Cytométrie en fluxBIOLOGIE CELLULAIRE ABB 2ieme année/ Objectifs pédagogiques/ (8h)/S3 Principales méthodes utilisées en biologie cellulaire, basées sur les cultures de cellules pour étudier la structure de la cellule et ses fonctions et interactions.
**Techniques de mesure de la prolifération, de la toxicité, de détection de l'apoptose, Bioessais, Phénotypage, Mesure de fonctions de cellules différenciées.
** Cytométrie en flux (principes, lecture de l'information biologique, applications)
**Différentes méthodes de purification cellulaire.
**Exemples d'utilisation des cellules dans le domaine de la santé (cellules "médicament"), cellules en thérapie humaine (greffes, cellules souches embryonnaires ou induites..…), lien avec les méthologies abordées dans les autres chapitres (Cytométrie, purification de cellules, imunomarquage).
Les TD permettent de (re)travailler plus en détail sur les techniques à partir d'un article technique ainsi que sur les applications de Cytométrie. Les TP permettent de mettre en pratique les techniques de bases de la culture cellulaire ainsi que certaines techniques autour de la prolifération, de l'apoptose, de la cytométrie en flux.
BIOLOGIE CELLULAIRE ET CULTURE de CELLULES
ABB 2ière année
**INTRODUCTION
S3-I-Tests cellulaires 1°) Prolifération et inhibition de prolifération 2°) Cytotoxicité 3°) Les fonctions spécifiques 4°) L’Apoptose 5°) Le phénotype cellulaire et méthodes d’analyse
S3-II- La cytométrie en flux A)-Description du système
1°)-Présentation de l’appareil 2°)-le faisceau excitateur 3°)-les signaux collectés 4°)-la conversion des signaux
B)-La Fluorescence 1°)- Les fluorochromes 2°)- Les méthodes de marquage
C)-Les applications de cytométrie en flux 1°)-Les techniques d’étude du cycle cellulaire 2°)-Les applications en hématologie et cancérologie
S3-III- Les Méthodes de purification et préparation des cellules 1) méthodes basées sur la densité 2) Méthodes basées sur l’utilisation d’anticorps 3) Les méthodes basées sur l’adhésion cellulaire
S4-IV- Applications en thérapie cellulaire 1)- Cellules souches et thérapie cellulaire
S4-V-Les modéles in vitro , transfection dans les cellules eucaryotes 1)-Les méthodes (vecteurs, transfection, sélection des cellules
transfectées, clonage, gènes rapporteurs..)
Organisme Organe cellule molécule
Méthodes d’Etude de la cellule : Structure, fonctions et interactions
Physiologie animale
Robots
Organisme Organe cellule molécule
Plusieurs aspects (niveaux d’études) peuvent être abordés 1°)- Les différents niveaux d’étude, exemples et régulation de la cellule normale : (faire el schema au fur et à mesure d’abord la cellule Macromolécules Cellule Tissu, organe, organisme (physiologie)
A/Structure intracellulaire et Activité (niveau moléculaire: Biologie moléculaire et biochimie) Synthèse des différents constituants (ADN, ARN, Protéines …) Modification des constituants (Modifications post-traductionnelles des protéines) Interaction des différents constituants (métabolisme et signalétiques cellulaires)
B/Structure intracellulaire et Activité (compartiments et organites intracellulaires) La structure (Noyau, site de transcription, usines à transcription, …Etude dynamique); Granules (RE, Granules de stress, Organites ….) Echanges et flux intracellulaires Mobilité des molécules à l’intérieur de la cellule, mobilité des organites Etude des macromolécules in vivo (dans leur contexte cellulaire ) localisation Implication des organites dans les fonctions cellulaire (Apoptose, cycle cellulaire,)
Plusieurs aspects (niveaux d’études) peuvent être abordés 1°)- Les différents niveaux d’étude, exemples et régulation de la cellule normale : (faire el schema au fur et à mesure d’abord la cellule Macromolécules Cellule Tissu, organe, organisme (physiologie)
C/ Echanges extracellulaires (cellule ligand) Récepteurs membranaires (Interactions membranaires) Infection, Action de drogues (pharmacologie), absorption, métabolisation,rejet D/ Interaction cellulaire Les jonctions cellulaires (les différents types) 1/Les jonctions deancrage (d’attachement) Adhésion Cell –cell (Jonction adhérente) Adhésion Cell - matrice extracellulaire Sites d’attachement des filaments d’actine Protéines d’attachement sur lesquelles sont fixées les filaments d’actine (cadherines)
Plusieurs aspects (niveaux d’études) peuvent être abordés 1°)- Les différents niveaux d’étude, exemples et régulation de la cellule normale : (faire el schema au fur et à mesure d’abord la cellule Macromolécules Cellule Tissu, organe, organisme (physiologie)
D/ Interaction cellulaire
Plusieurs aspects (niveaux d’études) peuvent être abordés 1°)- Les différents niveaux d’étude, exemples et régulation de la cellule normale : (faire el schema au fur et à mesure d’abord la cellule Macromolécules Cellule Tissu, organe, organisme (physiologie)
D/ Interaction cellulaire
2/Les jonctions de communications Constituées de connexines =famille de protéines transmembranaires numérotées en fonction de leur PM (Connexine 32-56) Six connexines forment un connexon, Le connexon est constitué d’un pore (diamètre ~ 2nm) 2 connexons s’associent, 1 sur une cellule l’autre sur l’autre 2 états ouverts ou fermés
Plusieurs aspects (niveaux d’études) peuvent être abordés 1°)- Les différents niveaux d’étude, exemples et régulation de la cellule normale : (faire el schema au fur et à mesure d’abord la cellule Macromolécules Cellule Tissu, organe, organisme (physiologie)
D/Interaction cellulaire 2/Les jonctions de communication
Plusieurs aspects (niveaux d’études) peuvent être abordés 1°)- Les différents niveaux d’étude, exemples et régulation de la cellule normale : (faire el schema au fur et à mesure d’abord la cellule Macromolécules Cellule Tissu, organe, organisme (physiologie)
D/ Interaction cellulaire Autres interactions cellulaires : Exemple des cellules du système immunitaire (Présentation de l’antigène, activité cytotoxique)
Echanges d’organites (mitochondries, exosomes, microvésicules)
Plusieurs aspects (niveaux d’études) peuvent être abordés 1°)- Les différents niveaux d’étude, exemples et régulation de la cellule normale : (faire el schema au fur et à mesure d’abord la cellule Macromolécules Cellule Tissu, organe, organisme (physiologie)
E/ Physiologie cellulaire Senescence, Apoptose, Autophagie... Auto-renouvellement, migration cellulaire et homing Cellules souches...
Cultures primaires Pratiquement toutes les cellules de tous les tissus peuvent être cultivées en cultures primaires Fibroblastes Tissu Nerveux Chondrocytes articulaires Cellules musculaires , precursurs, cellules souches et différenciation, enjeu de la thérapie génique Cellules épidermiques reconstitution de tissu pour des tests en cosmétologie (Test de substitution) Hépatocytes : test pharmacologiques de toxicité permet de réduire l’utilisation d’animaux pour les études Cellules du système hématopoïétique Etude des mécanismes de régénérescence du syst hématopoïétique Cellules souches et différenciation Cellules souches hématopoïétiques et cancérologie Notion de niche et environnement cellulaire (voir therapie cellulaire) Cellules souches embryonnaires
A)-Description du système 1°)-Présentation de l’appareil 2°)-le faisceau excitateur 3°)-les signaux collectés 4°)-la conversion des signaux
B)-La Fluorescence 1°)- Les fluorochromes 2°)- Les méthodes de marquage
C)-Les applications de cytométrie en flux 1°)-Les techniques d’étude du cycle cellulaire 2°)-Les applications en hématologie et
cancérologie
faisceau lumineux excitateur = laser
Nombre d'évènements (cellules)/canal
l'anticorps
Méthode indirecte fuorochrome couplé à un
anticorps secondaire fuorochrome couplé à la
streptavidine reconnaît un anticorps primaire ou secondaire couplé à la biotine
Avantage simple, peu de bruit de fond
Inconvénients besoin de nombreux Ab
Avantage amplifcation du signal
Protocole type
avec 104 à 107 cellules : laver au PBS / Bsa 1% : 4°C Incuber les anticorps à 4°C, 15-30 minutes Laver au PBS / Bsa 1% : 4°C Analyser au cytomètre
diférence marquage membrannaire / cytoplasmique fxation paraformaldéhyde ou éthanol perméabilisation par détergent : tween, triton, saponine
Méthode de marquages
Contrôles Ig ISOTYPE
Cycle Cellulaire
DNA Content
G0/G1 65%
Eliminer les doublets de cellules
FL2 Height
FL2 Width
FL2 Area
R1
Ungated
Propidium Iodide
A nt
i-B rd
U F
IT C
G1 G2/M
S Phase
488: PI, 7AAD
La fxation doit être stœchiométrique (saturation en IP)
les cellules doivent être perméabiliser pour faire pénétrer le fuorochrome (IP), avec l'éthanol (fxe et perméabilise) ou Tween 20
Traitement à la RNAse pour dégrader l’ARN (qui fxe l’IP)
Cytométrie de féux
I.Description du système
Expression
Analyser l'expression d'une protéine sur une population cellulaire ou une sous-population cellulaire notion de « gate »
Expression
Analyser l'expression d'une protéine sur une population cellulaire ou une sous-population cellulaire notion de « gate »
Immunologie : CD = cluster of diferentiation CD4, CD8 : marqueur protéine membrannaire
Analyse laboratoire médicale : formule leucocytaire Recherche : étude diférenciation, prolifération ...
« Gate » 
En hématologie
membrane
intracellulaire Condensation de la chromatine
Activation des endonucléases dégradation de l'ADN par
fragmentation
plasmique libération du cytoplasme avec
les protéases notamment ADN est dégradé par les
diférentes nucléases
Apoptose Nécrose
Dégradation ADN
41.9% 40.9%
16.7%0.5%
78.4% 6.7%
9.4%5.6%
Activité cellulaire
avec anticorps dirigé contre phospho-protéine avec une sonde sensible à un ion Transfection et géne rapporteur (ex GFP)
Localisation d’une protéine (protéine de fusion)
Expression d’un promoteur
Serine tyrosine glycine
Marqueurs protéines
généralement couplés à un anticorps : couplés directement à l'anticorps couplés à un anticorps secondaire
protéines fuorescentes : GFP et dérivées permet fusion à une protéine ou co-expression
Marqueurs acides nucléiques
ce sont des intercalants Iodure de propidium (PI) pour ADN Bromure d'étidium (BrdU) pour ADN Acridine Orange pour ADN ou ARN
IONS
ce sont des sondes : Indo-1, Fluo3 = Ca++
-)
COURS CULTURE CELLULAIRE ABB 2ière année
S3- III- Les Méthodes de purification et préparation des cellules 1) méthodes basées sur la densité
2) Méthodes basées sur l’utilisation d’anticorps 3) Les méthodes basées sur l’adhésion cellulaire
Elutriation
Elutriateur
Billes magnetiques
phosphorylations des histones H1. Dans certaines cellules, la phase G2 peut être allongée (cellules
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