Upload
veronica-montoya
View
367
Download
4
Embed Size (px)
Citation preview
CROMATOGRAFÍA
Mikhail Tswett, 1906Separación de pigmentos vegetales usando una columna de carbonato cálcico
CROMATOGRAFÍA
Separación de los
componentes de una mezcla
(muestra), disueltos en una
fase móvil a medida que se
van desplazando con
diferente velocidad a través
de una fase estacionaria
TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS
ESTADO FÍSICO DE LAS FASES:
Fase Móvil- Gaseosa (Cromatografía de
gases)- Líquida (Cromatografía Líquida)
Fase Estacionaria
- Líquida (inmovilizada, soporte)- Sólida
TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS
CRITERIOS DE SEPARACIÓN:
1. REPARTO (F. estacionaria “líquida”)Los componentes de la mezcla se reparten entre las fases móvil y estacionaria en función de sus características. La composición de la fase móvil es constante.
2. ADSORCIÓN (F. estacionaria sólida)Los componentes de la mezcla quedan retenidos sobre la superficie de la fase estacionaria y hay que cambiar la composición de la fase móvil para eluirlos.
CROMATOGRAFÍA DE REPARTO
1.SOLUBILIDADFase “Normal”: F. Estacionaria polar, F. Móvil
apolar
Fase Reversa: F. Estacionaria apolar, F. Móvil polar
2. TAMAÑO (exclusión molecular)Fases móvil y estacionaria líquidas idénticasseparadas por una especie de tamiz o malla
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
1. INTERCAMBIO IÓNICOFase estacionaria positiva: Intercambio aniónicoFase estacionaria negativa: Intercambio catiónico
2. INTERACCIÓN HIDROFÓBICAFase estacionaria hidrofóbica
3. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD BIOLÓGICAFase estacionaria con ligandos inmovilizados
4. ADSORCIÓN INESPECÍFICAhidroxiapatita, colorantes inmovilizados
TIPOS DE CROMATOGRAFíA
Tipo de interacción/reparto
Tipo de cromatografía
Reparto Solubilidad •Fase Normal•Fase Reversa
Tamaño •Exclusión Molecular
Interacción Electrostática •Intercambio aniónico•Intercambio catiónico
Hidrofóbica
Afinidad biológica •Ligandos inmovilizados•Inmunoafinidad
Afinidad inespecífica
•Hidroxiapatita•Colorantes
FORMATO
1. COLUMNA - Sistemas manuales - Equipos automatizados(HPLC)
2. “BATCH” o TANDAS
3. SUPERFICIES PLANAS
- Papel - Capa fina (TLC, thin layer
chromatography)
TERMINOLOGÍA
• FASE ESTACIONARIA: (matriz, soporte cromatográfico)
componente estático de la cromatografía
• FASE MÓVIL: (eluyente) solvente que arrastra a través de la columna los componentes de la mezcla a analizar
• ELUCIÓN: paso de fase móvil a través de una columna hasta lograr la salida de los solutos
• ELUIDO: fase móvil que se recoge a la salida de una columna
TERMINOLOGÍA
• CROMATOGRAMA: Perfil cromatográfico, Perfil de
elución. Representación gráfica de la cuantificación de
solutos en el eluído de una columna
• VOLUMEN DE ELUCIÓN: volumen de fase móvil que pasa
a través de la columna hasta que sale cada soluto
• VOLUMEN MUERTO: volumen de elución de una
molécula que viaja a través de la columna con la
velocidad de la fase móvil, que no experimenta ningún
retraso. También se llama VOLUMEN DE EXCLUSIÓN
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
Bomba(s)
Registrador
Detector
(UV)
Colector de
fracciones
CO
LUM
NA
Solventes
(fase móvil)
Inyector
Mezclador
HPLC:High Performance Liquid
Chromatography
Waters, MilliporeWaters, Millipore
Perceptive BioSystems, BioCAD Perceptive BioSystems, BioCAD
SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS MEDIANTE HPLC
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA(manual)
SEPARACIÓN DE COMPONENTES CELULARES POR ULTRACENTRIFUGACIÓN
ELIMINACIÓN DE MOLÉCULAS PEQUEÑAS MEDIANTE DIÁLISIS
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
VT = Vo+ Vi + Vg
Volumen total
de líquido (Vt)
Volumen de líquido
en los intersticios (Vo)
Volumen de líquido
en las partículas (Vi)
Volumen ocupado
por la matriz (Vg)
Volumen de elución (ml)20 40 60 80 100 120
0.0
2.0
Abs
orba
ncia
(28
0 nm
)
Flujo isocrático, condiciones nativas o desnaturalizantes
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
Nombre comercial Tipo de matriz Rango tamaño
Sephadex G-50 dextran 1500 - 30000 Sephadex G-100 dextran 4000 - 150000 Sephacryl S-200 HR dextran 5000 - 250000
Ultrogel AcA 54 polyacrylamide/agarose 6000 - 70000 Ultrogel AcA 44 polyacrylamide/agarose 12000 - 130000 Ultrogel AcA 34 polyacrylamide/agarose 20000 - 400000
Bio-Gel P-60 polyacrylamide 3000 - 60000 Bio Gel P-150 polyacrylamide 15000 - 150000 Bio-Gel P-300 polyacrylamide 60000 - 400000
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR:Estimación de masas moleculares
20 40 60 80 100 1200.0
2.0
A2
80
nm
Volumen de elución (ml)20 40 60 80 100 120
0.0
2.0
A2
80
nm
67 kD
43 kD
25 kD
14 kD
Log Mr
Vo
lum
en
de
elu
ció
n (m
l)
Recta de calibradoMarcadores de masa molecular
Proteína problema
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
VENTAJAS:
• Flexibilidad en cuanto a solvente
• Condiciones poco agresivas
• Proporciona información estructural
INCONVENIENTES:
• Poco resolutiva, debido a difusión
• La muestra se diluye
• Es necesario aplicar volúmenes muy pequeños
Etapas finales de protocolos de purificación
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR:Columnas de “desalado”
Volumen de elución (ml)
0.2 0.4 0.6 0.8 1. 1.20.0
2.00.3 kD
120 kD
• Cambio de solvente
• Purificación de fragmentos de DNA marcados
(fragmento 200 pb: 120 kD; nucleótidos libres: aprox. 0.3 kD
INTERCAMBIO IÓNICO
INTERCAMBIADORES IÓNICOS
FASE ESTACIONARIA: SOPORTE – GRUPO CARGADO
SOPORTES:
• RESINAS SINTÉTICAS. (P.ej. Poliestireno)
- Densidad muy alta de grupos
intercambiadores
- Muy hidrofóbicas: desnaturalización
de biomoléculas
- Eliminación de impurezas iónicas de
solventes químicos y de tampones
Purificación de agua
•POLÍMEROS NATURALES. Celulosa, agarosa
INTERCAMBIADORES IÓNICOS
INTERCAMBIADORES IÓNICOS
-CH2CH2-N-H
CH2CH3
CH2CH3
+
-CH2CH2-N-CH2CH(OH)CH3
CH2CH3
CH2CH3
+
--CH2CH2-CH2-SO3
--CH2-COO3
Intercambiador Tipo Grupo cargado Abreviatura
De aniones
Fuerte
Dietil-2-hidroxipropilamino etilo
QAE
Débil
Dietilamino etilo
DEAE
De cationes
FuerteSulfo propilo
SP
Débil
Carboxi metilo
CM
INTERCAMBIADORES IÓNICOS
pH
carga
+
-
aniónicofuerte(QAE)
aniónicodébil
(DEAE)
catiónicodébil(CM)
catiónicofuerte(SP)
INTERCAMBIO IÓNICO
[Matriz(-) . Soluto(+)] [Ión(+)]K=
[Matriz(-) . Ión(+)] [Soluto(+)]
Matriz(-). Ión(+) + Soluto(+) Matriz(-) . Soluto(+) + Ión(+)
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
1. Equilibrado. Ajuste a condiciones iniciales
2. Adsorción. Baja fuerza iónica. Intercambio aniónico, pH >pI Intercambio catiónico, pH < pI
3. Lavado. Condiciones iguales a la adsorción.
4. Elución. Modificación de la fase móvil: aumento de fuerza iónica
pH
pI
+
-
INTERCAMBIO IÓNICOGRADIENTE DISCONTINUO
Número de fracción
20 40 60 80 100 120
0.0
0.5
0.0
[NaCl](M)
- - - -
2.0A
bsor
banc
ia (
280
nm)
INTERCAMBIO IÓNICOGRADIENTE LINEAL
Número de fracción
20 40 60 80 100 120
0.0
0.5
0.0
[NaCl](M)
- - - -
2.0A
bsor
banc
ia (
280
nm)
CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA
Fenil-sefarosa Octil-sefarosa Número de fracción20 40 60 80 100 120
0.0
1.0
0.0
2.0
Abs
orba
ncia
(28
0 nm
)
[Sal](M)- - --
CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA
Capacidad de facilitar interacciones hidrofóbicas
(PO4)3- > (SO4)2- > Acetato > Cl- > Br- > SCN-
(NH4)+ > K+ > Na+ > Mg2+ > Ca2+
FORMATO
1. COLUMNA - Sistemas manuales - Equipos automatizados(HPLC)
2. “BATCH” o TANDAS
3. SUPERFICIES PLANAS
- Papel - Capa fina (TLC, thin layer
chromatography)
CROMATOGRAFÍA SOBRE SUPERFICIES PLANAS
- Papel
- Capa fina (TLC, thin layer
chromatography)
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
- Fase estacionaria: H2O retenida entre las fibras de celulosa del papel
- Fase móvil: Solvente orgánico (mezcla)
Cromatografía de reparto, fase normal
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
• Aplicación de la muestra: volumen mínimo
• Desarrollo de la cromatografía: Extremo
sumergido en la fase móvil, sin tocar el punto de aplicación de
la muestra. Recipiente cerrado herméticamente.
Ascendente/descendente
• Detección de las sustancias separadas: – Directa (sustancias coloreadas o fluorescentes)
– Tinción
– Autorradiografía (compuestos radiactivos)
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
• Optimización de cromatografía en papel
• Fase estacionaria: fina capa (0.15-0.5 mm) de
sólido pulverizado sobre una superficie de vidrio, plástico o
cristal.
• Celulosa, poliamida, alúmina, sílica-gel
VENTAJAS DE LA TLC
Característica Efecto Ventaja
Fase estacionaria finamente dividida
Elevada acción capilar Rapidez de desarrollo
Elevada superficie de contacto f. móvil f.
estacionaria Eficiencia cromatográfica
Sensibilidad
Ausencia de estructura fibrosa
Reducida dispersión de los solutos durante
aplicación y desarrollo
Válida cualquier fase estacionaria que pueda
ser pulverizada
Versatilidad
MÉTODOS DE TINCIÓN EN TLC
Método Aplicación Color
Inespecífico
Vapores de Iodo C. orgánicos Pardo-amarillento
H2SO4 + calor C. orgánicos Negro (carbonización)
Específico 2,4-dinitrofenilhidrac
ina
C. carbonílicos
Naranja
AgNO3/OH- C. carbonílicos
Marrón
Ácido iodoplatínico
Bases Púrpura-negro
Verde de bromocresol
Ácidos Verde-amarillento
Ninhidrina Aminas 1rias (aminoácidos
)
Azul-violáceo
Rodamina 6G Lípidos fluorescencia
FACTOR DE RETARDO (Rf)
origen
Frente del solvente
soluto
Rf =Distancia migrada por el soluto
Distancia migrada por el frente
TLC BIDIMENSIONAL1ª
dim
ensi
ón
punto de aplicación
2ª dimensión
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
+ glucose
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
1. Equilibrado. Ajuste a condiciones iniciales.
2. Adsorción. Alta fuerza iónica.
3. Lavado. Condiciones iguales a la adsorción.
4. Elución. • Competición con ligando libre
• Desnaturalización (pH, temperatura, agentes caotrópicos)
Número de fracción20 40 60 80 100
0.0
2.0
Abs
orba
ncia
(28
0 nm
)
Adición de ligando libre
LIGANDOS PARA CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Ligando Aplicación 2’,5’-ADP Deshidrogenasas dependientes de NADP+
5’-AMP Deshidrogenasas dependientes de NAD+ Arginina Serín-proteasas
Benzamidina Serín-proteasas Calmodulina Quinasa, proteínas dependientes de calmodulina
Concanavalina A (ConA) Glicoproteínas, polisacáridos ADN ADN y ARN polimerasas
Gelatina Fibronectina
Heparina Factores de coagulación, lipoproteínas, enzimas específicas de ADN y ARN
Lectinas Glicoproteínas, polisacáridos
Lisina Plasminógeno, ARNr
Proteína A Anticuerpos (IgG) Proteína G Anticuerpos (IgG)
Poli-(U), Poli-(T) Poli-(A), ARNm Poli-(A) Poli-(U)
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD: PREPARACIÓN DE LA FASE ESTACIONARIA
1. Activación del soporte
2. Anclaje covalente del ligando
3. Bloqueo de grupos reactivos
remanentes
+ CNBr
OH
OH
agar
osa O
O
+ NH2-ligando O-C-NH-ligando
OH
NH
agar
osa
=
C=N
agar
osa
PROTEÍNAS DE FUSIÓN RECOMBINANTES
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
INMUNOPRECIPITACIÓN
INMUNOPRECIPITACIÓN