Zbl. Vet. Med. B, 21, 385 - 388 (1974) @ 1974 Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg ISSN 0044-4294/ASTM-Coden: ZVRBA2

1-urze Mitteilungen

Aus der Akademie des Sanitats- und Gesundheitswesens der Bundeswehr Kommandeur: Generalarzt Dr. Zimmer

Der FA-Test als Schnellmethode zum Nachweis von Bacillus larvae

Von

W. AHRENS

M i t 2 Tabellen

(Eingegangen am 2 . Februar 1974)

Zur Oberprufung der Frage, ob und in welchem Ausmaf3 importierter Honig mit Bacillus larvae, dem Erreger der bosartigen Faulbrut der Bienen, kontaminiert ist, wurde nach einem Verfahren gesucht, den Keim moglichst schnell und sicher aus eingesandten Proben isolieren zu konnen. Es wurde versucht, spezifische Bacillus larvae-Antiseren herzustellen, die sich fur die Herstellung von Fluoreszenz-markierten Antikorpern eignen. Methode und Ergebnisse dieses Versuchs sollen hier dargestellt werden.

Gewinnung spezifischer Antiseren Fur die Immunisierung der Versuchstiere wurde als Antigen der Stamm

Bacillus larvae ATCC 9545 verwendet, der als viertagige Kultur mit physio- logischer Kochsalzlosung vom Nahrboden abgeschwemmt und dann im Photo- meter bei 546 nm auf 60 O / o Absorption eingestellt wurde. Diese Bakterienkon- zentration wird wahrend der weiteren Ausfuhrungen als Standard-Antigen bezeichnet. Als Versuchstiere dienten Kaninchen, denen die Lebendkultur i. v. appliziert wurde. Um festzustellen, unter welchen Bedingungen ein moglichst hoher Titer gegen Bacillus larvae zu erzielen ist, wurden vier Gruppen zu je vier Versuchstieren gebildet, die jeweils einem abgeanderten Verfahren unter- worfen wurden.

Die Tiere der Gruppe Z wurden in 7tagigem Intervall dreimal immuni- siert, wobei die Standard-Antigen-Dosis bei der ersten Injektion 0,25 ml, bei der zweiten 0,5 ml und bei der dritten Injektion 1,0 ml betrug.

In der Gruppe ZZ wurden Anzahl und Menge der Standard-Antigen- Dosen von Gruppe I beibehalten, das Intervall zwischen den Impftagen von 7 auf 4 Tage verkurzt.

Bei Gruppe ZZZ blieben das Intervall von 4 Tagen und die dreimalige Antigen-Dosis wie bei Gruppe I1 bestehen. Die Impfdosis wurde verdoppelt, so dai3 bei der ersten Impfung 0,5 ml, bei der zweiten 1,O ml und bei der dritten 2,0 ml injiziert wurden.

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Gruppe

Anzahl der Antigengaben

Antigendosis pro lrnpfung in ml

Interval1 zwischen den lrnrnunisierungen

In der Gruppe ZV erhohte sich die Anzahl der Standard-Antigen-Dosen von 3 auf 5. Es wurden bei der ersten Injektion 0,5, dann 1,0 und bei den letzten Injektionen je 2,0 ml injiziert.

Alle Tiere wurden vier Tage nach der letzten Immunisierung getotet, entblutet und anschliei3end dem Serum zur Konservierung Merthiolat 1 : 10 000 zugesetzt. Zur Feststellung der Titerhohe wurden Verdunnungen von 1 : 20 bis 1 : 10 240 hergestellt, Standard-Antigen zugesetzt und fur 18 bis 20 Stunden bei + 37 O C inkubiert. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind aus der nachfolgenden Tabelle zu ersehen.

Die obenstehende Aufstellung 1ai3t erkennen, dai3 mit den Versuchsan- ordnungen der Gruppen I und I1 erheblich geringere Titerhohen zu erreichen sind, als mit den Immunisierungsmethoden der beiden letzten Gruppen. Die Seren der Gruppe IV zeigen gegenuber denen der Gruppe I11 trotz haufigerer und hoherer Antigengabe keinen Titeranstieg. Die Seren der ersten beiden Gruppen wurden wegen des niederen Titers nicht fur eine Fluoreszenzmarkie- rung verwandt. Nur die Seren der Kaninchen von Gruppe I11 und Gruppe IV erschienen in ihrem Titer hoch genug, um sie zur Herstellung von Konjugaten

I I1 111 I V

3 3 3 5

1. 0,25 1. 0,25 1. 0,5 1. 0,s 2. 0,s 2. 0,5 2. 1,0 2. 1,O 3. l,o 3. 1,o 3. 2,0 3. 50 4. - 4. - 4. - 4. 50 5. - 5. - 5. - 5. 2,o

I Tage 4 Tage L Tage 4 Tage

Gruppe I Serum Nr. 1

2 3 4

Gruppe II Serum Nr. 1

2 3

20 LO 80 160 320 640 1280 2560 5120

I I I I I I I I I 1 I I

I 1 t t t t I t t t t I t t t + t t t l t t t l t 0 0 I 0 t t t 4 t + t I t t t + + t i t t 1 t t 0 I 0 ; 0 t t t t ~ t t t t ~ t t + ttt1 t t I t + t I 0 I 0 t t t t I t t t t I t + t t t t I t t t I t 0 I 0 , 0

I I I I

I I I I I I

tttt1tttt:tttt t t t ; + * + I t t 0 I 0 0 t t t t 1 t t + t I + t t t t + I t t 1 0 0 0 I 0

I 1 1 1 t t t+I t t t t I t t+ + + + I t + I t t 0 I 0 I 0

- 10240 Konlrolle

Serum

0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0

Antigr

0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

L

Gruppe 111 Serum Nr. 1

2 3 L

Gruppe I V Serum Nr. 1

2 3 4

t t t j + t t ! t t 0 j 0 i 0 0 j 0 j 0 0 I I I I I I I I I I I 1

+ t + t ~ t t t t ~ t t t + t t t t ~ t t t h t t t t t t t h t t t h t + t t t t t t *I+ t t t;+ t + t

, I I I

I 1 t t t * I t + t + I t t t t

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0 0 0 - 0

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I I I I I I I I

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t 0 ; 0 0 1 0 0 t + t t ~ t t t t I t t t t + + t t I t + t + I t t t t t t t t I t t I 0

Der FA-Test zum Nachweis von Bacillus larvae 387

zu verwenden. Das Serum 3 der Gruppe IV wurde wegen seiner geringen Titerhohe hiervon ebenfalls ausgeschlossen.

Herstellung der Konjugate Die Ausfallung der Globuline erfolgte nach einem von WITZ et al. (2) be-

schriebenen Verfahren. Es wurden je 20 ml Serum 40 O/o gesattigte Natrium- sulfatlosung zugesetzt und das Prazipitat nach zwei Stunden Ruhren 20 Minu- ten in der Kuhlzentrifuge bei 1600 g zentrifugiert. Der Oberstand wurde de- kantiert und das Sediment in 2 ml phys. NaCl gelost. Nach zweimaliger Wie- derholung des Vorganges wurde das geloste Globulin gegen phys. NaCl sul- fatfrei dialysiert. Die Prufung auf moglicherweise noch vorhandene Sulfat- Ionen geschah rnit 1 O/o-BaCl,-Losung.

Die Globulin-Losung wurde mit 0,5 M Carbonat-Puffer von pH 9,7 auf p H 9,4 eingestellt und dann 1 mg FITC pro 50 mg Globulin zugegeben. Nach lostundigem Ruhren bei + 4 O C wurde bei 17 100 g fur 1 Stunde zentrifugiert. Die Reinigung des Oberstandes erfolgte chromatographisch mit Sephadex G 50 COARSE, das rnit 0,02 M Phosphat-Puff er von p H 8,O aquilibriert war.

Priifung der Spezifitat Um die Spezifitat der Konjugate gegenuber Keimen zu uberprufen, die

haufiger in der Umgebung von Bienen vorkommen, wurden 45 Honigproben, Waben und Bienen bakteriologisch untersucht und die isolierten Bazillen nach KUNDRAT (1) bestimmt. Dabei konnten folgende Keime isoliert werden:

Bacillus subtilis Bacillus megaterium Bacillus licheniformis Bacillus pumilis Bacillus sphaericus Von diesen Keimen und einem Stamm Bacillus alvei wurden Ausstriche

angefertigt und gegen die hergestellten Konjugate auf ihre Spezifitat gepruft. Zur Positivkontrolle und zur Bestimmung der Gebrauchsverdunnung der Kon- jugate diente der ATCC-Stamm von Bacillus larvae. Als Gebrauchsverdun- nung galt diejenige Verdunnung des Konjugates, die in der nachsthoheren Verdunnungsstufe noch eine gute Brillanz ergab. Die Verdunnungsreihe be- stand aus den Stufen 1 : 0, 1 : 1, 1 : 2, 1 : 4, 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40 und 1 : 80.

Die Ausstriche wurden fur 20 Minuten in gekuhltem Aceton fixiert, rnit den Verdunnungsreihen der einzelnen Konju ate uberschichtet und fur 45 Minuten in einer feuchten Kammer mit +37 C gehalten. Nach zweimali- gem Wassern fur 5 Minuten in Aqua dest. wurden die Praparate im Dunkel- feld bei UV-Beleuchtung betrachtet.

Im verdunnten Zustand (1 : 0) zeigten die Konjugate 1 und 2 der Gruppe 111 unspezifische + + + Reaktionen mit Bacillus licheniformis, die in beiden Fallen bereits bei einer Verdunnung von 1 : 2 nicht mehr beobachtet werden konnten. Alle anderen Konjugate reagierten schon im unverdunnten Zustand nur mit Bacillus larvae.

Unspezifische Reaktionen, die zur Aufhellung des Hintergrundes fuhr- ten, konnten weitgehend dadurch eliminiert werden, dai3 die Kulturen zuerst zweimal in phys. NaCl gewaschen und erst dann auf die Objekttrager ge- bracht wurden.

Die Gebrauchsverdiinnung aller untersuchten Konjugate lag zwischen 1 : 10 und 1 : 20. Auch hier konnte wie bei der Feststellung der Titerhohe kein signifikanter Unterschied zwischen den Seren von Gruppe I11 und IV

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wahrgenommen werden, obwohl Gruppe IV eine hijhere Antigenmenge enthielt.

Diese Ergebnisse lassen trotz der geringen Anzahl der Versuchstiere pro Gruppe den Schlui3 zu, dai3 mit den Methoden der Gruppen I11 und IV genugend hohe Titer erzeugt werden, um spezifische Konjugate zum fluores- zenzmikroskopischen Nachweis von Bacillus larvae herzustellen.

Zusammenf assung Es wird eine Methode beschrieben, diagnostische Antiseren gegen Bacillus

larvae herzustellen. Hierbei erwies sich eine dreimalige Antigengabe mit viertatigem Interval1 als optimal. Die Impfdosis betrug bei der ersten Injek- tion 0,5 ml, bei der zweiten 1,0 ml, bei der dritten Impfung 2,O ml. Diese Seren wurden zu FITC-markierten Globulinen aufbereitet und ihre Spezifitat gegenuber verschiedenen anderen Bacillus-Arten uberpruft. In der Gebrauchs- verdunnung der Konjugate konnte keine unspezifische Reaktion gegeniiber diesen Keimen festgestellt werden.

Summary The fluorescent antibody test as a rapid method of demonstrating

Bacillus larvae A method is described for preparing diagnostic antisera against Bacillus

larvae. The results showed that three doses of antigen a t intervals of four days was optimal. The inoculation dose at the first injection was 0.5 ml. at the second 1.0 ml. and at the third injection 2.0 ml. These sera were processed to produce FITC-labelled globulins and their specificity to various other Bacillus species was tested. At the dilutions of the conjugate employed there was no nonspecific reaction to this organism.

Literaturverzeihnis 1. KUNDRAT, W., 1963 : Zur Ditferenzierung aerober Sporenbildner (Genus Bacillus Cohn).

2. WITZ, J,, Y. YAGI and D. PRESSMANN, 1968: Availability of Isoantigens to Circulating Zbl. Vet. Med. B, 10, 418-426.

Antibodies. J. Immunol. 101, 217-223.

Anschrift des Verfassers: Dr. W. Ahrens, OFVet, 8 Miinchen 40, Infanteriestrak 17.