Czy diagnostyka molekularna · W 7 przypadkach przy pomocy PCR zweryfikowano błedne rozpoznanie gatunku ocenianego na podstawie hodowli Verrier J, Krähenbühl L, Bontems O, Fratti

Czy diagnostyka molekularna

zakażeń grzybiczych ma

znaczenie praktyczne?

Anita Hryncewicz-Gwóźdź

Diagnostyka mikologiczna

klasyczna

Badanie bezpośrednie

• Zeskrobiny ze zmian skórnych

• Zeskrobiny z materiału pod płytką paznokciową

Widoczne nici grzybni

• Włosy

Widoczne zarodniki o układzie endothrix lub

ectothrix.

• Fluorescencja w lampie Wood’a (UV 366nm)

Lampa Wooda (UV 366nm)

• M. canis zielona fluorescencja

• Możliwy nieprawidłowy odczyt: nie myć

głowy przed badaniem, prawidłowe

zaciemnienie pomieszczenia w którym

przeprowadza się badanie.

• Inne substancje mogą powodować

fluorescencję: dezodoranty, mydła, maści

z petrolum

• Obecność Malassezia żółta fluorescencja

Badanie bezpośrednie

Badanie bezpośrednie - włos

Układ zarodników ectothrix Układ zarodników endothrix

Hodowla

• Podłoże podstawowe-

Sabourauda (pepton, glukoza,

agar, chloramfenikol, aktidion)

obserwacja 14 do 28 dni.

• Podłoże DTM (dermatophyt test

medium)

1. Cechy makroskopowe

hodowli

2. Cechy mikroskopowe

3. Dodatkowe testy

umożliwiające różnicowanie

gatunków

.

Test ureazowy na

podłożu Chritensena

T mentagrophytes

zmienia barwę podłoża na czerwoną

T rubrum nie zmienia

barwy podłoża

(uwaga:

zanieczyszczenia –

bakterie zmieniają

barwę podłoża)

Test włosowy

T mentagrophyes - wynik dodatni

T rubrum – wynik ujemny

Podłoże płynne

Sabourauda

T. rubrum rośnie na dnie

T. mentagrophytes rośnie na

powierzchni

(zanieczyszczenie pleśniowe

rosną na powierzchni)

Podłoże ziemniaczane – intensywniejsze

zabarwienie podłoża przez T. rubrum

Czas niezbędny do wykonania

badania mikologicznego

metodą klasyczną

• Hodowla do 4 tygodni

• Testy dodatkowe ok. 1 tydzień

Długi okres oczekiwania na wynik badania

Możliwość kontaminacji przez grzyby środowiskowe w trakcie hodowli i wykonywania testów dodatkowych

Diagnostyka mikologiczna

molekularna

Krótki czas trwania badania - kilka godzin.

Wysoka specyficzność i czułość.

Metody molekularne

• Określanie gatunku grzyba uzyskanego w

hodowli na podłożach laboratoryjnych

• Wykrycie obecności grzyba w materiale

uzyskanym od pacjenta

• Typowanie genetyczne szczepów np.

T. rubrum w celach epidemiologicznych

Metody molekularne w diagnostyce

dermatofitów

• Sekwencjonowanie DNA ustalenie gatunku

grzyba z hodowli

• PCR – amplifikacja fragmentów DNA wykrycie obecności grzyba w materiale biologicznym,

ustalenie gatunku grzyba z hodowli

• Inne metody jak RFLP, RAPD typowanie

genetyczne szczepów w obrębie gatunku

Sekwencjonowanie DNA

• Umożliwia ustalenie gatunku grzyba z hodowli (w przypadku trudności identyfikacji gatunku metodami klasycznymi – brak charakterystycznych struktur grzybni, brak zarodników)

• Sekwencjonowanie fragmenu 28S rybosomalnego DNA

GenBank database

MicroSeq D2 Fungal database

PCR – amplifikacja fragmentów DNA

• Powielanie wybranego fragmentu łańcucha DNA przy użyciu specyficznych starterów.

• Możliwe jest wykrycie obecności w badanym materiale minimalnych ilości poszukiwanego odcinka

DNA.

Detekcja produktu amplifikacji: elektroforeza produktu amplifikacji w żelu agarozowym i określenie jego

wielkości na podstawie wysokości położenia prążka w żelu.

PCR

łańcuchowa reakcja polimerazy

Cel molekularny amplifikacji:

• Rybosomalne DNA

• Gen kodujący syntazę chityny

• Gen kodujący topoizmerazę II

• Sekwencje mikrosatelitarne

Real time PCR

PCR


• Rybosomalne DNA

Brillowska-Dabrowska A, Saunte DM, Arendrup MC.

Five-hour diagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection of Trichophyton rubrum.

J Clin Microbiol. 2007 Apr;45(4):1200-4.

Turenne CY, Sanche SE, Hoban DJ, Karlowsky JA, Kabani AM.

Rapid identification of fungi by using the ITS2 genetic region and an automated fluorescent capillary electrophoresis system.

J Clin Microbiol. 1999 Jun;37(6):1846-51.

Trichophyton rubrum

PCR


• Gen kodujący syntazę chityny


Five-hour diagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection of

Trichophyton rubrum.


Kano R, Hirai A, Muramatsu M, Watari T, Hasegawa A.

Direct detection of dermatophytes in skin samples based on sequences of the

chitin synthase 1 (CHS1) gene.

J Vet Med Sci. 2003 Feb;65(2):267-70.

Dermatofity

PCR


• Gen kodujący topoizmerazę II

Kanbe T, Suzuki Y, Kamiya A, Mochizuki T, Fujihiro M, Kikuchi A.

PCR-based identification of common dermatophyte species using primer sets

specific for the DNA topoisomerase II genes.

J Dermatol Sci. 2003 Aug;32(2):151-61.

PCR

łańcuchowa reakcja polimerazy • Sekwencje mikrosatelitarne (tandemowe

powtórzenia składające się z dwu-, trzy- lub czteronukleotydowych sekwencji zwanych motywami)

Kardjeva V, Summerbell R, Kantardjiev T, Devliotou-Panagiotidou D, Sotiriou E, Gräser Y.

Forty-eight-hour diagnosis of onychomycosis with subtyping of Trichophyton rubrum strains.


Brasch J, Beck-Jendroschek V, Gläser R.

Fast and sensitive detection of Trichophyton rubrum in superficial tinea and onychomycosis by use of a direct polymerase chain reaction assay.

Mycoses. 2011 Sep;54(5):e313-7.

Opracowanie metody wykrywania

dermatofitów w materiale od pacjenta,

dla rutynowej diagnostyki labolatoryjnej

• Mała ilość etapów procedury – ograniczenia ryzyka kontaminacji

• Prostota wykonania – możliwość

wdrożenia do laboratorium

Dostępne zestawy do wykrywania

grzybów w materiale klinicznym

Statens Serum Institut (Dania)

Biotype Diagnostic GmbH (Niemcy)

Zestaw zawiera odczynniki wystarczające na

przeprowadzenie 100 multipleksowych reakcji PCR.

Statens

Serum

Institut

Wykrywa:

• Dermatofity (pan-dermatophytes)

• Trichophyton rubrum.

Przeznaczony do badania zakażenia

paznokci stóp

Duplex PCR

Zastosowanie testu umożliwia wykrycie w

materiale biologicznym DNA dermatofitów

i Trichophyton rubrum w ciągu 5 godzin.





Mieszanina starterów zawiera dwie pary starterów które zapoczątkowują amplifikację genów:

• syntetazy 1 chityny w celu wykrycia obecności dermatofitów

• ITS1 (internal transcribed spacer) w celu wykrycia T. rubrum

Wewnętrzna kontrola(~660 bp)

Pan-dermatophytes (366 bp)

T. rubrum (203 bp)

studzienka 1: Marker molekularny DNA100 bp

2: DNA genomowe dermatofitów (Kontrola 1)

3: DNA genomowe dla T. rubrum (Kontrola 2)

4: materiał z paznokcia dodatni w kierunku dermatofitów

5: materiał z paznokcia dodatni w kierunku dermatofitów

6: materiał z paznokcia dodatni w kierunku T. rubrum

7: materiał z paznokcia ujemny.

1 2 3 4 5 6 7

Badana próbka paznokcia

pozytywna w kierunku

T. rubrum daje najczęściej

silny sygnał na wysokości 203

par zasad i słabszy (bądź

zerowy) sygnał na wysokości

366 par zasad z powodu

wysokiej liczby kopii regionu

ITS1 w porównaniu z

regionem chs1.

• Reakcji multipleks-PCR, w skład której wchodzi

mieszanina starterów zaprojektowanych dla genów

specyficznych dla różnych gatunków lub rodzajów

grzybów.

• Dermatofity, drożdże i grzyby pleśniowe

http://www.biotype.de/en/home.html

• Epidermophyton floccosum

• Microsporum canis

• Microsporum gypseum

• T. rubrum

• T. interdigitale

• T. spp.

• Arthroderma benhamiae

• Candida spp. C. albicans C. tropicalis C. glabrata C. krusei C. guilliermondii C. parapsilosis

• Trichosporon cutaneum

• Scopulariopsis brevicaulis

• Aspergillus spp. A. fumigatus A. flavus A. niger A. Versicolor

Mieszanina wielu par starterów

Porównanie metod klasycznej i

molekularnej

Porównanie PCR

i metody klasycznej

Pan-dermatophytes T. rubrum

KOH

hodowla

38.1 %

22.9 %

PCR 42.4 % 41.5 %

Wzrost

wykrywalności

4.3 % 18.6 %





118 pacjentów z onychomykozą Duplex PCR

Porównanie PCR

i metody klasycznej

107 próbek z

paznokci

Kliniczne

podejrzenie

grzybicy

PCR + Hodowla +

77 (72%) 63 T.rubrum

14 pan-dermatophytes

57 (53%) 38 (35%) dermatofity

19 niedermatofity

Wzrost wykrywalności dermatofitów w PCR w porównaniu z hodowlą wynosi 37%

Chandran NS, Pan JY, Pramono ZA, Tan HH, Seow CS.

Complementary role of a polymerase chain reaction test in the diagnosis of onychomycosis.

Australas J Dermatol. 2013 May;54(2):105-8.

Duplex PCR

Singapore

Porównanie PCR

i metody klasycznej

177 próbek z

paznokci

Kliniczne podejrzenie

grzybicy

Hodowla PCR

59

(34%)

78

(44%)


Duplex PCR

Kondori N, Abrahamsson AL, Ataollahy N, Wennerås C.

Comparison of a new commercial test, Dermatophyte-PCR kit, with conventional methods

for rapid detection and identification of Trichophyton rubrum in nail specimens.

Med Mycol. 2010 Nov;48(7):1005-8. Göteborg,Sweden

Porównanie PCR

i metody klasycznej

120 próbek

z paznokci

Kliniczne

podejrzenie

grzybicy

KOH Hodowla PCR

35

(29,2%)

12

(10%)

48

(40%)

PCR pan-dermatophyt

Gen topoizomerazy II

Luk NM, Hui M, Cheng TS, Tang LS, Ho KM.

Evaluation of PCR for the diagnosis of dermatophytes in nail specimens from

patients with suspected onychomycosis.

Clin Exp Dermatol. 2012 Apr;37(3):230-4.


Hong Kong

Porównanie PCR

i metody klasycznej

Nested PCR

Sekwencjonowanie fragmentu 28S rDNA

Hodowla+ Hodowla +

PCR+

Hodowla –

PCR+

Hodowla-

Głowa 23 14 12 18

Skóra 10 6 3 5

Paznokcie 23 20 4 9

W 7 przypadkach przy pomocy PCR zweryfikowano błedne rozpoznanie gatunku

ocenianego na podstawie hodowli

Verrier J, Krähenbühl L, Bontems O, Fratti M, Salamin K, Monod M.

Dermatophyte identification in skin and hair samples using a simple and reliable nested polymerase

chain reaction assay.

Br J Dermatol. 2013 Feb;168(2):295-301. Lausanne, Switzerland

Porównanie PCR

i metody klasycznej

PCR pan-dermatophyt

PCR gatunek

KOH Hodowla PCR

Pan-

dermatophyt

PCR

gatunek

Multiplex

PCR

Pan-

dermatophyt

Multiplex

PCR

gatunek

42 28 45 45 45 41

Przebadano 107 próbek ze skóry gładkiej, głowy, paznokci z podejrzeniem

grzybicy

Wrocław Praca doktorska

Katarzyna Kalinowska

Multiplex PCR

Możliwości diagnostyczne z użyciem dostępnych

komercyjnie testów PCR

Materiał biologiczny

• dermatofity. Dermatophyte PCR KIT, MycoDermQS PCR Amplification KIT

• T. rubrum Dermatophyte PCR KIT. Wysoka przydatność w rozpoznaniu grzybicy paznokci stóp (T. rubrum jest najczęstszym patogenem), MycoDermQS PCR Amplification KIT

• E. floccosum, M. canis M. gypseum T. rubrum,

T. interdigitale, Trichophyton spp. MycoDermQS PCR Amplification KIT.

Znaczna ilość gatunków dermatofitów – brak możliwość detekcji przy zastosowaniu dostępnych komercyjnie testów opartych na metodzie PCR

Opracowywanie dalszych testów

PCR

Brillowska-Dabrowska A, Swierkowska A, Lindhardt Saunte DM, Arendrup MC.

Diagnostic PCR tests for Microsporum audouinii, M. canis and Trichophyton infections.

Med Mycol. 2010 May;48(3):486-90.

Brillowska-Dabrowska A, Michałek E, Saunte DM, Nielsen SS, Arendrup MC.

PCR test for Microsporum canis identification.

Med Mycol. 2013 Aug;51(6):576-9.

Diagnostyka grzybicy skóry owłosionej głowy – większa

wrażliwość Trichophyton niż Microsporum na terbinafinę.

Schemat diagnostyki mikologicznej z wykorzystaniem metod klasycznych i

molekularnych opracowany przez Brillowską-Dabrowską A.

Znaczenie metod molekularnych

• Metody molekularne łącznie z metodami klasycznymi powinny być wykorzystywane w laboratoriach mikologicznych

• Wykorzystanie metod molekularnych może prowadzić do zmniejszenia ilości próbek badanych metodami klasycznymi.

• W przyszłości laboratorium mikologiczne które będzie wykonywało badania bezpośrednie, hodowle i będzie korzystało z metod molekularnych umożliwi szybką i poprawną identyfikacje gatunkową.

Przypadki kliniczne, w których

dla oznaczenia gatunku

dermatofita zastosowano

metodę molekularną

Grzybica głowy z towarzyszącymi

rozsianymi zmianami grudkowo-krostkowymi

Przypadek kliniczny

5 letnia dziwczynka

W krótkim czasie rozwinął się

kerion Celsi w okolicy

ciemieniowo skroniowej

W wywiadzie nie podawano

kontaktu z dziećmi lub

zwierzętami z zakażeniem

grzybiczym


rozsianymi zmianami grudkowo krostkowymi

Po miesiącu

utrzymywania się zmian

na skórze owłosionej

głowy pojawiły się

wykwity rumieniowe,

grudkowe i krostkowe na

twarzy

Przypadek kliniczny


rozsianymi zmianami grudkowo krostkowymi Przypadek kliniczny

następnie na tułowiu i kończynach


rozsianymi zmianami grudkowo krostkowymi

• Badanie mikologiczne ze

zmiany w skórze owłosionej

głowy – dodatnie

• Bezpośrednie: zarodniki o

układzie endothrix

• T. tonsurans (hodowla, metoda

PCR)

• Dermatofit antropofilny

• Wywołuje grzybicę głowy

(najczęstszy czynnik etiologiczny grzybicy głowy w

USA i Wielkiej Brytanii)

• Leczenie Terbinafina 125

mg/dobę przez 12 tygodni

Przypadek kliniczny

PCR for T. tonsurans (173 bp) J. Brasch

Tinea incognito

23 letni pacjent

Skierowany do Kliniki Dermatologicznej z podejrzeniem Erythema gyratum repens

Trenował zapasy

Pierwsze zmiany rumieniowo złuszczające w okolicy skroniowej pojawiły się rok

wcześniej . Leczone miejscowo preparatami przeciwgrzybiczymi (bez diagnostyki

mikologicznej). Nawrót zmian zlokalizowanych na skórze owłosionej głowy i

ramionach.

Przypadek – Tinea Gladiatorum

Tinea incognito

Podejrzewano podłoże alergiczne zmian

skórnych.

Pacjentowi ordynowano leczenia

kortykosteroidam miejscowe i ogólne.

Stopniowo zmiany uległy dalszemu

rozsiewowi, zajmowały tułów, twarz i

kończyny.

Przypadek

Tinea incognito

Badanie mikologiczne: dodatnie

T. tonsurans.

Dermatofit antropofilny

Wywołuje zakażenie skóry owłosionej

głowy (najczęstszy czynnik etiologiczny

grzybicy głowy w USA i Wielkiej

Brytanii)

W Polsce stanowi 4,6% dermatofitów (w

Europie 1%)

Zakażenia wśród sportowców

trenujących zapasy.

Terapia: terbinafina 4 tygodni, miejscowo preparaty azolowe.

Przypadek

PCR dla T. tonsurans (173 bp)

Podsumowanie

• Zastosowanie procedur wykorzystujących metody klasyczne i molekularne w laboratoriach mikologiczych skrócą czas oczekiwania na wynik badania i zwiększą ich czułość.

• Metody molekularne są pomocne w oznaczeniu gatunku grzyba uzyskanego w hodowli (w przypadkach wątpliwych - pleomorfizm).

• Typowanie genetyczne szczepów dermatofitów umożliwi prowadzenie dokładniejszych badan epidemiologicznych.

Documents

Czy diagnostyka molekularna · W 7 przypadkach przy pomocy PCR zweryfikowano błedne rozpoznanie gatunku ocenianego na podstawie hodowli Verrier J, Krähenbühl L, Bontems O, Fratti