David Ezra Green and Derek Richter- Adrenaline and Adrenochrome

8/3/2019 David Ezra Green and Derek Richter- Adrenaline and Adrenochrome

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LXXXIII. ADRENALINE AND ADRENOCHROMEBy DAVID EZRA GREEN1 AND DEREK RICHTER,

From t h e B i o c h e m i c a l L a b o r a t o r y , C a m b r i d g e( R e c e i v e d 1 M a r c h 1 9 3 7 )

GREEN & BROSTEAUX [ 1 9 3 6 ] a n d G r e e n [ 1 9 3 6 , 2 ] s h o w e d t h a t t h e l a c t i c a n dm a l i c d e h y d r o g e n a s e s o f a n i m a l t i s s u e s c o u l d r e a c t w i t h o x y g e n o n l y i n p r e s e n c eo f c o e n z y m e I , a c a r r i e r a n d a k e t o n e f i x a t i v e . T h e d e h y d r o g e n a s e c a t a l y s e d t h et r a n s f e r o f h y d r o g e n f r o m t h e s u b s t r a t e t o t h e c o e n z y m e ; i n t u r n t h e r e d u c e dc o e n z y m e r e d u c e d t h e c a r r i e r , a n d f i n a l l y r e d u c e d c a r r i e r r e a c t e d w i t h m o l e c u l a ro x y g e n . T h e f u n c t i o n o f t h e k e t o n e f i x a t i v e c o n s i s t e d i n b i nd i n g t h e k e t o - a c i df o r m e d b y t h e o x i d a t i o n o f e i t h e r l a c t i c o r m a l i c a c i d . T h e p r o d u c t o f o x i d a t i o ni n b o t h c a s e s c o m p l e t e l y a r r e s t e d t h e c a t a l y t i c o x i d a t i o n u n l e s s r e m o v e d by t h ek e t o n e r e a g e n t .A d r e n a l i n e , f l a v i n a n d f l a v o p r o t e i n w e r e t h e o n l y s u b s t a nc e s o c c u r r i n g i na n i m a l t i s s u e s w h i c h w e r e f o u n d c a p a b l e o f a c t i n g a s c a r r i e r s i n t h e l a c t i c a n dm a l i c s y s t e m s . T h e m e c h a n i s m o f t h e f l a v i n a n d f l a v o p r o t e i n e f f e c t s w a s p e r -f e c t l y c l e a r . T h e s e s u b s t a n c e s w e r e a l t e r n a t e l y r e d u c e d by t h e c o e n z y m e a n do x i d i z e d b y m o l e c u l a r o x y g e n . T h i s s i m p l e i n t e r p r e t a t i o n h o w e v e r f a i l e d t oa c c o u n t f o r t h e a d r e n a l i n e e f f e c t . T h e e x p e r i m e n t s o f G r e e n & B r o s t e a u x [ 1 9 3 6 ]a n d G r e e n [ 1 9 3 6 , 2 ] s h o w e d c l e a r l y t h a t t h e a c t i o n o f a d r e n a l i n e a s a n o x i d a t i o nc a r r i e r i n v o l v e d a c o m p l i c a t e d m e c h a n i s m . T h e p r e s e n t c o m m u n i c a t i o n d e a l sw i t h t h e a n a l y s i s o f t h e a d r e n a l i n e e f f e c t i n t h e l a c t i c a n d m a l i c s y s t e m s o fa n i m a l t i s s u e s . I . E x p e r i m e n t a l d e t a i l s

T h e l a c t i c a n d m a l i c d e h y d r o g e n a s e s w e r e p r e p a r e d f r o m t h e h e a r t m u s c l e o fp i g b y t h e m e t h o d o f G r e e n & B r o s t e a u x [ 1 9 3 6 ] . T h e p r e p a r a t i o n o f c o e n z y m e Ii s a l s o d e s c r i b e d i n t h a t p a p e r .T h e m a n o m e t r i c e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t i n B a r c r o f t d i f f e r e n t i a l m a n o -m e t e r s a t 3 8 0 . T h e r e a c t i o n s w e r e s t a r t e d a f t e r e q u i l i b r a t i o n by d i s l o d g i n g t h eK e i l i n c u p s c o n t a i n i n g a d r e n a l i n e i n t o t h e m a i n p o r t i o n o f t h e m a n o m e t e r c u p s .T h e r a t e o f s h a k i n g w a s 1 5 0 o s c i l l a t i o n s p e r m i n .T h e a d r e n a l i n e s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g t h e r e c r y s t a l l i z e d b a s ei n w a t e r c o n t a i ni n g t h e t h e o r e t i c a l a m o u n t o f h y d r o c h l o r i c a c i d n e c e s s a r y f o rn e u t r a l i z a t i o n ( f i n a l pH 5 ) . T h e s e s o l u t i o n s w e r e s t a b l e f o r w e e k s when k e p t a t 0 0 .

I I . T h e d e p e n d e n c e o f t h e a d r e n a l i n e e f f e c t o n t h e a c t i v i t y o f t h el a c t i c a n d m a l i c s y s t e m sA m i x t u r e o f e n z y m e , c o e n z y m e I , m a l a t e ( o r l a c t a t e ) a n d c y a n i d e a t pH 8f a i l e d t o t a k e up a n y o x y g e n . W i t h a d d i t i o n o f a d r e n a l i n e a v i g o r o u s u p t a k ee n s u e d . T h i s e f f e c t was o b s e r v e d o n l y when t h e c o m p l e t e m a l i c o r l a c t i c s y s t e mw a s p r e s e n t ( c f . T a b l e s I a n d I I ) . I f t h e e n z y m e , c o e n z y m e , s u b s t r a t e o r f i x a t i v ew a s o m i t t e d , a d r e n a l i n e h a d n o i n f l u e n c e o n t h e o x y g e n u p t a k e .

B e i t M e m o r i a l R e s e a r c h F e l l o w .( 5 9 6


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ADRENALINE AND ADRENOCHROMET a b l e I . A d r e n a l i n e e f f e c t i n t h e m a l i c s y s t e m

Enzyme ( m l . )C o e n z y m e ( m l . )2MHCN ( m l . )M m a l a t e ( m l . )i M / 2 0 I - a d r e n a l i n e ( m l . )W a t e r ( m l . )P l . 0 2 i n 1 0 m m .

1 - 01 - 00 - 10 - 20 - 10 - 93 7 0

1 - 0 1 - 0 1 - 0 01 - 0 1 - 0 0 1 - 00 0 - 1 0 - 1 0 - 10 - 2 0 0 - 2 0 - 20 - 1 0 - 1 0 - 1 0 - 11 - 0 1 - 1 1 - 9 1 - 93 4 4 4 4T a b l e I I . A d r e n a l i n e e f f e c t i n t h e l a c t i c s y s t e m

Enzyme ( m l . )C o e n z y m e ( m l . )2M HCN ( m l . )M l a c t a t e ( m l . )M/20 a d r e n a l i n e ( m l . )W a t e r ( m l . )/ A ' 0 2 i n 3 0 m i n .

1 . 50 - 50 - 10 - 20 - 10 - 91 5 3

15 150 0 50 - 1 0 - 10 - 2 00 - 1 0 - 11 - 4 1 - 10 3T h e d e p e n d e n c e o f t h e a d r e n a l i n e e f f e c t o n t h e a c t i v e f u n c t i o n i n g o f t h e m a l i cs y s t e m c o u l d b e d e m o n s t r a t e d i n t h e f o l l o w i n gw a y s :( 1 ) T h e r a t e o f o x i d a t i o n o f m a l a t e i s d e t e r -m i n e d w i t h i n c e r t a i n l i m i t s b y t h e c o nc e nt r a t i o n 2 0 0o f c o e n z y m e . I f a f u n c t i o n a l r e l a t i o n e x i s t s 0b e t w e e n t h e a d r e n a l i n e e f f e c t a n d t h e a c t i v i t y g 1 5 0o f t h e m a l i c s y s t e m , t h e m a g n i t u d e o f t h e ' .a d r e n a l i n e e f f e c t s h o u l d s i m i l a r l y d e p e n d u p o n . - /t h e c o n c e n t r a t i o n o f c o e n z y m e ( c f . F i g . 1 ) . o( 2 ) T h e r a t e o f o x i d a t i o n o f m a l a t e o r l a c t a t e Jf a l l s o f f a t l o w c o n c e n t r a t i o n s o f s u b s t r a t e . T h e 5

a d r e n a l i n e e f f e c t s h o u l d t h e r e f o r e d e p e n d u p o nt h e c o n c e n t r a t i o n o f s u b s t r a t e w i t h i n t h e l i m i t o f C o . 0 - 2 0 - 3 0 - 4t h e s a t u r a t i n g c o n c e n t r a t i o n . F u r t h e r m o r e , w i t h m g . c o e n z y m e / m l .a l i m i t e d a m o u n t o f m a l a t e a v a i l a b l e , t h e i n -c r e a s e d u p t a k e i n d u c e d b y a d r e n a l i n e s h o u l d F i g . 1 E f f e t o f t h e c o n e n t r a t i o n o fc o e n z y m e o n t h e m a g n i t u d e o f t h ec o r r e s p o n d w i t h t h e a m o u n t o f o x y g e n r e q u i r e d a d r e n a l i n e e f f e c t .f o r t h e o x i d a t i o n o f a l l t h e a v a i l a b l e s u b s t r a t e T h e m a n o m e t e r s c o n t a i n e d 1 m l .t o t h e c o r r e s p o n d i n g k e t o - a c i d ( c f . T a b l e I I I ) . e n z y m e , 0 - 5 m l . M / 2 g l y c i n e - p h o s -( 3 ) ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ p h a t eu f f e r pH 8 - 5 , 0 - 1 m l . 2M( 3 ) I f a d r e n a l i n e i s a c t i n g i n t h e c a p a c i t y H C N , 0 1 m l . M / 2 0 a d r e n a l i n e a n do f a c a r r i e r , t h e d i s a p p e a r a nc e o f m a l a t e a n d 0 - 2 m l . M m a l a t e .t h e a p p e a r a n c e o f o x a l o a c e t a t e , t h e o x i d a t i o np r o d u c t , s h o u l d b e c a p a b l e o f d e m o n s t r a t i o n . T h e e s t i m a t i o n o f l - m a l i c a c i d

T a b l e I I I . T h e d e p e n d e n c e o f t h e a d r e n a l i n e e f f e c t o n t h ec o n c e n t r a t i o n o f m a l a t e a n d l a c t a t e1- 0 2

S y s t e m + 0 - 2 m l . I M m a l a t eS y s t e m + 0 - 1 m l . M/10 m a l a t eS y s t e m + 0 - 1 m l . M / 1 0 0 m a l a t eS y s t e m + no s u b s t r a t eS y s t e m + 0 - 2 m l . M l a c t a t eS y s t e m + 0 - 5 m l . 0 - 2M l a c t a t eS y s t e m + 0 - 1 m l . 0 - 2 M l a c t a t e

1 0 m i n . 2 0 m i n .3 4 8 4 8 17 1 1 0 90 0

3 0 m i n .5 1 01 2 00

4 5 m i M .

0 0 0 2- - 2 5 2 3 3 8- - 1 2 2 1 6 92 2 4 2The s y s t e m c o n t a i n e d 1 m l . e n z y m e , 0 - 5 m l . c o e n z y m e , 0 - 1 m l . 2M HCN a n d 0 - 1 m l . M / 2 0I - a d r e n a l i n e . T h e t h e o r e t i c a l u p t a k e f o r 0 - 1 m l . M / 1 0 m a l a t e i s 1 1 2 u 1 . 0 2 .

5 9 7


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5D. E . GREEN AND D . RICHTERw a s c a r r i e d o u t b y t h e p o l a r i m e t r i c m e t h o d o f A u e r b a c h & K r u g e r [ 1 9 2 3 ] .M a l a t e w a s f o u n d t o d i s a p p e a r i n t h e p r e s e n c e o f a d r e n a l i n e a n d t h e c o m p l e t es y s t e m .

m g . 1 - m a l i c a c i da t e n d o f 3 0 m i n .C o m p l e t e s y s t e m 1 8 - 2C o n t r o l - n o c o e n z y m e 2 6 - 0C o n t r o l - n o a d r e n a l i n e 2 6 - 0

The c o m p l e t e s y s t e m c o n t a i n e d 2 m l . e n z y m e , 2 m l . c o e n z y m e , 0 - 2 m l . 2M HCN, 0 - 2 m l . M / 1 0a d r e n a l i n e a n d 0 - 3 m l . M m a l a t e . T h e m i x t u r e was t r e a t e d w i t h 0 - 3 m l . g l a c i a l a c e t i c a c i d a n d ane q u a l v o l u m e o f 5 % u r a n i u m a c e t a t e . A f t e r f i l t r a t i o n t h r o u g h k i e s e l g u h r , t h e f i l t r a t e was t e s t e dp o l a r i m e t r i c a l l y . The i n i t i a l v a l u e o f m a l a t e h a s n o s i g n i f i c a n c e , s i n c e i n p r e s e n c e o f f u m a r a s e p a r to f t h e a d d e d m a l a t e was c o n v e r t e d i n t o f u m a r a t e d u r i n g t h e c o u r s e o f t h e e x p e r i m e n t . A d i s a p -p e a r a n c e o f 4 - 3 8 m g . 1 - m a l a t e p e r m l . e n z y m e c o r r e s p o n d s t o an o x y g e n u p t a k e o f 3 6 8 p l . 0 2 . T h eo b s e r v e d u p t a k e was 4 2 0 u l . 0 2 . T h e i s o l a t i o n o f o x a l o a c e t i c a c i d f r o m t h e e n z y m e m i x t u r e c o n t a i n -i n g c y a n i d e h a s n o t y e t b e e n a c c o m p l i s h e d . Added o x a l o a c e t i c - c y a n o h y d r i n c o u l d n o t b e r e c o v e r e df r o m t h e e n z y m e m i x t u r e a n d i t s e e m s v e r y p r o b a b l e t h a t t h e c y a n o h y d r i n u n d e r g o e s d e c o m p o s i t i o ni n t h e c o u r s e o f t h e e x p e r i m e n t .

( 4 ) P y r u v a t e a n d o x a l o a c e t a t e , w h i c h s p e c i f i c a l l y i n h i b i t t h e e n z y m i c o x i d a -t i o n s o f l a c t a t e a n d m a l a t e r e s p e c t i v e l y , s h o u l d d e p r e s s t o a c o r r e s p o n d i n g d e g r e et h e e f f e c t o f a d r e n a l i n e . I t i s n o t e w o r t h y t h a t , t o p r o d u c e i n h i b i t i o n i n p r e s e n c eo f c y a n i d e , p y r u v a t e a n d o x a l o a c e t a t e m u s t b e a d d e d i n c o n c e n t r a t i o n s e q u i v a l e n tt o t h a t o f c y a n i d e , o t h e r w i s e n o a p p r e c i a b l e c o n c e n t r a t i o n o f i n h i b i t o r i s a v a i l -a b l e ( c f . T a b l e I V ) .T a b l e I V . E f f e c t s o f p y r u v a t e a n d o x a l o a c e t a t e o n a d r e n a l i n e e f f e c t s

P d 0 21 0 m i n . 1 5 m i n .

C o m p l e t e l a c t i c s y s t e m 9 0+ 0 - 5 m l . M / 5 p y r u v a t e -0C o m p l e t e m a l i c s y s t e m 2 2 9 4 2 0+ 0 - 3 m l . M/ 5 o x a l o a c e t a t e 0 0

T h e c o m p l e t e s y s t e m s c o n t a i n e d 1 m l . e n z y m e , 0 - 6 m l . c o e n z y m e , 0 - 1 m l . 2M HCN, 0 - 1 m l .M / 2 0 a d r e n a l i n e a n d 0 - 2 m l . M s u b s t r a t e ( l a c t a t e o r m a l a t e ) .

( 5 ) L a s t l y , i f t h e a c t i o n o f a d r e n a l i n e i s c a t a l y t i c , t h e r a t e o f o x i d a t i o n o fm a l a t e s h o u l d d e p e n d u p o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f a d r e n a l i n e o n l y b e l o w s o m es a t u r a t i o n c o n c e n t r a t i o n . A b o v e t h a t l e v e l n o f u r t h e r i n c r e a s e o f t h e o x y g e nu p t a k e s h o u l d a c c o m p a n y a n i n c r e a s e i n t h e a d r e na l i n e e f f e c t . G r e e n & B r o s t -e a u x [ 1 9 3 6 ] a n d G r e e n [ 1 9 3 6 , 2 ] h a v e s h o w n t h a t t h e e f f e c t o f t h e c o n c e n t r a t i o no f a d r e n a l i n e o n t h e r a t e o f o xi d a t i o n o f l a c t a t e a n d m a l a t e c o n f o r m s t o t h e o r y .T h e c o nc e nt r a t i o n o f a d r e n a l i n e w h i c h p e r m i t t e d o f h a l f - s p e e d o x i d a t i o n w a sa b o u t 0 - 0 7 m g . I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e s m a l l e s t a m o u n t o f a d r e n a l i ne w h i c hc o u l d j u s t p r o d u c e a m e a s u r a b l e e f f e c t i n t h e r e c o ns t r u c t e d l a c t i c o r m a l i cs y s t e m was f o u n d t o b e 0 - 0 0 0 6 m g . p e r m l . ( c f . F i g . 2 ) .T h e r e s u l t s o f t h e s e v a r i o u s t e s t s u n i f o r m l y s u p p o r t t h e h y p o t h e s i s t h a ta d r e n a l i n e w a s a c t i n g a s a r e s p i r a t i o n c a r r i e r i n t h e l a c t i c a n d m a l i c s y s t e m s

5 9 8


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ADRENALINE AND ADRENOCHROMEp r e p a r e d f r o m h e a r t m u s c l e o f p i g , a n d r u l e o u t t h e p o s s i b i l i t y t h a t a d r e n a l i new a s m e r e l y u n d e r g o i n g a u t o x i d a t i o n u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f t h e e x p e r i m e n t .

9 08 5 -8 0 -7 57 0 2 2 86 5 - 2 * 66 0 -2-4

F i g . 2 . F i g . 3 . 2

The5 nm r - .Ca~~~~~~~~~~

4 ( a a e 5 m.M2bferp - n 1 1 l . 6 M 2 22.Teewsn paei 0mn

a 35 s 1 F 405 3 0 -

2 -& 2 5 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 1 . 02 0 0 - 8 F

I S 0 . 60 0 40 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 0 t O 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0y a d r e n a l i n e / m i . y a d r e n a l i n e / m i .F i g . 2 . F i g . 3 .

F i g . 2 . E f f e c t o f a d r e n a l i n e c o n c e n t r a t i o n o n t h e r a t e o f o x i d a t i o n .T h e m a n o m e t e r s c o n t a i n e d 1 m l . e n z y m e , 0 - 5 m l . c o e n z y m e , 01 m l . 2M HCN,r1l .M m a l a t e ,0r 5 m l . M/ 2 b u f f e r pH 76 a n dr 1 m l . M 1 2 0 H 2 2 . T h e r e w a s n o u p t a k e i n 2 0 m . i si n t h e b l a n k w i t h o u t a d r e n a l i n e .F i g . 3 . T h e e f f e c t o f t h e a d r e n a l i n e c o n c e n t r a t i o n on t h e t u r n o v e r n u m b e r .D e t a i l s a s f o r F i g . 2 .rqi . T h e o x y g e n e q u i v a l e n c e a n d t h e t u r n o v e r n u m b e r o f a d r e n a l i n eTo s a t i s f y t h e c r i t e r i o n o f a r e s p i r a t i o n c a r r i e r , t h e t o t a l o x y g e n u p t a k ei n d u c e d b y a g i v e n amount o f a d r e n a l i n e s h o u l d b e m a ny t i m e s t h a t r e q u i r e d f o rt h e s i n g l e r e v e r s i b l e o x i d a t i o n o f a d r e n a l i n e . I n e x p e r i m e n t s d e s i g n e d t o t e s t t h i sp o i n t , i t w a s d e s i r a b l e t o u s e a s m a l l amount o f a d r e n a i ne a n d a r e l a t i v e l y l a r g ee x c e s s o f t h e e n z y m e s y s t e m . U s i n gt01 m g . o f a d r e n a h n e i n3s3l . o f t h e m a l i cs y s t e m , a n o x y g e n u p t a k e wa s o b s e r v e d i n 3 0 m i n . w h i c h wa s 4 0 t i m e s t h a tr e q u i r e d t o o x i d i z e a d r e n a l i n e t o t h e c o r r e s p o n d i n g q u i n o n e . I n o t h e r w o r d s

e a c h m o l e c u l e o f a d r e n a l i n e r e a c t e d w i t h 4 0 a t o m s o f o x y g e n . We s h a l s e e l a t e rw h y t h i s o x y g e n e q u i v a l e n c e n u m b e r , h i g h a s i t s e e m s , i s p r o b a b l y v e r y muchl o w e r t h a n t h e t r u e e q u i v a l e n c e n u m b e r .The t u r n o v e r number h a s b e e n d e f i n e d a s t h e n u m b e r o f t i m e s a m o l e c u l e o fc a r r i e r i s r e d u c e d a n d o x i d i z e d i n 1 m i. T h e h i g h e s t n u m b e r o b s e r v e d i n v i t r o i s3 0 0 f o r c y t o c h r o m e c a c t i n g i n t h e c x - g l y c e r o p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e s y s t e m o fa n i m a l t i s s u e s [ G r e e n , 1 9 3 6 , 1 ] . W a r b u r g & C h r i s t i a n [ 1 9 3 3 ] f o u n d t h a t f l a v o -p r o t e i n w a s r e d u c e d a n d o x i d i z e d s o m e 5 0 t i m e s p e r m i n . i n t h e h e x o s e m o n o -p h o s p h a t e s y s t e m o f y e a s t . M o r e r e c e n t l y T h e o r e l l [ 1 9 3 6 ] s h o w e d t h a t a t o x y g e nt e n s i o n s s u c h a s o b t a i n i n t h e a n i m a l c e l l , t h e t u r n o v e r n u m b e r o f f l a v o p r o t e i n i so f t h e o r d e r o f 1 - 2 . T h e s e n u m b e r s a r e m aximum a n d a r e o b t a i n e d o n l y w i t h v e r ys m a l l a m o u n t s o f c a r r i e r i n c o n t a c t w i t h l a r g e e x c e s s o f t h e e n z y m e s y s t e m .T h e t u r n o v e r n u m b e r o f a d r e na l i n e u n d e r a s i d e a l c o n d i t i o n s a s c o u l d b ea r r a n g e d w a s never h i g h e r t h a n 4 5 . A l t h o u g h t h i s n u m b e r i s much l e s s t h a n t h a t

5 9 9


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D . E . GREEN AND D . RICHTERo f c y t o c h r o m e c , i t c o m p a r e s f a v o u r a b l y w i t h t h a t f o r f l a v o p r o t e i n a n d i n d e e dr e p r e s e n t s b i g h c a t a l y t i c a c t i v i t y . F u r t h e r m o r e , t h e r e i s g o o d e v i d e n c e a s s h o w nl a t e r f o r b e l i e v i n g t h a t t h e e x p e r i m e n t a l l y o b s e r v e d v a l u e i s a p p r e c i a b l y l o w e rt h a n t h e t h e o r e t i c a l l y a t t a i n a b l e v a l u e .T h e e x p e r i m e n t s i n w h i c h t h e t u r n o v e r n u m b e r w a s d e t e r m i n e d w e r e c a r r i e do u t w i t h l e s s t h a n 0 - 0 7 m g . o f a d r e n a l i n e p e r m l . i n p r e s e n c e o f e x c e s s o f t h ee n z y m e s y s t e m a t pH 7 - 3 - 7 * 6 . T h e o x y g e n u p t a k e w a s n o t l i n e a r a n d r e a d i n g sw e r e t a k e n a t 3 - m i n . i n t e r v a l s . T h e t u m o v e r n u m b e r t h e r e f o r e a p p l i e s t ot h e h i g h e s t r a t e o b s e r v e d f o r a 3 - m i n . p e r i o d . F i g . 3 s h o w s t h e d e p e n d e n c e o ft h e t u r n o v e r n u m b e r o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f a d r e n a l i n e . T h e maximum t u r n o v e rn u m b e r r e a c h e d i n t h i s p a r t i c u l a r e x p e r i m e n t w a s o n l y 2 - 8 .T h e d i f f e r e n c e b e t w e e n i n v i t r o a n d i n v i v o n u m b e r s i s i n s t r u c t i v e . H a a s [ 1 9 3 4 ]f o u n d t h a t c y t o c h r o m e i n i n t a c t y e a s t w a s r e d u c e d a n d o x i d i z e d 4 0 0 0 t i m e s p e r m i n .i n c o n t r a s t t o t h e 3 0 0 t i m e s f o r c y t o c h r o m e c i n t h e x - g l y c e r o p h o s p h a t e s y s t e m a n d3 0 t i m e s f o r c y t o c h r o m e c i n t h e s u c c i n i c s y s t e m o f a n i m a l t i s s u e s a n d t h e l a c t i cs y s t e m o f y e a s t [ O g s t o n & G r e e n , 1 9 3 5 ] . T h i s d i s c r e p a n c y m u s t b e b o u n d u p w i t h t h eq u e s t i o n o f t h e p h y s i c a l o r g a n i z a t i o n o f t h e i n t a c t c e l l . I n t h e r e c o n s t r u c t e d s y s t e mi n v i t r o w e a r e d e a l i n g w i t h r e a c t i o n s i n h o m o g e n e o u s s o l u t i o n . T h e r a t e o f r e -a c t i o n i s d e t e r m i n e d b y t h e p r o b a b i l i t y o f c o l l i s i o n b e t w e e n e n z y m e a n d s u b s t r a t e ,e n z y m e a n d c o e n z y m e a n d f i n a l l y c a r r i e r a n d o x y g e n . T h i s d e g r e e o f r a n d o m n e s si m p o s e s a l o w l i m i t t o t h e s p e e d o f t h e n e t r e a c t i o n . T h e r e i s g o o d r e a s o n f o r s u p p o s -i n g t h a t i n v i v o r e a c t i o n s t a k e p l a c e a t o r i e n t a t e d s u r f a c e s - r a n d o m n e s s b e i n gt h e r e b y m i n i m i z e d . I n s t e a d o f t h e v a r i o u s c o m p o n e n t s o f t h e c a t a l y t i c s y s t e mc o l l i d i n g w i t h o n e a n o t h e r i n u n p r e d i c t a b l e o r d e r , t h e p h y s i c a l o r g a n i z a t i o n i n t h ec e l l i s p r o b a b l y s u c h a s t o i m p o s e d i r e c t i o n u p o n t h e o r d e r o f c h e m i c a l e v e n t s .T h e r e i s t h e r e f o r e l i t t l e c a u s e f o r s u r p r i s e when t h e c a t a l y t i c a c t i v i t y o f c a r r i e r s i sf o u n d t o b e much s m a l l e r i n v i t r o t h a n i n v i v o .I V . T h e r o l e o f t h e k e t o n e f i x a t i v e

G r e e n & B r o s t e a u x [ 1 9 3 6 ] a n d G r e e n [ 1 9 3 6 , 2 ] f o u n d t h a t f i x a t i v e s o t h e r t h a nc y a n i d e c o u l d b e u s e d i n r e c o n s t r u c t i n g t h e l a c t i c a n d m a l i c d e h y d r o g e n a s e s o fa n i m a l t i s s u e s . S e m i c a r b a z i d e , h y d r a z i n e a n d h y d r o x y l a m i n e c o u l d b i n d k e t o -a c i d s b u t n o t a s e f f i c i e n t l y a s c y a n i d e . I t w a s n o t p e r f e c t l y c l e a r w h e t h e r t h er e l a t i v e i n e f f i c i e n c y o f t h e s e f i x a t i v e s w a s d u e t o a s l o w r e a c t i o n w i t h t h e k e t o -a c i d o r t o a t o x i c e f f e c t o n t h e d e h y d r o g e n a s e s . W h a t e v e r t h e c o r r e c t e x p l a n a t i o n ,t h e f a c t r e m a i n e d t h a t i n p r e s e n c e o f c y a n i d e t h e r a t e o f o x i d a t i o n o f m a l a t e w a ss e v e r a l t i m e s t h a t i n p r e s e nc e o f t h e o t h e r f i x a t i v e s . T h e o b j e c t i o n may t h e r e f o r eb e r a i s e d t h a t c y a ni d e w a s p l a y i n g a s p e c i f i c r o l e i n t h e a d r e na l i n e e f f e c t .G r e e n & W i l l i a m s o n [ 1 9 3 7 ] h a v e s h o w n t h a t c y a n i d e i n a q u e o u s s o l u t i o nc o m b i n e s a l m o s t i n s t a n t a n e o u s l y w i t h p y r u v i c o r o x a l o a c e t i c a c i d t o f o r m t h ec o r r e s p o n d i n g c y a n o h y d r i n . T h e s e c y a n o h y d r i n s a r e r e s i s t a n t t o h y d r o l y s i s a tn e u t r a l r e a c t i o n . I t i s o n l y b y t r e a t m e n t w i t h d i l u t e a l k a l i o r b y h y d r o l y s i s i nb o i l i n g a c i d t h a t t h e o r i g i n a l k e t o - a c i d s c a n b e r e g e n e r a t e d . T h e e v i d e n c e i st h e r e f o r e c l e a r t h a t c y a n i d e i s a c t i n g i n t h e c a p a c i t y o f a n e f f i c i e n t k e t o n e f i x a t i v e .T h e f o l l o w i n g e x p e r i m e n t s h o w s t h a t a d r e n a l i n e c a n a c t a s a c a r r i e r i n p r e s e n c eo f s e m i c a r b a z i d e a s f i x a t i v e : 0 2

5 m i n . 1 0 m i n .0 . 1 m l . 2M HCN a s f i x a t i v e 2 1 7 3 9 00 . 5 m l . M / 2 s e m i c a r b a z i d e a s f i x a t i v e 7 5 1 6 6S e m i c a r b a z i d e c o n t r o l w i t h n o m a l a t e 1 7 5 9S e m i c a r b a z i d e c o n t r o l w i t h n o a d r e n a l i n e 8 1 3

A l l m a n o m e t e r c u p s c o nt a i n e d 1 m l . e n z y m e , 1 m l . c o e n z y m e , 0 . 1 m l . M m a l a t e , 0 . 1 m l . M / l 0a d r e n a l i n e a n d 0 - 8 m l . b u f f e r pH 8 - 4 u n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d .

6 0 0


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ADRENALINE AND ADRENOCHROMEI t i s n o t e w o r t h y t h a t t h e m a g n i t u d e o f t h e a d r e n a l i n e e f f e c t w a s much s m a l l e rt h a n i n t h e p r e s e n c e o f c y a n i d e , a n d f u r t h e r m o r e t h a t t h e c o n t r o l s w i t h o u ta d r e n a l i n e a n d w i t h o u t m a l a t e w e r e n o t n e g a t i v e a s w a s t h e c a s e when c y a n i d ew a s u s e d a s t h e f i x a t i v e . T h e c o n t r o l o x y g e n u p t a k e i n a b s e n c e o f m a l a t e d o e s

n o t s i g n i f y t h e u n c a t a l y s e d a u t o x i d a t i o n o f a d r e n a l i n e . I n a l a t e r s e c t i o n , e v i -d e n c e i s p r e s e nt e d t h a t t h e i n d o p h e n o l o xi d a s e c a n c a t a l y s e t h e o x i d a t i o n o fa d r e n a l i n e . C y a n i d e i n h i b i t s t h e i n d o p h e n o l o x i d a s e c o m p l e t e l y - h e n c e t h ec y a n i d e c o n t r o l w i t h o u t m a l a t e w a s n e g a t i v e . H y d r a z i n e a n d s e m i c a r b a z i d e d on o t c o m p l e t e l y i n h i b i t t h e i n d o p h e n o l o x i d a s e . T h e u s e o f t h e s e r e a g e n t s a sf i x a t i v e s a l w a y s e n t a i l s t h e r e f o r e s o m e o x i d a t i o n o f a d r e n a l i n e w h i c h i s i n d e -p e n d e n t o f t h e m a l i c o r l a c t i c s y s t e m s .D e w a n , G r e e n a n d L e l o i r i n u n p u b l i s h e d e x p e r i m e n t s o n t h e f - h y d r o x y -b u t y r i c d e h y d r o g e n a s e h a v e f o u n d t h a t u n d e r c e r t a i n c o n d i t i o n s n o c a r r i e r i sr e q u i r e d f o r t h e r e a c t i o n o f t h e d e h y d r o g e n a s e s y s t e m w i t h m o l e c u l a r o x y g e na l t h o u g h c o e n z y m e I i s t h e i n t e r m e d i a r y b e t w e e n o x y g e n a n d t h e s u b s t r a t e .They h a v e i n t e r p r e t e d t h i s r e s u l t t o mean t h a t r e d u c e d c o e n z y m e I c a n r e a c td i r e c t l y w i t h o x y g e n . S t r o n g c y a n i d e i n h i b i t e d t h i s d i r e c t r e a c t i o n w i t h o x y g e n ,w h e r e a s t h e o t h e r k e t o n e r e a g e n t s d i d n o t i n t e r f e r e . S i m i l a r l y t h e y f o u n d t h a tt h e l a c t i c a n d m a l i c d e h y d r o g e n a s e s , p a r t i c u l a r l y i n p r e s e n c e o f h y d r a z i n e a sf i x a t i v e , d i d n o t r e q u i r e a n y a d d e d c a r r i e r f o r t h e r e a c t i o n w i t h m o l e c u l a ro x y g e n . I t a p p e a r s v e r y p r o b a b l e t h e r e f o r e t h a t c y a n i d e q u i t e a p a r t f r o m a c t i n ga s a f i x a t i v e p r e v e n t s t h e d i r e c t o x i d a t i o n o f t h e r e d u c e d c o e n z y m e . T h e r e i st h e r e f o r e n o d i r e c t r e a c t i o n b e t w e e n t h e r e d u c e d c o e n z y m e a n d o x y g e n i np r e s e n c e o f s t r o n g c y a n i d e u n l e s s a s u i t a b l e c a r r i e r i s p r o v i d e d .T h e q u e s t i o n m a y b e r a i s e d w h e t h e r c a r r i e r s a r e n e c e s s a r y i n v i v o f o r t h el a c t i c , m a l i c a n d f l - h y d r o x y b u t y r i c s y s t e m s i n v i e w o f t h e f a c t t h a t r e d u c e dc o e n z y m e i s c a p a b l e o f d i r e c t r e a c t i o n w i t h o x y g e n . T h e e v i d e n c e i s n o t c l e a r a tt h e moment j u s t how t h i s o x i d a t i o n o f r e d u c e d c o e n z y m e b y m o l e c u l a r o x y g e nt a k e s p l a c e , b u t i t s e e m s p r o b a b l e t h a t t h e p r o c e s s i s c a t a l y s e d b y s o m e e n z y m es y s t e m . T h a t w o u l d me a n t h a t i n a b s e n c e o f t h i s e n z y m e s y s t e m , c a r r i e r s a r ee s s e n t i a l f o r t h e r e a c t i o n o f c o e n z y m e d e h y d r o g e n a s e s w i t h o x y g e n . C o n v e r s e l yi n p r e s e n c e o f t h e e n z y m e s y s t e m , c a r r i e r s w o u l d b e s u p e r f l u o u s . I t i s f o r t u n a t et h e r e f o r e t h a t c y a n i d e , b y s u p p r e s s i n g t h e d i r e c t o x i d a t i o n o f r e d u c e d c o e n z y m e ,a l l o w s t h e c a r r i e r m e t h o d o f o x i d a t i o n t o b e s t u d i e d e x c l u s i v e l y .T h e d i f f e r e n c e i n r a t e o f o x i d a t i o n o f m a l a t e i n p r e s e n c e o f c y a n i d e , c o m -p a r e d w i t h t h e r a t e s o f o x i d a t i o n i n p r e s e n c e o f o t h e r f i x a t i v e s , i s n o t p e c u l i a r t ot h e u s e o f a d r e n a l i n e a s a c a r r i e r . T h e s a m e d i f f e r e n c e o c c u r s r e g a r d l e s s o f t h en a t u r e o f t h e c a r r i e r w h e t h e r i t b e m e t h y l e n e b l u e , f l a v i n o r a d r e n a l i n e .

V . S p e c i f i c i t y o f a d r e n a l i n eI n a l l t h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d a b o v e , I - a d r e n a l i n e , t h e n a t u r a l l y o c c u r r i n ge n a n t i o m o r p h w a s u s e d . A s t u d y o f a s e r i e s o f a d r e n a l i n e - l i k e s u b s t a n c e sh a s s h o w n t h a t d - a d r e n a l i n e , e p i n i n e ( ( O H ) 2 C 6 H 3 C H 2 C H 2 N H C H 3 ) , c o r b a s i l( ( O H ) 2 C 6 H 3 C H O H C H ( C H 3 ) N H 2 ) a n d 3 : 4 - d i h y d r o x y p h e n y l m e t h y l a m i n o p r o p a n o lc a n a c t i n a s i m i l a r w ay t o I - a d r e n a l i n e :

t d . 0 2 i n1 5 m i n .M a l i c s y s t e m + 1 - a d r e n a l i n e 3 0 0+ d - a d r e n a l i n e 3 0 0+ e p i n i n e 2 0 0+ c o r b a s i l 8 8+ 3 : 4 - d i h y d r o x y p h e n y l m e t h y l a m i n o p r o p a n o l 5 4 0n o c a r r i e r 0

6 0 1


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6 0 2 D . E . GREEN AND D . RICHTERI n e a c h c a s e 0 . 1 m l . M / 1 0 c a r r i e r w a s a d d e d . T h e c o n t r o l s w i t h o u t m a l a t ew e r e n e g a t i v e . A d r e n a l o n e , d - a n d l - p - s y m p a t o l , a r t e r e n o l , " d o p a " , t y r o s i n e ,t y r a m i n e , c a t e c h o l , e p h e d r i ne , p r o t o c a t e c h u i c a c i d , q u i n o n e , t h y r o x i n e a n dw - a m i n o a c e t o c a t e c h o l w e r e i n a c t i v e a s c a r r i e r s . T h e r e i s n o d o u b t t h e r e f o r e t h a t

t h e a d r e n a l i n e e f f e c t i s h i g h l y s p e c i f i c f o r a p a r t i c u l a r c o n f i g u r a t i o n a n d t h a t wea r e n o t d e a l i n g w i t h a g e n e r a l e f f e c t o f c a t e c h o l d e r i v a t i v e s .A l t h o u g h t h e m a l i c a n d l a c t i c s y s t e m s s h o w e d n o p r e f e r e n c e f o r e i t h e r o n e o ft h e t w o o p t i c a l i s o m e r i d e s o f a d r e n a l i n e , t h e s p e c i f i c i t y w a s c o m p l e t e a s f a r a s t h es u b s t r a t e s w e r e c o n c e r n e d . W h e t h e r d - o r i - a d r e n a l i n e w e r e u s e d , o n l y 1 ( + ) l a c t a t ea n d 1 ( - ) m a l a t e c o u l d b e o x i d i z e d . T h e i r o p t i c a l e n a n t i o m o r p h s w e r e n o t o x -i d i z e d . V I . T h e f a c t o r s c o n c e r n e d i n t h e a d r e n a l i n e e f f e c tT h e r e c o ns t r u c t e d h e a r t m a l i c d e h y d r o g e n a s e s y s t e m w o r k e d e q u a l l y w e l lw i t h m e t h y l e n e b l u e o r a d r e na l i n e a s c a r r i e r . H o w e v e r , a f t e r t r e a t i n g t h e e n z y m e

p r e p a r a t i o n w i t h a d s o r b i n g a g e n t s t h e r a t i o r a t e o f o x i d a t i o n by m e t h y l e n e b l u e dr a t e o f o x i d a t i o n w i t h a d r e n a l i n en o t r e m a i n c o n s t a n t . F o r e x a m p l e k a o l i n c h a n g e d t h e r a t i o f r o m t h e c o n t r o lv a l u e o f 1 - 4 t o 1 4 - 2 . K i e s e l g u h r h a d a s i m i l a r t h o u g h n o t s o p r o n o u n c e d e f f e c t ;c h a r c o a l h a d n o a p p r e c i a b l e e f f e c t ( c f . T a b l e V ) .T a b l e V . A d r e n a l i n e e f f e c t w i t h p u r i f i e d h e a r t e n z y m e

/ 1 d 0 2 i n 1 0 m i n .R a t i oM e t h y l e n e m e t h y l e n e b l u eb l u e A d r e n a l i n e a d r e n a l i n eO r i g i n a l e n z y m e 3 0 0 2 1 8 1 - 3 9K a o l i n - t r e a t e d 9 4 6 - 6 1 4 - 2

K i e s e l g u h r - t r e a t e d 1 9 7 4 6 4 - 2 7C h a r c o a l - t r e a t e d 2 6 6 3 1 8 0 - 8 9E a c h manometer c o n t a i n e d 1 m l . e n z y m e , 1 m l . c o e n z y m e , 0 - 1 m l . M / 2 0 a d r e n a l i n e o r 0 - 2 m l .0 - 5 % m e t h y l e n e b l u e , 0 - 2 m l . 2 MHCN a n d 0 2 m l . M m a l a t e .T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t some f a c t o r e s s e n t i a l f o r t h e a d r e n a l i n e e f f e c t i sr e m o v e d b y a d s o r p t i o n on k a o l i n o r k i e s e l g u h r . T h e c o n c l u s i o n a l s o f o l l o w s t h a t ,i n a d d i t i o n t o t h e d e h y d r o g e n a s e a n d c o e n z y m e , some o t h e r f a c t o r i s c o n c e r n e di n t h e m e c h a n i s m b y w h i c h a d r e n a l i n e a c t s a s a c a r r i e r .T h e m a l i c d e h y d r o g e n a s e c a n b e p r e p a r e d f r o m p r a c t i c a l l y e v e r y t i s s u e o ft h e a n i m a l b o d y . I f t h e r e i s an a d d i t i o n a l f a c t o r f o r t h e a d r e n a l i n e e f f e c t , wes h o u l d e x p e c t t h a t n o t a l l p r e p a r a t i o n s o f m a l i c d e h y d r o g e n a s e w o u l d b e c a p a b l e

o f u t i l i z i n g a d r e n a l i n e a s a c a r r i e r . A s t u d y o f t h e m a l i c d e h y d r o g e n a s e s o fr a b b i t t i s s u e s s h o w e d t h a t o n l y t h e h e a r t p r e p a r a t i o n a n d t o a s l i g h t e x t e n t t h es k e l e t a l m u s c l e p r e p a r a t i o n w e r e p o s i t i v e f o r a d r e n a l i n e . P r e p a r a t i o n s o f b r a i n ,l i v e r a n d k i d n e y w e r e n e g a t i v e , a l t h o u g h t h e y o x i d i z e d m a l a t e q u i t e r a p i d l y i np r e s e n c e o f m e t h y l e n e b l u e ( c f . T a b l e V I ) .T a b l e V I . T h e d i s t r i b u t i o n o f t h e a d r e n a l i n e f a c t o r i n r a b b i t t i s s u e s

1 d . 0 2 i n 3 0 m i n .K i d n e y B r a i n L i v e r M u s c l e H e a r t

S y s t e m + m a l a t e + a d r e n a l i n e 0 0 1 3 - 6 2 6 - 8 1 1 4S y s t e m + a d r e n a l i n e 0 0 1 2 - 0 1 2 - 4 1 7S y s t e m + m a l a t e + m e t h y l e n e b l u e 1 7 3 7 0 1 3 3 2 4 6 1 0 4T h e s y s t e m c o n t a i n e d i n e a c h c a s e 1 - 5 m l . e n z y m e , 1 - 0 m l . c o e n z y m e , 0 - 2 m l . 2 M H C N , 0 - 1 m l .M/20 a d r e n a l i n e o r 0 - 2 m l . 0 - 5 % m e t h y l e n e b l u e . The m a l a t e w h e r e a d d e d w a s 0 - 2 m l . M.The e n z y m e s were p r e p a r e d f r o m t h e v a r i o u s t i s s u e s b y t h e m e t h o d o f G r e e n & B r o s t e a u x [ 1 9 3 6 ] .


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ADRENALINE AND ADRENOCOROME 6 0 3No s y s t e m a t i c s t u d y h a s y e t b e e n made o f t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e a d r e n a l i n ef a c t o r . T h e b r e a s t m u s c l e o f t h e p i g e o n w a s f o u n d t o b e a p a r t i c u l a r l y r i c h s o u r c e .T h e s k e l e t a l m u s c l e o f t h e p i g w a s a n o t h e r t i s s u e b e s i d e s h e a r t w h i c h w a s f o u n dt o c o n t a i n t h e f a c t o r .T h e r e i s a s e r i o u s d i f f i c u l t y i n t h e way o f s t u d y i n g t h e d i s t r i b u t i o n o f t h ea d r e n a l i n e f a c t o r . S u p p o s e t h a t t h i s f a c t o r i s m o r e e a s i l y w a s h e d o u t o f b r a i n ,l i v e r a n d k i d n e y c e l l s t h a n o u t o f h e a r t o r s k e l e t a l m u s c l e c e l l s . S i n c e t h e m e t h o do f p r e p a r a t i o n i n a l l c a s e s i n v o l v e d t h o r o u g h w a s h i n g o f t h e t i s s u e b r e i p r i o r t og r i n d i n g a n d e x t r a c t i n g , t h e p o s s i b i l i t y i s o p e n t h a t i n c a s e s w h e r e t h e f a c t o r wasm i s s i n g i n t h e f i n a l e n z y m e p r e p a r a t i o n , i t h a d b e e n l o s t i n t h e c o u r s e o f t h ep r e p a r a t i o n .

V I I . T h e a d r e n a l i n e e f f e c t w i t h o t h e r d e h y d r o g e n a s e s y s t e m sT h u s f a r o n l y t h e l a c t i c a n d m a l i c d e h y d r o g e n a s e s o f h e a r t h a v e b e e n d e m o n -s t r a t e d t o b e c a p a b l e o f u t i l i z i n g a d r e n a l i n e a s a c a r r i e r . T h e f l - h y d r o x y b u t y r i ce n z y m e p r e p a r e d f r o m t h e s a m e s o u r c e s h o w e d a d e f i n i t e t h o u g h w e a k a d r e n a l i n ee f f e c t : 1 A 0 2 i n1 5 m i n .

C o m p l e t e a d r e n a l i n e s y s t e m 1 0 0No a d r e n a l i n e 0No f l - h y d r o x y b u t y r a t e 0T h e c o m p l e t e s y s t e m c o n t a i n e d 1 * 5 m l . h e a r t e n z y m e , 1 m l . c o e n z y m e , 0 - 2 m l . 2M HCN,0 - 1 m l . M / 2 0 a d r e n a l i n e a n d 0 - 2 m l . M d l - , B - h y d r o x y b u t y r a t e .W i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e s e t h r e e c o e n z y m e I d e h y d r o g e n a s e s y s t e m s o fa n i m a l t i s s u e s , n o o t h e r s y s t e m s h a v e b e e n f o u n d t o b e p o s i t i v e . T h e s u c c i n i c

d e h y d r o g e n a s e o f h e a r t , t h e o c - g l y c e r o p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e o f r a b b i t m u s c l ea n d t h e l a c t i c d e h y d r o g e n a s e o f y e a s t w e r e n e g a t i v e ( c f . T a b l e V I I ) . T h e s eT a b l e V I I . T h e a d r e n a l i n e e f f e c t w i t h c y t o c h r o m e d e h y d r o g e n a s e s y s t e m s

A L l 0 21 0 m i n . 2 0 m i n . 3 0 m i n .

Y e a s t l a c t i c s y s t e m + m e t h y l e n e b l u e 1 4 3 2 6 8 3 7 8Y e a s t l a c t i c s y s t e m + a d r e n a l i n e 0 0 0M u s c l e o c - g l y c e r o p h o s p h a t e s y s t e m + m e t h y l e n e b l u e 4 2 0M u s c l e o x - g l y c e r o p h o s p h a t e s y s t e m + a d r e n a l i n e 0H e a r t s u c c i n o x i d a s e + m e t h y l e n e b l u e 9 0 - -H e a r t s u c c i n o x i d a s e + a d r e n a l i n e 3The e n z y m e s w e r e p r e p a r e d b y t h e m e t h o d s o f O g s t o n & G r e e n [ 1 9 3 5 ] a n d G r e e n [ 1 9 3 6 , 1 ] .A l l t h e t h r e e s y s t e m s c o n t a i n e d 1 m l . e n z y m e , 1 m l . M / 2 b u f f e r pH 8 - 0 , 0 - 2 m l . 2M HCN a n d0 - 2 m l . M s u b s t r a t e . U s u a l c o nc e nt r a t i o ns o f c a r r i e r .

s y s t e m s d o n o t r e q u i r e a c o e n z y m e a n d n o r m a l l y r e a c t w i t h o x y g e n t h r o u g h t h ei n t e r m e d i a t i o n o f c y t o c h r o m e [ O g s t o n & G r e e n , 1 9 3 5 ; G r e e n , 1 9 3 6 , 1 ] .T h e t e n t a t i v e h y p o t h e s i s c o n c e r n i n g t h e c o m p o n e n t s n e c e s s a r y f o r t h ea d r e n a l i n e e f f e c t m a y b e f o r m u l a t e d a s f o l l o w s . Any c o e n z y m e I d e h y d r o g e n a s es y s t e m c a n r e a c t w i t h a d r e n a l i n e , p r o v i d e d t h e s p e c i a l f a c t o r c o n c e r n e d i n t h ea d r e n a l i n e e f f e c t i s p r e s e n t . S y s t e m s w h i c h d o n o t r e q u i r e a c o e n z y m e d o n o tr e a c t w i t h a d r e n a l i n e e v e n i n p r e s e nc e o f t h e f a c t o r . No e v i d e n c e h o w e v e r i sa v a i l a b l e w h e t h e r c o e n z y m e I I s y s t e m s b e h a v e l i k e t h o s e o f c o e n z y m e I .B i o c h e m . 1 9 3 7 x x x i 3 8


9/21

D . E . GREEN AND D . RICHTERV I I I . I n h i b i t o r s o f t h e a d r e n a l i n e e f f e c t

A s c o r b i c a c i d a n d g l u t a t h i o n e i n h i b i t e d c o m p l e t e l y t h e a d r e na l i n e e f f e c t i ne x t r e m e l y s m a l l c o n c e n t r a t i o n s ( c f . T a b l e s V I I I a n d I X ) . I t i s g e n e r a l l y knownt h a t t h e s e t w o s u b s t a n c e s p r o t e c t a d r e n a l i n e f r o m a u t o x i d a t i o n a n d i t i s c o n -c e i v a b l e t h a t t h e m e c h a n i s m o f t h e i n h i b i t o r a c t i o n c o n s i s t s i n p r o t e c t i n g

T a b l e V I I I . E f f e c t o f a s c o r b i c a c i d o n a d r e n a l i n e e f f e c t/ 4 0 2

5 m i n . 1 0 m i 1 5 m i M .C o m p l e t e s y s t e m 1 4 1 3 3 0 4 4 7+ 0 - 5 m l . M/20 a sc o r b i c a c i d 3 . 3 1 2 - 9 2 4 - 4+ 0 . 1 m l . M / 2 0 a sc o r b i c a c i d 0 0 3+ 0 - 3 m l . M / 2 0 0 a s c o r b i c a c i d 4 - 6 1 0 - 7 1 2 - 3

T h e c o m p l e t e s y s t e m c o n t a i n e d 1 m l . e n z y m e , 0 3 m l . c o e n z y m e , 0 - 5 m l . b u f f e r pH 7 - 8 , 0 - 2 m l .2M HCN, 0 - 1 m l . M / 2 0 a d r e n a l i n e a n d 0 - 2 m l . M m a l a t e . T o t a l v o l u m e 3 - 3 m l .T h e s m a l l o x y g e n u p t a k e o b s e r v e d w i t h t h e h i g h e s t c o nc e nt r a t i o n o f a sc o r b i c a c i d u s e d w a ss h o w n t o b e d u e t o s l o w a u t o xi d a t i o n o f a sc o r b i c a c i d u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s .

T a b l e I X . E f f e c t o f r e d u c e d g l u t a t h i o n e/ 4 . 0 2 i n 1 0 m i n .C o m p l e t e s y s t e m 3 2 8+ 0 - 5 m l . M / 2 0 g l u t a t h i o n e 2 3+ 0 - 1 m l . M/20 g l u t a t h i o n e 1 1+ 0 - 2 m l . M/200 g l u t a t h i o n e 3 3 8

D e t a i l s a s f o r T a b l e V I I I .a d r e n a l i n e a g a i n s t t h e c a t a l y t i c o x i d a t i o n . When a d r e n a l i n e i s r e p l a c e d b ya d r e n o c h r o m e , t h e a c t u a l r e v e r s i b l y r e d u c i b l e a n d o x i d i z a b l e d e r i va t i v e o fa d r e n a l i n e , t h e n a s c o r b i c a c i d a n d g l u t a t h i o n e h a v e n o i n h i b i t o r y a c t i o n .

I X . T h e e f f e c t o f pHT h e a d r e n a l i n e e f f e c t w i t h t h e m a l i c s y s t e m d e p e n d e d i n a n e x t r a o r d i n a r yw a y u p o n t h e pH ( c f . F i g . 4 ) . At pH 9 t h e e f f e c t was o b s e r v e d a t o n c e . W i t hd e c r e a s e o f pH a l a g p e r i o d i n t e r v e n e d b e f o r e o x i d a t i o n o f m a l a t e s t a r t e d , t h el e n g t h o f t h e l a g p e r i o d i n c r e a s i n g u n t i l a t pH 7 0 o r b e l o w t h e a d r e n a l i n e e f f e c td i s a p p e a r e d . O n c e t h e l a g p e r i o d was o v e r c o m e , t h e r a t e s o f o x i d a t i o n a t t h ev a r i o u s pH v a l u e s w e r e n o t g r e a t l y d i f f e r e n t .T h e pH c u r v e c o u l d n o t b e e x t e n d e d b e y o n d 9 , s i n c e t h e n o n - e n z y m i c a u t o x i -d a t i o n o f a d r e n a l i n e came i n t o p l a y i n t h e more a l k a l i n e r a n g e . W i t h i n t h e r a n g eo f pH s t u d i e d , t h e c o n t r o l u p t a k e s w i t h o u t m a l a t e w e r e v e r y s m a l l o r n e g a t i v e .D i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s o f t h e m a l i c d e h y d r o g e n a s e f r o m p i g ' s h e a r t d i d n o ta l w a y s c o r r e s p o n d i n t h e pH a t w h i c h t h e a d r e n a l i n e e f f e c t was n e g a t i v e . I ns o m e c a s e s pH 7 - 3 was t h e l i m i t i n g v a l u e ; i n o t h e r s pH 6 - 8 . S i m i l a r l y t h e r e wasv a r i a b i l i t y i n t h e l e n g t h s o f t h e l a g p e r i o d f r o m o n e p r e p a r a t i o n t o a n o t h e r . B u ta s w i l l b e s e e n l a t e r t h e s e v a r i a t i o n s c a n p r o b a b l y b e e x p l a i n e d i n t e r m s o fd i f f e r e n c e s i n t h e amo unt o f a d r e n a l i n e f a c t o r a n d i n h i b i t o r s p r e s e n t .T h e d e p e n d e n c e o f t h e a d r e n a l i n e e f f e c t o n t h e pH a n d t h e e x i s t e n c e o f a l a gp e r i o d a t n e u t r a l r e a c t i o n h a v e p r o v e d t o b e v a l u a b l e a s s e t s f o r a n a l y s i n g t h em e c h a n i s m b y w h i c h a d r e n a l i n e a c t s c a t a l y t i c a l l y . C l e a r l y a f a c t o r w h i c h i s e s s e n t i a lt o t h e a d r e n a l i n e e f f e c t w a s e i t h e r n o n - o p e r a t i v e o r i n h i b i t e d a t t h e pH v a l u e s a tw h i c h t h e l a g p e r i o d s w e r e o b s e r v e d . T h a t i s t o s a y t h e a d d i t i o n a l f a c t o r w a s

6 0 4


10/21

ADRENALINE AND ADRENOCHROME 6 0 5e f f e c t i v e a t pH 8 a n d a b o v e a n d p r o g r e s s i v e l y l o s t i n e f f i c i e n c y w i t h d e c r e a s i n gpH . T h e p r o b a b l e n a t u r e o f t h e f a c t o r c o u l d t h e r e f o r e b e a r r i v e d a t by f i n d i n go u t w h a t s u b s t a n c e s c o u l d e l i m i n a t e t h e l a g p e r i o d .T h e p o s s i b i l i t y o f a h a e m a t i n c a t a l y s i s s u g g e s t e d t r y i n g c y t o c h r o m e c . A tpH 7 * 6 a m i x t u r e o f m a l i c d e h y d r o g e n a s e , c y a n i d e , c o e n z y m e I , m a l a t e a n da d r e n a l i n e f a i l e d t o t a k e u p a n y o x y g e n i n 2 0 m i n . W i t h a d d i t i o n o f 0 - 2 m l .M / 1 0 0 0 h e a r t c y t o c h r o m e c t h e r e a c t i o n p r a c t i c a l l y w e n t t o c o m p l e t i o n i n t h a t

6 0 0

e 4 0 0 ~400-~ 3 0 0 ' 3 0 0 O

2 0 0 2 0 01 0 0 1 0 0

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0T i m e ( m i n . ) M o l a r i t y o f c y t o c h r o m e x 1 0 6F i g . 4 . F i g . 5 .

F i g . 4 . T h e e f f e c t o f pH o n t h e l a g p e r i o d o f t h e a d r e na l i ne e f f e c t .T h e pH o f t h e b u f f e r s o l u t i o n s w e r e d e t e r m i n e d e l e c t r o m e t r i c a l l y a t 3 8 . T h e m a n o -m e t e r s c o n t a i n e d 1 m l . e n z y m e , 1 m l . c o e n z y m e , 1 m l . M/ 2 p h o s p h a t e - g l y c i n e b u f f e r , 0 . 1 mL2M HCN, 0 - 1 m l . M m a l a t e a n d 0 - 1 m l . M / 2 0 a d r e n a l i n e .

F i g . 5 . T h e e f f e c t o f h e a r t c y t o c h r o m e c o n t h e a d r e n a l i n e e f f e c t a t pH 7 - 6 .T h e m a n o m e t e r s c o n t a i n e d 1 m l . e n z y m e , 1 m l . c o e n i y m e , 0 - 2 m l . 2MHCN, 0 - 1 m l . M 1 2 0a d r e n a l i n e a n d 0 - 5 m l . M/2 b u f f e r pH 7 - 6 .T a b l e X . E f f e c t o f h e a r t c y t o c h r o m e c o n t h e l a g p e r i o d a t pH 7 - 6

1 A 0 2 i n 2 0 m i n .A d r e n a l i n e - m a l a t e s y s t e m 0+ 0 - 2 m l . M / 1 0 0 0 c y t o c h r o m e c 2 6 0C y t o c h r o m e c c o n t r o l - n o m a l a t e 0C y t o c h r o m e c c o n t r o l - n o c o e n z y m e 4D e t a i l s a s i n T a b l e V I I I .

t i m e ( c f . T a b l e X ) . C y t o c h r o m e c h a d n o e f f e c t o n t h e o x y g e n u p t a k e u n l e s s t h ec o m p l e t e s y s t e m was p r e s e n t . G r e e n [ 1 9 3 6 , 2 ] h a s d e m o n s t r a t e d t h a t c y t o -c h r o m e c a l o n e c a n n o t a c t a s a c a r r i e r i n t h e m a l i c s y s t e m .T h e e f f e c t o f t h e c y t o c h r o m e c o n c e n t r a t i o n o n t h e e l i m i n a t i o n o f t h e l a gp e r i o d a n d o n t h e r a t e o f o x i d a t i o n i s s h o w n i n F i g . 5 . I n c r e a s e o f c y t o c h r o m ec o n c e n t r a t i o n d i d n o t a f f e c t t h e f i n a l r a t e b u t o n l y t h e s p e e d w i t h w h i c h t h er e a c t i o n s t a r t e d . T h a t i s t o s a y w i t h o r w i t h o u t c y t o c h r o m e , o n c e t h e r e a c t i o nw a s u n d e r w ay t h e v e l o c i t i e s w e r e i d e n t i c a l . C y t o c h r o m e w a s t h e r e f o r e a c t i n g i na t r i g g e r c a p a c i t y .H y d r o g e n p e r o x i d e b e h a v e d v e r y much a s c y t o c h r o m e c ( c f . T a b l e X I ) . I te l i m i n a t e d t h e i n i t i a l l a g b u t d i d n o t i n f l u e n c e t h e l i m i t i n g v e l o c i t y o n c e t h a t was38-2


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6 0 6 D . E . GREEN AND D . RICHTERT a b l e X I . E f f e c t o f H 2 0 2 o n a d r e n a l i n e lg p e r i o d a t pH 7 - 6

H l . 0 21 0 m i n . 2 0 m i n . 3 5 mM.A d r e n a l i n e - m a l a t e s y s t e m 5 . 5 1 7 - 7 1 6 3+ 0 - 1 m l . M/10 H 2 0 2 1 1 0 2 9 0 4 3 3H 2 0 2 c o n t r o l - n o m a l a t e 0 0 0

D e t a i l s a s i n T a b l e V I I I .a t t a i n e d . H e r e a g a i n t h e e f f e c t o f H 2 0 2 w a s c o n n e c t e d w i t h t h e m a l i c d e h y d r o -g e n a s e - a d r e n a l i n e s y s t e m , f o r i n a b s e n c eo f a n y o n e o f t h e c o m p o n e n t s h y d r o g e n 1 5 0p e r o x i d e d i d n o t i n d u c e a n y o x y g e n u p t a k e . 1 4 0F i g . 6 s h o w s t h e e f f e c t o f v a r y i n g t h e c o n - . ' ' oc e n t r a t i o n o f h y d r o g e n p e r o x i d e . 1 2 0A t f i r s t g l a n c e i t i s d i f f i c u l t t o u n d e r s t a n d l i o -why c y t o c h r o m e c a n d H 2 0 2 s h o u l d p r o d u c e 1 0 0 't h e s a m e e f f e c t . A d r e n a l i n e c a n b e o x i d i z e d 9d i r e c t l y b y c y t o c h r o m e c . H 2 0 2 h o w e v e r d o e s 8 0n o t o x i d i z e a d r e n a l i n e a t n e u t r a l o r s l i g h t l y 7 0a l k a l i n e r e a c t i o n . /T h e a m o u n t o f c y t o c h r o m e c a d d e d ' 4 0t o e l i m i n a t e t h e l a g p e r i o d w a s s u f f i c i e n t 3 0t o o x i d i z e o n l y a n i n s i g n i f i c a n t f r a c t i o n o f & 2 0t h e t o t a l a d r e n a l i n e p r e s e n t . A p p a r e n t l y l 0t h e n c y t o c h r o m e c s e t t h e r e a c t i o n o f f b y C 0 L L 20 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0r e a c t i n g d i r e c t l y w i t h a d r e n a l i n e a n d t h e r e - M o l a r i t y o f H 2 0 2 x 1 0 4b y f o r m i n g s o m e o f t h e a d r e n a l i n e o x i d a t i o n M o f a r t o f h y r g x ridop r o d u c t . T h a t i s t o s a y t h e l a g p e r i o d r e - thF. e T h e f f e c t e f f e c t a t p p H 7 6 .p r e s e n t s t h e d e l a y i n f o r m i n g a s u f f i c i e n t D e t a i l s a s f o r F i g . 5 .q u a n t i t y o f t h e a d r e na l i n e o x i d a t i o n p r o d u c tw h i c h i s e s s e n t i a l f o r t h e i n i t i a t i o n o f t h e r e a c t i o n . I f t h i s h y p o t h e s i s i s c o r r e c twe s h o u l d e x p e c t t h a t c y t o c h r o m e c i n t h e r e d u c e d f o r m w o u l d h a v e n o e f f e c to n t h e l a g p e r i o d , s i n c e t h e r e w o u l d b e n o p o s s i b i l i t y o f r e a c t i o n w i t h a d r e n a l i n e .S u c h w a s i n d e e d t h e c a s e : l-

1 0 m i n . 2 0 m i n .A d r e n a l i n e - m a l a t e s y s t e m 0 7 5+ 0 - 2 m l . M / 1 0 0 0 o x i d i z e d c y t o c h r o m e c 1 6 6 3 5 4+ 0 - 2 m l . M / 1 0 0 0 r e d u c e d c y t o c h r o m e c 5 2 7

No w how c a n t h e H 2 0 2 e f f e c t b e b r o u g h t i n t o l i n e w i t h t h a t o f c y t o c h r o m e c ?I n a b s e n c e o f a n y e n z y m e a l a r g e a m o u n t o f a d r e n a l i n e i n c o n t a c t w i t h a s m a l lamount o f c y t o c h r o m e c w i l l i n t e r a c t u n t i l a l l t h e c y t o c h r o m e i s r e d u c e d . T h er e a c t i o n t h e n s t o p s . I f H 2 0 2 i s a d d e d t o t h e s y s t e m t h e o x i d a t i o n o f a d r e n a l i n ec o n t i n u e s u n t i l a l l t h e H 2 0 2 i s u s e d u p . T h e e x p l a n a t i o n i s f o u n d i n t h e t w o f a c t s( 1 ) t h a t r e d u c e d c y t o c h r o m e c i s n o n - a u t o x i d i z a b l e a n d ( 2 ) t h a t r e d u c e d c y t o -c h r o m e c c a n b e o x i d i z e d b y H 2 0 2 . T h e c h a i n o f r e a c t i o n s i s t h e f o l l o w i n g :a d r e n a l i n e + o x i d i z e d c y t o c h r o m e c - o x i d a t i o n p r o d u c t o f a d r e n a l i n e + r e d u c e dr m o l n w 1 ^ l a . v t e n h r o m r . T T AO ~ As i f l i z . R f l e v t . n a h r a m cy t o c h r o m e cI r'UL U U J V LVUllVIU(rT J2 -JVA CUUy t V U ' J VJ G


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ADRENALINE AND ADRENOCHROMEw a t e r , i n w h i c h i t w a s s p a r i n g l y s o l u b l e , w a s p u r p l e - r e d i n c o l o u r a n d i t c r y s t a l -l i z e d f r o m w a t e r i n p r i sm s w i t h g r e e n m e t a l l i c l u s t r e . I t d e c o m p o s e d o n t r e a t i n gw i t h d i l u t e h y d r o c h l o r i c a c i d o r ammonia o r o n b o i l i n g i n a q u e o u s s o l u t i o n . I th a d t h e p r o p e r t i e s o f a n o r t h o - q u i n o n e , s i n c e i t w a s r e a d i l y r e d u c e d b y s u l p h u rd i o x i d e t o a s u b s t a n c e w h i c h g a v e t h e c h a r a c t e r i s t i c c a t e c h o l r e a c t i o n w i t h f e r r i cc h l o r i d e . T h e s u b s t a n c e h a d n o b a s i c p r o p e r t i e s , w h i c h m a k e s i t p r o b a b l e t h a t ,l i k e t h e i o d o - c o m p o u n d , i t i s a l s o a d i h y d r o i n d o l e d e r i v a t i v e .1 g . a d r e n a l i n e w a s d i s s o l v e d i n 5 0 m l . 2 % a c e t i c a c i d a n d 5 g . s o d i u m a c e t a t ea n d 0 - 5 7 m l . b r o m i n e w e r e a d d e d w i t h v i g o r o u s s h a k i n g . T h e s o l u t i o n b e c a m ed e e p r e d i n c o l o u r a n d o n s t a n d i n g i n t h e i c e c h e s t c r y s t a l s o f t h e b r o m o -d e r i v a t i v e s e p a r a t e d . Y i e l d 0 - 2 3 g . ( F o u n d ( W e i l e r ) : C , 4 1 - 6 ; H , 3 - 5 ; N , 5 - 5 ;B r , 3 0 - 2 % . C 9 H 1 0 0 3 N B r r e q u i r e s C , 4 1 - 5 ; H , 3 - 9 ; N , 5 - 4 ; B r , 3 0 - 7 % . )

X I I . O x i d a t i o n w i t h c a t e c h o l o x i d a s eC a t e c h o l o x i d a s e a t pH 7 - 3 c a t a l y s e d t h e o x i d a t i o n o f a d r e n a l i n e , b u t a t t h i s

pH t h e r e d c o l o u r e d p r o d u c t r a p i d l y d e c o m p o s e d t o g i v e a b l a c k m e l a n i n - l i k es u b s t a n c e . At pH 5 t h e r e d c o m p o u n d w a s much m o r e s t a b l e , b u t w i t h o r d i n a r yp r e p a r a t i o n s o f t h e c a t e c h o l o x i d a s e o f p o t a t o e s t h e r a t e o f o x i d a t i o n a t pH 5w a s s o much r e d u c e d t h a t a t t e m p t s t o i s o l a t e t h e r e d p r o d u c t w e r e u n s u c c e s s f u l .U s i n g a h i g h l y a c t i v e p r e p a r a t i o n o f t h e c a t e c h o l o x i d a s e o f t h e mushroomA g a r i c u 8 c a m p e s t r i s k i n d l y g i v e n b y P r o f . K e i l i n i t w a s f o u n d p o s s i b l e t o o b t a i na s u f f i c i e n t l y r a p i d o x i d a t i o n a t pH 5 f o r a c o m p a r a t i ve l y p u r e s o l u t i o n o f t h er e d q u i n o n e t o b e o b t a i n e d . O n r a p i d e v a p o r a t i o n o f t h i s s o l u t i o n i n a F u c h s ' sa p p a r a t u s [ F u c h s , 1 9 2 8 ] c r y s t a l s o f t h e r e d compound w e r e o b t a i n e d .A s o l u t i o n c o n t a i n i n g 0 - 5 g . a d r e n a l i n e i n 5 0 m l . w a s b r o u g h t t o pH 5 w i t ha c e t i c a c i d . C a t e c h o l o x i d a s e w a s a d d e d a n d a r a p i d s t r e a m o f o x y g e n wasp a s s e d i n t h r o u g h a s i n t e r e d g l a s s b u b b l e r . T h e r a t e o f o x y g e n u p t a k e o f as a m p l e o f t h e s o l u t i o n w a s e s t i m a t e d f r o m t i m e t o t i m e i n a B a r c r o f t a p p a r a t u s .When t h e o x i d a t i o n c a m e t o a n e n d ( 2 - 3 h o u r s a t 2 0 0 ) t h e s o l u t i o n was f i l t e r e da n d e v a p o r a t e d .S u b s e q u e n t w o r k s h o w e d t h a t t h i s s u b s t a n c e i s p r o b a b l y i d e n t i c a l w i t h t h er e d c o m p o u n d d e r i v e d f r o m a d r e n a l i n e w h i c h o p e r a t e s i n t h e m a l i c s y s t e m , a s i tb e h a v e d e q u a l l y w e l l a s a c a r r i e r i n t h e m a l i c s y s t e m a n d g a v e q u a n t i t a t i v e l y t h es a m e t u r n o v e r n u m b e r . I n v e s t i g a t i o n o f t h e c h e m i c a l c o n s t i t u t i o n s h o w e d t h a ti t h a s t h e p r o p e r t i e s o f N - m e t h y l - 2 : 3 - d i h y d r o - 3 - h y d r o x y i nd o l e - 5 : 6 - q u i n o n e . T h es h o r t e r name a d r e n o c h r o m e i s p r o p o s e d f o r t h i s s u b s t a n c e .X I I I . P r o p e r t i e s o f a d r e n o c h r o m e

A d r e n o c h r o m e i s a v e r y u n s t a b l e s u b s t a n c e : i t i s c o m p l e t e l y d e s t r o y e d i n4 m i n . b y 1 % h y d r o c h l o r i c a c i d , a n d i n 4 0 s e c . b y 1 % a m m o n i a . A t pH 7 - 3 a n d3 7 0 t h e r e d c o l o u r d i s a p p e a r s i n 3 5 m i n . , a n d e v e n u n d e r t h e optimum c o n d i t i o n sf o r k e e p i n g t h e s o l u t i o n , a t pH 4 - 0 a n d 0 0 , m a r k e d d e c o m p o s i t i o n a n d m e l a n i nf o r m a t i o n c o u l d b e o b s e r v e d i n 4 - 5 h o u r s . I n t h e d r y c r y s t a l l i n e c o n d i t i o na d r e n o c h r o m e c o u l d b e k e p t f o r s e v e r a l w e e k s , b u t o n s t a n d i n g i n a vacuumd e s i c c a t o r i t d e c o m p o s e d t o g i v e a b r o w n a m o r p h o u s p r o d u c t . T h e c r y s t a l l i n es u b s t a n c e a p p e a r s t o b e a h y d r a t e . T h e c r y s t a l s d e c o m p o s e o n h e a t i n g a t a b o u t1 1 5 - 1 2 0 .A d r e n o c h r o m e i s v e r y s o l u b l e i n w a t e r a n d c r y s t a l l i z e s f r o m w a t e r o n l y o ne v a p o r a t i o n p r a c t i c a l l y t o d r y n e s s . I t i s a l s o r e a d i l y s o l u b l e i n m e t h y l a l c o h o l .I t i s r e m o v e d q u a n t i t a t i v e l y f r o m t h e a q u e o u s s o l u t i o n b y a d s o r p t i o n o n c h a r -c o a l , a n d c a n b e e l u t e d a g a i n f r o m t h e c h a r c o a l w i t h m e t h y l a l c o h o l .

6 0 9


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D . E . GREEN AND D . RICHTERX I V . C o n i s t t u t i o n o f a d r e n o c h r o m e

I n t h e o x i d a t i o n o f a d r e n a l i n e c a t a l y s e d by c a t e c h o l o x i d a s e t h e r e a c t i o nc a m e t o a n e n d when a p p r o x i m a t e l y 2 a t o m s o f o x y g e n p e r m o l e c u l e o f a d r e n a -l i n e h a d b e e n t a k e n u p .t d 0 2

T h e o r e t i c a l f o r5 m i n . 1 0 m i n . 3 5 m i n . 2 a t o m s o x y g e nEnzyme a l o n e 5 8 1 6 00 - 1 m l . M/20 a d r e n a l i n e 8 8 9 4 1 1 0 1 1 20 - 2 m l . 1 5 6 1 8 5 2 1 3 2 2 4T h e c o m p l e t e s y s t e m c o n t a i n e d 1 m l . e n z y m e s o l u t i o n , 1 m l . M / I 0 b u f f e r p H 5 - 3 a n d a d r e n a l i n e .T o t a l v o l u m e 3 - 3 m l .T h i s w o u l d i n d i c a t e t h e f o r m u l a C 9 H 9 0 3 N f o r a d r e n o c h r o m e a c c o r d i n g t o t h ee q u a t i o n : C g H 1 3 0 3 N + 0 2 - C 9 H 9 O 3 N + 2 H 2 0

T h i s f o r m u l a w a s c o n f i r m e d b y a n a l y s i s ( W e i l e r ) . ( F o u n d C , 5 7 - 5 % ; H , 6 - 0 % ;N , 7 . 2 % O . C 9 H 9 0 3 N , ! H 2 0 r e q u i r e s C , 5 7 . 4 % ; H , 5 . 4 % ; N , 7 . 4 % ) .A d r e n o c h r o m e b e h a v e s a s a n o r t h o - q u i n o n e i n t h a t i t i s r e a d i l y r e d u c e d b ys u l p h u r d i o x i d e , h y d r o g e n s u l p h i d e o r p a l l a d i u m a n d h y d r o g e n t o g i v e a c o l o u r -l e s s l e u c o - c o m p o u n d w h i c h g i v e t h e c o l o u r r e a c t i o n s o f a c a t e c h o l d e r i va t i v e sw i t h f e r r i c c h l o r i d e . L e u c o - a d r e n o c h r o m e i s o p t i c a l l y a c t i v e a n d h a s [ o c ] " ' = 7 9 . 2 0 .T h e a s y m m e t r i c CH. OH g r o u p i s t h e r e f o r e p r o b a b l y i n t a c t i n a d r e n o c h r o m e .A d r e n o c h r o m e i s much l e s s b a s i c t h a n a d r e n a l i n e s i n c e i t c r y s t a l l i z e s f r o m d i l u t ea c e t i c a c i d i n t h e f r e e c o n d i t i o n a n d n o t a s a s a l t .T h e a q u e o u s s o l u t i o n s o f a l l t h e s i m p l e o r t h o - q u i n o n e s w h i c h a r e known a r eo r a n g e o r y e l l o w i n c o l o u r . T h e b r i l l i a n t r e d c o l o u r o f a d r e n o c h r o m e i n d i c a t e dt h a t s u b s t i t u t i o n i n t h e b e n z e n e n u c l e u s m i g h t h a v e o c c u r r e d ; t h e c o l o u r i ss u g g e s t i v e o f t h e a m i n o q u i n o n e s w h i c h a r e a l s o r e d . T h e u l t r a v i o l e t a b s o r p t i o ns p e c t r u m o f l e u c o - a d r e n o c h r o m e ( 2 5 0 0 - 4 0 0 0 A . ) a l s o d i f f e r s w i d e l y f r o m t h a to f a d r e n a l i n e . Some c h a n g e i n t h e g r o u p s a t t a c h e d t o t h e b e n z e n e n u c l e u s , w h i c hd e t e r m i n e s t h e a b so r p t i o n i n t h i s r a n g e o f w a v e - l e n g t h s , i s a g a i n i n d i c a t e d .A d r e n o c h r o m e c o n t a i n s 4 h y d r o g e n a t o m s l e s s t h a n a d r e n a l i n e . Tw o o f t h e s eh y d r o g e n a t o m s h a v e b e e n r e m o v e d i n q u i n o n e f o r m a t i o n : t h e o t h e r t w oh y d r o g e n a t o m s h a v e b e e n r e m o v e d i n a r e a c t i o n w h i c h h a s d i m i n i s h e d t h eb a s i c i t y o f t h e n i t r o g e n a t o m a n d a t t h e s a m e t i m e a p p e a r s t o h a v e e f f e c t e da s u b s t i t u t i o n i n t h e b e n z e n e n u c l e u s . T h i s i s b e s t e x p l a i n e d b y r i n g c l o s u r eb e t w e e n t h e n i t r o g e n a t o m a n d t h e b e n z e n e n u c l e u s t o g i v e a d i h y d r o i n d o l ed e r i v a t i v e I V .

HO O ~ ~ ~ ~ H 2 O H 2 O H 21 V\/NHCH2 O NHCH3 ,1 NII~ ~ H 3I t i s p r o b a b l e b o t h f r o m t h e k no wn m od e o f a c t i o n o f c a t e c h o l o x i d a s e a n d f r o mB a l l & C h e n ' s w o r k t h a t t h e f i r s t s t a g e i n t h e o x i d a t i o n o f a d r e n a l i n e t o a d r e n o -c h r o m e i s t h e f o r m a t i o n o f t h e o r t h o - q u i n o n e ( I I ) . T h e w o r k o f R a p e r [ 1 9 2 7 ] o n t h ef o r m a t i o n o f i n d o l e d e r i v a t i v e s f r o m d i h y d r o x y p h e n y l a l a n i n e g i v e s an e x a m p l eo f a s i m i l a r r e a c t i o n o c c u r r i n g i n a n a n a l o g o u s s e r i e s o f c o m p o u n d s . T h e p r o p o s e d

6 1 0


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ADRENALINE AND ADRENOCHROMEc o n s t i t u t i o n a l f o r m u l a f o r a d r e n o c h r o m e g i v e s a n i n t e r p r e t a t i o n o f a l l t h e p r o p e r -t i e s h i t h e r t o o b s e r v e d a n d i n d i c a t e s t h a t i t m a y b e r e l a t e d t o t h e n a t u r a l l yo c c u r r i n g p i g m e n t h a l l a c h r o m e w h i c h w a s i s o l a t e d by M a z z a & S t o l f i [ 1 9 3 1 ] f r o mt h e p o l y c h a e t e H a l l a p a r t h e n o p e a .

O n t r e a t m e n t w i t h h y d r o x y l a m i n e a d r e n o c h r o m e g a v e a q u i n o n e o x i m e ( V )V

/ N , / \ / CHOHC H 2

0 ~ NICH3w h i c h c r y s t a l l i z e d f r o m w a t e r i n b r i g h t o r a n g e n e e d l e s . T h e o x i m e w a s a muchm o r e s t a b l e s u b s t a n c e t h a n a d r e n o c h r o m e a n d m e l t e d s h a r p l y a t 2 7 8 0 . ( F o u n dC , 4 8 - 8 , 4 8 - 8 ; H , 5 . 9 , 5 - 8 ; N , 1 2 * 4 , 1 2 - 7 % . C g H 1 0 0 3 N 2 , 1 1 H 2 O r e q u i r e s C , 4 8 8 ;H , 5 9 ; N , 1 2 - 7 % . ) When t r e a t e d w i t h a m i x t u r e o f p o t a s s i u m i o d a t e a n d i o d i d e ,a d r e n o c h r o m e g a v e a p r o d u c t i d e n t i c a l w i t h t h e i o d o - c o m p o u n d d e s c r i b e d i ns e c t i o n X I . T h i s c o n f i r m s t h e c o n s t i t u t i o n w h i c h h a s b e e n g i v e n t o a d r e n o c h r o m e ,s i n c e t h e c o n s t i t u t i o n o f t h e i o d o - c o m p o u n d h a s b e e n d e t e r m i n e d i n d e p e n d e n t l y .

XV. O x i d a t i o n o f a d r e n a l i n e b y h a e m a t i n d e r i v a t i v e sA d r e n a l i n e w a s f o u n d t o b e o x i d i z e d b y a number o f h a e m a t i n d e r i v a t i v e s ,i n c l u d i n g m e t h a e m o g l o b i n a n d t h e c y t o c h r o m e s .H a e m a t i n . 0 5 m l . 1 % a d r e n a l i n e h y d r o c h l o r i d e a n d 1 m l . M / 1 F 5 p h o s p h a t eb u f f e r pH 7 - 5 w e r e a d d e d t o a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 0 . 5 m g . o f t h e d i s o d i u m s a l t o fh a e m a t i n i n 1 m l . o f w a t e r . O n a d d i n g a f e w d r o p s o f p y r i d i n e a n d a l l o w i n g t h em i x t u r e t o s t a n d a t 2 0 0 f o r a f e w m i n u t e s , c r y s t a l s o f p y r i d i n e h a e m o c h r o m o g e ns e p a r a t e d o u t . T h e y w e r e i d e n t i f i e d b y t h e i r c h a r a c t e r i s t i c c r y s t a l l i n e h a b i t a n da b s o r p t i o n b a n d s a t 5 5 8 0 a n d 5 2 6 0 A .M e t h a e m o g l o b i n . A s o l u t i o n o f m e t h a e m o g l o b i n w a s p r e p a r e d b y o x i d i z i n g5 m l . hum a n b l o o d d i l u t e d 1 : 2 0 w i t h 2 m g . p o t a s s i u m f e r r i c y a n i d e a n d d i a l y s i n gt o r e m o v e t h e e x c e s s o f t h e r e a g e n t . O n a d d i n g 1 m l . M / 1 - 5 b u f f e r pH 7 . 3 a n d0 5 m l . 1 % a d r e n a l i n e h y d r o c h l o r i d e t o 1 m l . o f t h e s o l u t i o n a n d i n c u b a t i n g i n avacuum t u b e a t 3 7 0 t h e m e t h a e m o g l o b i n b a n d a t 6 3 3 0 A . s l o w l y d i s a p p e a r e d . I n3 0 m i n . i t h a d b e e n r e p l a c e d b y t h e h a e m o g l o b i n s p e c t r u m . T h e s o l u t i o n t h e ns h o w e d t h e b a n d s o f o x y h a e m o g l o b i n o n s h a k i n g i n t h e a i r .C y t o c h r o m e s a , b a n d c . C y t o c h r o m e c i s r e d u c e d v e r y r a p i d l y b y a d r e n a l i n ea t pH 7 . 3 . C y t o c h r o m e a i s r e d u c e d l e s s r a p i d l y , w h i l e w i t h c y t o c h r o m e b t h er e d u c t i o n w a s v e r y s l o w . T h e r e d u c t i o n o f c y t o c h r o m e a a n d b w a s f a s t e r a t morea l k a l i n e r e a c t i o n s .A s o l u t i o n c o n t a i n i n g 0 - 1 m l . o f 0 * 1 % c y t o c h r o m e c a n d 1 m l . M / 1 0 p h o s p h a t eb u f f e r pH 7 - 3 r e a c t s a l m o s t i n s t a n t a n e o u s l y w i t h 0 - 5 m l . 1 % a d r e n a l i n e h y d r o -c h l o r i d e s o l u t i o n a t 2 0 0 g i v i n g t h e a b s o r p t i o n b a n d s o f r e d u c e d c y t o c h r o m e .Vacuum t u b e s c o n t a i n i n g 2 - 5 m f . c y t o c h r o m e a a n d b p r e p a r a t i o n f r o m p i g ' sh e a r t , 0 5 m l . M / 1 - 5 p h o s p h a t e b u f f e r pH 7 . 3 a n d 0 - 5 m l . 1 % a d r e n a l i n e h y d r o -c h l o r i d e i n 5 m l . s h o w d i s t i n c t b a n d s o f r e d u c e d c y t o c h r o m e a a f t e r i n c u b a t i n g a t3 0 0 f o r 4 5 m i n . U n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s c y t o c h r o m e b s h o w e d p r a c t i c a l l y n o

r e d u c t i o n i n t h i s t i m e , b u t a t pH 8 * 8 a d i s t i n c t r e d u c t i o n o f t h e b c o m p o n e n tc o u l d b e o b s e r v e d .

6 1 1


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6 1 2 D . E . GREEN AND D . RICHTERX V I . O x i d a t i o n b y i n d o p h e n o l o x i d a s e - c y t o c h r o m e s y s t e m

A p r e p a r a t i o n o f i n d o p h e n o l o x i d a s e o b t a i n e d f r o m p i g ' s h e a r t m u s c l e b y t h em e t h o d o f O g s t o n & G r e e n [ 1 9 3 5 ] b r i n g s a b o u t a r a p i d o x i d a t i o n o f a d r e n a l i n ei n t h e p r e s e nc e o f c y t o c h r o m e c . 1 - d 0 2 i n 5 m i n .Enzyme + a d r e n a l i n e 1 4Enzyme + c y t o c h r o m e c + a d r e n a l i n e 1 8 9B o i l e d e n z y m e + a d r e n a l i n e 0B o i l e d e n z y m e + c y t o c h r o m e c + a d r e n a l i n e 0

I n e a c h t u b e 1 m l . e n z y m e , 0 - 2 m l . M/10 a d r e n a l i n e a n d 1 m l . 3 1 / 2 p h o s p h a t e b u f f e r pH 7 - 6c o n t a i n i n g 3 1 / 2 g l y c i n e . T h e e n z y m e w a s n o t e n t i r e l y f r e e f r o m c y t o c h r o m e a n d h e n c e t h e e n z y m ea n d a d r e n a l i n e s h o w e d a c e r t a i n o x y g e n u p t a k e w i t h o u t a d d e d c y t o c h r o m e . T h e t u b e s w i t hc y t o c h r o m e c c o n t a i n e d 0 . 3 m l . M / 1 0 0 0 . T o t a l v o l u m e 3 - 3 m l .T h e d e p e n d e n c e o f t h e r a t e o f o x i d a t i o n o n t h e pH w a s s h o w n b y t h e f o l l o w -i n g e x p e r i m e n t s c a r r i e d o u t u n d e r s i m i l a r c o n d i t i o n s b u t w i t h d i f f e r e n t b u f f e r

s o l u t i o n s j P d . 0 2 i n 5 m i n ., ~ ~ ~~ApH . . . 7 - 0 7 - 6 8 - 4Enzyme + a d r e n a l i n e 6 1 4 7 3Enzyme + a d r e n a l i n e + c y t o c h r o m e c 1 2 9 1 8 9 2 9 0T h e b u f f e r s o l u t i o n s u s e d w e r e made u p w i t h M/2 g l y c i n e w h i c h h a s b e e n s h o w nb y W i l t s h i r e [ 1 9 3 1 ] t o i n h i b i t t h e s p o n t a n e o u s a u t o x i d a t i o n o f a d r e n a l i n e . T h es y s t e m w a s c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b y M / 1 0 0 0 c y a n i d e .B e s i d e s a d r e n a l i n e a n u m b e r o f o t h e r c a t e c h o l d e r i v a t i v e s a n d s y m p a t h o -m i m e t i c d r u g s h a v e b e e n t e s t e d a n d a m a r k e d s p e c i f i c i t y o f a c t i o n w a s o b s e r v e d .I t m i g h t h a v e b e e n a n t i c i p a t e d o n s t r u c t u r a l g r o u n d s t h a t a d r e n a l o n e a n ds y m p a t o l w o u l d b e l e s s r e a d i l y o x i d i z e d , b u t t h e l o w r a t e o f o x i d a t i o n o f d i -h y d r o x y p h e n y l a l a n i n e w a s u n e x p e c t e d , a s a l s o w a s t h e s p e c i f i c i t y s h o w n i n t h ed i f f e r e n t r a t e s o f o x i d a t i o n o f d - a n d i - a d r e n a l i n e . A f u r t h e r p o i n t o f i n t e r e s t i st h e d i f f e r e n t s p e e d s o f o x i d a t i o n o f c o l e p h r i n e a n d c o r b a s i l , w h i c h d i f f e r o n l y i nt h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f a m e t h y l g r o u p o n t h e n i t r o g e n a t o m .

t L d 0 2 i n 5 m i n .W i t h o u t Withc y t o c h r o m e c y t o c h r o m ei - A d r e n a l i n e ( O H ) 2 C 6 H 3 . C H O H . C H 2 . N H C H3 4 2 4 6d - A d r e n a l i n e ( O H ) 2 C , 6 H 3 . CHOH . C H 2 . NH C H3 2 1 5 5E p i n i n e ( O H ) 2 C 6 H 3 . C H 2 . C H 2 . N H C H O 1 4 2 3 8d l - D o p a ( O H ) 2 C 6 H , . C H 2 . CH(COOH)NH2 0 1w - A m i n o a c e t o c a t e c h o l ( O H ) 2 C 6 H . . C O . C R 2 . NH2 0 3 0A d r e n a l o n e ( O H ) 2 C 6 H 3 . C O . C H 2 . N H C H 3 6 2 2d l - A r t e r e n o l ( O H ) 2 C 6 H . . C H O H . C H 2 . NH 2 0 1 7 4I - m - S y m p a t o l ( O H ) C 6 H 4 . C H O H . C H 2 . N H C H 8 0 0d l - C o r b a s i l ( O H ) 2 C . H . . C H O H . C H ( C H 3 ) * N H 2 2 2 4 6d l - C o l e p h r i n e ( O H ) 2 C 6 H 3 . C H O H . C H ( C H 3 ) . N H C H , 2 4 1 4

E a c h t u b e c o n t a i n e d 0 * 7 m l . e n z y m e , 1 m l . p h o s p h a t e - g l y c i n e b u f f e r pH 7 - 6 , 0 - 3 m l . M / 1 0 0 0 ,c y t o c h r o m e c a n d 0 3 m l . M/10 a d r e n a l i n e d e r i v a t i v e .X V I I . A c t i o n o f a d r e n o c h r o m e i n t h e m a l i c s y s t e m

A d r e n o c h r o m e a c t e d i n t h e s a m e wa y a s a d r e n a l i n e a s a c a r r i e r i n t h e m a l i cs y s t e m , t h e o n l y d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o b e i ng t h a t w i t h a d r e n o c h r o m e t h e r ew a s n o l a g p e r i o d ; t h e r a p i d o x y g e n u p t a k e b e g a n i m m e d i a t e l y . T h e t w o c o m -p o u n d s e v e n s h o w e d t h e s a m e t u r n o v e r n u m b e r ( T . N . ) a t e q u i v a l e n t c o n c e n t r a -


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ADRENALINE AND ADRENOCHROME 6 1 3T a b l e X I I I . A d r e n a l i ne a n d a d r e n o c h r o m e a t pH 7 - 6

1 A . 0 2 i n 2 0 m i n .S y s t e m + a d r e n a l i n e 0S y s t e m + a d r e n a l i n e + c y t o c h r o m e c 2 6 0S y s t e m + a d r e n o c h r o m e 2 7 4S y s t e m + a d r e n o c h r o m e + c y t o c h r o m e c 2 9 0T h e s y s t e m c o n t a i n e d 1 m l . e n z y m e , 1 m l . c o e n z y m e , 0 - 5 m l . M/ 2 b u f f e r pH 7 - 6 , 0 - 1 m l .2 MHCN a n d 0 - 2 m l . M m a l a t e .

t i o n s . T h e r e i s t h e r e f o r e g o o d r e a s o n f o r c o n c l u d i n g t h a t a d r e n o c h r o m e a n d t h er e d o x i d a t i o n p r o d u c t f o r m e d f r o m a d r e n a l i n e i n t h e m a l i c s y s t e m a r e i d e n t i c a l .P d 0 2 i n 3 m i n .

W i t h W i t h o u tA d r e n o c h r o m e m l . m a l a t e m a l a t e T . N .2 - 5 m g . / m l . 0 - 5 8 0 1 2 0 - 50 - 1 4 5 5 1 - 40 - 2 5 m g . / m l . 0 - 3 1 6 0 1 - 9, , l l 0 . 1 1 5 - 5 0 5 . 3

T h e c o m p l e t e s y s t e m c o n t a i n e d 1 m l . e n z y m e , 1 m l . c o e n z y m e , 0 . 1 m l . M m a l a t e , 0 - 1 m l .2 MHCN a n d 0 - 8 m l . M/2 p h o s p h a t e - g l y c i n e b u f f e r pH 7 - 6 . T o t a l v o l u m e 3 - 3 m l .

A d r e n o c h r o m e , when a d d e d i n v e r y s m a l l a m o u n t s t o t h e c o m p l e t e a d r e n a l i n e -m a l i c s y s t e m , h a d t h e e f f e c t o f t e r m i n a t i n g t h e l a g p e r i o d a n d a c c e l e r a t i n g t h ei n i t i a t i o n o f t h e r e a c t i o n : 1 d 0 25 m i n . 1 0 m m .

A d r e na l i n e - m a l i c s y s t e m 0 0A d r e n a l i n e . m a l i c s y s t e m + a d r e n o c h r o m e 3 9 9 7M a l i c s y s t e m + a d r e n o c h r o m e 7 1 9T h e amount o f a d r e n o c h r o m e a d d e d w a s 0 - 5 m l . 0 - 2 5 m g . / m l . s o l u t i o n . T h e c o m p l e t e s y s t e m

c o n t a i n e d 1 - 3 m l . e n z y m e , 1 m l . c o e n z y m e , 0 - 8 m l . M/ 2 g l y c i n e , p h o s p h a t e b u f f e r pH 7 - 6 , 0 - 2 m l .M/1 HCN, 0 . 1 m l . M/1 m a l a t e a n d 0 . 1 m l . M / 1 0 a d r e n a l i n e .X V I I I . D i s c u s s i o n

I t h a s b e e n s h o w n t h a t m a l i c a c i d i s r a p i d l y o x i d i z e d b y t h e s y s t e m c o m -p r i s i n g c o e n z y m e , c y a n i d e , a d r e n a l i n e a n d t h e m a l i c d e h y d r o g e n a s e o f h e a r tm u s c l e . A g e n e r a l s c h e m e f o r t h e r e a c t i o n s i n v o l v e d i s g i v e n i n T a b l e X I V .T h e i n i t i a t i o n o f t h e r e a c t i o n d e p e n d e d o n t h e p r i m a r y o x i d a t i o n o f t h ea d r e n a l i n e t o a r e d p i g m e n t , a d r e n o c h r o m e ( r e a c t i o n s I a n d I I ) . A d d i t i o n o fo x i d i z i n g a g e n t s s u c h a s c y t o c h r o m e c o r h y d r o g e n p e r o x i d e h a s t e n e d t h i so x i d a t i o n ; c o n v e r s e l y r e d u c i n g a g e n t s s u c h a s g l u t a t h i o n e o r a s c o r b i c a c i d i n -h i b i t e d t h e o x i d a t i o n .When o n c e t h e a d r e n o c h r o m e h a d b e e n f o r m e d t h e o x i d a t i o n o f m a l a t ep r o c e e d e d b y r e a c t i o n s I I I , IV a n d V . A d r e n o c h r o m e was r e d u c e d b y t h e m a l i cs y s t e m t o l e u c o - a d r e n o c h r o m e w h i c h i n t u r n r e o x i d i z e d , s o t h a t t h e a d r e n o -c h r o m e a c t e d a s a n o x y g e n c a r r i e r .I n c o n s i d e r i n g how t h e a d r e n a l i n e b e c a m e o x i d i z e d t o a d r e n o c h r o m e i n t h ef i r s t p l a c e , i t w a s f o u n d t h a t u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f t h e e x p e r i m e n t , i . e . i n t h ep r e s e n c e o f c y a n i d e , g l y c i n e a n d t h e e n z y m e , a d r e n a l i n e d i d n o t a u t o x i d i z e . T h ef a c t o r r e s p o n s i b l e f o r t h e o x i d a t i o n o f a d r e n a l i n e t o a d r e n o c h r o m e was p r o b a b l ya h a e m a t i n c o m p o u n d s i m i l a r t o c y t o c h r o m e w h i c h c o u l d b e s e e n s p e c t r o -s c o p i c a l l y t o b e p r e s e n t i n t h e e n z y m e p r e p a r a t i o n a n d w h i c h h a s b e e n s h o w n t oo x i d i z e a d r e n a l i n e .


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6 1 4 D . E . GREEN AND D . RICHTERT a b l e XIV

I 2 + R e d u c e d O x i d i z e d + H 2 0c y t o c h r o m e c y t o c h r o m e{ I I Oxidized + Adrenaline A d r e n o c h r o m e + R e d u c e dc y t o c h r o m e c y t o c h r o m eI I I 0 2 + L e u c o - A d r e n o c h r o m e + H 2 0 2a d r e n o c h r o m eIV A d r e n o c h r o m e + R e d u c e d O x i d i z e d + L e u c o -c o e n z y m e c o e n z y m e a d r e n o c b r o m eV O x i d i z e d + M a l a t e O x a l o a c e t a t e + R e d u c e dc o e n z y m e c o e n z y m eVI O x a l o a c e t a t e + H C N C y a n o h y d r i n

I n t h e c o m p l e t e a d r e n a l i n e - m a l i c s y s t e m t h e i n i t i a t i o n o f t h e r e a c t i o n w a sg r e a t l y a c c e l e r a t e d b y t h e a d d i t i o n o f a s m a l l t r a c e o f a d r e n o c h r o m e w h i c hp r o d u c e d a n e f f e c t o u t o f a l l p r o p o r t i o n t o t h a t w h i c h w o u l d b e e x p e c t e d f r o mt h e a c t u a l amount o f a d r e n o c h r o m e a d d e d . T h i s t r i g g e r a c t i o n o f a d r e n o c h r o m ec o u l d b e e x p l a i n e d i f t h e o x i da t i o n o f e a c h m o l e c u l e o f l e u c o - a d r e n o c h r o m e c a u s e dt h e p r o d u c t i o n o f a m o l e c u l e o f h y d r o g e n p e r o x i d e ( r e a c t i o n I I I ) . T h e h y d r o g e np e r o x i d e s o p r o d u c e d w o u l d o x i d i z e a f u r t h e r q u a n t i t y o f a d r e n a l i n e a n d s o makea f u r t h e r amount o f a d r e n o c h r o m e a v a i l a b l e a s a c a r r i e r . T h e a u t o c a t a l y t i co x y g e n u p t a k e c u r v e s t h a t w e r e r e g u l a r l y o b t a i n e d w i t h t h e a d r e n a l i n e - m a l i cs y s t e m a r e a l s o e x p l a i n e d i f h y d r o g e n p e r o x i d e i s p r o d u c e d i n t h i s r e a c t i o n . I nt h e a b s e n c e o f m a l a t e , a d d e d a d r e n o c h r o m e d i d n o t b r i n g a b o u t t h e o x i d a t i o n o fa d r e n a l i n e t o a d r e n o c h r o m e : b u t t h i s w a s t o b e e x p e c t e d , s i n c e o n l y i n t h e p i e s e n c eo f m a l a t e w o u l d t h e t u r n o v e r o f a d r e n o c h r o m e b e s u f f i c i e n t l y r a p i d t o l i b e r a t ea s i g n i f i c a n t amount o f h y d r o g e n p e r o x i d e i n t h e s o l u t i o n .I n a b s e n c e o f c y a n i d e , a d r e n a l i n e a n d l e u c o - a d r e n o c h r o m e w e r e r e a d i l y o x i d i z e db y t h e i n d o p h e n o l o x i d a s e - c y t o c h r o m e s y s t e m . T h e r a p i d o x y g e n u p t a k e o b -t a i n e d w i t h a d r e n o c h r o m e a n d t h e m a l i c s y s t e m i n t h e p r e s e n c e o f c y a n i d es h o w e d t h a t f o r t h e o p e r a t i o n o f t h i s s y s t e m t h e i n d o p h e n o l o x i d a s e w a s n o tn e c e s s a r y . A d r e n o c h r o m e a p p e a r e d i n f a c t t o p r o v i d e a s h o r t c u t f o r t h e o xi d a -t i o n o f m a l i c a c i d w h i c h c o u l d p r o c e e d by r e a c t i o n s I I I , IV a n d V w i t h o u t i n -v o l v i n g t h e i n d o p h e n o l o x i d a s e s y s t e m . W h e t h e r t h e o x i d a t i o n o f l e u c o - a d r e n o -c h r o m e t o a d r e n o c h r o m e w a s a n a u t o x i d a t i o n o r w h e t h e r i t w a s e n z y m i c r e m a i n st o b e i n v e s t i g a t e d .T h e o b s e r v e d v a l u e o f 5 f o r t h e t u r n o v e r number s h o w s t h a t a d r e n o c h r o m e i sh i g h l y a c t i v e a s a n o x y g e n c a r r i e r f o r t h e m a l i c d e h y d r o g e n a s e s y s t e m . T h i sv a l u e w a s o b t a i n e d d e s p i t e t h e f a c t t h a t a d r e n o c h r o m e i s a v e r y u n s t a b l e s u b -s t a n c e a n d w a s i n f a c t d e c o m p o s i n g d u r i n g t h e t i m e t h a t t h e m e a s u r e m e n t w a sm a d e . T h e t r u e c a t a l y t i c a c t i v i t y o f a d r e n o c h r o m e m a y t h e r e f o r e b e e v e n h i g h e rt h a n t h i s v a l u e f o r t h e t u r n o v e r number w o u l d s u g g e s t .I n a c t i v a t i o n o f a d r e n a l i n e . A d r e n a l i n e i s b e l i e v e d t o p a s s c o n t i n u o u s l y i n t ot h e b l o o d s t r e a m f r o m t h e m e d u l l a r y t i s s u e o f t h e s u p r a r e n a l g l a n d . R e c e n tw o r k h a s made i t p r o b a b l e t h a t a d r e n a l i n e i s a l s o l i b e r a t e d a s t h e t r a n s m i t t e rs u b s t a n c e a t t h e a d r e n e r g i c n e r v e e n d i ng s o f t h e s y m p a t h e t i c s y s t e m [ L o e w i &N a v r a t i l , 1 9 2 6 ; Gaddum & S c h i l d , 1 9 3 4 ] . A f t e r s e r v i n g i t s p h y s i o l o g i c a l p u r p o s ea d r e n a l i n e i s r a p i d l y d e s t r o y e d ; b u t i t i s n o t known how t h i s d e s t r u c t i o n t a k e sp l a c e .


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ADRENALINE AND ADRENOCHROMEA d r e n a l i n e i s v e r y r e a d i l y a u t o x i d i z a b l e i n v i t r o . T h e a s s u m p t i o n h a s t h e r e -f o r e o f t e n b e e n made t h a t a d r e n a l i n e i s a l s o d e s t r o y e d b y a u t o x i d a t i o n i n t h eb o d y ; b u t t h i s h a s b e e n made i m p r o b a b l e , s i n c e i t h a s b e e n s h o w n t h a t t h e t i s s u e sc o n t a i n a n i n h i b i t o r w h i c h i s v e r y e f f i c i e n t i n p r o t e c t i n g a d r e n a l i n e f r o m

a u t o x i d a t i o n [ W i l t s h i r e , 1 9 3 1 ; W e l c h , 1 9 3 4 ; H e a r d & W e l c h , 1 9 3 5 ] .B l a s c h k o e t a l . [ 1 9 3 6 ; 1 9 3 7 ] h a v e r e c e n t l y s h o w n t h a t a d r e n a l i n e i s d e s t r o y e dby a n e n z y m e , a d r e n a l i n e o x i d a s e , w h i c h i s p r e s e n t m a i n l y i n l i v e r , k i d n e y a n di n t e s t i n e . T h i s e n z y m e i s n o t i n h i b i t e d b y c y a n i d e a n d o x i d i z e s t h e a d r e n a l i n em o l e c u l e i n t h e s i d e c h a i n .I n t h e p r e s e nt i n v e s t i g a t i o n a d r e n a l i n e w a s f o u n d t o b e r a p i d l y o x i d i z e d b yc y t o c h r o m e a n d b y t h e i n d o p h e n o l o x i d a s e - c y t o c h r o m e s y s t e m . T h e o x i d a t i o np r o d u c t a d r e n o c h r o m e , a l t h o u g h a c t i v e a s a n o x i d a t i o n c a r r i e r , w a s c o m -p a r a t i v e l y i n a c t i v e a s a v a s o c o n s t r i c t o r . T h e i n d o p h e no l o x i d a s e - c y t o c h r o m es y s t e m i s known t o b e p r e s e n t i n p r a c t i c a l l y a l l a n i m a l t i s s u e s . T h i s s u g g e s t s a na n a l o g y w i t h t h e c h o l i n e e s t e r a s e s y s t e m w h i c h i n a c t i v a t e s t h e t r a n s m i t t e rs u b s t a n c e o f t h e c h o l i n e r g i c n e r v e e n d i n g s .O f t h e s y m p a t h o m i m e t i c d r u g s w h i c h h a v e b e e n t e s t e d i t i s s i g n i f i c a n t t h a tt h o s e w h i c h a r e known t o b e m o s t r a p i d l y d e s t r o y e d i n v i v o w e r e a l s o t h e m o s tr a p i d l y o x i d i z e d b y t h e i n d o p h e n o l o x i d a s e - c y t o c h r o m e s y s t e m .P h y s i o l o g i c a l a c t i o n s o f a d r e n a l i n e . I t h a s b e e n s h o w n q u a l i t a t i v e l y t h a tu n d e r c e r t a i n c o nd i t i o ns a d r e n a l i ne i s r a p i d l y c o n v e r t e d i n t o a d r e n o c h r o m ew h i c h c a n a c t a s a n o x i d a t i o n c a r r i e r f o r t h e c o e n z y m e I d e h y d r o g e n a s e s y s t e m so f l a c t i c a n d m a l i c a c i d s . T h e q u e s t i o n a r i s e s w h e t h e r t h i s a c t i o n o f a d r e n o -c h r o m e c a n b e e f f e c t i v e a t c o n c e n t r a t i o n s w h i c h a r e o f p h y s i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e .S t e w a r t & R o g o f f [ 1 9 2 2 ] e s t i m a t e d t h e n o r m a l c o n c e n t r a t i o n o f a d r e na l i ne i nt h e b l o o d o f t h e c a r o t i d a r t e r y a s 1 0 - 9 . I n t h e s u p r a r e n a l v e i n t h e y f o u n d n o r m a lc o n c e n t r a t i o n s o f a b o u t 2 x 1 0 - 6 w h i c h r o s e t o 1 0 - a f t e r a n i n j e c t i o n o f s t r y c h -n i n e . T h e hum a n s u p r a r e n a l m e d u l l a s c o n t a i n a b o u t 9 m g . o f a d r e n a l i n e w h i c h i nm u s c u l a r f a t i g u e c a n b e d i s c h a r g e d w i t h i n a f e w h o u r s . I f i t i s t a k e n t h a t 1 m g .c a n b e d i s c h a r g e d i n t h e c o u r s e o f a s h o r t s p e l l o f m u s c u l a r e f f o r t t h i s r e p r e s e n t sa c o n c e n t r a t i o n o f 2 x 1 o - 7 i n 5 l i t r e s o f b l o o d .I n t h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d o n t h e m a l i c d e h y d r o g e n a s e s y s t e m a d r e n a l i n ee x e r t e d a c a r r i e r a c t i o n t h a t w a s m e a s u r a b l e i n v i t r o a t c o n c e n t r a t i 9 n s down t o6 x 1 o - 7 . I t i s h a r d l y t o b e e x p e c t e d t h a t t h e c o n d i t i o n s o f t h e s e e x p e r i m e n t sw e r e p h y s i o l o g i c a l l y o p t i m a l . T h e g e n e r a l e x p e r i e n c e w i t h o x y g e n c a r r i e r s s u c ha s c y t o c h r o m e a n d l a c t o f l a v i n i s t h a t f a r h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s a r e r e q u i r e d t oo b t a i n a n o x y g e n u p t a k e m e a s u r a b l e i n v i t r o t h a n a r e n e c e s s a r y i n t h e l i v i n g c e l l .I t c a n t h e r e f o r e b e c o n c l u d e d t h a t t h e c a r r i e r a c t i o n o f a d r e n o c h r o m e m a y c o m ew i t h i n t h e r a n g e o f p o s s i b l e p h y s i o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n s . I n r e c o n s t r u c t i n g t h ec o m p l e t e s y s t e m i n v i t r o , c y a n i d e w a s n e c e s s a r y f o r t h e r e m o v a l o f o x a l o a c e t i ca c i d ; b u t t h e e s s e n t i a l s t a g e s o f t h e o x i d a t i o n c o u l d a l s o b e c a r r i e d o u t i n d i -v i d u a l l y i n t h e a b s e n c e o f c y a n i d e . T h e e n z y m e s a n d s u b s t a n c e s d e s c r i b e d a r eknown t o b e p r e s e n t i n mammalian m u s c l e , a n d t h e r e i s n o known r e a s o n whyt h e r e a c t i o n s d e s c r i b e d s h o u l d n o t a l s o o c c u r i n v i v o .C l e a r l y t h e c a r r i e r a c t i o n d e s c r i b e d c a n h a v e n o t h i n g t o d o w i t h t h e v a s o -c o n s t r i c t o r a c t i o n o f a d r e n a l i n e w h i c h i s s h a r e d b y m a ny o t h e r p h e n y l e t h y l -a m i n e d e r i v a t i v e s ; b u t a d r e n a l i n e h a s a n u m b e r o f o t h e r a c t i o n s a f f e c t i n g m e t a -b o l i c p r o c e s s e s i n w h i c h t h e c o e n z y m e a n d d e h y d r o g e n a s e s y s t e m s a r e i n t i m a t e l yc o n c e r n e d . T h e q u e s t i o n w h e t h e r a n y p a r t o f t h e p h y s i o l o g i c a l a c t i o n o fa d r e n a l i n e c a n b e a t t r i b u t e d t o t h e c a r r i e r a c t i o n o f a d r e n o c h r o m e r e m a i n s f o rf u r t h e r i nv e s t i g a t i o n t o d e c i d e .

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6 1 6 D . E . GREEN AND D . RICHTERSUMMARY

A d r e n a l i n e i n d u c e s a v i g o r o u s o x y g e n u p t a k e when a d d e d i n l o w c o n c e n t r a -t i o n s t o t h e r e c o n s t r u c t e d l a c t i c a n d m a l i c d e h y d r o g e n a s e s y s t e m s o f h e a r tm u s c l e . T h i s e f f e c

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David Ezra Green and Derek Richter- Adrenaline and Adrenochrome