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RESUMEN
La cromatografía en columna es una técnica de separación, generalmente usada para
compuestos orgánicos, que tiene el mismo principio que la cromatografía en papel y en
capa fina, ya que para la separación de los componentes de la sustancia, se juega con
su polaridad.
El proceso consiste en llenar una columna de vidrio o plástico, como lo fue en este
caso, con un soporte sólido adsorbente que fue la fase estacionaria, alúmina (Al2O3)).
La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte. El
resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase móvil)
que, por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a través de la columna.
Se establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el
disolvente eluyente que fluye por la columna. Debido a que cada uno de los
componentes de una mezcla establecerá interacciones diferentes con la fase
estacionaria y la móvil, serán transportados a diferentes velocidades y se conseguirá su
separación
Se logró separar 15ml de la fase verde correspondiente a clorofilas y 10ml de una fase
amarilla clara, correspondiente a carotenos.
Se determinó que las longitudes de onda máximas experimentales para la clorifila fue
de 630nm y entre 415-435nm para los carotenos.
MARCO TEORICO
Cloroplastos
Los cloroplastos son los organelos en donde se realiza la fotosíntesis. Están formados
por un sistema de membranas interno en donde se encuentran ubicados los sitios en
que se realiza cada una de las partes del proceso fotosintético.
Los cloroplastos son plastidios que contienen los pigmentos verdes clorofila a y b, así
como carotenoides de color anaranjado y xantofilas amarillas, son característicos de los
seres fotoautótrofos, que poseen la maquinaria enzimática para transformar la energía
solar en energía química, a través de la fotosíntesis
Figura 1. Espectro de absorción óptica de la clorofila como grafico de porcentaje de
absorción versus la longitud de onda. La clorofila a, se muestra en rojo y la clorofila b
en azul.
Fuente: bibliografía 1.
Clorofilas
La clorofila: Es una porfirina, contiene un átomo de magnesio en el centro del anillo de
porfirina. Contiene radicales específicos unidos al anillo de porfirina, así como una
molécula hidrofóbica de un alcohol de cadena larga. La clorofila se asocia con lípidos y
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proteínas hidrofóbicas de las membranas fotosintéticas mediante esta cadena lateral
del alcohol. Se localiza en la membrana de los tilacoides dentro de la célula.
Existen dos, clorofila a y clorofila b y se distinguen por sus diferentes espectros de
absorción.
Clorofila a :Es de color verde porque absorbe con preferencia la luz roja y la azul y
transmite la luz verde. Muestra una fuerte absorción de la luz roja (absorción máxima a
una longitud de onda de 680nm) y de la luz azul (máximo a 430nm). Esta clorofila se
encuentra en los procariotas y las bacterias.
Clorofila b: Tiene una absorción máxima de 660nm en vez de 680
Carotenos y Xantofilas
El β-caroteno, es el carotenoide más abundante en la naturaleza y el más importante
para la dieta humana, por lo que da su nombre a todo un grupo de compuestos
bioquímicos.
El espectro de absorción del β-caroteno muestra dos picos de absorción entre los
400 nm y 500 nm, correspondiente al azul y verde, por lo que la luz roja-anaranjada-
amarilla que refleja le proporciona su color característico. En general, el contenido de
carotenos y xantofilas (carotenoides) se cuantifica a 480 nm.
Figura 2. Longitudes de ondas de los pigmentos en los cloroplastos.
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La cromatografía en columna es el método más general, utilizado para la separación,
a la vez que para la purificación, de diferentes compuestos orgánicos que se
encuentren en estado sólido o líquido.
En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria utilizada, es
decir, el absorbente, se coloca en el interior de una columna de
vidrio o plástica, la cual finaliza con una llave para controlar el paso
de sustancias al exterior de la columna.
La fase estacionaria se impregna con el eluyente o fase móvil.
Seguidamente la mezcla orgánica que nos interesa separar la
depositamos por la parte superior de la fase estacionaria, y así la
fase móvil podrá ir atravesando el sistema.
Los compuestos que se encuentran disueltos en la fase móvil, poco
a poco saldrán de la columna cromatográfica, y se recogen en
fracciones. Las fracciones menos polares, que son por lo general
las que se retienen poco o nada en el absorbente, serán las primeras en salir de la
columna.
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RESULTADOS
Tabla 1. Volúmenes de muestra recuperados
Verde 15ml
Amarillo 9ml
Tabla 2. Longitud de onda máxima de absorción de las muestras obtenida por
espectroscopia UV-Vis
Color Absorción máxima
[A]
Longitud de onda
[nm]
Verde 2.767 295
0.355 630
Amarillo 2.792 305
Tabla 3. Datos teóricos de longitud de onda a la máxima absorbancia correspondientes
a cada pigmento.
Compuesto Color Longitud de onda a la Longitud de onda
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máxima absorbancia [nm] experimental
Clorofila a Verde intenso 680 --
Clorofila b Verde 640 630
Carotenos Amarillo claro 400-500 305
Xantofilas Amarillo
anaranjado
480 --
DISCUSION
La cromatografía en columna es una técnica de separación, generalmente usada para
compuestos orgánicos, que tiene el mismo principio que la cromatografía en papel y en
capa fina, ya que para la separación de los componentes de la sustancia, se juega con
su polaridad.
El proceso consiste en llenar una columna de vidrio o plástico, como lo fue en este
caso, con un soporte sólido adsorbente que fue la fase estacionaria, alúmina (Al2O3)).
Se analizó los componentes de los cloroplastos. Los cloroplastos le dan ese color
característico a las plantas verdes. Para ello se pesaron 15g de hojas de durazno, se
macero con 10mñ de metanol y se dejó reposar, luego se agregó 6ml de hexano y se
separó el extracto. Luego se separó el extracto en un ampolla de decantación y se lavó
con una solución de NaCl para eliminar los residuos de disolvente. Se descartó la fase
polar y a la fase no polar se le agrego se depositó en un beacker.
Se preparó la columna cromatográfica colocando un algodón en la parte inferior de la
columna sobre la llave de paso y luego se rellenó la columna con alúmina, se agregó
una solución de tolueno-acetona 9:1. Se esperó hasta que se mojara toda la fase
estacionaria, se colocó el extracto. Se utilizó una fase móvil de hexano debido a que
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este es de baja polaridad al igual que el extracto, con esto se consiguió separar una
fase amarilla, correspondiente a los carotenos.
Luego de un tiempo, había quedado una fase verde en la parte superior de la columna.
Para extraerla se agregó metanol que es un disolvente más polar que el hexano y se
logró separa 15ml de pigmentos verdes, los cuales corresponden a la clorofila.
Para saber que compuesto representaba cada color, se realizó un barrido para
determinar la longitud de onda a la máxima absorción, para cada color. Se obtuvieron
las gráficas 1 y 2 (ver anexo). Para el barrido de color amarillo, se obtuvo un pico muy
claro y definido, el cual se tomó como representativo de carotenosy ocurre a 305nm.
Por otra parte el barrido para el compuesto verde, el barrido marco varios picos. Al
comparar la figura 2 con la figura 4, se encuentra una similitud. La figura 3, es el barrido
obtenido en el laboratorio y el pico 11 da una longitud de onda de 630, es similar a la
longitud de onda máxima teorica, según la figura 1, entre 600 y 700nm
aproximadamente, por lo que se tomó como válida la separación de clorofila b
En el caso de los volúmenes obtenidos, no se tomaron como representativos ya que no
se utilizó la misma fase móvil. Ya que el hexano no logro hacer descender el verde en
la columna, por lo que se le agrego un disolvente más polar, metanol, hasta que este
descendiera. Por esta razón el volumen de verde o clorofila a, fue de 15ml y 9ml para
los carotenos.
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CONCLUSIONES
1. La cromatografía en columna es un método sencillo de identificación y
separación de los compuestos de los cloroplastos.
2. De la maceración de hojas verdes de durazno, se logró separar clorofila b,
verde, y carotenos que fue la solución amarilla clara.
3. la longitud de onda máxima experimental para la clorofila b fue de 630nm y
305 para los carotenos.
4. Al realizar una separación en columna se debe verificar las polaridades de la
fase móvil como el de la muestra en estudio.
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BIBLIOGRAFÍA
1. Atkins, William. Loretta Ones “Principios de Química: Los Caminos Del
Descubrimiento” Editorial Medica Panamericana. Pág. 124.
2. Descripcion de compuestos de los cloroplastos. Consultado el 22/4/2013.
Disponible en http://espanol.answers.yahoo.com/question/index?
qid=20080103100126AAFeyKm
3. Isoprenos/Terpeno. Consultado el 22/4/2013. Disponible en:
http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e20/20b.htm
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ANEXOS
Fotografías de práctica
1. Decantación del extracto
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2.
Columna al inicio, agregando la fase móvil
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3. Columna a media separación
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4. Separaciones obtenidas
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Fotografía de resultado del análisis espectrofotométrico
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Figura 1. Verde
Figura 2. Amarillo
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