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Genetic Resources and Biotechnology
Cenargen
Curso PCR em Tempo Real
Dr. Júlio Carlyle M. Rodrigues (Cenargen)
XVIII MET – Salvador, Outubro 2013
Introdução: Reação em Cadeia da Polimerase
• Mecanismo de replicação;
• Histórico;
• Princípios;
• Aplicações.
Replicação do DNA
Replicação do DNA
Mecanismo de reação da DNA polimerase
• ataque nucleofílico –OH/PO4;
• cofatores: metais divalentes (Mg+2);
• energia: quebra de pirofosfato;
• pareamento posiciona dNTP corretamente
PCR: histórico
• 1953 – Watson & Crick: estrutura (1962)
• 1957 – Arthur Kornberg: replicação e descoberta da DNA polimerase (1959)
• 1959 – Gobind Khorana: código genético, síntese de oligonucleotídeos (1968)
• 1969 – Thomas D. Brock: isolamento da bactéria Thermus aquaticus
• 1970 – Isolamento do fragmento Klenow
• 1971 - "... one would hope to obtain two structures, each containing the full length of the template strand appropriately complexed with the primer. DNA polymerase will be added to complete the process of repair replication. Two molecules of the original duplex should result. The whole cycle could be repeated, there being added every time a fresh dose of the enzyme."
• 1976 – Isolamento de DNA polimerase de T. aquaticus
• 1977 – Frederick Sanger – Sequenciamento (1980)
•Pesquisa em diagnóstico – Cetus Corporation, California
•Kary B. Mullis (1983) – reação cíclica para detecção da mutação de anemia falciforme (usou princípio de Sanger e teve a idéia de colocar o 2nd primer);
• Cetus – aplicou para patente em Março, 1985, aprovada em 1987;
• Cetus – purificação e utilização da Taq polimerase, patente Junho 1987, aprovada em 1990;
• 1985 – joint venture Cetus- Perkin Elmer: instrumentação;
• Kary B. Mullis – Nobel 1993
• Roche compra patente por US$ 300.000.000,00
PCR: histórico
Polymerase Chain Reaction
Polymerase Chain Reaction
Polymerase Chain Reaction
• simplicidade;
• custo;
• diversidade de aplicações;
• material biológico limitante.
PCR: cuidados
• Contaminação!!!!
Bancada, primers, reagentes, pipetas
• preparar controles negativos/positivos;
• sempre uma boa idéia sequenciar produtos;
• desenho de primers fundamental: evitar ‘hairpins’, complementariedade (formação de dímeros). Programas:
primer3 (http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm);
PCR: otimização
• MgCl2 - altas concentrações facilitam inespecificidade, típico 1,5 mM;
• dNTP – alta concentração aumenta erro, típico 0,2 mM;
• concentração do molde: muito pode favorecer inespecifidade;
• temperatura de anelamento do primer: ponto mais crítico, quanto mais alta mais específico. Testar usando gradiente;
• tempo do ciclo: extensão - de acordo com tamanho do fragmento a ser amplificado (aprox. 1Kb/min)
Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription)
• análise de expressão gênica;
• isolamento de RNA (total ou poli-A+);
• síntese de cDNA (transcriptase reversa);
• PCR com primers específicos
Aplicações: RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)
• obtenção de cDNA full length;
•kits (Clontech/Invitrogen);
• extração de RNA total;
• sintese de cDNA (oligo-dT);
• adição de adaptadores nas pontas;
• PCR usando primers gene-específicos e primers específicos aos adaptadores;
• derivação: genome walking – elementos regulatórios (promotores)
Aplicações: RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA)
• detecta polimorfismos;
• utilização de primers randômicos (6nt);
• gera marcadores moleculares;
• pode gerar SCAR (Sequence Characerized Amplified Region)
Aplicações: PCR-based diagnostic assays
US$ 5,4 bilhões (2008)
Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription)
Considerações importantes
• Qualidade do RNA (padronizar protocolo);
• Remoção de DNA;
• Quantificação precisa (Nanodrop + gel);
• Genes de referência: constitutivos/housekeeping;
• Controle negativo: sem template/reações de cDNA sem TR;
• Controle positivo: gDNA
Genes de Referência
• controle de quantidade inicial de molde (evitar diferenças de amplificação sejam devido à quantidades iniciais diferentes): Normalização
• mesmo número de cópias em todas as células;
• expressão em todas as células;
• Exemplos: gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase; actina; tubulina; ubiquitina, genes ribossomais, etc.;
• Pode variar de acordo com tecido: TEM QUE TESTAR!!
Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription)
Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription)
Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription)
Semi-quantitativo
• análise na fase exponencial do PCR;
• usar mesma quantidade de molde;
• montar vários tubos da mesma reação;
• variar qtde de ciclos de cada reação;
• softwares de análise de imagem (Image J)
Polymerase Chain Reaction
Pq PCR em tempo real? QUANTIFICAÇÃO
Método de detecção de produtos de amplificação: SYBR Green
Vantagens:
• custo;• sensibilidade;• só liga a DNA fita dupla;• não interfere na reação.
Desvantagens:
• liga a qualquer DNA fita dupla(detecta produtos inespecíficos)
Método de detecção de produtos de amplificação: TaqMan probes
Vantagens:
• especificidade;• sensibilidade.
Desvantagem:
• custo (uma sonda por reação)
Método de detecção de produtos de amplificação
PCR em Tempo Real: quantificação de expressão gênica
• vantagem quando o RNA é limitante;
• muito mais sensível que RT-PCR comum;
• fazer cDNA com kits comerciais, testar diluições (depende do nível de expressão do gene);
• desenho de primers: amplicon pequeno (100 a 200 bp); Tm alto; muito cuidado com formação de dímeros!
• fazer amostras em triplicatas.
PCR em Tempo Real
PCR em Tempo Real: genes de referência
• controle de quantidade inicial de molde (evitar diferenças de amplificação sejam devido à quantidades iniciais diferentes): Normalização
• mesmo número de cópias em todas as células;
• expressão em todas as células;
• repetições para ter média;
• Exemplos: gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase; actina; tubulina; ubiquitina, genes ribossomais, etc.;
• Pode variar de acordo com tecido: TEM QUE TESTAR!!
Passo-a-passo
1) Extração de RNA total
2) Sintese de cDNA – same kit, standard and optimized protocol;
3) Gene de referência;
4) Primer design – parâmetros, teste com RT-PCR convencional;
5) Curva de diluição – eficiência , determinar diluição para experimento, curva de dissociação (especificidade);
6) Experimento – triplicata
7) Análise – Delta-delta Ct
8) Data – Fold change
Extração de RNA total
• time points – controle rígido, padronização de tratamentos;
• DNAse treatment – controle, primers spanning introns;
• integridade: gel - ribossomais;
• quantificação: nanodrop e gel;
Gene de referência
• testar vários;
• estabilidade, pouca variação (geNorm);
• experimento: pode usar mais de um para normalização;
• geNorm: determina estabilidade entre vários genes testados, Calcula fator de normalização - auxilia na escolha
Gene de referência
meristema
flor
raiz
PCR em Tempo Real: genes de referência
• parâmetros: GC 40-50%, 18-22 nt, amplicon de 100-200bp
• cuidados: auto-complementariedade, dimerização;
• Primer 3 software – http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/
• teste com RT-PCR convencional;
• Determinar eficiência;
• Curva de diluição – usar cDNA ou plasmídeo;
• determinar diluição para experimento;
• curva de dissociação (especificidade);
Desenho de primers
Desenho de primers – Primer3
PCR em Tempo Real: correlação e eficiência dos primers
Eficiência: E = 10(-1/slope) –1
PCR em Tempo Real: correlação e eficiência dos primers
PCR em Tempo Real: curva de dissociação
Desnaturação e Temperatura em que fluorescência some
Depende de tamanho e sequência: utilizado para genotipagem
Mais de um pico: recomenda desenho de primers novos
PCR em Tempo Real: quantificação por curva padrão
• fazer curva padrão atribuindo valores para cada ponto de diluição;
• quantificar amostras desconhecidas na curva padrão;
• correlação (r2) tem que ser alta e valores das amostras dentro da curva;
• normalização com valores do gene de referência;
• Quantificação absoluta: saber número de cópias, moléculas, partículas virais
PCR em Tempo Real: quantificação por curva padrão
PCR em Tempo Real: quantificação relativa método DDCt
• ∆Ct(controle)- ∆Ct(tratamento);
• assume eficiência de 100% para os dois pares de primers;
• precisa ser validado: curva padrão;
• bastante utilizado, mas o Pfaffl corrige para eficiências diferentes.
PCR em Tempo Real: quantificação relativa formula de Pfaffl
PCR em Tempo Real: quantificação relativa método DDCt
• 2∆∆Ct;
• 211.40 = 2702
• pelo método Pfaffl: 1901
REST (Relative Expression Software Tool) - rest.gene-quantification.info/
Corrige variações do gene de referência, entre placas, vários genes de referência
Statistical analysis programs
Statistical analysis programs
http://www.biotechniques.com/softlib/qgene.html
Q-gene
Aplicações PCR em tempo real
• Expressão gênica;
• Detecção de transgenes – número de cópias, rastreabilidade;
• Diagnóstico – presença/ausência, genotipagem;
• microRNA expression;
• multiplex para detecção, diagnóstico e expressão
PCR em Tempo Real: Aplicações
Transgenic detection
PCR em Tempo Real: Aplicações
Pathogen detection
Alteração da temperatura dos picos mostra fragmentos diferentes: genotipagem
PCR em Tempo Real: Aplicações
Pathogen detection
Painel de primers e alvos:
presença/ausência
genotipagem
PCR em Tempo Real: Aplicações
Pathogen detection
Detecção e análise de expressão de microRNA
• codificados por genes endógenos;
• 21-22 nucleotídeos;
• afetam expressão de genes-alvo: bloqueio/degradação de mRNA;
• controlam vários processos do desenvolvimento de plantas e animais;
• detecção por gel de acrilamida;
• validação de high throughput small RNA data
PCR em Tempo Real: Aplicações
microRNA expression
PCR em Tempo Real: Aplicações
Transgenic detection
• Análise por Southern blot;
• Caro, time-consuming, método radioativo;
• Real-time: análise em high throughput;
• Método delta-delta Ct: gene endógeno com número de cópias conhecido;
• Planta não transformada ou previamente caracterizada
PCR em Tempo Real: Aplicações
Transgenic detection
Gene endógeno
Transgene
- Quantificação pode determinar número de cópias
Detecção de transgenes: Javdi et al. Euphytica (2010) 173:185–191
Taqman probe
1)Curva padrão
Adicionar plasmideo equivalente de acordo com tamanho do genoma;
Usar DNA de planta não transformada;
Detecção de transgenes: Javdi et al. Euphytica (2010) 173:185–191
2) Curva padrão: reação multiplex gene endógeno e transgene;
TPS – uma cópia por genoma;
Delta Delta Ct
Detecção de transgenes: Javdi et al. Euphytica (2010) 173:185–191
Homozigose – valores pequenos negativos, Hemizigose - valores positivos pequenos,Não transgênico – valores altos negativos
Real-Time PCR Technology for Cancer Diagnostics
Método: Taqman probes
Alvo: Proteína p53
PCR em Tempo Real: Aplicações
High Resolution Melting (HRM) analysis: Genotyping
Fibrose Cística
Detecção de SNP – HTR2A
PCR em Tempo Real: Aplicações
High Resolution Melting (HRM) analysis: Genotyping
Simultaneous detection of Brazilian isolates of grapevine viruses by TaqMan real-time RT-PCR. Dubiela et al, Trop Plant Path 38(2). 2013
Taq probes and primer sets
Simultaneous detection of Brazilian isolates of grapevine viruses by TaqMan real-time RT-PCR. Dubiela et al, Trop Plant Path 38(2). 2013
Variabilidade genética dificulta detecção e diagnóstico
Desenvolvimento de técnica para detectar isolados virais brasileiros
Metodologia
Infecção controlada com amostras controle;
Sondas: alinhamento e detecção de regiões conservadas;
Extração de RNA total;
Real time
96-well plates using the kit TaqMan Master Mix One-Step RT-PCR (Applied Biosystems): 6.1 µL of the One-Step RT-PCR Master Mix (containing AmpliTaq Gold DNA polymerase, dNTPs, a passive reference ROX and optimized buffer); 0.6 µL of the mixture of primers and probe(s) (415 nM primer and 85 nM probe); 0.3 µL of MuLV reverse transcriptase and RNAse inhibitor and 3 µL of total RNA (ca. 300 ng) to a final volume of 12 µL.
Thermocycler StepOnePlus Real-time PCR System (Applied Biosystems) :45ºC for 35 min (for reverse transcription), 95ºC for 10 min (activation of AmpliTaq Gold), followed by 40 cycles at 95ºC for 15 s (denaturation) and 60ºC for 1 min (annealing and extension).
Presence/absence assays by determining the CT (threshold cycle). It was established that a CT value below 35 indicates a positive result.
To check the efficiency and reproducibility of reactions resulting from the use of primers and probes, virus-infected control samples and samples with unknown phytosanitary status were analyzed in simplex reactions for all ten viruses evaluated.
Simultaneous detection of Brazilian isolates of grapevine viruses by TaqMan real-time RT-PCR. Dubiela et al, Trop Plant Path 38(2). 2013
Simultaneous detection of Brazilian isolates of grapevine viruses by TaqMan real-time RT-PCR. Dubiela et al, Trop Plant Path 38(2). 2013
Grapevine leafroll-associated virus (GLRaV-1, -2, -3 and -5),
Grapevine virus A (GVA),
Grapevine virus B (GVB),
Grapevine virus D (GVD),
Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (GRSPaV),
Grapevine fleck virus (GFkV)
Grapevine fanleaf virus (GFLV)
Simultaneous detection of Brazilian isolates of grapevine viruses by TaqMan real-time RT-PCR. Dubiela et al, Trop Plant Path 38(2). 2013
Duplex – detecção de dois isolados virais
Análise de 6 sets de primers para detecção de 4 isolados. Qual par funcionou melhor?
Thanks for Your Attention!Thanks for Your Attention!
Julio Carlyle, PhDJulio Carlyle, PhD
Assessor CHPD – BiotecnologiaAssessor CHPD – Biotecnologia
Embrapa Genetic Resources and Embrapa Genetic Resources and BiotechnologyBiotechnology
[email protected]@embrapa.br
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Assessor CHPD – BiotecnologiaAssessor CHPD – Biotecnologia
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