda de leitura (280 ? 275 nm).

4.7 Atividade antioxidante in vitro

4.7.1 Mtodo fotocolorimtrico do DPPH

Todo o procedimento foi baseado nas tcnicas descritas por BRAND-

WILLIAMS e colaboradores (1995), TREVISAN e colaboradores (2006) e CHAN e

colaboradores (2007) com pequenas modificaes. A atividade antioxidante dos

extratos de ch-verde foi determinada atravs do mtodo de doseamento

fotocolorimtrico do radical 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH). Como substncia

antioxidante de referncia, foi utilizado o cido ascrbico. Todas as substncias

qumicas de referncia utilizadas nos doseamentos das amostras tambm foram

testadas por este mtodo.

Os extratos utilizados foram os descritos nos itens 4.3.1, 4.3.2 e 4.3.3.

Para construo da curva-padro do DPPH, utilizaram-se solues nas

seguintes concentraes: 84,96; 127,44; 169,9 e 254,88 M de 2,2-difenil-1-

picrilidrazila.

36

Preparou-se cada soluo amostra a partir dos diferentes extratos liofilizados

de ch-verde, das amostras comerciais e das substncias qumicas de referncia e

em seguida, diluiu-se em metanol conforme as concentraes descritas nas Tabelas

8 a 12.

Tabela 8 Concentraes finais (g/ml) utilizadas no estudo da atividade antioxidante in vitro, de cada substncia de referncia .

c

ido

asc

rbic

o

cid

o g

lico

cate

quin

a

epic

ateq

uina

epig

aloc

ateq

uina

gala

to d

e ep

icat

equi

na

gala

to d

e ep

igal

ocat

equi

na

gala

to d

e ga

loca

tequ

ina

Soluo-me

(g/ml) 34,67 32,32 31,2 32,96 31,4 32,2 31,2 32,4

DPPH (250 M) 1000l 1000l 1000l 1000l 1000l 1000l 1000l 1000l

Volume final 1500l 1500l 1500l 1500l 1500l 1500l 1500l 1500l

Con

cent

ra

o

final

(g

/ml)

Ponto 1 2,31 1,08 2,08 1,10 2,09 2,15 1,04 2,16

Ponto 2 4,62 1,62 4,16 3,30 4,19 4,29 2,08 4,32

Ponto 3 6,93 2,15 6,24 4,39 6,28 6,44 4,16 6,48

Ponto 4 9,24 3,23 8,32 7,69 8,37 8,59 6,24 8,64

Ponto 5 11,55 4,31 10,4 9,89 10,47 10,73 * *

* ponto no avaliado

Tabela 9 Concentraes finais (g/ml) utilizadas no estudo da atividade antioxidante in vitro, de

cada extrato liofilizado extrado pelo sistema 1. .

EC

VB

-V1A

EC

VB

-V2A

EC

VB

-V3A

EC

VB

-P1A

EC

VB

-P2A

EC

VB

-P3A

Soluo-me (g/ml) 99,20 96,64 101,76 32,96 31,4 97,28

DPPH (250 M) 1000l 1000l 1000l 1000l 1000l 1000l

Volume final 1500l 1500l 1500l 1500l 1500l 1500l

Con

cent

ra

o

final

(g

/ml)

Ponto 1 6,61 6,44 6,78 6,19 5,03 6,49

Ponto 2 9,92 9,66 10,18 12,37 7,55 9,73

Ponto 3 13,23 16,11 13,57 15,47 10,07 12,97

Ponto 4 16,53 19,33 16,96 18,56 12,59 16,21

Ponto 5 19,84 * 20,35 * 15,10 19,46

* ponto no avaliado

37

Tabela 10 Concentraes finais (g/ml) utilizadas no estudo da atividade antioxidante in vitro, de

cada extrato liofilizado extrado pelo sistema 2.

EC

VB

-V1B

EC

VB

-V2B

EC

VB

-V3B

EC

VB

-P1B

EC

VB

-P2B

EC

VB

-P3B

Soluo-me (g/ml) 64,00 64,96 64,32 64,32 69,44 71,36

DPPH (250 M) 1000l 1000l 1000l 1000l 1000l 1000l


Con

cent

ra

o

final

(g

/ml)

Ponto 1 2,13 4,33 2,14 4,29 4,63 4,76

Ponto 2 6,40 6,50 6,43 6,43 6,94 7,14

Ponto 3 8,53 8,66 8,56 8,58 9,26 9,51

Ponto 4 14,93 10,83 14,98 10,72 11,57 11,89

Ponto 5 * 12,86 * 12,86 13,89 14,27

* ponto no avaliado

Tabela 11 Concentraes finais (g/ml) utilizadas no estudo da atividade antioxidante in vitro, de cada extrato liofilizado extrado pelo sistema 3.

EC

VB

-V1C

EC

VB

-V2C

EC

VB

-V3C

EC

VB

-P1C

EC

VB

-P2C

EC

VB

-P3C

Soluo-me (g/ml) 80,64 80,00 81,28 83,84 81,28 78,08

DPPH (250 M) 1000l 1000l 1000l 1000l 1000l 1000l


Con

cent

ra

o

final

(g

/ml)

Ponto 1 8,06 5,33 8,13 8,38 8,13 5,21

Ponto 2 10,75 8,00 10,84 11,18 10,84 7,81

Ponto 3 13,44 10,67 13,55 13,97 13,55 10,41

Ponto 4 16,13 13,33 16,26 16,77 16,26 13,01

Ponto 5 * 16,00 * * * 15,62

* ponto no avaliado

38

Tabela 12 Concentraes finais (g/ml) utilizadas no estudo da atividade antioxidante in vitro, de cada extrato liofilizado das amostras comerci

Documents

cromatografia 5 ocimum