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DESENVOLVIMENTO DO MODELO 3D DA DERME EQUIVALENTE IN VITRO PARA AVALIAR A ENTREGA DO FOTOSSENSIBILIZADOR
H. L. Ma a, T. F. L. Moraisa, C. Bernalb, V. C. A. Martinsb, A. M. G. Plepisa,b, J. R. Perussia,b aPrograma de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia EESC/FMRP/IQSC,
Universidade de São Paulo, São Carlos, SP, Brazil bInstituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, SP, Brazil
Instituto de Química de São Carlos - IQSC-USP; Avenida Trabalhador São-carlense, 400 -
CEP 13566-590; [email protected]
RESUMO
O sistema tridimensional (3D) de culturas celulares tem sido considerado um
modelo alternativo para completar a lacuna entre os estudos in vitro e in vivo para os
ensaios citotóxicos. Devido à similaridade de cultura celular 3D com a arquitetura
morfológica do tecido que pode fornecer as previsões próximas à resposta in vivo. O
nosso objetivo foi desenvolver uma derme equivalente in vitro utilizando uma esponja
de colágeno com cultura de células para investigar a entrega de Hipericina (HY). A
microscopia eletrônica de varredura mostrou que a esponja de colágeno hidrolisado
possui os poros distribuídos com tamanho de 68,37±13,83 μm. O material não é
citotóxico para as células de fibroblasto Vero. A microscopia confocal exibiu a
fluorescência da HY distribuída na derme e, principalmente, nas fibras de colágeno,
após 2h de aplicação. Concluiu-se que o suporte desenvolvido foi um biomaterial
adequado para o modelo 3D de cultura de células.
Palavras-chave: colágeno, derme equivalente, fotossensibilizador.
INTRODUÇÃO
A cultura celular está cada vez mais difundida, isso deve à versatilidade dessa
metodologia, além de ser baixo custo em comparação com o uso de animais nos
testes, também possibilita o controle dos parâmetros experimentais e proporciona
boa reprodutividade (1). Contudo, atualmente, em boa parte dos testes pré-clínicos
para aprovação das drogas ou produtos cosméticos requer os testes com células e in
vivo (2). Embora os sistemas convencionais da cultura bidimensional têm sido
amplamente aplicados para o melhor entendimento da fisiologia celular e as reações
das células diante do estímulo, entretanto, devido à ausência da matriz extracelular
impossibilita as interações da célula-célula e célula-matriz para desenvolver a
diferenciação, proliferação e função celular (3). Dessa forma, a cultura celular
tridimensional (3D) foi proposta como uma etapa a fim de aproximar às condições in
vivo.
A cultura celular 3D utilizando um suporte ou matriz mimetiza tecido in vivo. Os
materiais destacados para suporte são agarose, colágeno, gelatina, laminina,
vitonectina e polímeros sintetizados (4). Dependendo da natureza do estudo, existem
requisitos na escolha do suporte cujo material deve ser não citotóxico, além disso, é
necessário fornecer a morfologia e comportamento fisiológico apropriados às células
cultivadas. Portanto, as características como a porosidade, fibra, permeabilidade e
estabilidade da matriz 3D são essenciais para criar um microambiente ativado à
proliferação e aderência das células (5).
A sobrevivência prolongada das células nos modelos 3D é a maior vantagem
da engenharia dos tecidos que pode servir como alternativa para o uso dos animais
nos desenvolvimentos das drogas para diversas terapias na medicina 6. Estudo
mostrou que há diferença da cultura celular 3D na predição da eficácia da droga que
induz a hepatoxicidade, uma vez que os hepatócitos humanos e do rato cultivados 3D
foram menos suscetíveis ao metotrexato do que em cultura 2D, isso comprova a
melhor confiabilidade para testes de drogas (7,8).
O colágeno tipo I é comumente usado no sistema da cultura 3D, devido à
facilidade na preparação, baixo custo e não ser citotóxico às células. Além disso, o
tamanho e a densidade dos poros podem ser controlados através da concentração
do colágeno ou adição de compostos cross-linking para alterar as propriedades do
gel (9). A derme é composta predominantemente por uma matriz extracelular de fibras
de colágeno entrelaçadas, na qual os fibroblastos, que é o principal tipo de células da
derme, produz colágeno para manter a estrutura (10). Assim, a cultura 3D dos
fibroblastos, Vero, utilizando uma esponja de colágeno biomimetiza a camada derme
da pele. O objetivo do presente estudo visou à formação do modelo 3D da derme
equivalente in vitro para estudar a entrega do fotossensibilizador no tecido biológico.
MATERIAIS E MÉTODOS
Esponja de colágeno
Utilizou-se uma placa de teflon com 72 poços e colocou-se 0,5 g de gel de 1,1%
de colágeno Tipo I de origem serosa porcina em cada poço. O gel foi congelado
lentamente com nitrogênio líquido, e posteriormente, levado à liofilização por 12h.
Em seguida, as esponjas de colágeno foram colocadas individualmente nos
cassetes histológicos e mergulhadas na solução de bicarbonato de sódio 1 mol L-1
por 36 h visando neutralizar os grupos de carboxiamida do colágeno tipo I. Após
esse período, os cassetes com esponja foram mantidos na água deionizada para
retirar o sal formado depois da neutralização. As esponjas de colágeno foram
removidas do cassete e liofilizadas novamente para a esterilização com o gás óxido
de etileno (C2H4O).
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
A Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) utilizada para visualizar as
cavidades formadas na esponja de colágeno foi feita com um equipamento ZEISS
LEO 440 (Cambridge, Inglaterra) com detector OXFORD (modelo 7060), operando
com feixe de elétrons de 15 kV. As amostras foram recobertas com 6 mm de ouro em
um metalizador Coating System BAL-TEC MED 020 (BAL-TEC, Liechtenstein) e
mantidas em dessecador até o momento de análise. Condições de metalização:
pressão na câmara = 2x10-2 mbar; corrente = 60 mA; taxa de deposição 0,60 nm s-1).
As amostras foram colocadas na porta amostra de alumínio para a observação.
Cultura celular
A linhagem celular de células epiteliais fibroblastos de rim de macaco verde
africano VERO (ATCC CCL-81) foi cultivada e aderida ao substrato sólido consistindo
da garrafa de polipropileno com área de 25 cm2 plana em 5 mL de meio de cultura
Dulbecco modificado por Iscove’s com 10% de soro fetal bovino (SFB) e antibióticos
penicilina 10 000 U.I. mL-1 e estreptomicina 10 mg mL-1. As células foram mantidas
em estufa a 37°C e 5% CO2.
Ensaio de citotoxidade pelo método de difusão em ágar
Um volume de 5 mL da suspensão de células Vero, na concentração de 3,0 x
105 células mL-1, foi semeado em placa de Petri (15x60 mm) e, incubado durante 48h
a 37°C e 5% CO2. Após esse período, o meio de cultura foi sugado e adicionado 5 mL
do meio “overlay” em cada placa de Petri a uma temperatura aproximadamente 44°C.
Este meio é composto por 38 mg mL-1 de Muller Hinton Agar (HIMEDIA) contendo
0,01% de vermelho neutro e, foi previamente preparado e auto clavado.
Os materiais: papel de filtro e látex, foram cortados em fragmento com área
cerca de 0,25 cm2 e colocados no meio da placa de ágar, esses serviram como
controle negativo e positivo, respectivamente, do experimento. Para investigar a
citotoxidade das esponjas de colágeno, esta foi colocada no meio da placa de ágar.
Todas as placas de ágar com matérias de estudo foram incubadas novamente na
estufa de 37°C e 5% CO2 por 24h.
As placas foram avaliadas macroscopicamente quanto a presença de halo e
microscopicamente quanto a integridade celular ao redor da amostra. A característica
de toxicidade foi constatada pela presença de um halo claro ao redor do material
testado. Este halo é observado quando há lise e morte das células, liberando o
corante vermelho neutro incorporando nas células, dando um aspecto transparente
ao local. A citotoxidade foi constatada pela medida do diâmetro deste halo claro
formado medido com uma régua milimétrica.
Formação da derme equivalente in vitro através da cultura celular 3D
Numa placa de petri com meio de cultura, colocaram-se as esponjas para
umedecer por 2h. Em seguida, as esponjas foram transferidas separadamente para
placas de cultura de 24 poços. O meio de cultura em excesso na superfície foi
sugado com agulha cuidadosamente. Adicionou-se 100 μL de suspensão celular
1x106 células mL-1 em cima da esponja umedecida, após isso, a placa foi incubada
por 15 min para acomodação das células. Adicionou-se mais 100 µL de meio de
cultura para manter as células úmidas e as placas foram armazenadas na estufa de
cultura por 30 minutos. Logo após, adicionou-se mais 2 mL de meio e as placas
foram incubadas a 37°C e 5% de CO2 por 7 dias com a troca do meio no terceiro dia
da incubação. No sétimo dia, formou-se a derme reconstituída. O protocolo da
formação de derme reconstituída foi previamente determinado e testado por Anna
Cecília Bezerra de Oliveira, ex-aluna de mestrado da Profa. Dr. Janice Rodrigues
Perussi.
Ensaio de Permeação de hipericina na derme reconstituída
Empregou-se a derme equivalente in vitro para proceder ao ensaio de
permeação, logo no sétimo dia da cultura tridimensional celular, o meio de cultura foi
sugado com o auxílio de uma agulha e bomba a vácuo, adicionando-se 2 mL do meio
de cultura sem vermelho fenol, depois de 2 h de incubação, retirou-se o meio de
cultura que fica na parte superior da derme e, aplicou 20 μL de Hipericina 10 μg mL-1
em PEG 400 (estéril). Paralelamente, adicionou-se 20 μL de PEG 400 (estéril) na
outra derme formada, a qual serviu como o controle do ensaio.
O resultado da permeação foi avaliado pela microscopia Confocal de
fluorescência Zeiss (modelo LSM 780 invertido) utilizando objetiva Plan-Apochromat
M27 com aumento de 20X e abertura numérica de 0,8. A excitação das amostras foi
realizada por um e dois fótons, (1P) e (2P), respectivamente, utilizando Laser de 800
nm para o colágeno e 594 nm para a Hipericina. A emissão foi coletada nas regiões
espectrais de 400 a 800 nm, com detecção em 2º harmônico em 400 nm para o
colágeno e 604 nm para hipericina.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A esponja de colágeno foi obtida através da hidrólise alcalina do tropocolágeno,
durante a reação, os grupos de carboximidas presentes nos resíduos de asparagina
e glutamina são convertidos em carboxilatos cujas cargas negativas são
responsáveis pela alteração da morfologia do colágeno, uma vez que a repulsão
eletrostática dessas cargas promove a porosidade do biomaterial (11).
A Figura 1-A) é a imagem da MEV, a qual mostrou que o biomaterial obtido
apresentou uma distribuição homogênea dos poros, através do programa
computacional, Imagem tool, foi possível medir a distância entre os canais dos poros
foi 68±13,83 μm. Sabe-se que as células mamíferas possuem tamanho em torno de
11-18 μm (12), dessa maneira, a esponja de colágeno apresentou microambientes
adequados para o crescimento celular. Além disso, a Fig. 1-B) foi uma corte
transversal da esponja, na qual mostrou os canais verticais que evidenciou a
interligação entre os poros.
Figura 1. As imagens da microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) da
esponja de colágeno. 1-A) mostra a distribuição dos poros com tamanhos de 68±
13,83 μm. 1-B) é a corte transversal da esponja de colágeno que mostra as
interligações entre os poros. (Autoria própria)
Empregou-se o método de difusão em ágar para avaliar a citotoxidade do
biomaterial, através do contato direto da amostra em análise com a monocamada de
células Vero, os controles: positivo (látex) e negativo (papel de filtro), foram
estabelecidos como os parâmetros de avalição visual.
As Figuras 2 - A) e B) mostram as fotos das placas dos controles, a presença do
halo na placa com látex indica a morte celular ao redor do material. Ao contrário da
placa com papel de filtro, o halo não foi observado. A Figura 2- C. corresponde à foto
da placa com a esponja de colágeno, na qual não foi verificado o halo transparente,
assim, pode-se concluir que a esponja de colágeno não é citotóxica.
Figura 2. Teste de citotoxidade do biomaterial pelo método de difusão em ágar.
2-A) O controle negativo – papel de filtro que é um material não citotóxico; 2-B) O
controle negativo – Látex apresentou o halo ao redor do material citotóxico; 2-C) A
esponja de colágeno não apresentou o halo. (Autoria própria)
A Figura 3. trata-se de uma imagem da permeação de 10 μg mL-1 de hipericina
no veículo PEG 400, mostrando a emissão de fluorescência em 604 nm que foi
representada pela cor vermelha na imagem, dessa forma, pode-se concluir que a
maior parte da hipericina permeada ligou-se às fibras de colágeno, fato que
confirmou que a permeação topical da hipericina em PEG 400 ocorre através da
matriz extracelular (colágeno).
Figura 3. A imagem da microscopia Confocal da derme equivalente in vitro
formada pela cultura célula na esponja de colágeno, após 2h de incubação da
hipericina. Os sinais de fluorescência indicam: vermelho-hipericina e azul-colágeno.
(Autoria própria)
A hipericina é um fotossensibilizador que possui alto rendimento quântico de
formação de espécies reativas de oxigênio através da excitação luminosa para levar
as células tumorais à morte (13). Por outro lado, tanto no experimento que foi realizado
com derme equivalente in vitro quanto na literatura, comprovou-se que a hipericina
exibe a forte interação com o colágeno e pode ser um fotossensibilizador eficiente
para atuar nos tecidos ricos em colágenos como pele e córnea (14). Em destaque, os
canceres de bexiga, ovário, pâncreas, nasofaringe e pele, demostram resultados
positivos tratando com a terapia fotodinâmica empregando a hipericina (15).
O colágeno é a principal proteína constituinte da matriz extracelular em
diversas estruturas dos tecidos, dessa forma a sua manutenção e degradação podem
influenciar diretamente as funções biológicas, bem como o crescimento, proliferação,
diferenciação e migração das células (16). Além disso, os estudos mostram que a
alteração do colágeno interfere em alguns processos de tumorgênese como a
vascularização e metástase (17). À vista disso, o estudo da interação da hipericina
com o colágeno foi essencial a fim de melhorar o entendimento da forma de entrega
dessa molécula orgânica no tecido alvo. Uma vez que a entrega dos
fotossensibilizadores e a eficiência terapêutica dependem intrinsicamente do
microambiente onde localiza o tumor.
CONCLUSÕES
A esponja preparada a partir do gel de colágeno de origem serosa porcina
apresentou as propriedades morfológicas adequadas para cultura celular, além disso,
o material é biocompatível por não ser citotóxico às células fibroblastos Vero. Através
da aplicação da hipericina na derme equivalente in vitro, mostrou-se que a hipericina
se liga intensamente com as fibras de colágeno, este resultado sugeriu que a
hipericina pode ser um potente candidato de fotossensibilizador para aplicar nos
tecidos que constituem majoritariamente pelo colágeno.
AGRADECIMENTOS
Os autores gostariam de agradecer ao Central de Esterilização Comércio e
Indústria Ltda. - ACECIL, Campinas, por oferecer o serviço de esterilização do
material, ao Prof. Dr. Anderson Oliveira da UFABC pela obtenção da hipericina, ao
Centro de Pesquisa em Óptica e Fotônica (CePOF – Fapesp) pelo apoio financeiro
da pesquisa e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) por conceder a bolsa de estudo para Ma Hui Ling.
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DEVELOPMENT OF AN IN VITRO 3D CELL CULTURE MODEL TO
EVALUATE PHOTOSENSITIZER DERMIS DELIVERY
ABSTRACT
The three-dimensional system (3D) cell cultures has been considered an
alternative model to fill the gap between in vitro and in vivo studies to cytotoxic assays.
Due to the similarity of 3D cell culture with the morphological architecture of tissue
that can provide forecasts close to in vivo response. Our aim was to develop in vitro
dermis equivalent by cells culture in collagen sponge to investigate the hypericin
delivery. The scanning electron microscopy showed that the hydrolyzed collagen
sponge has pores distributed with size of 68.37 ± 13.83 micrometers. The material is
not cytotoxic to Vero fibroblast cells. After 2 hours of hypericin (HY) application,
Confocal microscopy showed HY fluorescence distributed in the dermis and
especially in collagen fibers. It was concluded that the scaffold developed was
suitable biomaterial for the 3D cell culture.
Key-words: collagen, equivalent dermis, photosensitizer.