10
× × ×

Current Protocols in Cell Biology || Identification of Protein Interactions by Far Western Analysis

Embed Size (px)

Citation preview

��������%�$������������������������������������&������1�������

�������������������� ���������������� ����������������������������������� ������� 7�� � � ������������������������ ������� ��� �������3����� ���������������� ������������������ ���� �������������& �������������� ������������������������������� ��������������� ������#���#������������������/ ����*������������ ���� ����� ���������������# ����������� �������������������� � ����������� � � ��3�� ��� ���������� ���� � ��������� ���������� ��� ���� ���� �������������#�������������������������������������� ������������ ���������������������� ��������� ������� �� �������� ����*�������� ������������������������������� ��������� ��������������� ��� �� �������� ������������������ ���� ��������� -���� �� *���� :��� 7�� ������� � ��� ��������� ������� �����"����� ������ �� ���������� �� ������� �����������&���# ��������������������� ������������������������� �� �������� ����� ��������� ������� �� ������������-���� ��*���0��������������"���� ����� ����� ��� ������� ���� �����"��������� � ������������������ �� ��

����� �!�-������ ��� �������� ������������ ��������������������� �� ����� ��� ����7���� ������������ ������� �������� ����� �� �������������� ����������������������� ���� ������ ����������� ��� �� ���� ��������� ����������������� ������ �������,=���� ��������������� ��������������������� ����������������

���

�������

�1��&�����/�1/1# �������1�������/���!�0��

��������������� �� ������������������������������������ ��������� ��������������������������������� ����������� ���������������#���#�������������&��������������� ���������� ��� ����� ������*-)(���������������-������������������� ��� ������� ��� � ��������� ���� ��� ����� �� � ����� ������ ����� ��� ������������� ������ ����� �� ��������� ����� ���� � �� ��� � ����� ���� *��� �� �� � ���� ���� ��� ����������� ����������������������9�������������������������� ���� ��������������� �� ������������� ������ ����������� ���� ������������� ������� �� ��� ��������� ������������������-����� ��������������� �������������� ������������� �� ���� ��������������

���������

� ���������� � ��3��0������ �������������������������*��� ����� ������������������������/��������������7D�<�<=B���C���������:<����0�*/�����������������*/��2����� ��

�����/��������������77D���������0��������������� ��������/�-2��� ����G�����0<<���

0�*/�����������������*/��2����� ��������*���� ������������ ������*/�2���������������!�;�1��9-��������������������������������� ����������#������������7������� ��������C� ��� �������*���� �0<��+�C���,=������������0<<<�+�C����*����������� ����������������������*������������������������������

����������;

��������$����"�����4%��$��$�����$��'��� %���'+������*��������+����/������:<<<��0;�:�0�0;�:�0<

+�������>�:<<<����4���.�����?������7���

*+%,%*

�������������������������

*��������������������*G�&��������������������� ������������� �����8������� ���������������������������)��� ��9 ������* ���&�������

8��������8������

-����� ���� ����� ����"��������������*-)(����������������������� ���������������� ������������ ���������������������� ��� ������������� ��� �� ���� �������������

� ��!�-�� ���� ���������������� ��������������������� ����������

��������� ������� �

0�� *��� ������������� ��������� � ��3������������������������0������ ������������

���������#�������� ����������'��',�,������1��,('����,�*�,(� ����1��,('���������,*����

�����,�)�∼87����77�µ���,��-����,*�*�����,�+��,���1���,���('��&�(�&� ����1�'�����������(,�����,(� ��)�����)�7�����7�µ�)������,*�*�1����������('��&�'��������,('������+��,(� ����,*�*�(,��,�������*����-��,*5 ���*�1����+����<���1������2�� ,�����7�µ�:((����,*����� �1,���,��-�������#�*�0��+� ���(�,�����3

:�� ��� � ������ �������� ��������� ���� ������������������

,�� �� ������ ��� ������� ���� ��� ���� � � ����� ������ ����� ��� ������� *G�&� ����������������������������������������������

���+������������ ���������M�"�(�(-�,�����,��-�� ��*�0��+����*���� ������M�"�(�($

-�,����,����,��������+,�*���,�*����*������#��,�����+����+��+�������,�$��$�������,���)�'��-,-��* ����������,��*�'�����������������-���+��(�(-�,���

������1��,� ����$��

A�� -����� �������� ����������� ������=��������∼0<<�������������������0×�*��� ���� �������������� ����������� ������ ��� ������ ������ �������������������� �����������������*��� ������������������ ������������

�+������'�����'����,���B+����+��'��������,('�������������1�,�1�0�'�������)����0+����+���

,������,����#���-���-,�*���+,��1,�����,���������,������1��+��-���)���,������0��+������, 6��,��'��#�*��+��'1 �� �,�*(,�/��� ����,�� ��; �#��,�����*����1�������,������-,�*�)

(,�/��+��'���������1�(���� �,��0���+����,�*,�*�)�,�*����(�,0,���&�����(�(-�,���(����&,�����

=�� ��� ��� ��� ����� ��� � ������ ��� ����� �� �� ����� �� �����3��� � ��� ����� ��������� ������ �������������*� ���������������� ���� � ��������� �������� ������ �������������������������������� � ���#���������� ���

�+����,���1,*���; ��/�������+��(,�/��( ���-��'�,��*��((�*�,�����

5�� ��� ��� �� ����� ��=��������� ���������������� ������� ����

� �5�#�#�����

;�� /������� ��� :���� ���:<<������������������� 7� � ��� ����� ������������� �� ���

6�� ��� �� ��� ���:<<�������������������77��7���� �� ���������;�

1�� ��� �����������������77� ����������������� ��������������0<<������0�*/��

����+���'����)��+��-����(,��-��'��-�*��((�*�,��������(,��-��0�,''�*����'�,�����0�,'�,�*

�����*�1��� '������0��/��,���°��

����������; +������*��������+����/����

*+%,%,

�$������������������

����������������&�����

1�������

��������,���� ��

0<�� &������� � ��� �����U�� ����������� ���� ��� � � ��� ������ ��� ���J� ��� ���������������������������������,=������������ ����������������

�+��'��-���,��-�����#���������'��',��*�* ������+��-���/�������'��

�+��, �+������ ������� ����+�����(��,�����; ��/$�� '��*���,�����'����:��,���,����������(

1���'��* �����'��-����"���,��(,���-����2����)�≤I�×�IF�(3)�����+,�1��1�,���,�*,�*����#������,�����'����:��,���,�������,������2����)��8�µ�3����� 11�������1����+��'��-���"����,�����-����),���������87$µ����,������(,��-�� ��*������+��, �+���=��,-��,����������������*���*��������,��+,���+����,�����'����:��,���,��������,�������-����'�,��*���1��<���,�*��+,0�*�

00�� -����� ��� ����������������������=<<�µ�������������� ����������� ����������������������������0=��,<����� �0<�<<<�×��)��������� �������� ��������� ������������ ��� ��"������������������������� � �������������*-)(��������:µ���� ������������� �����������������:��=�µ���

�+��/�(����1����,����� ��� (��(,� 1,�� ���=�� '����* ��� 1��� �&,��� ������1 �,����� ��(��

��; ���*�-��*�11��������� (�������'�,�����)�����������,�0,���������,������' ��1���+��'��-��+�� �+�,�(����1����,�������� (�H�(,���'��-�����#�����*�����,���0��+� ��' ��1��,�����

D�0�#��)��1�����,�$��$�������,���������0)�'��-��' ��1��,�����(,���('��#����� ��������,**�����)

������'����-������; ,����,����+��'��'��������1�'��-��-� �*��1��+��'��-��+,��-����' ��1��*�

������ ��

0:�� *������� ��������0<��������=<������0���������������������������������������� �� ���� ��������� ����

0,�� ���������� ��� ������������0����������������������� ������������������������������ ������������������ ����,�����

"��� �(,��� -����)� ����)�≤I�×� IF�()� ,� 87$(�� �����,�� � -��(,/��� ,� ���#������� ��� -,�����+,(-������#�� (���1���(�������� �+���� ����������#����+��-����,�*�� -����,��-�����,��*

���,�(��+,���,�����,��������,**�����)��+�������,��� -��(,/����+���,*���,-���*�'��-���,��

�������,���,�*�*��'�����1��>,�����-������,��-����� -,��*����,�� �,���������-��,���+,/�����,�+�,�$��,�,-���-,�)�������,��*����,�+�-��*�<,������#���,*5 ���*�������(���('��,� ���

0A�� -�������������������� ��� �������� ��:���� ��������� �����' ����������� �� ��� ����������������������� ����

7��,��,��#�#�����

0=�� �� �������������� ���� ��� ��������� ���� ����������� �������:<<����0�*/����=�������������� �����'��� ���� � ��������� �����

�,�/��� �*���������,����; ������0�,�*��&���*�*�0,�+����*��������� -��,���,������* ��

-,�/��� �*�

05�� -��� ���� ��� ����� ��� ��� �#���� � E�� �� ����� � �� ���� ����� �� �������� �����������������������������������"�����

���������#��� �+��-�����0��+�'�,�����0�,'�,�� �+���0����; ���+� �+�� �86�����,��� #�����+�

�&'�� �������$�,��1��(���� � ,����� 11����������*������'�����#�������,�������

��"���"

���������

"������/4��/���1���/4�������/��) ����0/�)#����/4

7�����J� ��� ���������� ������ �� � ������������"����������������� ������������ ���"� �� ��������� ������ ������� �������������7�� ��������� ��������������������� ���������� ������������������������������ ���� �������������� �������������� ���� ������������� ������������-���� �� � �����������J� ��� ������������������������������������������������������������ ��� ������� �����������&�� ��� � ��� �� ����� �� ��� ������� �� ������ ��� ���� �� ��� ���� ��� ���� �� ��

+������*��������+����/���� ����������;

*+%,%-

�������������������������

���J� ��� ��� ������� L0A+M�������� ��� L,!M�������� � �� ��� ��� ����� ��� ��� ���� ��� �����������2��������������� ����U�� �� ���L0A+M��������� �������������������� ����������� ��� ���������������

������ ���� �������� ��������� ������������ ����������������������������� ������ �����������������0:=7������� ����� ������������011=������3�� �� �������,:*� �P��� ���� 0116��� /����� ������ ������ � �� ��� ������� ���� ���� ��������������������������$�� ��01152�)�������!������ ����01162�P��� ����� ����0116���*������������� ���������������������� ��������7�� �� �������������� ������������� � �� ��������� ����� ������������������ ������������������ ����� �� ������������� ��� ������� ���������� � ������� ����� ��� ������ ���� ������� ����� � ����������� �� ������ ��� ������ � ��� �� ��� � �� ����� ���� �������� ��������������������������� ����� ������������������������������ �������8 ���� �� �����������������#��2� ����� ������� ��� �������������� ���������������������

����� ��������������2,���������,������������3

'������ ������������� �������������� ��� ��J�������������=B���C������� ���� ��������������0��/�������������������/���*��� ��� �����������������������������/���������������-�� ���������� ����-*�J�� �� �������� ��� ������ � ����7�����������

������������������� ������� ��� ����-�� ���������� ��������������������������������������������������0<<��8�(��-���!�6�<��������������

��������� �������� ��

0�� *��� ��� �������������������/ ����*����������0��1��

:�� *��� ����������������������������������J� ��� ������������ �����������,�����0��������������������

�+�� ,(� ��� �1� ����(-��,��� '�������( ��� -�� �('����,���� *����(���*� 1��� �,�+� '�������

M,��� ������,��+����+,#�� ��*�1��(�7�8�����7�µ������(-��,���'������:(���1�'��-��*�� ����- 11���

"�� ����� ��� ��� ��

,�� /���������������� ���� ��������/ ����*����������0:� ���0A��0=������������������ ��� ����� ������

A�� 7���� ��������:<<������=B����� ���������0��/������0������������� ��������������� ����� ����� ���� ����

"�� ���� ������ ����

=�� ������������� ��� ���������=B���������0��/����7���� ��������=��0<���������� ������ ��������� �������������� �� ������������������������������������� ������������

��� -,������,��� � ,�����,����*�� �����+�,�$��,��*�'�,�����-,������+�-��*�<,�����-���������

(���(�<���+��#�� (��������,��������('���������#����+��-�������#�� (���1�8����7�(���1*�� ��*�,���-�*������ 11������������#���(����-�������''��'��,���,���-�*����������,������#,��

1����,�+�,���-�*��,�*�( ���-��*����(���*��('����,����

5�� . ������0<��������≥:<<����0×��/������ �� ������ ����� ���� �����'��� � � ����� ���������

����������; +������*��������+����/����

*+%,%.

�$������������������

����������������&�����

1�������

;�� ���������-*��� �� �������� ��� ���������=��0<������=B���������0��/�� �������� ��������0���� ���������A�

6 ''�����������,����'��#�*��,������(,����1�,''��'��,���*�� �����1����+�������*,���,���-�*��

6�� . ��������#���������=������ ������≥:<<�����/�������� �� ���

*����������� ����

1�� /��������������������=<���� �� ���������� ����������

0<�� 7���� ��������:<�����������������������0��0=����� ����������������0<<���� ���

00�� . ���������=���������0<<������0<<��8�(��-���!�6�<�������������������� �����'���������0<<����� ��������� ������� ���

����&,('����1�,�1,��0�������-�����1�'������������+�0�����"�� ���������>,�����+�0��,

���(,�����-� ����,����1�,�'��������,('��������+�*�1���+�������'����������',�,��*����,���96�6$��4�������>,������+�0��,�1,��0�������, ���,*����,(��1�,�',�,������,���'��-�*�0��+

�+����,���� '�'�������,����*��������+���'���������>,������+�0��,�',�,������,���'��-�*�0��+,�� ��,-���*�� '�'�������,�*�*������*�0��+�,���-�*���'���1��� ���� '�,�� ���������,��

���������������+�'�������������*��+���,(����� ��N� ''������,����0��+�D��,�*�D��- �����

0��+�D������D����>,������,�*�8��+�0��(( ��-������1�',�,������,���� �����,���$D��,�*,���$D��,���-�*��������*����1��+���������D��,�*�D�� ��; �#��,����

1 2 3 4 5

H4

H3H2BH2AH3*

anti-

H4

wes

tern

anti-

Tup1

far w

este

rnan

ti-H

3 w

este

rn

far w

este

rn

stai

n

����������� ���� ������� �� � ����� ��������� �� �� ���� ��� �������� � ���������� ��

� ���� !������� ���������������"�����������������#��� � � ������������ ��� ����

$�������� �����#���������%�� ����������������� ��� ���#��������!������� �#�����#�!���!

�����&������'���������� ����������� �����(%��#�!���!������&������)���������� ������

���� �����('��#�!���!������&�

+������*��������+����/���� ����������;

*+%,%3

�������������������������

��"���"

��������%

0��/4������"�������"�/��� �����������/���1���/4���:0�/����/�1��1��&�����/�)#��

����������������� �� ��������������� ��������� � ��������������������������� ��������������� ������������������ �������"��������������������� ��� �� �������� ������ ������# �������������������������������������� ������*������� ���� �� ��00� ���� ������ �������������������������� ��� ��������� �����

*������� �������������������������� ������������������������ � ������������*������ �������� ��� ���� ����� ���� �� �� ��� ����� �� ��� ������ ����� ���/������� ����������������������� ��������� ���������������������� ���� ��� ���������������� ������ ��� � ����� �������� � ���� � ����"� ������������������������� ��������� �����/�� ����*��� ����� ������������� ����� �������������� ���������7��� ��������������������� ����� ������������������������

7����� ����U��#����������������������� �� ���������������3�����8-*��������� �������� ����� ��� ������� ����� 8-*� ������� ������ �� �� ������ ������� �� ���� ���������� ���� ������������ ����������������-������������������ ������������ ��������������������� �������� ���������������� ������"������ �������� ���������� ��������������� ��������"���������8-*����������� �������������������������������������� ������������ ����������������������������� ���������� ������8-*������R�������S������������������� �� ��� ���������� ����������������� ����

����� ��������������2,���������,������������3

*������<�AB�������:<C*/��������������7��� ��������������������������������� �� � ����������/��' ��/�����&��������������?��������

8�������77�

0�� 8 ����������������������������=���� ���=�µ����� ���� ����������0<<��:<<�µ������������� ���

:�� *��� ��� ��� �� �� ����� ��� ������ ����� ��� �*G�&� �� ������������� ������������������ ��� �������$ ������������������������������*��� ���������� �������������� ��������� ���������7��� ������ �������-���� ���� ������ ��� ����� ������ �������� ������������� ���������������� ������������� ������������������ ���

,�� /������������ ���� ��� �� ���� ������������� ��������������/ ����*���������;��05��

A�� 7���� �� ��� ������ ��� ��� 0<<� ��� �� <�AB� ������ :<C*/�� ��� =� ���� � ������� �������������� �� ����'��� ������ ���

=�� � �������������� ����0=������������������0<<����7��� ����������� �������� ����

5�� . ���������������:�������A��� �������0�*/������� ��������������� ���

�+�����,������'��(,�����

"�� ����������+�0��,���&,('����1���� ����1��(��+���,�����,���'�������)� �����'�'��*���,�,�� -���,���1���,�1,��0���������+�����+�$+,�*�',�������,�-������,���*�0��+���*�,���/�#���1����

�+,����(',�,-���; ,���������1�'�'��*��0������,*�*�����+��-������+����1�$+,�*�',�������,�1,�

0��������1�,�* '���,���-����*�(�����,������+���11�����1�,�����,������1������������* ����1+�������'�'��*������� '':+������������,������

����������; +������*��������+����/����

*+%,%5

�$������������������

����������������&�����

1�������

��14�/���1/"���#0���/�

����*�����<�*����*�������*�0,�������,�������'���,�*�'�����������'���"�����((�������/���� �����)���� "�*�+�%H�1���� ''�����)������� ��"��� "�*�+�

�5�������, ��,�������$&&��

0<<����0�8�����⋅+����!�1�=��������������:<����=�8�9 +���������������=����0�8�8�+�:��������������-���!:%��0�������������0��� �� ��������� ���

84� # 4.4�,� � 494��� �!���, ��,����0�� 3��� �5�� �$�� �

��������<�=�����/+7*����0<������0<<B����������� ���������� �A°+������� ��� ��"��� �−:<°+������ �����������������������

*�(�� ���'�� �$�� �

-���55�µ����9/��������������������0<������ �� ���������� �����������������������8�#�������-���,,�µ����/+7*������������������������ �����#� � ���*��� ���������

��������5�� �$�� �

-���0<<�µ�� 7��� � �����*���� ����!��� ���� �0<<����<�AB�������:<C*/���������������*��� ���������

���� ��$�������: ��$#��,� �����0��3��� �5�� �$�� �

��������<�=�����9/�����0<������;<B����������� ���������� �A°+�������� �� ��"�������5������ �−:<°+�

, ��,���4�$&&������������0 �3-��6××××6<���9 +�:�:���P+�1�1���9 :!*%A

:�<���P:!*%A

-���!:%��0�����

������ �*

far western blot india ink

5 µg

1 µg

0.2 µg

0.04 µg

0.008 µg

A

H4

H4

H2B

H4-

Ac 1

6

H4

H3

H2B

H4

H4-

Ac 1

6

H3-

Ac 9

.18

H4-

Ac 9

.8.1

2.16

H3-

Ac 9

.18

H4-

Ac 9

.8.1

2.16

H3

B

����������� ������������ ����#�#������*�+����� ��������,��������������* +�����������

-�����.�����������#���!������ �#����������� ���#����(������������&��������

+������*��������+����/���� ����������;

*+%,%+

�������������������������

-� ����!��;�A���������������� ��������� ���*�����������������0������#����0�� ��0<�*/������1�� ���� ��

>�1��#���×���6��+� �*�-�������*�,���°�����*���� �,���-,�����,�����0�+�

����$����������'�� �$�� �-��6××××:���*��� ���,<��������� ����� ���,<�������� �������� ���-���!:%��0<<������������������� ��������� ���4��������������������0×������#����0�� ��0<×�*��� ��������1�� ���� ��

� ������$�� ���$&&��-��6××××,�<��������������� ��������/�-�0<������� ��� ������0<����0<×�*/��������������!:%��0<<������������������� �−:<°+4���������������������0×������#����0�� ��0<×���������1�� ���0×�*/�

� ����$��&����� ���$&&��

A<<�µ��0�8�!(*(����!�;�A�A<<�µ��0�8����������������1�:����!:%*��� ��������

���-��6××××1<���9 +�0<<����0�8�����⋅+����!�;�=��������������0<���������:<-���!:%��0�����&��0×��/���������0�� ��0<×��/�������1�� ���� ���������������������������� ��������� ���

�1����%62 �-�6�./�012(3

��������<�A���������:<����0<<����0�*/������������������������0������ �������� ����

�����/�1�

)��8���$������������� � �� ������� ��� � ��� � ����� � ���

������� ��� ���� �������� ������������������� �# ����� ��� ���� ����� �� � ��� ���������������&���# ��������� ��������������#� ������������ ��������������������������� ����� ���� ��� � ���� �P��� ��� �� ���0116��� � ��� � ���� ����� ������� � �������#��������#� �9-��������� �������+� ��� ����� ����011;��� �����# ����������� ���������� ��� �������� �� ��� �������� ������ �� ������� �P������ �� ���011A���& ����������� ��������� ����� ����������������# ����������� ���������������������� ��� �������� & �� �������� � ��� ����

��������� ����� �������.������ �������������������� �(��������� ����01152* � � ��� �� ���� 011;��� ��� ���� ������(�������/ �������������� �� ������:����������!0��)� ������� ����011,��� ���������� �����������������������' ������������90�P����������� ����������0166��� 7�� ������� ����������� ����������������������������� ������� ����� ��������������� ����������� �������������)�������!������ ����01162!�� � ���+� ����0111��

������������� ����������������������# ������ ��� ����� � � � �� ��� ������ ��������� ������������ ���� ����� ��� ����������&���# ����������������� ���������

����������; +������*��������+����/����

*+%,%6

�$������������������

����������������&�����

1�������

������������3������#� �������������#��������� �������� � � ������� ��������������� ����� ������������ ������������� �� ���������������� ����%������������ ������#������������ ���� ����� �������#������������� ����� ����� ��� ���������� �������� �� ������� �� ��� ���� �� �������� �� ��������������& ���������� ���� ����� ���������� ��� ����� � ����� ������ � �� �������� ����������� ���� ��� ����� ���� �����������������������������

-����� �� � ��������� ��������������������#��������*���������� ������� �� ������� ���� ���������������� �� ���+�����#� ���������� ���������� ������������ �� ���������� �� ��� ����� ��� ���� �������� &��# ������* � � ����� ����011;�������������#�� ��������� ��������������������� ���� ��� ������� ����� ������� �� ������� ��� ��������� !�� � ��� +� ��� �0111�� ������ ����#����������������������3������������������ �� ������������� �����������N������������������#� ����� ������������� �������� �������������������������� ���������&�������� ����011;��

7�� �������� �������������������������"����� ������ � �� ����� �� ��� �� ������ �� ��� ������ P��� ��� ��� ��������� ����������� ��������������� ������� ������ �� ������� ���� ��� ���� ��� ������� ��������� ��������������� ��������"������������ ���� � ���� ����������� ��������������)�������!������ ����01162�P��� ���� ���� 0116��������� �����"���� ��� �� ����� ���� ������� ���� �����"��������� � ������������������ �� ��

&�� ��������� ���������� �������������������� ��� ������ �� ���� ��� ���� ������������ � � ��� ���� �� ������������������ ������8� ����3���������� ������������������ �� ������������������-�����������*-)(������ ������������������� ��� ��� ���������������� ��� ����������������J� ���� ��������� �������������� ���������7������ ������������ �� ����� �������� �������������� ��������������� ����������� ����� � ����������

9��������� ���� ����������� �� �������������� � ������������� �����������&��# ������ ������� ���������������� � ������� �����������3�� ����� ������ ���������������������� ��������� &�� ����� �������� ��������������������������� �������"�������� �����������3�������������������� ��� �� ������� ���� � ��� ������������������������������ �����

����������������/������������������ �������� ������� ��

����� ������������ ��� ����������������������� ���������������������������������������� � ��������� ������ �#������ ���� ����������������������������� �������������� ��������� ������������������������ ��������� ��� ��� ������ ��� �� ��� �� ����� ���� �� ��� ������� ��� �������� ����� �� ���� �� ��� �� ��� � �� ��"����� ���������������������������� ���������������������� ��������� �����"������������ �������3 ����7�� ���������������������/�-� ��� �������������������������� ��������������������� �������� ��������"� ����/�-���� ����� ����� ��� ������

-������ ��������� ������������������� ������ ������������������������������ ������ ���������������� ��������������� ������������������������������������� ����������� ������������������.��������� ������#���#������������������� �������#� ���� �� �����R��� ���S�������������� ��� ��� �����������!����������������� ���#���������� ���������������������� ��������� ������� � ������� ���� �� ������ �� ���� ���������������������������������������� ����� ������������������������ �������������������������� ���� �����3��-������ �� ������ ������ ��� ��� ����� ����*-)(� ��� ����� ��� � � ����� ���� ��� ����������������-��������� ��������� ��� ���� �� �� ������ ����� � ��� ����� �� �� ��������� ��� ����� ������� �������� �� �������������� ���������������

������'����*������� �������� ��� � �� �������� � ��

����������������������� ������ ���������������� ����������������� ���������������# �������%��� �������������� ��������� ���������������������������� �����7��� ���������� ������ ��� ������� ����� �������� ����������������������������� ���������������� � ����� ������ ��� �������� %���R�������S��� ������ ������������������������� �������� ������������ ���������������� �������0B��=B��� ���������������������������%������������������ ��9*�A<� �������E�0<<� ��������������������������������� ��� � �� ����� � ����� ��� � ���������� -���� ����� ����� ��� ������ �� ��������������� �� ������� ����������������8������������� �� �������#������������������������������ ��� �A°+�

7�������������� ���������������������������"� ���������� ��� ������������������

+������*��������+����/���� ����������;

*+%,%7

�������������������������

*-)(� ��� �� ���� ����� 8 ��� ����� ��������������� ��� ������������� ��������3��� ��� � ����� 7�������� � ������� ��������C ��������������������� ��� ��������� ����� ������������������

�������� ������ ������������������������� �������������������� �������������� ������ ��������������� ������ �������� �������������� ���� � ��C��� �� ���������7������� ������������ ����������� ������0������*/�����������;�8��� ���������6�8���� � ����� ��������������'�� ����������������������� 7� �����/ ����*���������� �� ��� A°+���������� ���� ���������������&�� ���������������������������� ����� ���������� ����

1���������$������������������������ ����������������������

�������� ����������������������������� ������������������ ��� ��������"� �������� ������ ������ �#� � ����� ������ � ������ � ����� ������"� ��������� ��� ������ �� ��������������.���������� �� ��� ������������� ������������ ����� ������ ���������� ��3��� �������������#�������E�� ������

���������$����������� ���������� �������������� ���:

� ����-������*-)(������ ����������� ���������A��5���������������������������� ����������������6��0<�����7������������������������������*-)(������������ �� ��������������������������������������� ��������� �����������������������#�� ����������� ��������"������∼:�������������������� ���∼A����������������������� ����∼:����� ��������������� ��������������� �� ����� ���� � ����� ���� ∼0� ���� ������� ����� ����������� �����������������������������"������ �� ����� ��� ���*���������� ��������������������� ��

7� ��� �������� � ���� ��� ���� ���� ����������������������:������� �A°+�������������������������� �������� ��������� ������������������������7�� ��������� ���J� ��� ��� ������ � �� ��� ������� �� �������� ������������������� �−:<°+� ������ ��� ����������� � �� ��� �������� ������������

#������������$+� ��� ����4���+�����-����� ������������8�P��011;�

'������ ��������#��������#�� ���������� ���������������������������� ��D�7������� ���� ��(��#����������������������� �����������������*�����������0,6D55;�5;=�

(�������� ��)��� ������ 8�8��� ��� '��� ��F�0115�� '��������� �� ��� �� ��� �� �� ��� �������������0� ���� ��� ������������������!,� ���!A��4�����O���#��0<D0:A;�0:=1�

&��������9���P��������(���$ ���� ���)���8�������$ �3�����9��� ���)� ������&��-��011;��(������/ ��� ������ ����� �� ������ 0� ����� � �����#������������ ��� �������� ��������� ��� :�E���������+�(��:;:D,111�A<<=�

)� ������&��-���� ������+���! �����*���!������-���P��������)��������P��������(���$������ ����!��*��H����3 �����8��� ���8�������$ �3�����9��011,�7�������� ������������������ ���� ���������(������/ �������������� �� ������:-�M��������01=D==<�=5<�

)�������!�����4���������������!���������N������������������ ���/��������8��0116��$�� ����� � ������ �� ������������� ����� � ����������������� ������ ������ ��� ������������� ����� ���7��D��(��%����A1D0�;�

!�� �� *�� .��� ��� +� ���� +�� 0111�� 7�� ��� ���� � ����3 �����-'-05<� ���������� ������������� 9������ �� ���� ��� � ��� �� ����� ����� ���������E���������+�(��:;AD::,;,�::,;1�

P��� �������'���!���3�������9��P���!�������'��$�� ���4���������$�����0116��7������� �������������������� ����������������������������� ����� ���� ��� � ���� �7&:� ��� �7&:/�� E��������+�(��:;,D,<,1�,<AA�

P������������4��-��� ����������-��0166��7������� �������� �������������������� ���� ��� ������������������������90�������' ���,�#����.� �E��;D05<=�050A�

P������� *�� ���� !���� (��� ��� &������ (�� 011A�8 ����� � �������D� ������ �������� ��������� ����������� ����� ����� ��������� ���������E�������������0:;D0<A1�0<5<�

$�� ��(�4��0115��/����� �������������������� ��� �� ����� ���� ����� ��� +������ *����� ��*���������������4�(��+��� ���/�8��������!�$�*��������.������������ ���*����.�������������������,�5�0�,�5�0=��4���.�����?������9���F���

* � � ����-���/ � 3��-��� ������ �������011;�����)����C� ���������������� ������������� ��������� �� ���������� ���� �� ���� ��� ������� ������������ ��������� �������������� ����������!,��E���������+�(��:;:D:55<A�:550<�

����� ������ ��9�8�� ��� ��������� ��7�� 011=�� 7������ ��� ����������������� �������������+������*��������*��������������4�(��+���� ���/�8��������!�$��*��������.����������� ���*����.��������������������,�,�0�,�,�01��4��.�����?������9���F���

+������������� ���)��(������� ��� �� ���F��'�8����-�������+ �����+����!�������# �

����������; +������*��������+����/����

*+%,%*9

�$������������������

����������������&�����

1�������