Cytochemical Localization of Polysaccharides in Claviceps paspali Ultrastructure During Submerged Fermentation of Alkaloids

7/29/2019 Cytochemical Localization of Polysaccharides in Claviceps paspali Ultrastructure During Submerged Fermentation o

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J O U R N A L OF B A C T E R I O L O G Y , A p r . 1 9 7 4 , p . 2 8 5 - 2 9 4C o p y r i g h t ( 1 9 7 4 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y V o l . 1 1 8 , N o . 1P r i n t e d i n U . S . A .

C y t o c h e m i c a l L o c a l i z a t i o n o f P o l y s a c c h a r i d e s i n C l a v i c e p sp a s p a l i U l t r a s t r u c t u r e D u r i n g S u b m e r g e d F e r m e n t a t i o n o f

A l k a l o i d sJ . V O r d W E K , J . LUDVIK, AND Z . t E H A V E K

I n s t i t u t e o f M i c r o b i o l o g y , C z e c h o s l o v a k Academy o f S c i e n c e s , P r a g u e , C z e c h o s l o v a k i aR e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 1 1 O c t o b e r 1 9 7 3

M o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f two t y p e s o f e l e m e n t s i n t h e s u b m e r g e dm y c e l i u m o f C l a v i c e p s p a s p a l i are d e s c r i b e d . D i s t r i b u t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e s i nt h e c e l l w a l l a n d c y t o p l a s m was c y t o c h e m i c a l l y d e t e r m i n e d a t t h e u l t r a s t r u c t u r a ll e v e l . P o l y s a c c h a r i d e d e p o s i t i o n i n t o t h e c e l l w a l l s was p r o p o r t i o n a l t o t h ei n c r e a s e i n t h e a l k a l o i d y i e l d . I n t h e c y t o p l a s m , on t h e o t h e r h a n d , t h e presenc eo f p o l y s a c c h a r i d e g r a i n s i n d i c a t e d a n a b s e n c e o f a l k a l o i d s y n t h e s i s .

O u r p r e c e d i n g s t u d i e s o n s a p r o p h y t i cC l a v i c e p s s t r a i n s w e r e c o n c e r n e d w i t h t h e p h y s -i o l o g y o f a l k a l o i d f o r m a t i o n ( 9 - 1 2 ; Z . t e h a c e k ,D . S c . t h e s i s , C z e c h o s l o v a k Academy o fS c i e n c e s , P r a g u e , 1 9 7 2 ) . A s t h e n e x t s t e p , t h eu l t r a s t r u c t u r a l d i s t r i b u t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e sw a s s t u d i e d c y t o c h e m i c a l l y a s a p o s s i b l e i n d i c a -t o r o f t h e p h y s i o l o g i c a l s t a t e o f C l a v i c e p sp a s p a l i . O u r i n t e r p r e t a t i o n h a s b e e n i n f l u e n c e db y t h e w o r k o f M a r e t , who r e l a t e d u l t r a s t r u c -t u r a l d a t a t o t h e r e s u l t s o f d e t a i l e d b i o c h e m i c a la n a l y s i s o f c e l l w a l l c o m p o n e n t s o f t h ea s c o m y c e t e , C h a e t o m i u m g l o b o s u m ( 7 ) .

MATERIALS AND METHODSC . p a s p a l i ( S t e v e n s a n d H a l l ) s t r a i n MG-6 w a su s e d i n t h i s w o r k . T h e e x p e r i m e n t a l d e s i g n c o n s i s t e d

o f g r o w i n g t h e c u l t u r e s i n a r i c h medium w h i c h d i dn o t f a v o r a l k a l o i d p r o d u c t i o n a n d t h e s u b s e q u e n tt r a n s f e r o f t h e s e c u l t u r e s i n t o a n u t r i t i o n a l l y p o o rm e d i u m i n w h i c h a l k a l o i d s w e r e f o r m e d ( 1 2 ) . B i o m a s sa n d a l k a l o i d s y n t h e s i s p r o c e e d e d s i m u l t a n e o u s l y ( 1 2 ) .T h e m y c e l i u m w a s c o l l e c t e d a t v a r i o u s t i m e i n t e r v a l sa n d a n a l y z e d . L y s e r g i c a c i d - a - h y d r o x y e t h y l a m i d ew a s a p r e d o m i n a n t c o m p o n e n t o f t h e a l k a l o i d m i x t u r ee x t r a c t e d f r o m t h e c u l t u r e m e d i u m .C y t o c h e m i c a l d e t e r m i n a t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e sw a s b a s e d o n t h e o x i d a t i o n o f v i c - g l y c o l g r o u p s o fm a c r o m o l e c u l a r g l y c o l s t o a l d e h y d e g r o u p s b y p e r -i o d i c a c i d , a n d t h e b i n d i n g o f t h i o s e m i c a r b a z i d e a s as e l e c t i v e r e a c t i o n c e n t e r f o r t h e f o r m a t i o n o f osmiumb l a c k ( 2 , 4 , 1 7 ) .T h e m y c e l i u m w a s w a s h e d a n d f i x e d w i t h 4%p a r a f o r m a l d e h y d e f o r 1 6 h ( 1 4 , 1 6 ) . A f t e r f i v e f o l dw a s h i n g w i t h 3 0 v o l o f i s o t o n i c N a C l s o l u t i o n , t h er e a c t i o n w a s a l l o w e d t o p r o c e e d f o r 3 . 5 h i n 1%p e r i o d i c a c i d . T h e n t h e m y c e l i u m w a s w a s h e d a g a i nf i v e t i m e s w i t h 0 . 8 5 % N a C l s o l u t i o n a n d s u s p e n d e d i n1% t h i o s e m i c a r b a z i d e ( E . M e r c k A g . , D a r m s t a d t ,G e r m a n y ) s o l u t i o n i n 1 0 % a c e t i c a c i d f o r 7 2 h . A f t e r a

s e r i e s o f s e v e n r e p l a c e m e n t s o f t h e i s o t o n i c s o l u t i o nw i t h g r a d u a l l y d e c r e a s i n g a c e t i c a c i d c o n c e n t r a t i o n ,t h e s a m p l e s w e r e p l a c e d i n 1 % O S O 4 i n d o u b l e - d i s -t i l l e d w a t e r , pH 6 . 8 , f o r 2 h . I n c o n t r o l s a m p l e s , t h eo x i d a t i o n w i t h p e r i o d i c a c i d w a s o m i t t e d . T h e s e -l e c t e d c r e a c t i o n s c h e m e a l s o e n a b l e d m u c o p o l y s a c c h a -r i d e s a n d t h e l e a s t r e a c t i v e g l y c o p r o t e i n s t o u n d e r g ot h e r e a c t i o n . A f t e r t h e r e a c t i o n , t h e s a m p l e s w e r ed e h y d r a t e d b y a n a l c o h o l s e r i e s a n d t r a n s f e r r e d t oa b s o l u t e a c e t o n e a n d t h e n t o V e s t o p a l W ( M a r t i nJ a e g e r C o . , G e n e v a , S w i t z e r l a n d ) . U l t r a t h i n s e c t i o n sw e r e m a d e o n LKB U l t r a t o m e I a n d v i e w e d u n d e rTESLA 6 1 3 ( F i g . 1 , 3 , 5 ) a n d JEM 1 0 0 - B m i c r o s c o p e s .S o m e s e c t i o n s f r o m c o n t r o l s a m p l e s w e r e s t a i n e d w i t hl e a d c i t r a t e f o r b e t t e r c o n t r a s t ( 1 3 ) .

RESULTSF i g u r e s 1 a n d 2 s h o w s e c t i o n s o f c o n t r o l s a m -p l e s o f C . p a s p a l i c e l l s c o m p a r i n g t h e u l t r a -s t r u c t u r e o f t h e m y c e l i u m w i t h t h e p a t t e r n o fp o l y s a c c h a r i d e d e p o s i t i o n a s b r o u g h t o u t b y t h ec y t o c h e m i c a l r e a c t i o n . T h e c o n t r o l s s h o w e d a n

e a s i l y r e c o g n i z a b l e e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t c e l lw a l l a n d l a r g e i n c l u s i o n s i n s i d e t h e c e l l s . A f t e rs t a i n i n g c o n t r o l s e c t i o n s w i t h l e a d c i t r a t e , t h em i t o c h o n d r i a a n d c y t o p l a s m i c m e m b r a n e a p -p e a r e d ( F i g . 3 ) .T h e f o l l o w i n g e l e c t r o n - o p t i c a l o b s e r v a t i o n sw e r e m a d e o n c e l l s i n w h i c h p o l y s a c c h a r i d e s o ft h e # ( 1 - 4 ) a n d 0 ( 1 - 6 ) - g l u c a n t y p e s w e r e d e -t e c t e d c y t o c h e m i c a l l y ( 7 ) . C e l l s f r o m a c o m p l e xmedium u s e d a s i n o c u l u m h a d a c a p s u l e f o r m e db y a t a n g l e o f f i n e p o l y s a c c h a r i d e f i b r i l s o n t h e i rs u r f a c e ( F i g . 3 , 4 ) . T h e c e l l s c o u l d b e d i v i d e di n t o t w o g r o u p s : ( i ) b a s i c h y p h a e w i t h a d i a m e -t e r o f 1 . 5 t o 3 u m ( F i g . 3 ) a n d ( i i ) e n l a r g e d c e l l sw i t h a m i n i m a l d i a m e t e r o f 3 ,m a n d a l e n g t h o fu p t o 1 5 u m ( F i g . 4 ) , d e n o t e d b y M e r c a n t i n i e ta l . a s a r t h r o s p o r e s ( 8 ) . Th e a r t h r o s p o r e s f o r m e d

B 5


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b -k.E.-_.s t =s El ! r q 1,F # 3 FC X , . v k S F

b

4%~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~4

pd;~~~~~~~~~~~~~bB'z ~ ~ ; > v r S > ; S f tA X

F I G . 1 . S e c t i o n o f 9 - d a y - o l d c u l t u r e o f C . p a s p a l i ; c o n t r o l w i t h o u t p e r i o d i c a c i d t r e a t m e n t . a , H y p h a ; b ,a r t h r o s p o r e ; c w , c e l l w a l l ; c , c y t o p l a s m ; p d , p o l y s a c c h a r i d e d e p o s i t ; l i l i p i d s . B a r , I p m ._~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~A.?. . . . ..... _st 4

4

'~Cm ,cmpd

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A. . iC W w .h . .

'SS

f t .

c f9* 9

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F I G . 2 . C r o s s - s e c t i o n o f h y p h a f r o m 9 - d a y - o l d C . p a s p a l i c u l t u r e . C o n t r o l w i t h o u t p e r i o d i c a c i d t r e a t m e n t ,c o n t r a s t e d b y l e a d c i t r a t e . c w , C e l l w a l l ; p d , p o l y s a c c h a r i d e d e p o s i t s ; c m , c y t o p l a s m i c m e m b r a n e : m ,m i t o c h o n d r i a ; c f , c a p s u l a r f i b r i l s . B a r , 1 p m .

2 8 6

. .

t

AM... , W-1w.


3/10

F I G . 3 . C r o s s - s e c t i o n o f h y p h a o f C . p a s p a l i f r o m i n o c u l u m c u l t u r e ; c y t o c h e m i c a l l y t r e a t e d . c f , C a p s u l a rf i b r i l s ; c w , c e l l w a l l ; l i , l i p i d s ; c , c y t o p l a s m . B a r , 1 u m .

F I G . 4 . C r o s s - s e c t i o n o f a r t h r o s p o r e s o f C . p a s p a l i f r o m i n o c u l u m c u l t u r e . c f , C a p s u l a r f i b r i l s ; c w , c e l l w a l l ; c ,c y t o p l a s m ; p s , p e r i p l a s m i c s p a c e ; v , v a c u o l e . B a r , 1 A m .2 8 7


4/10

288VOfEK,U D V I K , A ND I E H A R E K1 0 t o 2 0 % o f t h e i n o c u l u m p o p u l a t i o n . T h em a j o r i t y o f h y p h a e e x h i b i t e d a l a r g e p e r i p l a s -m i c s p a c e w i t h l a r g e , p o l y s a c c h a r i d e - l i k eg r a i n s . T h e p l a s m a m e m b r a n e w a s p r o b a b l yd i s i n t e g r a t e d d u r i n g a u t o l y s i s . B o t h b o u n d a r i e so f t h e h y p h a l c e l l w a l l w e r e c o v e r e d w i t h am a r k e d l a y e r o f f i n e p o l y s a c c h a r i d e g r a i n s s e n -s i t i v e t o p e r i o d i c a c i d . B e t w e e n t h e s e t w o l a y e r st h e c e l l w a l l s h o w e d d e p o s i t s o f m a t e r i a l i n s e n -s i t i v e t o p e r i o d i c a c i d , w h i c h w a s p r o b a b l yp r e d o m i n a n t l y o f t h e # ( 1 - 3 ) - g l u c a n t y p e ( 7 ) .T o t a l t h i c k n e s s o f t h e c e l l w a l l w a s a b o u t 0 . 1, m . T h e c o n t e n t o f a r t h r o s p o r e s w as s i m i l a r t ot h a t o f h y p h a e . T h e i n n e r s u r f a c e o f t h e c e l l w a l lw a s t h i c k e n e d t o 0 . 2 ,m ( F i g . 4 ) b y a n o t h e rh o m o g e n e o u s l a y e r o f p o l y s a c c h a r i d e m a t e r i a l .T h r e e d a y s a f t e r t h e t r a n s f e r o f i n o c u l u m t os y n t h e t i c m e d i u m , t h e c u l t u r e w a s f o u n d t oc o n t a i n c h i e f l y h y p h a e . A t l e a s t o n e - h a l f o ft h e s e h a d s u p p r e s s e d c y t o p l a s m a n d c o n t a i n e dp o l y s a c c h a r i d e g r a n u l e s a g g r e g a t e d i n t h e l a -m e l l a e o f g r a i n s ( F i g . 5 ) . T h e u l t r a s t r u c t u r e o fc e l l w a l l a n d s e p t a w a s n o t c h a n g e d a s c o m -

% 4 b

p a r e d w i t h t h e i n o c u l u m c u l t u r e . Y o u n g h y p h a ew i t h i n t a c t c y t o p l a s m l a c k e d t h e c a p s u l a r c o a t( F i g . 6 ) . T h e c e l l w a l l c y t o p l a s m b o u n d a r y w a sb l u r r e d b y t h e p r e s e n c e o f a p o l y s a c c h a r i d el a y e r o n t h e i n n e r s u r f a c e o f t h e c e l l w a l l , w h i c ht h u s b e c a m e t h i c k e n e d t o 0 . 1 5 Mm ( F i g . 6 ) . I ns u c h c a s e s , t h e h y p h a l c e l l w a l l s h o w e d a c l e a rm u l t i l a y e r p a t t e m ( F i g . 7 ) . T h e o c c u r r e n c e o fp o l y s a c c h a r i d e ( g l y c o g e n ) g r a i n s i n h y p h a l c y -t o p l a s m v a r i e d c o n s i d e r a b l y ( 7 ) . C o m p a c t p o l y -s a c c h a r i d e d e p o s i t s w e r e a l s o f o u n d ( F i g . 7 ) .A r t h r o s p o r e s f o r m e d a b o u t a q u a r t e r o f t h ep o p u l a t i o n a n d u s u a l l y e x h i b i t e d a c o n s i d e r a b l yr e d u c e d c y t o p l a s m . A c h a r a c t e r i s t i c t h i c k e n i n ga n d r o u n d i n g o f h y p h a l c e l l s w a s s p o r a d i c a l l yo b s e r v e d , s i g n i f y i n g a t r a n s i t i o n t o i n t r a c h a i na r t h r o s p o r e s ( 8 ) . T h e m o s t m a r k e d c h a n g e i na r t h r o s p o r e s , a s c o m p a r e d w i t h h y p h a l c e l l s ,w a s t h e f o r m a t i o n o f a s h a r p b o u n d a r y b e t w e e nc e l l w a l l a n d c y t o p l a s m a n d a f u r t h e r t h i c k e n -i n g o f c e l l w a l l ( F i g . 8 ) . T h e d i a m e t e r o f t h ei n t r a c h a i n a r t h r o s p o r e s w a s 3 t o 5 , u m , a n d t h ea v e r a g e t h i c k n e s s o f t h e i r c e l l w a l l w a s 0 . 2 5 g m .

t . .v

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F I G . 5 . A u t o l y z e d h y p h a f r o m 3 - d a y - o l d c u l t u r e o f C . p a s p a l i ; c y t o c h e m i c a l l y t r e a t e d . c f , C a p s u l a r f i b r i l s ;c w , c e l l w a l l ; s , s e p t u m ; c , c y t o p l a s m . B a r , 1 A m .

2 8 8 J . B A C T E R I O L .

I W I P P ,

. ; 4f

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A V~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ }.it' . . , w ,~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ a %9 t t e o ~ ~ ~ ~ ~ .

F I G . 6 . Hypha f r o m 3 - d a y - o l d c u l t u r e o f C . p a s p a l i ; c y t o c h e m i c a l l y t r e a t e d . c w , C e l l w a l l ; c , c y t o p l a s m ; n ,n u c l e u s ; v , v a c u o l e ; p l , p o l y s a c c h a r i d e l a y e r o n c e l l w a l l . B a r , 1 A m .' A . ~ SI _. I & S i = : . ' *

A- 'O,IoF I G . 7 . H y p h a f r o m 3 - d a y - o l d c u l t u r e o f C . p a s p a l i ; c y t o c h e m i c a l l y t r e a t e d . c f , C a p s u l a r f i b r i l s ; c w , c e l lw a l l ; s , s e p t u m ; c , c y t o p l a s m ; v , v a c u o l e ; p d , p o l y s a c c h a r i d e d e p o s i t . B a r , 1 g m .

2 8 9

*I * . X s -

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4f& q** '. ; 4w


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v~~~~~~~~~~iiwitSt"i os s *(4/ t

. . II + V l . t s

F I G . 8 . I n t r a c h a i n a r t h r o s p o r e f r o m 5 - d a y - o l d c u l t u r e o f C . p a s p a l i ; c y t o c h e m i c a l l y t r e a t e d . c f , C a p s u l a rf i b r i l s ; c w , c e l l w a l l ; s , septum; v , v a c u o l e ; n, n u c l e u s ; m, m i t o c h o n d r i a ; a , a u t o l y z e d h y p h a l c e l l . B a r , 1 g i m .2 9 0

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POLYSACCHARIDES I N C . PASPALI ULTRASTRUCTUREA c h a r a c t e r i s t i c f e a t u r e o f t h e a r t h r o s p o r e s w a sa c o m p a c t l a y e r o f c a p s u l a r p o l y s a c c h a r i d ef i b r i l s .A 5 - d a y - o l d c u l t u r e c o n t a i n e d a p p r o x i m a t e l y5 0 % f i l a m e n t o u s h y p h a e , m o s t l y a u t o l y z e d . T h er e s t o f t h e c u l t u r e c o n s i s t e d o f y o u n g a r t h r o -s p o r e s no w a l s o f o r m e d t e r m i n a l l y o n m y c e l i a lh y p h a e ( F i g . 9 ) . T h e u l t r a s t r u c t u r e o f c e l l w a l l so f t e r m i n a l a r t h r o s p o r e s , a s s e e n a f t e r c y t o -c h e m i c a l d e t e c t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e s , d i f f e r e df r o m t h a t o f i n t r a c h a i n a r t h r o s p o r e s ( F i g . 1 0 ) .S t r a t i f i c a t i o n w a s n o t d i s c e r n i b l e , a n d t h et h i c k n e s s o f t h e c e l l w a l l w a s a s much a s 0 . 5 u m .T h e b o u n d a r y b e t w e e n t h e c e l l w a l l a n d c y t o -p l a s m e x h i bi t e d t h e p r e s e n c e o f a l a y e r s l i g h t l ys e n s i t i v e t o p e r i o d i c a c i d , w h i c h r e m a i n e d a t -t a c h e d t o c e l l w a l l o n i t s d e t a c h m e n t f r o mc y t o p l a s m ( F i g . 1 0 ) .Y o u n g i n t r a c h a i n a r t h r o s p o r e s f r e q u e n t l ys h o w e d t h e p r e s e n ce o f s e p t a w h o s e u l t r a s t r u c -t u r e w a s i d e n t i c a l t o t h a t o f t h e b a s i c t y p e o fc e l l w a l l ( F i g . 5 , 8 ) . T h e s e p t a w e r e d i s t i n c t l yc o n n e c t e d w i t h t h e i n t e r n a l l a y e r o f t h e t h i c k -e n e d c e l l w a l l ( F i g . 7 , 8 ) . T h e i n t r a c h a i n a r t h r o -

s p o r e s l a t e r d i v i d e d i n t o f i l a m e n t s c o m p o s e d o fu p t o f i v e c e l l s c o n s t r i c t e d i n t h e p l a c e s o f t h es e p t a . A t t h i s s t a g e , t h e s e p t a w e r e c o v e r e d f r o mb o t h s i d e s b y a 0 . 1 5 - , g m p o l y s a c c h a r i d e l a y e r( F i g . 1 1 ) . We a s s u m e t h at t h e l a y e r o f p o l y s a c -c h a r i d e s i n t e g r a t e s w i t h t h e c e l l w a l l a n d m a k e sp o s s i b l e t h e d e c i d u a t i o n o f a r t h r o s p o r e s . On t h es e v e n t h d a y o f f e r m e n t a t i o n , t h e c u l t u r e c o n -s i s t e d m a i n l y o f a r t h r o s p o r e s ( 8 0 % ) . T h e r e -m a i n i n g h y p h a e w e r e u s u a l l y a u t o l y z e d . A f t e rt h e a l k a l o i d y i e l d c e a s e d t o i n c r e a s e , t h e v a c u o l -i z a t i o n o f t h e c y t o p l a s m o f a r t h r o s p o r e s a n dm y c e l i a l h y p h a e b e c a m e a c c o m p a n i e d b y t h ea p p e a r a n c e o f n u m e r o u s p o l y s a c c h a r i d e g r a i n so n t h e v a c u o l e - c y t o p l a s m b o u n d a r y ( F i g . 1 2 ,a r r o w s ) . T h i s p r o c e s s h a d a l r e a d y s t a r t e d o n t h es e v e n t h d a y o f c u l t i v a t i o n ( F i g . 1 1 ) . A f t e r a na u t o l y s i s o f t h e c y t o p l a s m , t h e p a t t e r n o f p o l y -s a c c h a r i d e d e p o s i t i o n m i g h t b e v e r y s i m i l a r t ot h a t f o u n d i n c u l t u r e g r o w n o n a r i c h medium( F i g . 4 ) . A l o n g w i t h i t , h o w e v e r , c o m p a c t g l y c o -g e n d e p o s i t s i n h y p h a e i n c r e a s e d i n s i z e a n dn u m b e r s ( 7 ) . T h e s e d e p o s i t s w e r e n e v e r f o u n di n c u l t u r e s g r o w n o n a r i c h m e d i u m . I n c o n t r o l

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Cytochemical Localization of Polysaccharides in Claviceps paspali Ultrastructure During Submerged Fermentation of Alkaloids