CULTURA DE TECIDOS APLICADA ÀMANUTENÇÃO DE GERMOPLASMA IN

VITRO E AO MELHORAMENTOGENÉTICO DO MARACUJÁ (Passiflora

spp.).

Dra. Ilene Ribeiro da Silva PassosPesquisador Científico -VI

IAC- CPD Recursos Genéticos Vegetais.E-mail:irpassos@iac.sp.gov.br

INTRODUÇÃO

•Fonte: Matos et al. (2005)

Conservação de RecursosGenéticos

“Há muito tempo, a conservação derecursos genéticos tem sidoreconhecida como um componenteessencial no melhoramento deplantas.”

(Withers & Williams , 1998)

Manutenção e Conservação deGermoplasma.

► a) Evitar a erosão genética (conservação).

► b) Manter coleção de estudos (manutenção).

Estratégias:

► In vivo► In situ► In vitro (em cultura/ criopreservação).

Manutenção de germoplasma demaracujá no campo.

Vantagens:►Possibilita a caracterização agronômica.► Estabilidade genética.

Desvantagem:

► Vulnerável.

Manutenção e conservação degermoplasma de maracujá in vitro.

Vantagens:

►Ocupa menos espaço.

► Demanda menos mão de obra.

Desvantagens:

►Variação somaclonal.• .

Melhoramento genético do maracujá.

Métodos Clássicos:(Visam aumentar os alelos favoráveis na população)

a) Seleção massal (alta herdabilidade) quandoexiste bastante variabilidade – Ex. P. alata(Martins, 2002).

b) Por meio de cruzamentos e seleção/ teste deprogênie – Ex. Série IAC -270 e híbridos IAC-275,IAC-273, IAC 277 (Meletti et al.,2000).

Métodos Biotecnológicos.• Transformação genética.►modifica uma característica em cultivar elite.► demanda testes moleculares e testes de campo.b) Hibridação somática.► recombina genótipos: entre espécies ou

gêneros diferentes.►demanda caracterização do híbrido/ seleção/

retrocruzamentos/ testes de campo.►testes moleculares (fusão assimétrica).

ESTUDOS EM PASSIFLORA SPP VISANDO ASUA MANUTENÇÃO IN VITRO.

1. Estabelecimento in vitro de plantas.

2. Organogênese adventícia.

3. Meios de cultura e condições ambientais declonagem (manutenção).

4. Meios de cultura e condições ambientaispara conservação in vitro.

Estabelecimento in vitro de plantas demaracujá.

a) Por meio de sementes.

b) Por meio de explantes vegetativos:

►explorando gemas pré-existentes.

►pela organogênese de novo.

Por meio de sementes.

► Embebição prévia.► Descontaminação.► Meio de cultura.

►Condições ambientais: luz/ temperatura.

►Qualidade das sementes: estágio dematuração do fruto/ retirada do arilo/armazenamento.

Embebição prévia: importância

►Evitar a absorção de agentesdescontaminantes → faz-se aembebição prévia em águadestilada antes dadescontaminação.

►Antecipar a absorção de água pelasemente, antes de ser colocadaem meio de cultura.

ABSORÇÃO DE ÁGUA PELASEMENTE

• Fase I – embebição, onde há umarápida absorção de água pela semente.

• Fase II – as sementes, praticamente,param de absorver água.

• Fase III – as sementes voltam aabsorver água e a respirarintensamente e o eixo embrionárioapresenta crescimento visível.(Carvalho e Nakagawa, 1988)

Dormência em sementes de Passiflora nitida.

► A dormência em P. nitida não estárelacionada com a impermeabilidadedo tegumento (Melo, 1999).

Sementes de várias espécies dePassiflora absorvem água com maiorvelocidade durante 2 a 3 horas deembebição (fase I).

► GA3 →Tabela 1 (Passos et al., 2004).

Descontaminação.

►Retirar restos de arilo com pano“Perfex” ou sapólio, em casosextremos.

► Hipoclorito de cálcio 2%.►Enxágüe com solução ácida para tirar

os resíduos de hipoclorito de cálcio.►Enxaguar muito bem as sementes com

água esterilizada.

Passiflora alata Curtis (7,0x).

Passiflora foetida L.

Passiflora cincinnata Mast (9,0x).

Passiflora edulis Sims (8,5x).

Passiflora nitida Kunth (8,5x).

Sementes de Passiflora alata,P.edulis e P.nitida.

Meios de cultura para a germinação desementes.

Murashige e Skoog (1962) na metade dasconcentrações de sais, vitaminas e açúcar.Solidificado com agar.

Condições ambientais:luz/ temperatura

► P. edulis, P. alata, P. nitida, P. suberosa, P.foetida e P. kermesina (temperatura ≥ 28ºC).

► P.setacea, P. cincinnata (luz).► P. quadrangularis.

Germinação in vitro dePassiflora alata.

Germinação in vitro de P.cincinnata (8,0x).

TABELA 1. Número médio de sementes de Passiflora nitida germinadasaos 14, 28 e 50 dias após a semeadura quando tratadas com 3 dosagens

(0; 500; 1000 mg.L-1) de GA3 nos tratamentos sob luz (L) e escuro (E)(média ± desvio padrão). Campinas, SP, 2001.

4,13±0,83c3,66±1,11d1,66±1,11cEscuro 10003,33±1,00bc3,00±0,70c0,77±0,83bcEscuro 5000,44±0,72a0,33±0,50a0,00±0,00aEscuro 04,30±0,67c4,20±0,63d1,80±1,31cLuz 10003,40±0,96bc2,60±0,96bc0,90±0,73cLuz 5002,30±1,15b1,30±1,15ab0,10±0,31abLuz 0

50 dias28 dias14 diasTempo/Tratamento(mg.L-1 GA3).

Estabelecimento in vitro por meio deexplantes vegetativos.

►explorando gemas pré-existentes.

►pela organogênese de novo.

Estabelecimento in vitro por meio deexplantes vegetativos explorando as

gemas já existentes.• Explantes:►ápices meristemáticos de caule.►segmentos nodais.2. Meio de cultura:►MS com ou sem 6-Benzilaminopurina.3. Limitação:►Contaminações – material de campo e

órgãos mais velhos.

Organogênese de novo ouadventícia.

►Estratégia para estabelecer plantas invitro.

►Estratégia para multiplicação deplantas in vitro.

►Estratégia para obtenção de plantastransformadas.

►Via principal de regeneração de calosprovenientes da hibridação somática.

Organogênese de novo

►Meio de cultura: Murashige e Skoog (1962).►Explantes: cotilédones, hipocótilos, discos

foliares, segmentos internodais.► Aditivos: água de coco, tiossulfato de prata

ou nitrato de prata.► Hormônio vegetal: 6-BA (0,5 – 2,0 mg.L-1)► Condições ambientais: Luz (fotoperíodo de

16 horas)/ Temperatura: 25-30ºC.► Frasco com tampa ventilada.

Organogênese de novo – condições deluminosidade.

► A quantidade de luzfotossinteticamente ativa, medida emµE.m-2.s-2, tem sido bastante variávelentre os trabalhos publicados (25-150µE.m-2.s-2).

►Alexandre (2002) encontrou umaimportante interação entre o nível deirradiância e a concentração desacarose no meio de cultura.

Organogênese de novo – luminosidade xconcentração de sacarose (Alexandre,

2002).Explante: segmentos de hipocótilo.Melhor resposta organogênica:► 1,0 mg.L-1 de BAP + 0,1 mg.L-1 de ANA +

10g.L-1 de sacarose + 150 µE.m-2.s-2, deirradiância.

Maior comprimento de brotos:► 1,0 mg.L-1 de BAP + 20g.L-1 de sacarose +

50µE.m-2.s-2, de irradiância.

Organogênese de novo em Passiflora alata.(Discos foliares de 7mm, em meio MS +

0,5mg.L-1 de 6-BA + 5,0 mg.L-1 de AgNO3)

Organogênese de novo em Passifloracincinnata (raiz não isolada, de plântula em

meio MS/2 + 1,0 mg.L-1 de 6-BA).

Organogênese de novo em P. cincinnata(Lombardi et al. 2005).

► Explantes:a) plântulas;b) discos foliares;c) segmentos de raízes.

► Melhor resposta organogênica: segmentosde raízes com 0,5 mg.L-1 de 6-BA em meioMS com 5% de água de coco.

Organogênese de novo em Passiflora edulis(disco foliar de 7mm em meio MS + 2,0 mg.L-1

de 6-BA) (64% de genótipos regenerativos).

Organogênese de novo em Passiflora nitida(disco foliar de 7mm em meio MS + 1,0 mg.L-1

de 6-BA+2,5 mg.L-1 de AgNO3).

Hibridação somática.

“Obtida pela fusão de protoplastos,é uma alternativa para areprodução sexual a fim decombinar (por meio de tratamentosquímicos ou por eletrofusão) doisgenomas completos, incluindo asorganelas citoplasmáticas”(Binsfeld, 1999 e refs.).

Hibridação somática.

1) Superar incompatibilidades sexuais.2) Produzir anfidiplóides (fusão simétrica).3) Transferir parte de um genoma de umaespécie para outra (fusão assimétrica).4) Transferir o DNA citoplasmático de umaespécie para outra (por meio da obtenção decíbridos).“Visando à obtenção de plantas resistentes aestresses ambientais ou pragas e doenças.(Davey et al., 2005).

Hibridação somática.

►A hibridação somática obtida pela fusãosimétrica de protoplastos, está sendoestudada com vistas ao melhoramentogenético do maracujá no CPD de RecursosGenéticos Vegetais do I.A. de Campinas, SP.(Matos et al., 2005).

►Trabalhos pioneiros sobre a fusão deprotoplastos em Passiflora spp., pormétodos físicos ou químicos, foramefetuados, respectivamente por Otoni et al.(1995) e Dornelas et al. (1995),respectivamente.

Isolamento e cultura de protoplastos emPassiflora spp.

►Para se aplicar a tecnologia da fusão deprotoplastos há necessidade de protocolosde isolamento e cultura, bem estabelecidos,disponíveis na literatura e assimilados noslaboratórios.

► Vieira e Dornelas (1996) apresentam umaimportante revisão sobre protocolos paraobtenção de plantas regeneradas a partir deprotoplastos de espécies de Passiflora.

Isolamento e cultura de protoplastos emPassiflora spp.

►Passos et al (2004b): modificações emprotocolos publicados.

1) Retirou-se o 2,4- D do meio K8, paradiminuir o budding.

2) Diminuiu-se o intervalo entre trocas demeios, quando se visa a diminuiçãoda osmolaridade – 5 dias→ 3- 4 dias.

Isolamento e cultura de protoplastos emPassiflora spp.

Eficiências de plaqueamento:(Densidade: 1,0 x 105 protoplastos /ml;gotas de agarose; K8P/K8)

P. edulis: 45,8%P. alata: 36,8%P. nitida: 24,5 %.(Passos et al. 2004b).

Idade dos cotilédones e efeito da germinaçãona luz, no isolamento de protoplastos de P.

edulis (Matos et al. 2005).

ISOLAMENTO MÉDIA DA IDADE DO EXPLANTE

PESO DO MATERIAL VEGETAL (mg)

NÚMERO DE PROTOPLASTOS

ISOLADOS A (PRESENÇA

DE LUZ) 6 dias 140,8 2,0X106

A (AUSENCIA DE LUZ) 6 dias 137,0 4,3X106

B (PRESENÇA DE LUZ) 21 dias 297,0 3,5X105

B (AUSENCIA DE LUZ) 21 dias 063,0 2,0X105

Influência da luminosidade durante a germinação e daidade dos cotilédones no nº de células em divisão deprotoplastos em cultura de P. edulis (30 campos x 3

placas) 1= 6 dias; 2=21 dias.

Testes NÚMERO DE CÉLULAS

VIVAS

NÚMERO DE CÉLULAS MORTAS

NÚMERO DE CÉLULAS EM PRIMEIRA DIVISÃO

NÚMERO DE CÉLULAS ACIMA DA PRIMEIRA DIVISÃO

NÚMERO DE

CÉLULAS TOTAIS

x±s2 % % % % % 1°

CLARO 7,5±1,3 27,43 19±1,5 68,7 0,96±0,01 3,5 0,08±0,06 0,3 27,34 100

1° ESCURO 4,0±0,8 25,00 11±0,3 70,0 0,57±0,27 3,7 0,23±0,21 1,4 16 100

2° CLARO 19,6±4 62,48 9,7±0,7 30,9 2,00±0,20 6,4 0,07±0,09 0,2 31,3 100

2° ESCURO 4,6±0,2 40,50 4,9±0,2 40,5 1,80±0,40 15 0,5±0,12 4,1 12 100

Influência da luminosidade durante a germinação e daidade dos cotilédones no nº de células vivas e mortasde protoplastos em cultura de P. edulis (30 campos x 3

placas)

40,5 4,959,6 6,9Esc/ 21d

30,9 9,769,121,7Luz/ 21d

70,011,030,14,8Esc./ 6d

68,719,031,28,5Luz/ 6d

%Total%TotalTratam.

MortasMortasVivas +Vivas +Células

HibridaçãoSomática (P.edulis + P. cincinnata)

(Matos et al. 2005)

Equipe

PESQUISADORES:Dra. Ilene Ribeiro da Silva PassosDr. Pedro Canisio Binsfeld.Dr. Marcelo Carnier Dornelas.Dra. Laura Maria M. Molina.Dr. Luís Carlos Bernacci.Dra. Marta Dias Soares Scott.Dra. Beatriz Appezato da Glória.Dra. Haiko H. Sawasaki.Dra. Vera Maria Quecini.

Alunas de Mestrado:Simone Pacheco LombardiGiovana Vesechi da C. Matos

Estagiários - Iniciação Científica:FAPESPGiovana Vesechi da C. Matos.Maria Aparecida Ribeiro VieiraMariana C. Z. Mori BazzoMilena Binatti FerrariPIBICLuciana Kiyomi Kinoshita.FUNDAGMariana Aparecida B. RosalesVoluntáriosLuciana Rocha AntunesLeonardo Held.Bruna de Paula.Carlos Marcelo Ribeiro.

AGRADECIMENTOS

Dra. Maria Lúcia Carneiro Vieira (Esalq/Usp).Dr. João Carlos de Oliveira (Unesp/Jabotic.)Dra. Sigrid Luiza Jung Mendaçolli (IAC).Dr. Augusto Tulmann Neto (Cena/Usp).Dr. Francisco Antonio Passos (IAC).Dra. Neiva Izabel Pierozzi (IAC).

Técnica de Laboratório: Rauly Máximo RabelloMoretti (IAC).