Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu

7/29/2019 Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu

1/82

ASPECTE TRATATE IN CURS

Aspecte generale legate de biosenzori;Discutie sumara asupra grupelor majore de enzime redoxutilizate in constructia biosenzorilor:

OxidazeDehidrogenazePeroxidaze

Avantajele si dezavantajele utilizarii enzimelor redox inproiectarea si constructia biosenzorilor;Aspecte legate de TME si TDE;Avanatajele analitice ale TDE;

Aplicatiile biosenzorilor in detectia:Metalelor grele

PesticidelorFenolilor

Peroxizilor anorganici si organici


2/82

Una dintre provocarile actuale din domeniul chimiei

analitice o reprezinta simplificarea metodologieide lucru pina la nivelul de la care determinarea practica,

de rutina a analitului de interes sa se desfasoare

rapid

fara o pretratare a probei

cu un minimum de cerinte asupra deprinderile practice ale operatorilor


3/82

OBIECTIVELE CHIMIEI ANALITICE

In acest sens unul dintre

REACTIVI SELECTIVI

UNOR METODE ANALITICE SELECTIVE

este dezvoltarea

bazate pe folosirea unor


4/82

ENZIMELE

REACTIVI FOARTE SELECTIVI SI VERSATILIexistente in natura care pot fi integrate cu

UN TRADUCTOR FIZICO-CHIMIC

Obtinindu-se astfel un instrument analitic denumit in sens generic

BIOSENZOR


5/82

Este un detector (instrument analitic) care converteste (transforma) semnalulbiochimic intr-un semnal masurabil (cuantificabil)

Ce este un biosensor?

Analiti Bioreceptor(cataliticafinitate)

Traductorfizico-chimic

Componentaelectronica

Reprezentarea schematica a unui biosenzor


6/82

DEFINITIA BIOSENZORILOR

Instrumentul are drept scop detectia (reversibila si selectiva) a concentratiei

speciilor chimice in orice tip de proba..

D. R. Thevenot, K. Toth, R. A. Durst, G.S. Wilson, Biosens. Bioelectron., 16 (2001) 121-131

El este capabil sa genereze o informatie analitica specifica cantitativa sausemicantitativa (IUPAC,1996)

Biosensorul este un instrument analitic care consta dintr-un componentbiologic responsabil pentru recunoasterea selectiva a anlitului, aflat incontact intim (spatial direct) cu un traductor adecvt.

Interactia specifica de tip cheie-lacat dintre analit si biocomponentconduce la o modificare a unui parametru fizico-chimic care este detectat

de traductor, masurat si procesat


7/82

Principiul de constructie si functionare a unui biosenzor

BIOCOMPONENT

TRADUCTOR

Analati

ELECTROCHIMIC,OPTICCALORIMETRICPIEZOELECTRIC

ENZIME, ANTICORPIORGANITE, CELULE

METABOLITI, IONI, GAZEVAPORI ORANICI

Interactiecheie-lacat

Etapa generariisemnalului

Transmitereasemnalului

Amplificare siprocesare


8/82

Trebuie facuta o distinctie clara intre un biosenzor si:

Sistemul bioanalitic

necesita etape aditionale de procesare (prelucrare) a probeicum ar fi adaugarea de reactivi

Bioproba

care fie este de unica folosinta si se arunca dupa o singura masurare,

fie nu este capabila de a monitoriza in mod continuu concentratiaanalitului de interes


9/82

CLASIFICAREA BIOSENSORILORFunctie de:

Elementul de recunoastere

molecularaTipul traductorului Reactiile

monitorizate

ex. redox

hidroliza

Speciile monitorizate

Monitorizare directa a Monitorizare indirecta a

-concentratiei de analit

-reactiilor in care se consuma sau

se produc substrate noi

Inhibitorilor sau a activatorilor elementelor de

recunoastere biologica


10/82

TRADUCTORUL

BIOMOLECULAR

(asigura selectivitatea

biosenzorului)

Avantaje Dezavantaje

Enzime Selectivitate si activitate mare Stabilitate limitata

SinzimeSisteme mutienzimatice Cresterea posibilitatilor de

imobilizare, marirea

gamei de compusi

detectabili

Cresterea interferentelor,

probleme legate de

optimizarea conditiilor de

lucru

Organite celulare

Tesut animal sau vegetal Simplitatea constructieibiosenzorului, marirea gamei

de compusi detectabili

Cresterea interferentelor si a

timpului de raspuns al

biosenzorului

Microorganisme Varietate mare, simplitateaconstructiei, posibilitati de

regenerare

Selectivitate redusa, timp mare

de raspuns

Anticorpi

monoclonalipoliclonali

Selectivitate mareRelative ieftini

Cost ridicatSelectivitate limitata

Acizi nucleici

Aptameri

Receptori celulari selectivi instabili

Receptori sintetici


11/82

TRADUCTORUL

FIZICO-CHIMIC

(asigura sensibilitatea

biosenzorului)

Modul de masurare

(marimea masurata)

Avantaje Dezavantaje

Electrochimic Potentiometric (potentialul)

Amperometric (curentul)

Impedimetric (impedanta)

Domeniu mare de

raspuns;

instrumentatie

simpla

Variatie liniara a

raspunsului

Variatie logaritmica a

raspunsului;

selectivitate

limitata

Posibile interferente

Coductometric Conductivitatea

(conductanta)

Pret de cost scazut neselectivi

Optic/optoelectronici

(absorbanta,

fluorescenta,

luminiscenta,

unda

evanescenta)

Optic

fibre opticeDimensiuni mici,

raspuns rapid,

maresc domeniul

compusilor

detectabili

Instrumentatie

speciala, probleme

in cazul solutiilor

tulburi

Piezoelectric Modificari de masa(frecventa)

Dimensiuni reduse Raspuns lent

Termistori Calorimetric/thermometric

(caldura/temperatura)Simpli, raspuns liniar Neselectivi, dificultati

de lucru in faza

gazoasa

Magnetic


12/82

TRADUCTORII FIZICO-CHIMICIUTILIZATI IN CONSTRUCTIA

BIOSENZORILOR


13/82

Stabilitate mica a biomoleculelor

Pret de cost ridicat pentru enzime si receptori

Necesitatea adaugarii unor compusi suplimentari (ex. Oxigenul, cofactori)

Probleme legate de imobilizarea biocomponentilor

Performante scazute in medii neapoase

Compatibilitate scazuta relativa la tehnologia de microfabricare rezultind in

dificultati legate de proiectarea multisenzorilor

Dimensiunile moleculare

PROBLEME LEGATE DE TRADUCTORUL BIOCHIMIC


14/82


15/82

SCOPUL UNUI BIOSENZOR

Este acela de genera o informatie certa (de incredere) in timp util asupracompozitiei chimice a unei probe.

continuureversibil

sa nu conduca la perturbarea saucontaminarea probei

Biosenzorul trebuie in mod ideal sa raspunda

Masuratorile realizate trebuind a firapide

de increderela un pret de cost scazut

Astfel de instrumente vor permite realizarea masuratorilor multor compusi deimportanta chimica si biochimica in afara laboratorului direct pe teren


16/82

Sa permita o masurare selectiva a analitului de determinatin cadrul unei metode care necesita un minimum de preparare a probei

Poate fi reutilizabil (prezinta un raspuns reversibil)

Dispozabil (de unica folosinta)


17/82

BIOSENSORIIau fost clasificati functie de modul de transfer deelectroni dintre enzima si electrod in 3 generatii

La o valoare de potential controlata aplicata la suprafata senzorului amperometricbiosenzorii genereaza un semnal analtic (curent) care este corelat direct cuconcentratia compusului de analizat


18/82

SENZORII ELECTROCHIMICI

Reprezinta o clasa de sensori chimici care s-a dezvoltat cel mai rapid

datorita simplitatii generarii semnalului electrochimicsi de aceea au fost des utilizati ca traductori in constructia biosenzorilor.

Sensorii amperometrici beneficiaza de o serie de avantaje legate de:Sensibilitatea lor marePretul de cost scazut

Usurinta fabricarii lor in masa, in diferite formate si de orice dimensiune

Un biosensor electrochimic este considerat a fi un electrodchimic modificat deoarece in constructia lui materialul deelectrod electronic, semi-electronic conductor sau ionic conductoreste acoperit cu un film biochimic


19/82

Enzox

Enzred

e-

electrod

S

P

Transfer de electroni

Ele reprezinta o provocare pentru chimistii electroanalisti acestea fiind ideal deutilizat in constructia biosenzorilor deoarece ele catalizeaza reactii de oxido-reducere

ale diferitelor substrate si ar putea fi implicate in reactii cu transferdirect de electroni cu suprafata electrodului

A.Heller, Electrical Connection of Enzyme Redox Centre to Electrodes, J. Phys.Chem. 96 (1992) 3579-3587

Oxido-reductazele enzimele redox reprezinta o clasa binecunoscuta de macromolecule chimice care sunt comercializate si

folosite drept element de biorecunoastere in constructia biosenzorilor


20/82

Problema care se pune este legata de posibilitatile de a serealiza un transfer eficient de electroni de la cofactorul

unuei enzime redox spre suprafata electrodului si invers laun potential aplicat mic!

A.Heller, Electrical Connection of Enzyme Redox Centre to Electrodes, J. Phys.Chem. 96 (1992) 3579-3587.

Centrul actival enzimei

electrod

=

Transferul direct de electroni blocat

datorita impiedicarilor de ordin

steeric sau al restrictiilor cinetice

e-

Transferul direct de electroni (DET) intre centrul activ al uneienzime redox si suprafata de electrod este de cele mai multe ori blocat.


21/82

Centrul activ

al enzimei

electrod

Transferul de electroni are loc in 2etape

1: intre enzima si mediator

2: intre mediator si electrod

e-

e-mediator

Transferul mediat de electroni (MET) intre centrulactiv al unei enzime redox si suprafata de electrod.


22/82

Posibile moduri de cuplare a reactiei enzimatice cu reactia electrochimica:(a) transferul mediat de electroni (MTE) si (b) transferul direct de electroni (DTE)

Reprezentarea schematica a bioelectrocatalizei in cazul unei enzimecare contine 2 grupari redox (cofactori) in structura moleculara

servind drept centre de schimb de electroni electrocatalitic

si centru de transformare biocatalitica a substratului.

Enzime redox pentru care s a dovedit existenta unor reactii cu DET cu suprafata electrozilor


23/82

Enzime redox pentru care s-a dovedit existenta unor reactii cu DET cu suprafata electrozilor.

EnzimaCofactor Substrat Reactii

Redox

Lacaza 4 Cu O2 Reducere

Ascorbat oxidaza 4 Cu O2 ReducereSuperoxid dismutaza Cu-Zn O2

Peroxidaza

Citocromc peroxidaza

Citocromc peroxidaza

-Paracoccus denitrificans

Lactoperoxidaza din bovina

Microperoxidaza

Hem

Hem

Hem

Hem

Hem

2 Hem

H2O2

H2O2

H2O

2

H2O2

H2O2

H2O2

Reducere

Reducere

Reducere

Reducere

Reducere

Reducere

Hidrogenaza cluster Fe-S H2

H+Oxidare

Reducere

Diaforaza FMN NADH Oxidare

Enzime bi-functionale

Citocrom b2

- Lactat dehidrogenaza

- Flavocitocrom c552- Celobioz dehidrogenaza

- Phanerochaete

chrysosporium

- Sclerotium rolfsii

Alcool dehidrogenaza

Flavo-hem

FMN-hem

FAD-hem

FAD-hemFAD-hem

PQQ-hem

PQQ-4 hem

PQQ-4 hem

FAD- cluster Fe-S

Lactat

p-cresol

sulfide

etanoletanol

etanol

succinat

fumaratalcool

Oxidare

Oxidare

Oxidare

OxidareOxidare

Oxidare

Oxidare

Oxidare

Reducere

Enzime tri-functionale

D-Gluconat dehidrogenazaFAD-hem- cluster Fe-S D-gluconat Oxidare


24/82

SCOPUL FINAL !

Il reprezinta realizarea unui transfer de electroni dintresubstrat si electrod prin intermediul unei enzime

redox a carui centru activ sa poata schimba direct

electronii cu suprafata electrodului

(ex. o reactie de oxidare a unui substrat)

Domeniul optim de potential

Thermodynamic driving force enough to drive the reaction


25/82

ENZIME REDOX

OXIDAZEDEHIDROGENAZE PEROXIDAZE

Enzime continandFAD/FMN

EnzimecontinandCu

Enzime continindcofactor legat

Enzime utilizindNAD/NADP dreptcofactor solubil

-FMN oxidazeex. L-amino acid oxidaza-FAD oxidazeex. D-amino acid oxidaza-Metalo FAD oxidazeex. glucoz oxidaza

xantin oxidaza

-Tirozinaza-Lacaza-Ascorbat oxidaza-Citocrom c oxidaza-Galactoz oxidaza

Enzimecontinind

PQQ

EnzimecontinindFAD/FMN

-Metanoldehidrogenaza-Glucozdehidrogenaza-Fructozdehidrogenaza

-FAD dehidrogenaze

ex. lipoil dehidrogenaza-Metalo-FAD dehidrogenazeex. colin dehidrogenaza-Metalo-FMN dehidrogenazeex. L-lactat dehidrogenaza(citrocrom b2)

-Alcool dehidrogenaza- Glucoz dehidrogenaza- Glutamat dehidrogenaza- Aminoacid dehidrogenaza-Testosteron 17dehidrogenaza- Lacat dehidrogenaza

-Peroxidaza din hrean

-Citocrom coxidaza-Ascorbat peroxidaza-Lactoperoxidaza

Clasificarea oxido-reductazelor utilizate in constructia biosensorilor [4]


26/82

Schema de detectie a substratelor bazata pebiosensori amperometrici implicind enzimele redox [4]


27/82

GRUPELE MAJORE DE ENZIME REDOX

OXIDAZELE FAD dependentecare au ca produs de reactie H2O2 80 enzime

care au ca produs de reactie H2O 20 enzime

DEHIDROGENAZELE

NAD(P) + NAD(P)H dependente 450 enzimePQQ dependente 20 enzime

Flavin dependente 50 enzime

PEROXIDAZELE

Hem dependente 40 enzime

Exista aprox. 600-700 diferite enzime redox cunoscute

Care pot fi combinate in constructia biosenzorilorcu un numar de alte enzime (ne-redox)


28/82

Structura chimica a flavin adenin dinucleotidei, FAD

N N

N

H

NO

O

CH2

C C

OH

H

C

OH

H

CH2

O

OH

H

P

O

O

OH

P O

OH

O

CH2

O

OH OH

N

N

NH2

N

(grupare legata covalent de molecula de enzima)

NO

O

HOO

HOOC

N

COOHH

Structura chimica a pirolo-chinolin chinonei, PQQ(grupare legata covalent de molecula de enzima)

2,7,9-tricarboxi-1H-pirolo-(2,3-f-chinolin-4,5-diona)


29/82

Structura chimica a nicotinamid adenin dinucleotidei,NAD+ (cosubstrat solubil)

O

P OHO

O

PHO

O

O

CH2

CH2

O

H

N

CNH

2

O

OH OH

O

OH OH

N

N

N

N

NH2

Daca este fosforilata, NAD(P)+

Structura hemului

Fe

COOH-

COOH-

Hemul


30/82

OXIDAZELE

S Oxidazaox H2O2(sau H2O)

P Oxidazared O2

Cofactorul este legat puternic (covalent) de enzima

ex. FAD, FMN, Cu

Produs de reactie H2O2 - ( 60 - 70 enzime)glucoz oxidaza (FAD, Fe)xantin oxidaza (FAD, Fe, Mo)L-amino acid oxidaza (FAD-veninul de sarpe)

(FMN-ficat)alcool oxidaza (FAD) Produs de reactie H2O

tirozinaza (polifenol oxidaza) (Cu)ascorbat oxidaza (Cu)


31/82

DEHIDROGENAZELE

(nu sunt afectate de oxigenul molecular)

substrat cofactorox aceptor de electroniredenzima redox

produs cofactorred aceptor de electroniox

cofactori legatienzime continind flavinaex.:L-lactat dehidrogenaza (FMN, hem)

(citochromul b2)diaforaza (FAD, hem)

(enzima care oxideaza NADH-ul)enzime continind PQQ(descoperite relative recent10-20 enzime)ex. glucoz, alcool-, lactat-, fructozdehidrogenaza

cofactor solubil

enzime nicotinamid dependenteNAD+/ NADH dependente (250 enzime)

NADP+/ NADPH dependente ( 150 enzime)


32/82

PEROXIDAZELE

N

N

Fe

COOH-

N

N

COOH-

Heme

De facut!!!!


33/82

BIOSNZORII ELECTROCHIMICI

Sau dintr-un biosensor care poate functiona in mod reversibil si care poate fi inserat(implementat intr-un sistem de anliza in flux (sau automatizat) pentru monitorizareacontinua a anlitului de interes

ei constau din:

Parte sensibila de unica folosinta, care consta dintrun electrod miniaturizat pesuprafata caruia s-a imobilizat un biocomponent, parte care este introdusa intr-un instrument portabil

cei mai studiati biosenzori

Reprezentarea schematica a biosensorului pentru glucoza produs deExac Tech.


34/82

Compania

Compounsul

Yellow Springs Instruments-YSA (USA) Glucoza, etanolul, lactoza, fructoza, lactatul etc.

Baxter Travenol, (USA) Glucoza

Universal Sensor, (USA) Glucoza, aspartamul, ureea, acidul uric, Listeria, etc.

Molecular Devices, (USA) ADN, poluanti, toxine, etc.

AndCare Inc, ESA (USA) E.Coli, Salmonella, Polivirus, hibridizarea AND, etc.

Bioanalytical Systems, BAS (USA) Apa oxigenata

VEB-MLV Prufagerate-Medigen (D) Glucoza, lactatul, BOD,

Institute of Molecular Biology-Berlin (D) Glucoza, lactatul, acidul uric.

Setric SGI (F) Lactatul, glucoza

Ceres (F) Glucoza, colina, lyzina.

Radiometer (F) Glucoza

Metertech Inc. (Taiwan) Glucoza

Nissan Electric (JPN) BOD

Daiichi-Kyoto (JPN) Glucoza

Pegasus Biotechnology Ontario (Canada) Prospetimea pestelui

Exemple de companii care comercializeaza biosenzori electrochimici


35/82

medical/clinic (prevenirea si diagnosticarea unor boli)

controlul poluarii mediului

industriile alimentara si a bauturilor (calitatea alimentelor)

apararii si securitatii militare

testelor sportive de dopare

O data cu intrarea in cel de al III-lea mileniu domenii ale societatii precum

necesita utilizarea unor instrumente analitice simple precum

SENSORII BIOCHIMICI


36/82

METODELE CLASICE DE ANALIZA FOLOSITE IN DETERMINAREA

COMPUSILOR DE IMPORTANTA CHIMICA SI BIOCHIMICA

sunt metodesensibileselective

care permit identificarea si determinarea diferitilor compusii apartinind uneisingure clase

spectrometria in UV si IR, HPLC, GC, MS

combinatii ale acestora (GC/MS, HPLC/MS

in ciuda selectivitatii si sensibilitatii lor aceste metode necesita:

Laboratoare foarte bine dotateUn personal inalt calificatSunt metode laborioaseNecesita un timp relativ mare de analizaNu pot fi utilizate pe teren pentru omonitorizare continua


37/82

si testarea ei in laborator

Aparitia biosensorilor

A facut posibila realizarea unor determinari analitice pe teren

Conducind la o scadere a timpului de realizare a unei masurari

nemaifiind necesar transportul probei,

scurtind timpul intre obtinerea si transferul de date si actiunile de remediere ce se impun


38/82

BIOSENZORI CLASICI (prima generatie)Primul biosensor construit a avut la baza un electrod de tip Clark, cu ajutorulcaruia s-a urmarit scaderea concentraiei de O2.

Reactiile bioelectrochimice ce stau la baza constructiei electrodului de tip Clark

Electrodul enzimatic de tip Clark

O2 difuzeaza atit in afara membranei spre solutie cit sispre suprafata senzorului pentru oxigen unde este redus electrochimic

O2 + 2 H+ + 4 e- 2 OH-E > - o,6 V

glucoza + O2+H2OGox

acidul gluconic + H2O2


39/82

suprafata unui electrod de platina unde este oxidata electrochimic

H2O2 formata difuzeaza atit

G.G. Guilbault, G.J. Lubrano, Anal.Chim.Acta, 60 (1972) 254S.J. Updike, G.P. Hicks, "The Enzyme Electrode", Nature, 214, 1967

E > + 0,6 V

S

E

E

H O2 2

Reactia enzimatica

Glucoza+ Glucozoxidaza

Glucolactona+

O2H2O2

Reactia electrochimica

O2H2

+2 H + + 2 e-O2

Detectia apei oxigenate folosind un electrod de Pt

in afara membranei spre solutiecit si spre


40/82


41/82

Eappl -600mV

O2 + 2H+ + 4e- 2OH-

Eappl +600mV

H2O2 O2 + 2H+ + 2e-

dezavantaje: supra-potentialraspunsul electrodului nu este stabil

OXIDAZE acceptorul natural de e-O2

Dezavataje: solubilitate limitata a O2

H2O2 denatureaza enzima

H2O2 poate reationa cu alte

substante din solutie species

Electrodul Clarkdezavanaje: masoara scaderea semnalului

(semnal de baza mare)

Supra-potential

Electrochimia O2 si a H2O2

Sufera de aplicarea unor potentiale mari(suprapotentiale


42/82

ENZIMA

Substrat + O2 Produs + H2O2

hidrolaza

METABOLIT

SENZOR

PRODUS ELECTROACTIV

PRODUS VARIATIE

ELECTROACTIV SEMNAL ELECTRIC

Enzima

(oxidaza)

E1

E2

Glucoza + O2 acidul gluconic + H2O2

Lactatul + O2 Piruvat + H2O2

Urea HCO3-

+ NH4+

ureaza

electrochimic

Bi i i ti i t d t i i b ti


43/82

Biosenzori enzimatici pentru determinarea ureei bazati pesenzorii de gaz

Asamblarea biosenzorului

Se folosesc senzorii de gaz pentru: CO2NH3

Enzimele sunt imobilizate pe suprafata membranelor gaz permeabile

Acestia se obtin prin fixarea uneimembrane gaz permeabile pe suprafata unui ISE

ISE este senzorul de pH (sticla)

intre membrana gaz permeabila si suprafata ISE se introduce un electrolit adecvat

uree

ureaza

CO2 + NH3


44/82

Principiul de functionare:

NH3 sau CO2 rezultat in urma reactieienzimatice difuzeaza din solutia probei prinmembrana gaz permeabila si hidrolizeaza in solutia interna rezultind astfel o

variatie in concentratia ionilor de H+ care este detectata de ISE (senzorul de pH).

Ptr. Senzorul deCO2:solutia interna: NaHCO3 0.1 M

Echilibrul stabilit[NH4+] NH3 + H+

Ptr. Senzorul de NH3:Soltia interna NH4Cl 0.1 M

Echilibrul stabilitCO2 + H2O HCO3- + H+

Deoarece [HCO3-] este constanta

fiind prezenta in concentratie mare,

[NH4+] este constanta fiind prezenta in

concentratie mare, si atunci:

Ecel= K + 59 log [CO2]Ecel = K - 59 log [NH3]

BIOSENZORI CLASICI ( i ti )


45/82

BIOSENZORI CLASICI (prima generatie)

DOMENIUL CONCENTRATIILOR DE SUBSTRAT CARE POT FIDETERMINATE PRIN INTERMEDIUL DIFERITILOR SENZORI ELECTROCHIMICI

METODA SENZOR Dom. Conc.mol/l

Potentiometrie H+

, Na+

, CN-

, NH4+

,I- 10

-5

10-2

Amperometrie Pt/H2O2 10-710-3

Sensor de gaz

potentiometricNH3, CO2 10

-410-2

Sensor de gaz

amperometricOxygen 10-510-4

C i


46/82

Compui

Gaze anestezice

Gaze respiratorii

Gaze inflamabile

Gaze toxice

Metabolii

Metabolii n urme

Ioni

Ioni ai metalelor grele

Vapori organici toxici

Proteine,acizi nucleici

Microorganisme

N O2

CO , O2 2

CH4

CO, H S,Cl , NH2 2 3

Glucoz, uree

Hormoni,steroizi,

H+, Li+, Na+, K+, Ca2+, PO3-4

Pb2+, Hg2+, Cu+, Cd2+

Benzen, toluen

AND, ARN, cazeina

Virui, bacterii

Bi C l l I t Ch t


47/82

Biosensor

-----------------------

TraductorEnzima

Celule,

Micro-

Organisme

Imuno-

Agentesut

Animal/

Vegetal

Chemo-receptor

Celula Electro

chimicAmpero-

metricx x x x x x x x

Ponteio-

metricx x x x x x x x X

Semiconductor

( ISFET)x x x

Termistor x x

Fotometric

(fibre optice)x x

Piezoelectric(cuar) x x

Chemomecanic x

D i l A li ii


48/82

Domeniul Aplicaii

Clinic/medical Analiza medicamentelor, analiza sngelui, monitorizarea medicamentelor terapeutice,diagnostice clinice

Industrial Procese biotehnologice i fermentative, procese industriale i alimentare, controlul calitii,deteciacontaminanilor, analiza apei i apelor uzate, detecia unorprodui/subprodui

toxici, testarea produselor cosmetice

Agricultur/veterinar Diagnosticarea bolilor la plante i animale, detecia compuilor toxici, testarea calitiisolului i apei, msurarea necesarului biochimic de oxigen, controlul calitii

produselor vegetale i animale, monitorizareapstrrii lor n timp.

Securitate/aprare Deteciasubstanelorchimice duntoareiagenilorbiologici, incluzind explozivi, gaze delupt, micotoxine, virui, bacterii patogene i toxine biologice.

Mediu Detecia unor compui chimici toxici n ap, aer, sol, detecia contaminarii personale.

Robotic Instrumente senzoriale pentru construcia unor sisteme automate care funcioneaz n medii

ostile, n mediu casnic isntate.


49/82

-Timpul de raspuns (t90) 2-3 minute-Timpul de revenire- Domeniul de linearitate-Stabilitatea raspunsului:

Pe parcursul masuratorilor: drift


50/82

Compusi biochimici detectabili

1. Glucoza2. Alcoolul3. Colesterolul4. Ureea

5. Metalele grele6. Pesticidele7. Fenolii


51/82

suprafata unui electrod de platina sau oxigenunde este oxidata respectiv redus electrochimic

H2O2/O2 difuzeaza atit

E > + 0,6 V

S

E

E

H O2 2

Reactia enzimatica

Glucoza

+ Glucozoxidaza

Glucolactona

+O

2H2O2

Reactia electrochimica

O2H2

+2 H + + 2 e-O2

DETECTIA GLUCOZEI

in afara membranei spre solutie

cit si spre

O2 + 2 H+ + 4 e- 2 OH-E > - o,6 V

Biosensor pentru determinarea alcoolului


52/82

Determinarea etanolului este probabil cel mai frecvent test necesar in cazurile destabilire legala a gradului de intoxicare cu alcool, care reprezinta una din cauzele majore ale

accidentelor rutiere; ea prezinta importanta si scopuri forensice. Dificultati in conducerea

autoturismelor incepe de cantitati de 50 mg de etanol/100 mL singe.Masuratorile de etanol se efectueaza in probe de singe, urina si saliva.In USA peste 14 millioane de oameni sunt alcoolici, iar in 1996 mai mult de doua

millioane de oameni au fost arestati pentru conducere sub influenta alcoolului.Concentratia de alcool din singe este in present masurata cu ajutorul unor analizoare ale

respiratiei, gaz cromatografie si enzimatic. Imprecizia rimei metode a facut ca in in scopurimedicale sa se foloseasca in mod exclusiv ultimile doua metode.

Alcool + O2 H2O2 + AcetaldehideaAox = alcool oxidazaH2O2 produsa este masurata de sensorul amperometric si corelata cu concentratia de alcool din saliva. Alcoolul are o

presiune de vapori relativ mare ceea ce duce la eliminarea interferentelor datorate compusilor nevolatili.

Biosensor pentru determinarea alcoolului

METHODA ENZIMATICA DE DETERMINARE A ALCOOLULUI DIN SALIVA

Ea are la baza un sensor amperometric pentru H2O2 acoperit cu o membranacontinind alcool-oxidaza (Aox) imobilizata si cu o membrane hidrofoba gazpermeabila, care elimina majoritatea interferentelor posibile.

Alcoolul din saliva difuzeaza prin membrane gaz permeabila sireactioneaza cu enzima conform ecuatiei:

AOx


53/82

Etanol Acetaldehid

ADH

NAD+ NADH + H+

Principiul determinarii spectrometrice a alcoolului

Detecie la 340nm

Concentraia de NADH crete proprorional cu cea a etanolului.

ADH=alcool dehidrogenaza

NADH-ul este determinat pe baza absorbanei lui la 340nm


54/82

S-a realizat un biosensor electrochimic pentru determinarea acidului lactic din saliva.Interferentele electrochimice si biologice din cadrul determinarii au fost eliminate prin

folosirea a doi electrozi de Pt si a unei membrane.

Lactat + O2 +H2O2 Piruvat + H2O2

LOx

METODA ENZIMATICA DE DETERMINARE A LACTATULUI

REACTIE

H2O2 produsa este masurata la + 650 mV fata de Ag/AgCl cu ajutorul electrodului dePt. Modificarea curentului datorata oxidarii H2O2 este proportionala cu concentratiade lactate din proba.

(LOx)= lactat oxidaza


55/82

Colesterol

exemplu reprezentativ de steroid

component esential in membranele celulare ani

precursor in biosinteza tuturor steroizilor,

hormonilor, a vitaminei D etc.

stocat in celule sub forma unui ester a acizilor g

Plasma sanguina umana contine 130-260 mg colesterol / 100mL

2/3 din colesterol : esterificat cu acizi grasi

1/3 din colesterol : este sub forma de sterol (cholesterolul liber)

Concentratii mari de colesterol:


56/82

Reactia catalizata de enzima

Colesterol O2COx

Colesterol-4-en-3-ona H2O2

Reactia bioelectrochimica de detectie acolesterolului


57/82

Dependenta raspunsului senzorului de diferite concentratii de colesterol, acid colic si deoxicolic

Colesterol

Acidul deoxicolic

Acidul colic

Specificitatea senzorului pentru colesterol

HO

H

CH3

H

H

CH3

OH

COOH

OH

H

H3C

H

HO

H

CH3

H

H

CH3

OH

COOH

H

H3C

H

R i li d i


58/82

Reactia catalizata de enzima

O O

H

H

H

Grupa ester

Colesteril oleatul H2OCE

Colesterol acidul oleic

OHO

Determinarea colesterolui esterificat


59/82

Detectia esterului colesterolului

Reprezentarea schematica a seventelor de reactii reactii enzimatice pentru determinarea

Introduction 5


60/82

Detectia esterului colesterolului

Curba de calibrare pentru colesteril oleat obtinuta la suprafata electrodului modificat

Cai de reducere a potentialului pentru transformarea electrochimica a H2O2 si a O2


61/82

Cai de reducere a potentialului pentru transformarea electrochimica a H2O2 si a O2

i depunerea unor metale nobile pe suprafata electrozilor de carbunei depunerea unor mediatori redox (ex. albastrul de prusia) pe suprafata electrozilor

conventionalii folosirea altor catalizatori ex. feroftalocianinai folosirea electrozilor modificati cu peroxidaza

Inlocuirea O2 cu un alti aceptori de e- (mediatori)

Biosensorii vor functiona la valoarea potentialului formal redox al mediatorlui


62/82

Electron transfer in biosensors

Second Generation


63/82

For an oxidation reaction

Mediated electron transfer path between a redox enzymeand an electrode

reduced mediator

oxidised mediator

electrode

2 e-electron transfer

substrate

product

oxidised enzyme

reduced enzyme

electron transfer electron transfer

Transferul de electroni mediat dintre o enzima redox si un electrod


64/82

Depunerea albastrului de Prusia Fe4III[FeII(CN)6]3 si a altorcatalizatori pe suprafata electrozilor conventionali

+ conduce la crestere selectivitatii electroreducerii H2O2 care are loc

pe domeniul cuprins intre +150- -150 mV vs. Ag|AgCl

substrate

oxidase

product

O2

H2O2

2 H2O

electrode

2 e-

2 H+

re duction at +150 - -150 mV vs. Ag|AgCl

Depunerea de metale nobile (Pt, Pd, Ru, Rh) pe suprafata electrozilor de carbon are

dezavantajul lipsei de selectivitate

MEDIATORI CHIMICI UTILIZATI IN BIOELECTROCHIMIE


65/82

N

N

CH3

CH3

S

N

(H3C)2N+ N(CH3)2

N+

N

CH3

O

O

Fe(CN)64-/3-

Fe0/1+

hexacyanoferrate

ferrocene

methylviologen

methylene blue

/+

+

N-methylphenazinium

anthraquinone

1 e- aceptori/donori vs. 2 e--H+ aceptori/donori


66/82

ELECTROZI CHIMIC MODIFICAI (CME)

Un electrod chimic modificat poate fi definit ca reprezentnd o modificareraionala intentionat a structurii moleculare a suprafeei electrozilor convenionalin scopul utilizrii lor n cadrul unor aplicaii specifice

Electrozii chimic modificai (CMEs) se bazeaz pe fixarea unui centru redox (mediator) pesuprafaa electrodului.Acesta funcioneaz ca un mediator pentru transferul rapid de electroniSpre molecula de substrat, care in lipsa mediatorului este oxidat sau redus lent(sau deloc n unele cazuri) la suprafaa unui electrod convenional.


67/82

e-

SOLUIE

SUPRAFAA

ELECTRODULUI

SUBSTRATred

SUBSTRATox

Medox

Medred

Sox+Mred

- ne-

SredMox +

Mred Mox

Reprezentarea schematic a unui CME si a reaciei de electrod

Determinarea electro-enzimatica a glucozei din singe


68/82

Determinarea electro enzimatica a glucozei din singe

Eapl = 0,4V vs. SCE

Glucoza + chinona (Q) + H2O acidul gluconic+ hidrochinona (HQ)

Electrod de Pt

Gox

HQ Q + 2H+ + 2e-

D.L. Williams, A.R. Doig, Jr., A.Korosi, Anal. Chem., 42 (1970)

Electrozii chimic modificati bazati pe metalo-ftalocianine catalizeaza reactiile:


69/82

c c c d c b p c c c

tiolilor, carbohidratilor, apei oxigenate si a peroxizilor organici

A. Ciucu, R. P. Baldwin, Electroanlysis, 4, 515-519 (1992)

Structura tetraamino-cobaltftalocianinei

Structura fero ftalocianinei

Proprietatile importante ale metalo-ftalocianinelor:


70/82

p p

Solubilitate mica in majoritatea solventilor aposi si organici

B Domeniu larg de potentiale care se schimba odata cu metalulcentral

Metaloftalocianinele prezinta urmatoarele potentiale de oxidare fata de SCE

Fe (II) PhC +0.16 V

Co (II)PhC + 0.77 V

Co (II)PhC are un potential de oxidare pozitiv mare, iar starea ei oxidata

Co(III)PhC generata electrochimic reprezinta un agent oxidant.

Fe(II)PhC poate fi utilizata ca agent reducator

Inhibitia reactiilor enzimatice are aplicatii analitice pentru determinarea unor poluanti ai


71/82

mediului

Grupele principale de inhibitori i enzimele asupra crora acioneaz

Inhibitor

Enzima

Pesticide:

Insecticide:

(organofosforice

i carbamate)

Erbicide

(sulfoniluree,

triazaine)Fungicide

(ditiocarbamate)

colinesteraza, alcalin fosfataza, tirozinaza,

peroxidaza

aldehid dehidrogenaza, tirozinaza

Metale grele:

Beriliu

Cadmiu

Crom

CobaltCupru

Plumb

Mercur

Argint

Zinc

Alcalin fosfataza, Colinesteraza, ureaza

Monitorizarea mediului necesita analiza unui numar mare de probe


72/82

p

pret de

cost scazut

rapide

Si de aceea sunt necesare metode

de analiza

automate

Monitorizarea continua a modificarilor de mediu necesita realizare unor sisteme analitice de

supraveghere si alerta

POLUAREA CU METALE GRELE


73/82

POLUAREA CU METALE GRELE

Devezvoltarea si validarea unor metode de determinare in timp utila metalelor grele toxice

prezente in soluri si ape de suprafata contaminate

! identificarii tendintei de poluare

! a gradului de poluare! controlului eficientei activitatilor deremediere

In scopul

In acest domeniu se are in vedere


74/82

Cerinte tehnice pentru metodele de monitorizare a zonelor contaminate

Nu trebuie sa prezinte o precizie ridicata (metode de scanare)

Domeniu de concentrtii (in jurul valorilor de ppm)

Simplitatea analizei (sa nu necesite personal inalt calificat)

Timp de analiza mic (aprox. 1 ora)

Metale grele = Cu, Pb, Hg,etc

Pret de cost scazut

BIOSENSOR PENTRU DETECTIA METALELOR GRELE


75/82

Based on this scheme of reaction involving an oxidase:

invertase

Sucrose + H2O D-glucose + D-fructose (I)

Gox

D-Glucose + O2 gluconic acid + H2O2 (II)

and a glucose probe

we developed a FIA system for Hg(II) detection in the range 10-80 ppb.

Curba de calibrare pentru Hg(II), obtinuta cu biosensorul bazat pe invertaza

Inhibata de Hg(II)

A. Lupu, D. Compagnone, A.Ciucu, V.Magearu, G. Palleschi, Anal. Lett., 34 (2001) 17-25

Tab. 3.4Determinarea metalelor bazata pe inhibiie enzimatic

M t l l

Enzima inhibat Metoda de detecie Limita de detecie moli/l


76/82

Metalul

determinat

Hg

Ureaza

Invertaza

BuChE

Xantin-oxidaza

Peroxidaza

Glucoz-oxidaza

Poteniometric

Spectrometric

Fluorimetric

Spectrometric

Polarimetric

Amperometric

Spectrometric

Spectrometric

Amperometric

5x10-92x10-7

2,5x10-101x10-8

2,5x10-91x10-8

1x10-11

2x10-8

3x10-5

1x10-8

5x10-6

1x10-5

Cu

Ureaza

BuChE

Alcalin fosfataza

Xantin oxidaza

Glucoz oxidaza

Spectrometric

Poteniometric

Termometric

Amperometric

Spectrometric

Spectrometric

Amperometric

1,5x10-71x10-8

2x10-63x10-6

1x10-6

1x10-9

1,5x10-5

1x10-7

5x10-5

Pb

BuChE

Peroxidaza

Alcalin fosfataza

Ureaza

Amperometric

Spectrometric

Spectrometric

Poteniometric

5x10-71x10-5

5x10-8

3x10-9

2x10-6

CdBuChE

Alcalin fosfataza

Peroxidaza

Amperometric

Spectrometric

Spectrometric

5x10-56x10-5

9x10-61x10-4

5x10-6

BiAlcalin fosfataza

BuChESpectrometric

Fluorimetric

Amperometric

1x10-6

1,4x10-5

1x10-5

NiUreaza

Alcalin fosfatazaPoteniometric

Spectrometric2x10-6

2x10-6

CoUreaza

Alcalin fosfatazaPoteniometric

Spectrometric2x10-6

1,5x10-5

Cr

Ureaza

Xantin oxidaza

Spectrometric

Spectrometric

1,8x10-4

3x10-7

WHY PESTICIDES?


77/82

WHY PESTICIDES?

Insecticidele organofosforice si carbamate sunt folosite in agricultura

Ele sunt contaminanti ai alimentelor avind un impact deosebit asupra sanatatii umane

Ele inhiba ireversibil sau cvasi-ireversibil AchE si BuChE care hidrolizeaza neurotransmitatorul

acetilcolina implicat in transmisia neuronalaneuronala

Efect toxict

Directiva comunitatii europenee relativa la calitatea apei potabile:

Concentratia maxim admisibila este de 0.1 ppb pentru pesticidele individuale

si de 0.5 ppb pentru pesticidele totale.

Detectia pesticidelor


78/82

Pesticidele sunt prezente in:

Multe probe de solApele de adincime si reziduale

Masurile preventive presupun existenta unor metode rapide de detectie

Sursei de poluare Gradului de poluare

Direct pe teren

Principiile biochimice care stau la baza metodelor de detectie a pesticidelor sunt:

Inhibitia enzimaticaimunodeterminariBlocarea activitatii fotosintetice

Pentru identificarea

Metoda Ellman


79/82

bazat pe detecia tiocolinei format n urma reaciei de hidroliz a acetiltiocolinei

ATChO + H2O TChO + CH3COOH

tiocolina

AChE

(CH3)3+N (CH 2)2 SH +

-OOC

SNO2

S NO2

COO-

(CH3)3+N (CH 2)2 S S NO2

COO-

+ HS NO2

COO-

Derivat al acidului di-nitrobenzoic Acid 5-mercapto 2-nitrobenzoic

Tiocolina Acidul dinitro ditiobenzoic

Compus galben (= 412 nm)


80/82

AChE

Acetilcolin + H2O Colin + CH3 COOH

Colina + 2O2 + H2O Betain + 2H2O2

ChOx

n general, metodele descrise n literatura de specialitate pentru determinareaactivitii acetilcolinesterazei (AChE) au la baz un sistem de reacii enzimatice

cuplate incluznd pe lng AChE i colin-oxidaza (ChOx), care mpreuncatalizeaz secvena de reacii:

Sistem monoenzimatic


81/82

AChEATCh + H2O TIOCOLINA + CH3OOH

oxidare anodicaTIOCOLINE

+410mV

Ditio-bis-colina

S - (CH2)2N+(CH3)3

S - (CH2)2N+(CH3)3

+ 2H+ + 2e-

Sistem monoenzimatic

R iil bi l hi i l i l l i l d d d b difi F PhC


82/82

Reactiile bioelectrochimice la nivelul unui electrode de pasta de carbune modificat cu FePhC

Fe (II) PC + H2O2 Fe (III) PC+produs de reactie redus

Fe (III) PC + e- Fe (II) PC

Documents

Curs Biochim Analitica Prof.dr. Anton Ciucu