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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões

Química Industrial

Química Analítica Instrumental A

Juliane Froncheti de Moura

Santo Ângelo, 13 de Maio de 2014.

Aplicações da Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (HPLC)

HPLC

Toxicologia

Cosméticos

Fármacos

Pesticidas

Alimentos

Corantes

Aminoácidos

Proteínas

Pré – requisito: a amostra deve ser solúvel

na fase móvel

Vantagens:

FE é utilizada várias vezes.

Versatilidade: único requisito é a solubilidade da

amostra na FM.

Tempo reduzido de análise.

Alta resolução.

Boa para análise qualitativa.

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Parâmetros para identificação: tR, espectro de

absorção no UV (detector de arranjo de diodos),

espectro de massas.

Bons resultados quantitativos: desvios inferiores a 5%.

Boa detectabilidade.

Automação

Vantagens: Desvantagens:

Alto custo do equipamento.

Alto custo de manutenção do equipamento

Não existe um detector universal com boa

detectabilidade e baixo custo:

Índice de refração: baixa detectabilidade (10-6 g),

pouco estável,

Espectrofotômetro de massas: ~US$ 150.000

Sistema de HPLC Sistema de HPLC - comercial

Filtro do Reservatório:

Captar a FM e evitar que partículas suspensas

na FM obstruam os capilares ou contaminem a bomba.

Filtros de 10 a 40 um.

Fase Móvel Fase Móvel - Solventes

DEVE TER ALTO GRAU DE PUREZA

As impurezas da FM podem absorver e diminuir a

sensibilidade do detector.

TER POLARIDADE E VISCOSIDADE ADEQUADAS.

NÃO DEGRADAR A FASE ESTACIONÁRIA

Não utilizar fases móveis agressivas.

SER COMPATÍVEL COM O DETECTOR UTILIZADO

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Fase Móvel - Solventes

FILTRAÇÃO DA FASE MÓVEL

Essencial

DESGASEIFICAÇÃO DA FASE MÓVEL

Indispensável para o bom funcionamento do sistema

Garante:

Reprodutibilidade da vazão: retira ar dissolvido na fase

móvel e evita bolhas na bomba;

Estabilidade na linha de base: bolhas no detector

causam instabilidade na linha de base.

Métodos de desgaseificação

ULTRA - SOM

Muito lento, pouco eficiente, requer agitação, em

geral o pior método quando usado sozinho.

VÁCUO + ULTRA - SOM

Rápido, eficiente, refazer de 12 em 12 horas.

PURGA COM HÉLIO

Contínuo, hélio é relativamente caro, leva a aumento

de vazamentos, maior custo operacional.

DESGASEIFICADOR “ON-LINE”

Contínuo, remove o ara logo antes da entrada da

bomba, investimento alto inicial (melhor opção a longo

prazo).

Eluição

É o desenvolvimento da amostra no sistema cromatográfico.

ISOCRÁTICA

Mesma composição da fase móvel durante a eluição.

Ex: Hexano ou metanol/Água 80:20 (v/v)

GRADIENTE

A composição da fase móvel varia durante a eluição.

Utilizado na separação das misturas complexas com diferentes

funções químicas.

Exemplo:

Sistemas de Injeção de amostras - Injetores

‐ Amostra deve ser aplicada na coluna pressurizada na forma de

uma banda estreita.

‐ Válvula de introdução de amostra mais comum: válvula de 6

pórticos (orifícios).

‐ Alça de amostragem ou loop: comprimento e diâmetro do loop

para escala analítica interno definem seu volume

Loop para escala

analítica (uL)

Loop para escala

preparativa (uL)

Sistemas de Injeção de amostras - Injetores Colunas Cromatográficas

Tubo de aço inoxidável tratado; contém FE.

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Colunas Cromatográficas Condicionamento da Coluna

Necessário para que haja um perfeito equilíbrio entre a FM e a FE.

Coluna nova: 4 – 8 horas

Coluna parada a alguns dias: 2 horas

Coluna de uso diário: 15 minutos

Coluna deve ser

guardada em solvente

orgânico ou fase móvel!

Cuidados com a Coluna

Manter a coluna sempre tampada.

Evitar choques de pressão, térmicos e mecânicos.

Usar pré-coluna (guard columm)

Usar solventes ultrafiltrados

Pré-tratamento das amostras deve considerar eliminação de

partículas e de impurezas que possam ficar adsorvidas.

Obedecer faixa de pH em que a FE é estável (2 < pH < 8)

Eliminar sais, tampões e aditivas de FM antes de armazenar a

coluna.

Cuidados com a Pré-Coluna

Remover partículas;

Remover substâncias que teriam forte interação com a coluna;

Remover substâncias que posam precipitar quando em contato

com a FM e FE.

Resumindo, aumentar o tempo de vida das colunas.

Instalada entre o injetor e a coluna, com cerca de 2

cm de comprimento, tem a função de :

Cromatografia : Classificação pela polaridade da

fase estacionária

Cromatografia em FASE NORMAL: fase estacionária polar

Exemplo: sílica gel

Cromatografia em FASE REVERSA: fase estacionária de baixa

polaridade

Exemplo: sílica de fase ligada C18

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Cromatografia de Fase Reversa (FR)

COLUNA DE FASE REVERSA C18

Aplicação quase universal (~ 70% das aplicações da

literatura).

Permite analise desde substancias hidrossolúveis e/ou

iônicas até substâncias lipofílicas

VANTAGENS

FE menos polar que a FM

- Equilíbrio mais rápido

- Menor adsorção irreversível

- Água não influencia na reprodutibilidade

- Sítios de adsorção mais homogêneos

- Eluição em gradiente facilitada

Cromatografia de Fase Reversa (FR)

Cromatografia de Fase Reversa (FR)

FE menos polar que a FM

Aplicação: Análise de tocoferóis

Fase reversa (C18)

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Vantagens Desvantagens

FASE REVERSA

Otimização dos parâmetros envolvidos na separação

cromatográfica

PRATOS TEÓRICOS

Conceito baseado na analogia entre CROMATOGRAFIA,

DESTILAÇÃO e EXTRAÇÃO COM SOLVENTES.

COLUNA CROMATOGRÁFICA

Vários estágios de extração líq.-

líq ou de pratos teóricos

(destilação).

Prato Teórico: Segmento da coluna onde se atinge um equilíbrio

termodinâmico entre FM, FE e analito.

Número de pratos teóricos e altura equivalente a

um prato teórico

Tempo de retenção e tempo de retenção ajustado

tM (t0) – tempo morto: tempo em que elui 1 componente que não

interage com a fase móvel.

tR – tempo de retenção: tempo necessário para eluir uma substância de

um determinado sistema cromatográfico (máximo do pico

cromatográfico).

t’R – tempo de retenção ajustado:

Fluxo (Fc ou F): vazão da fase móvel, geralmente em mL/min.

Volume morto (VM): volume de FM necessário para preencher todos os

interstícios e poros da FE, ou volume de FM necessário para eluir uma

substância que não interage com a FE.

Volume de retenção (VR): volume de FM necessário para eluir uma

substância de um determinado sistema cromatográfico.

Fator de retenção (k)

Relação de partição/Relação de retenção/Fator de capacidade (k)

Razão de distribuição do analito entre FE e FM.

> k > afinidade pela fase estacionária.

Posição de um pico no cromatograma depende do fluxo e do fator de

retenção.

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Cálculo do Fator de retenção (k) Eficiência da Coluna (N)

Relação entre tempo de permanência do analito na coluna e

alargamento das bandas .

Determinada pelo número de pratos teóricos

Número de pratos teóricos efetivos (Nef): substitui-se tR por t’R

Cálculo da Eficiência (N) Retenção Relativa ou Fator de Separação (α)

Seletividade

Razão entre fatores de retenção de 2

analitos.

> α, melhor a separação

Cálculo do Fator de Retenção (α) Resolução (Rs)

Indica a qualidade da separação entre duas bandas cromatográficas .

Resolução completa: Rs > 1,25 (ou 1,50)

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Otimização Cromatográfica

ISOCRÁTICA

Modos de eluição em cromatografia líquida

GRADIENTE

Ajuste da força cromatográfica

Ajuste da força cromatográfica Ajuste da força cromatográfica

Ajuste da força cromatográfica -

Gradiente Bombas de Alta Pressão

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Detectores Detectores - Classificação

Detector no UV/Vis de comprimento de onda fixo

Mede só um comprimento de onda.

Mudança de comprimento de onda só com troca de filtro.

Lâmpada de vapor de mercúrio (253,7 nm – banda mais

intensa)

Filtro mais comum (254 nm) – onde maioria das

substâncias orgânicas tem absorção.

Exige maior conhecimento prévio da amostra.

Baratos.

Detector no UV/Vis de comprimento de onda variável

Permite selecionar um comprimento de onda. (190 –

600 nm)

Possível de mudar o comprimento de onda durante a

análise – Otimização da sensibilidade.

Possível optar por maior ou menor sensibilidade e

seletividade

Operação muito fácil.

Detectores baseados no fenômeno de fluorescência

Mais sensível – 10 a 1000 vezes mais sensível que UV.

Cerca de 15% das substâncias orgânicas são fluorescentes.

Específico e seletivo.

Substâncias

Fluorescentes

Moléculas com

ligações duplas conjugadas

e grupos aromáticos

Absorvem radiação

de comp. de onda mais

curto e emitem radiação de

comp. de onda maior.

O que NÃO se deve fazer em HPLC

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