10/17/2010

1

ELEMENTE DE ANALIZ INSTRUMENTAL

CURSURILE 3-4

PROF. DR. SILVIA IMRE

UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE DIN TRGU-MURESPECIALIZAREA NUTRIIE I

DIETETIC

1

2

II.1. Generaliti

II.2. Proprieti ale produsului rezultat n urma pregtirii probei

II.3. Bazele fizico-chimice ale metodelor de pregtire a probelor

II.4. Clasificarea metodelor de pregtire a probelor

II.5. Procedee de separare prin transfer de faz: Extracia lichid-lichid, extracia n faz solid

II.6. Procedee de separare prin ruptur de faz: Sublimarea, liofilizarea, distilarea

II.7. Tendine actuale

CAPITOLUL II. METODE DE PRELUCRARE A PROBELOR N VEDEREA ANALIZRII

II.1. Generaliti

Obiectivele analizei

instrumentale

Identificarea (ex. Prezena proteinelor n urin)

Dozarea(ex. determinarea glicemiei)

3

10/17/2010

2

ndeprtarea compuilor carepot afectadeterminarea(Ex. Precipitarea

proteinelor

din plasm)

n cazul metodelorde analizcu specificitateredus(ex. Refractometria)

n cazulprobelor n careanaliii sunt n cantitiprea mici pentru tipulde metod de analizales

4

Tipuri de probe Caracterizare

Medicamente:

Comprimate, capsule, geluri, creme, unguente, supozitoare, soluii medicamentoase, suspensii, emulsii farmaceutice

Amestecuri solide, semisolide, lichide omogene, sisteme heterogene

Identificarea i dozarea substanei active

Probe biologice (plasm, urin, fecale, lichid cefalorahidian etc.)

Studii de metabolism, biodisponibilitate, determinarea unor parametri biochimici etc.

Alimente

Etc.

Amestecuri solide, semisolide, lichide omogene, sisteme heterogene

Caracterizarea calitativ-cantitativ a nutrientului

5

Repetabilitate

Reproductibilitate

Randament(regsire)suficient scopului

determinrii

Principii de baz ale dezvoltrii unei metode de pregtire a unei probe pentru analiz

6

10/17/2010

3

SOLUIE

final

de analizat

1. Concentraia analitului este n domeniul de msur al instrumentului

2. Puritatea probei corespunde tehnicii instrumentale alese (ex. cromatografie)

3. Regsirea analitului este cantitativ i reproductibil de la o prob la alta

4. Analitul este stabil pn la efectuarea msurtorii (stabilitate n timpul preparrii i post-preparativ)

5. Solventul soluiei finale de analizat este compatibil cu tipul de metod instrumental ales

II.2. Proprieti ale produsului rezultat n urma pregtirii probei farmaceutice

Prelucrarea probei7

Concentraia probei finale de analizat

Instrumentele msoar cu exactitate i precizie atunci cnd semnalul msurat se ncadreaz ntre anumite valori i care corespund unor intervale de concentraii specifice fiecrui analit n parte semnalul s fie n domeniul de msur de ncredere al aparatului.

Probele prea concentrate diluare cu un solvent potrivit analitului (s fie solubil), dar potrivit i metodei instrumentale

Probele prea diluate concentrare prin:

ndeprtarea unei pri de solvent prin nclzire i/sau evapoare la vid

evaporare la sec i reluare cu un volum mic de solvent

extracie (lichid-lichid, n faz solid etc.) urmat de concentrare prin una din metodele de mai sus 8

Selectivitatea Constituenii matriciali ai soluiei rezultate n

urma prelucrrii probei farmaceutice s nu interfereze determinarea analitului; exemple de interferene: Absorbii semnificative la aceeai lungime de und

cu cea a analitului (metode spectrofotometrice) Substane interferente cu caracter acido-bazic n

cazul n care se urmrete determinarea analiilor cu caracter acido-bazic printr-o metod volumetric acido-bazic

Proteinele plasmatice i alte macromolecule etc.9

10/17/2010

4

Regsirea sau randamentul de prelucrare a probei

S fie 100% n cazul controlului substanelor i formelor farmaceutice

S fie consistent i reproductibil n cazul probelor biologice (se accept valori sub 100%)

Un randament de prelucrare (extracie) mare exactitate i precizie adecvate

10

11

Regsirea sau randamentul de prelucrare a probei

Se exprim folosind: O prob standard matrice martor (blanc) + analit adugat n

cantitate cunoscut; ex. Plasm blanc marcat cu analitul de determinat; se prelucreaz proba, se ajunge la proba final de analizat i se msoar semnalul S1

O soluie standard de analit obinut ntr-un solvent potrivit (ex. ap, metanol, etanol etc.) cu o concentraie egal cu concentraia ateptat n proba final de analizat; se msoar soluia n aceleai condiii obinndu-se semnalul S0

12

Prelucrarea probei

Prob

standard

matrice/blanc

analitSoluia

final de

analizat

Soluia

standard

Substan de referin + solvent

S1 S0

Msurare instrumental

Obinerea soluiei standard

10/17/2010

5

Stabilitatea post-preparativ a analitului n soluia final de analizat: Trebuie asigurat pentru a nu interveni procese

degradative post-preparative care pot conduce la rezultate false

Se poate asigura prin: Ajustri de pH Modificarea compoziiei solvenilor soluiei finale Meninerea probei la temperaturi sczute pn la

momentul msurtorii

13

Compatibilitatea cu metoda instrumental n spectrofotometrie solventul soluiei finale de analizat s

nu absoarb n domeniul spectral de absorbie al analitului n cromatografia de lichide - solventul probei:

s fie miscibil cu faza mobil lichid pe ct posibil s aib o compoziie asemntoare cu faza mobil

pentru a reduce efectul de interferen spectral (n cazul metodelor HPLC cu detecie n

UV, de fluorescen) efectul asupra formei picului cromatografic

Solventul (natura, pH) soluiei finale de analizat i al soluiilor standard de calibrare s fie identic

14

II.3. Bazele fizico-chimice ale metodelor de pregtire a probelor pentru analiz

PRINCIPII DECHIMIE FIZIC

INTERACIUNIFIZICO-CHIMICE

SOLUBILITATEAECHILIBRUL DE

FAZ

15

10/17/2010

6

Tipuri de interaciuni

Exemple de tehnici de preparare, caracteristici

Ionice Purificare pe rini schimbtoare de ioni

Afectate de: pH, trie ionic

Dipol-dipol Extracie n faz solid normal (adsorbie)

Afecteaz regsirea analiilor care se adsorb pe particulele solide ale probei

Legturi de hidrogen

Extracie n faz solid normal

Influenate de pH, solveni, prezena apei

Hidrofobe Extracie lichid-lichid

! Tipurile de interaciuni - descrise n cursurile de: Elemente de

Chimie Bioanorganic, Elemente de Chimie organic

Interaciuni fizico-chimice

16

Soluie

Na+(aq) + Cl-(aq) NaCl(s)

Precipitat

Solubilitatea (solidelor) Este concentraia solutului atunci cnd acesta se

afl n echilibru cu substana solid (soluie saturat)

Exemplu:

17

La pregtirea probelor solide i semisolide, concentraia soluiei finale de analit extras trebuie s fie sub limita de solubilitate a acestuia pentru a avea o regsire reproductibil (dac ne aflm la limita de solubilitate, o parte din analit rmne nesolubilizat n proba iniial),

Factori care influeneaz solubilitatea:

Natura solventului, amestecuri de solveni (ap, metanol, acetonitril etc.)

pH, tria ionic (dat de sruri)

Temperatura etc.

Ex. solubilitatea acizilor carboxilici n soluii apoase este mai mare la un pH > pKa + 2 (se afl n forma ionizat)

18

10/17/2010

7

Echilibrul de faz Important n cazul metodelor de prelucrare a probelor

prin extracie lichid-lichid

Dou faze total nemiscibile notate cu 1 i, respectiv, 2

Analitul (solutul) A se repartizeaz ntre cele dou faze pn la echilibru:

A1 A2 La echilibru, viteza cu care A trece din faza 1 n 2 este

egal cu viteza cu care A trece din faza 2 n 1

19

Echilibrul de faz

Constanta de echilibru sau de repartiie va fi:

unde KD constanta de repartiie, cA1 i cA2 sunt concentraiile lui A n faza 1 i, respectiv, faza 2, dup stabilirea echilibrului

20

21

A

Faza 1

Faza 2

CA1

CA2

Repartizarea

ntre cele dou

faze

Dou faze

nemiscibile

(ex. Ulei Ap)

La echilibru:

10/17/2010

8

n practic, se urmrete trecerea n proporie ct mai mare a analitului n una din faze analitul se msoar, astfel, dup extracie n una dintre faze.

Factori care influeneaz echilibrul de faz:

Natura celor dou faze

pH-ul fazei apoase (n cazul analiilor cu caracter acido-bazic)

Temperatura

Tria ionic a fazei apoase

Volumul celor dou faze 22

a. Tehnici de separare prin transfer de faz substana de separat este transferat din faza probei de analizat ntr-o faz nemiscibil cu aceasta (extracia lichid-lichid), pe un suport solid (extracia n faz solid) sau prin utilizarea unei membrane semipermeabile (dializ)b. Tehnici de separare prin ruptur de faz bazate fie pe schimbri de faz ale substanei de separat (distilarea, sublimarea, liofilizarea), fie pe precipitarea principiului activ (n urma concentrrii prin evaporarea solventului sau adugarea unui reactiv sau solvent n care acesta nu este solubil)Aplicarea unuia sau altuia dintre procedeele mai sus amintite se face n

concordan cu urmtoarele proprieti ale substanelor de separat:

solubilitatea; volatilitatea; caracterul acid/bazic/amfoter sau neutru; caracterul

polar sau nepolar; stabilitatea substanei n cursul prelucrrii

II.4. Clasificarea tehnicilor de pregtire a probelor pentru analiz

23

II.5. Tehnici de separare prin transfer de faz

II.5.1. Extracia lichid-lichid

Principiul de separare n extracia lichidlichid se bazeaz pe inegalitatea de solubilitate a componenilor n acelai solvent.

Extracia lichid-lichid - transferul unui analit din soluia probei, de obicei o faz apoas, ntr-un solvent organic nemiscibil cu apa, cnd se realizeaz o distribuie a analitului ntre cele dou faze.

Faza 2 - solvent de extracie A2

Faza 1 - proba A124

10/17/2010

9

EXTRACIA SIMPL

Extracia simpl se poate realiza cu ajutorul unei plnii de separare (figura de mai jos), comportnd introducerea probei, a solventului de extracie, a reactivilor pentru ajustarea pH-ului, agitare energic, repaus pentru separarea fazelor i decantarea prin scurgerea extractului.

Separarea cantitativ nu este posibil printr-o singur extracie, dar se poate realiza o astfel de separare prin 3-4 extracii succesive.

25

Plnii de separare

! Poziia solventului de extracie:- faza superioar (ex. eter etilic)- faza inferioar (ex. clorurura de metilen)

Ustensile de laborator

Procedura de laborator: adugare prob lichid i solvent de extracie

10/17/2010

10

Procedura de laborator: nchidere plnie, agitare energic, repaus pentru separarea fazelor

Separarea fazelor

Extraction Movie.

Dintre solveni organici cei mai utlizai sunt: Hidrocarburi lichide: n-hexan, n-heptan, benzen, toluen, xilen; Derivai halogenai: diclormetan, cloroform, tetraclorura de carbon; Cetone: acetona, metilizobutilcetona; Eteri: eter etilic, dioxan, terbutileter; Ali solveni: dimetilformamida etc.

Avantaje:- separare selectiv, cu randamente bune, dac se alege judicios solventul sau amestecul de solveni, dac se regleaz pH-ul corespunztor, sau dac se face o derivatizare pre-extracie a analitului ce trec ntr-un compus mai uor i mai selectiv extractibil ntr-un anumit solvent- nu este stnjenit de adsorbie, de coloizi sau de culoarea soluiilor- echilibrele de extracie se stabilesc relativ repede- separarea fazelor nemiscibile se face rapid n plnia de separare i mult mai uor dect filtrarea- se pot realiza concentrri ale analiilor de sute sau mii de ori- se poate aplica att pentru separarea unor cantiti mari de substan, ct mai ales pentru concentrarea urmelor i ultraurmelor de substane 30

10/17/2010

11

II.5.2 Extracia n faz solidAceast tehnic se bazeaz pe adsorbia diferit a componenilor dintr-o prob, pe o faz staionar solid i reluarea lor pe rnd de pe suportul solid.Extracia n faz solid (Solid-Phase Extraction SPE) se poate aplica tuturor tipurilor de probe lichide i solide.

Principiul

extraciei

n faz

solid

31

32

33http://www.waters.com/webassets/cms/category/media/other_images/primer_d_%20solidphase.jpg

10/17/2010

12

Aparat de extracie n faz solid cu

mai multe locuri 34

Extracia SPE prezint unele avantaje fa de extracia lichidlichid dintre care se pot meniona:

se utilizeaz coloane mici de extracie, numite cartue de extracie, care conin o faz staionar solid, evident insolubil in faza de eluie care este utilizat; este o metod mai selectiv datorit naturii fazelor utilizate (staionar i mobil); necesit volume mult mai mici de prob;se simplific mult matricea n care se afl analitul dup extracie, deoarece are loc mai nti fixarea analitului pe faza staionar, apoi se ndeprteaz marea majoritate a componenilor indezirabili din prob; n final, se scoate analitul rmas n faza staionar folosind un solvent potrivit; simplitatea i rapiditatea metodei.

35

II.6. PROCEDEE DE SEPARARE PRIN SCHIMBRI DE STARE

II.6.1. SublimareaSublimarea = trecerea unei substane din stare solid n stare gazoas la presiuneCapacitatea de sublimare cu T (temperaturii) i p (presiunii).Se obin substane extrem de pure.

II.6.2. LiofilizareaSe aplic mai ales n cazul analiilor uor degradabili prin nclzire.Liofilizarea = uscare la rece, cu pstrarea integritii probei. Const n nghearea rapid a probei dup care se elimin solventul prin sublimare n vid naintat, cnd solventul este transformat direct n vapori.Utilizri:- pstrarea timp ndelungat a culturilor microbiene, enzimelor, esuturi sau probe biologice- pstrarea unor medicamente (pulberi liofilizate) 36

10/17/2010

13

II.6.3. Distilarea

Distilarea = metod de separare bazat pe diferena de volatilitate a componenilor dintr-o prob; const n volatilizarea succesiv a analiilor i condensarea acestora, colectarea acestora fcndu-se separat.

Distilarea poate fi:

- simpl

- fracionat

Recapitulare noiuni: distilare simpl, fracionat, amestecuri azeotrope de la Elemente de Chimie Bioanorganic

37

Tendine actualen pregtirea

probelorpentru analiz

Automatizareatotal

Instrumente

analitice

mai specifice

Eliminareacomplet apregtiriiprobelor

Miniaturizarea

tehnicii

de pregtire

a probelor

38

II.7. Tendine actuale

Automatizarea (total) a pregtirii probelor

Extractor n faz solid cuplat la un sistem cromatografic

Sistem automat de prelucrare a probelor

39

10/17/2010

14

HPLC cuplat cu detector de spectrometrie de mas

Instrumente de analiz specifice

40

Miniaturizare (nanotehnologie)

41

Analiz direct fr pregtire prealabil a probei

Dispozitiv de reflectan total atenuat

(ATR Attenuated Total Relectance)

- permite analiza spectrometric n IR a probelor ca atare

- se msoar radiaia reflectat 42