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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS
DESENVOLVIMENTO E EMPREGO DE VACINAS NO CONTROLE DOS PROTOZOÁRIOS PARASITOS DE RUMINANTES
Marcelo Sales Guimarães
Orientadora: Profa. Dra. Andréa Caetano da Silva
GOIÂNIA
2011
ii
MARCELO SALES GUIMARÃES
DESENVOLVIMENTO E EMPREGO DE VACINAS NO CONTROLE DOS PROTOZOÁRIOS PARASITOS DE RUMINANTES
Seminário apresentado junto à disciplina
de Seminários Aplicados do Programa de
Pós-Graduação em Ciência Animal da
Escola de Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal de Goiás.
Nível: Doutorado
Área de Concentração: Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de Alimentos
Linha de Pesquisa: Parasitos e doenças parasitárias dos animais
Orientadora: Profa. Dra. Andréa Caetano da Silva – IPTSP/UFG
Comitê de Orientação: Profa. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis – IPTSP/UFG
Dra. Débora Pereira Garcia Melo – PNPD/EVZ/UFG
GOIÂNIA
2011
iii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 3
2.1 Aspectos importantes no desenvolvimento de vacinas ......................................... 3
2.2 Vacinas baseadas no agente vivo ......................................................................... 4
2.2.1 Theileria .............................................................................................................. 4
2.2.2 Toxoplasma gondii ............................................................................................. 7
2.2.3 Neospora caninum ............................................................................................. 8
2.2.4 Babesia .............................................................................................................. 9
2.3 Vacinas baseadas no agente inativado, subunidades e antígenos recombinantes
.................................................................................................................................. 10
2.3.1 Theileria ............................................................................................................ 10
2.3.2 Toxoplasma gondii ........................................................................................... 11
2.3.3 Neospora caninum ........................................................................................... 11
2.3.4 Cryptosporidium parvum .................................................................................. 13
2.3.5 Babesia ............................................................................................................ 14
2.3.6 Tritrichomonas foetus ....................................................................................... 15
2.3.7 Sarcocystis ....................................................................................................... 16
2.3.8 Eimeria ............................................................................................................. 17
2.4 Aspectos econômicos no desenvolvimento de vacinas ....................................... 17
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 19
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 20
1 INTRODUÇÃO
Os protozoários estão entre os mais bem sucedidos organismos no
mundo, sendo capazes de sobreviver e se multiplicar em uma grande variedade de
hospedeiros. As doenças causadas por estes parasitas causam perdas produtivas de
grande importância nos rebanhos, como falhas reprodutivas, redução no ganho de
peso, contaminação da carne e redução na produção de leite, podendo chegar à
perda do animal. Além disso, protozoários como Cryptosporidium parvum e
Toxoplasma gondii representam risco potencial à população humana por serem
agentes zoonóticos.
Os protozoários apresentam ciclos biológicos complexos nos organismos
hospedeiros. Por meio de mecanismos adaptativos, desenvolveram diferentes
estratégias para a evasão da resposta imune do hospedeiro, de modo que consigam
sobreviver, se multiplicar e diferenciar até que se complete seu ciclo de vida
(DALTON & MULCAHY, 2001). Em situações particulares, a resposta imune do
hospedeiro acaba por favorecer a estabilidade e permanência do protozoário no
organismo parasitado. Exemplos clássicos são N. caninum e T. gondii, que diante da
ação de citocinas pró-inflamatórias como interferon gama, se diferenciam em
bradizoítos, desacelerando sua multiplicação e se perpetuando no hospedeiro no
interior de cistos teciduais (INNES et al., 2007).
Entender a relação parasito-hospedeiro é fundamental para nortear o
desenvolvimento de drogas e produtos imunobiológicos eficazes no controle destes
protozoários. Os mecanismos pelos quais iniciam a infecção, se estabelecem e se
multiplicam no organismo hospedeiro, bem como os principais eventos que podem
levar a uma evolução da doença, são importantes para possibilitar o
desenvolvimento e a implementação racional de estratégias de intervenção
adequadas.
Uma vez iniciado o processo de invasão do organismo hospedeiro, os
protozoários são capazes de induzir tanto a resposta imune inata quanto a
adaptativa. A indução destas respostas imunes e a forma como estas funcionarão no
2 papel de debelar o ataque são críticos na determinação do resultado da infecção. A
compreensão de como o sistema imunológico é capaz de proteger o hospedeiro
contra uma variedade de patógenos é um componente vital na concepção de vacinas
eficazes (DALTON & MULCAHY, 2001).
O mercado de anti-parasitários é um dos setores que mais cresce no
segmento pecuário. Enquanto a pesquisa, o desenvolvimento e a re-formulação de
drogas para o tratamento de parasitas de animais ainda dominam este setor, a
demanda dos consumidores por alimentos livres de produtos químicos e de
preocupações relativas ao impacto ambiental e bem-estar animal motivam o
interesse crescente no desenvolvimento de vacinas seguras e eficazes (DALTON &
MULCAHY, 2001).
O uso de vacinas vai de encontro à tendência crescente e irreversível de
um sistema de produção de proteína de origem animal dentro dos preceitos da
sustentabilidade. Promovem o controle das enfermidades, reduzindo a dependência
de drogas farmacológicas e pesticidas. Assim, melhoram a saúde e o bem-estar
animal, contribuem para a saúde pública por atuarem no controle de agentes
zoonóticos e de patógenos de origem alimentar nos animais, além de solucionarem
problemas associados à resistência aos quimioterápicos. Este aspecto contribui
ainda na manutenção do ambiente livre de resíduos químicos (INNES et al., 2011).
Diante da importância dos efeitos deletérios que os protozoários provocam
na produção pecuária, e com o entendimento que a adoção de estratégias de
controle baseadas no uso de vacinas é de grande importância em um sistema
sustentável de produção, este seminário busca abordar questões relacionadas à
pesquisa, desenvolvimento e uso de vacinas no controle de protozoários parasitos de
ruminantes domésticos.
3 2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Aspectos importantes no desenvolvimento de vacinas
Vacinas são imunobiológicos que, administrados em um indivíduo,
apresentam capacidade imunogênica e conferem a este proteção contra desafios
com organismos patogênicos em condições naturais (INNES et al., 2011).
As vacinas em uso na atualidade são formuladas baseando-se em três
categorias principais: contendo uma versão enfraquecida do patógeno original
(vacinas vivas atenuadas); contendo o patógeno morto (vacinas inativadas), ou parte
do patógeno (vacinas de subunidade). Recentemente, vacinas baseadas em ácido
nucléico foram desenvolvidas, chamadas recombinantes, onde o DNA que codifica
um importante gene do patógeno é diretamente transcrito e traduzido em um vetor
plasmidial e, então, administrado ao animal hospedeiro, induzindo-lhe imunidade
contra o patógeno de origem (INNES et al., 2011).
O uso do agente patogênico vivo, inativado, ou mesmo de seus
fragmentos antigênicos, objetiva induzir uma resposta imune efetiva, simulando uma
infecção natural e produzindo uma memória capaz de proteger o organismo
hospedeiro diante de um desafio real com maior rapidez e eficiência (INNES et al.,
2007; INNES et al., 2011).
Outro ponto de vital importância no sucesso de uma vacina é o
componente que desempenha papel de adjuvante na formulação, especialmente em
vacinas a partir de antígenos inativados ou recombinantes. Dentre as alternativas já
relatadas, têm destaque a associação dos antígenos a organismos vetores, como
Escherichia coli ou partículas virais (vaccínia vírus), a fusão em peptídios
hidrofóbicos ou moléculas lipídicas e a utilização de complexos imunoestimulantes
(ISCOMs), que são emulsificações a base de moléculas de colesterol, fosfatidilcolina
e saponina purificada (Quil A) (WIKMAN et al., 2005).
4
O processo de invasão do organismo hospedeiro desencadeia diferentes
respostas imunes, trazendo consequências distintas na relação parasito-hospedeiro.
Enquanto determinados tipos de resposta atuam na proteção do organismo contra a
invasão e o ataque, outros tipos acabam por provocar danos graves aos tecidos
devido ao processo de imunopatogenia da doença, como severos processos
inflamatórios em órgãos vitais. Uma vacina eficaz atuará para estimular a proteção
do hospedeiro sem agravar a imunopatogenia (INNES et al., 2007, INNES et al.,
2011).
2.2 Vacinas baseadas no agente vivo
O uso de vacinas a partir do agente vivo atenuado tem grande sucesso na
indução de imunidade protetora contra alguns protozoários. Esta modalidade de
vacina é a que mais se aproxima da infecção natural. De maneira mais eficaz,
promove uma ativação de resposta mediada por células T, por meio do
processamento intracelular adequado do agente invasor pelas células
apresentadoras de antígeno, em associação com MHC classes I e II (INNES et al.,
2011).
2.2.1 Theileria
Agente etiológico da Febre da Costa Leste Africana ou Febre da Costa
Oriental (East Coast Fever), Theileria parva é um protozoário intracelular que utiliza
como vetor carrapatos do gênero Rhipicephalus. Foi desenvolvida nos anos 70 uma
estratégia de imunização em associação a um esquema terapêutico, onde os
bovinos eram inoculados com uma dose definida de esporozoítos criopreservados
(uma diluição de 1:80 da solução original de aproximadamente 5,9x104 parasitos)
5 concomitantemente à administração de oxitetraciclina na formulação de longa ação
(RADLEY et al., 1975; DI GIULIO et al., 2009). Tal dose corresponde à quantidade
de parasitos presentes nos ácinos das glândulas salivares de carrapatos alimentados
em bovinos naturalmente infectados e é considerada fatal em animais que não
recebem o protocolo terapêutico adequado (DI GIULIO et al., 2009). Esta inoculação
simultânea da droga e do agente atenua o desenvolvimento do parasito no
organismo, proporcionando ao sistema imune o tempo necessário ao
desenvolvimento de imunidade sólida contra o agente (MORZARIA et al., 1987).
O uso dessa estratégia perdura até a atualidade, principalmente no leste
do continente africano, apesar de oferecer alguns riscos e limitações na sua
utilização. Requer estrutura no preparo dos lotes de esporozoítos, apresenta risco de
contaminação por outros patógenos, visto que tem seu preparo a partir de material
de animais naturalmente infectados, e demanda um sistema de resfriamento
constante, pois deve ser administrada dentro de curto período após a retirada do
nitrogênio líquido, o que reduz sua aplicabilidade a campo (MORRISON &
MCKEEVER, 2006; KATZER et al., 2007).
Atualmente, pesquisas estão em desenvolvimento na busca por uma
vacina recombinante que apresente, além de eficácia satisfatória, custo reduzido e
meio de conservação menos exigente, melhorando sua viabilidade de aplicação.
Ainda não existem publicações que garantam níveis adequados de imunização para
estas vacinas recombinantes, suficientes para subsidiar a comercialização. Diante
disso, têm-se priorizado a busca de melhorias na tecnologia atual do método de
infecção-tratamento (DI GIULIO et al., 2009).
A imunização de bovinos contra T. annulata, agente da Theileriose
Tropical, adota estratégia diferente, também a partir do agente vivo. Em situação
natural, uma vez infectados, os leucócitos hospedeiros são induzidos a uma
proliferação clonal onde multiplicam-se também os parasitos diferenciados em
esquizontes. Assim, essa sincronização entre divisão da célula hospedeira e do
parasito possibilita sua proliferação protegido em ambiente intracelular (INNES et al.,
2011).
6
A partir do emprego de técnicas de cultura de células in vitro, cultivam-se
leucócitos bovinos infectados por esporozoítos de T. annulata. Estas células
transformadas são mantidas por passagens sucessivas em laboratório tornando-se
atenuadas, ou seja, não capazes de produzir sinais clínicos aos animais quando
inoculadas, bem como são incapazes de se diferenciar em merozoítos quando
ingeridas pelo carrapato. Estes aspectos conferem segurança na utilização de
linhagens de células transformadas in vitro como vacinas (INNES et al., 2011).
Esta estratégia de imunização consiste na inoculação de células
cultivadas in vitro e infectadas com esquizontes atenuados. Os macrófagos do
organismo identificam os antígenos MHC destas células, as fagocitam e os
esquizontes são capazes de sobreviver no interior destes macrófagos, conferindo ao
sistema imune hospedeiro a capacidade de proteção. Este é o ponto que diferencia
as duas espécies de Theileira, permitindo a adoção deste método para T. annulata e
não para T. parva. Enquanto que T. annulata tem capacidade de infectar macrófagos
e induzir imunidade, T. parva tem predileção por células T. Assim, se a mesma
técnica fosse aplicada utilizando T. parva, este seria incapaz de multiplicar nos
macrófagos e uma imunidade protetora não seria induzida (INNES et al., 2011).
Animais vacinados com esquizontes de cultura de células adquirem
imunidade que perdura por seis meses, quando então começa declinar se não
houver nova exposição (BENIWAL et al., 2000). A eficiência deste mecanismo de
imunização foi comprovada em estudo por SINGH et al. (2001), onde animais
vacinados apresentaram títulos de anticorpos significativamente maiores,
comparados a animais não vacinados que se infectaram naturalmente. Além disso,
apenas animais que não receberam imunização sofreram os efeitos deletérios da
infecção.
7 2.2.2 Toxoplasma gondii
Vacinas com agente vivo atenuado têm sido utilizadas para conferir
proteção contra a ocorrência de toxoplasmose congênita em ovelhas. Isso se deve
ao fato dos animais serem capazes de desenvolver uma memória imunológica
protetora a partir do primeiro contato com Toxoplasma gondii, eficaz contra novos
desafios em prenhezes subsequentes (INNES et al., 2009; INNES et al., 2011).
Trata-se de um protozoário que se apresenta ao organismo hospedeiro de
duas maneiras diferentes: ora no interior da célula hospedeira, o que significa que a
resposta mediada por células T é de fundamental importância na proteção; ora no
ambiente extracelular, no intervalo que antecede a invasão de novas células, o que
possibilita a atuação do sistema imune humoral no objetivo final de debelar a
infecção (INNES et al., 2009; INNES et al., 2011).
O desenvolvimento de vacinas para T. gondii pode ser direcionado a
distintos objetivos: limitar a parasitemia aguda e evitar a toxoplasmose congênita;
limitar a formação de cistos teciduais e reduzir a transmissão aos hospedeiros
definitivos; ou mesmo direcionada a estes, na tentativa de reduzir a excreção de
oocistos e reduzir a transmissão aos hospedeiros intermediários (INNES et al., 2009;
INNES, 2010, INNES et al., 2011).
A única vacina disponível é constituída de taquizoítos do parasito vivo
atenuado, por meio de sucessivas passagens da cepa T gondii S48 em ratos e
cultivados in vitro. Esta cepa foi inicialmente cultivada com o propósito de fornecer
antígeno para diagnóstico. Observou-se, porém que o protozoário havia perdido a
habilidade de diferenciação em bradizoíto, não sendo, portanto capaz de permanecer
in vivo em sua forma cística (INNES et al., 2011).
Produzida comercialmente para ovelhas, com licença de uso em países da
Europa e na Nova Zelândia, estimula a imunidade protetora efetiva por pelo menos
18 meses. Sua aplicação é subcutânea e não é capaz de produzir cistos teciduais,
fazendo com que os animais não permaneçam com infecção vacinal permanente.
8 Apresenta risco em potencial para indivíduos imunodeprimidos e para fêmeas
gestantes (DUBEY & LINDSAY, 2006; OIE, 2008)
2.2.3 Neospora caninum
Para Neospora caninum não se observa imunidade protetora após a
infecção. Uma alta taxa de abortamentos ou transmissão vertical pode ser observada
em sucessivas gerações e em sucessivas prenhezes, possivelmente devido a uma
nova exposição ao agente ou a recrudescência de uma infecção persistente (INNES
et al., 2002).
Entretanto, a probabilidade de ocorrência de transmissão vertical nos
rebanhos parece sofrer decréscimo em prenhezes subsequentes, o que poderia
sugerir o surgimento de algum tipo de imunidade efetiva do hospedeiro interferindo
neste processo (ROMERO & FRANKENA, 2003). Da mesma forma, rebanhos que
experimentaram abortamentos epidêmicos por N. caninum, ou mesmo que foram
previamente expostos ao protozoário, parecem ser menos propensos a novas
ocorrências desta natureza pelo mesmo agente (WOUDA et al., 1998; MCALLISTER
et al., 2000). Assim, mesmo que de maneira menos eficiente, é possível inferir sobre
a possibilidade do uso de vacina no controle da neosporose bovina (INNES et al.,
2011).
A administração de taquizoítos vivos previamente ao início da gestação se
mostrou uma maneira de proteção contra a transmissão vertical ou abortamento em
bovinos desafiados durante a gestação, em comparação a animais sem imunização
prévia (BUXTON et al., 2001; INNES et al., 2001; WILLIAMS et al., 2007).
A busca por uma vacina formulada com parasitos vivos de N. caninum
evidencia especial interesse na identificação de cepas de N. caninum que
apresentem baixa virulência e patogenicidade in vivo, que possam ser consideradas
naturalmente atenuadas (INNES et al., 2011). Para tal propósito, modelos murinos
são utilizados para demonstrar esta característica em alguns dos isolados obtidos
9 pelo mundo (MILLER et al., 2002; REGIDOR-CERRILLO et al., 2008; GARCÍA-
MELO et al., 2009). Para sua utilização como vacina, é de fundamental importância
que estas cepas não permaneçam no organismo hospedeiro, bem como não
ofereçam risco de transmissão congênita (INNES et al., 2011).
2.2.4 Babesia
A babesiose bovina é uma enfermidade conhecida por provocar infecção
aguda e possivelmente fatal em bovinos adultos (WAAL & COMBRINK, 2006).
Animais que se recuperam de uma primo-infecção adquirem a condição de
persistentemente infectados e ainda apresentam certa resistência a parasitos
relacionados, sendo animais jovens geralmente mais resistentes que adultos
(BROWN et al., 2006; WAAL & COMBRINK, 2006).
Vacinas vivas contra B. bovis e B. bigemina são baseadas em sangue
obtido de bovinos naturalmente infectados (PIPANO, 1995). Os parasitos obtidos são
inoculados por sucessivas vezes em bezerros esplenectomizados e em cultura de
células para que sua virulência seja reduzida, conferindo segurança na sua
utilização, especialmente em animais adultos (SHKAP et al., 2007).
Embora uma formulação ideal deva ser capaz de induzir imunidade sem
produzir manifestação clínica nos animais, neste tipo de vacina é necessário um
acompanhamento quando da aplicação, por se tratar da utilização de agente vivo. A
intervenção por meio da administração de quimioterápicos como o imidocarb,
embora possa se mostrar necessária, foi relatada como fator prejudicial à eficácia do
esquema vacinal, destruindo os protozoários vacinais e evitando que se estabeleça
uma imunidade duradoura, devendo ser evitada (COMBRINK et al., 2002; WAAL &
COMBRINK, 2006).
A Embrapa Gado de Corte, em parceria com o laboratório Hemopar, com
sede no Rio Grande do Sul, desenvolveu e disponibilizou comercialmente uma
vacina atenuada que contempla os agentes do complexo Tristeza Parasitária Bovina
10 (EMBRAVAC®-HEMOPAR), apresentada em três tubos criogênicos, sendo que cada
tubo contém, separadamente, as cepas atenuadas de B. bovis, B. bigemina e A.
centrale e um frasco contendo o diluente. A vacina é conservada congelada em
nitrogênio líquido até o momento do uso.
2.3 Vacinas baseadas no agente inativado, subunidades e antígenos recombinantes
Vacinas formuladas a partir do protozoário inativado ou mesmo frações
antigênicas deste apresentam uma característica extremamente desejável no
desenvolvimento de um produto imunobiológico: são seguras para indivíduo ao qual
se destinam, não representando risco de instalação de doença ou demais efeitos
deletérios possíveis no uso de vacinas vivas. O desafio no desenvolvimento de
vacinas inativadas eficazes está na seleção de componentes antigênicos
suficientemente capazes de induzir respostas imunes inata e adaptativa efetivas,
conferindo assim ao organismo a proteção desejada (INNES & VERMEULEN, 2006;
INNES et al., 2011).
2.3.1 Theileria
Enquanto o uso de parasito vivo na imunização contra as theilerioses está
consolidado e é amplamente difundido, os estudos com antígenos inativados e
recombinantes têm demonstrado baixa eficácia nesse propósito. Antígenos
imunodominantes de esporozoítos e esquizontes de T. parva e T. annulata já foram
identificados (GRAHAM et al., 2006; INNES et al., 2011). De acordo com
MORRISON & MCKEEVER (2006), estes antígenos são reconhecidos por
anticorpos, resultando na neutralização do esporozoíto e proteção das células
11 hospedeiras. Formas recombinantes do antígeno de T. parva, com massa de 67 KDa
(conhecido como p67) foram capazes de proteger, ainda que parcialmente, bovinos
de desafio agudo experimental (BALLINGALL et al., 2004). Por outro lado, não se
obteve eficácia na imunização pelo uso deste antígeno associado a formas vivas
recombinantes como o vírus da varíola (HONDA et al., 1998) ou Salmonella
(GENTSCHEV et al., 1998). A habilidade dos antígenos imunodominantes de
esquizontes para induzirem imunidade efetiva em bovinos foi verificada usando
técnicas de imunização com DNA plasmidial ou vetores vivos recombinantes, não se
obtendo resposta imune satisfatória. Entretanto, em alguns protocolos, a gravidade
da enfermidade foi atenuada, sugerindo que houve certa proteção (GRAHAM et al.,
2006).
2.3.2 Toxoplasma gondii
Para T. gondii, o uso de vacinas inativadas não tem promovido imunidade
satisfatória, demonstrando que o sucesso obtido em vacinas vivas não é alcançado
nesta modalidade de imunobiológico (INNES et al., 2011). BUXTON et al. (1989)
relataram falha na indução de proteção contra abortamentos em ovelhas por T.
gondii após a administração de antígenos de Toxoplasma incorporados em partículas
ISCOM (immunostimulating complexes). Para que se atinja uma eficácia adequada,
INNES et al. (2011) afirmam que o antígeno inativado de T. gondii deveria ser capaz
de induzir respostas efetivas de células CD4+, CD8+ e de interferon gama.
2.3.3 Neospora caninum
Há uma vacina feita de taquizoítos inteiros inativados (Bovilis® Neoguard,
Intervet) formulados com um adjuvante a base de polímero de ácido acrílico
12 (Havlogen), que embora não previna a infecção fetal, relatos têm associado sua
administração com a redução estatística do abortamento bovino em áreas endêmicas
para a enfermidade (BIELSA et al., 2004). É administrada em dois momentos: antes
da prenhez e no primeiro trimestre da gestação, com reforço anual (INNES et al.,
2011).
Por outro lado, apesar dos animais imunizados serem capazes de produzir
respostas humoral e celular, estas não se mostram eficazes, visto que em uma
situação de desafio, além da infecção congênita não ser evitada, não se percebe
diferença na redução de abortamentos, em comparação a animais não vacinados
(SCHETTERS et al., 2004).
Além disso, o uso da vacina interfere no resultado da sorologia, não
permitindo diferenciar animais infectados de vacinados (GIVENS, 2006). Sua eficácia
duvidosa provocou sua indisponibilização para comércio no mercado nacional.
Estudos vêm sendo conduzidos no sentido de obter um produto que apresente
resultados mais satisfatórios (REICHEL & ELLIS, 2009).
Existe grande interesse por parte dos pesquisadores na identificação de
antígenos imunodominantes de N. caninum, candidatos à formulação de vacinas.
Dentre estes, são destacados os antígenos parasitários que possam estar envolvidos
na invasão e sobrevivência no hospedeiro, como micronemas, roptrias, grânulos
densos ou demais antígenos abundantes na superfície dos taquizoítos (JENKINS,
2001).
Como ocorre para Theileria, existe a busca de maneiras de estimular
adequadamente as respostas imunes do organismo hospedeiro por meio da
associação de antígenos imunodominantes de N. caninum a vetores vivos
recombinantes, obtendo resultados promissores (NISHIKAWA et al., 2001).
13 2.3.4 Cryptosporidium parvum
Outra importante enfermidade no rebanho bovino, a Criptosporidiose é
também alvo de estudos na busca por um produto imunobiológico eficaz. Em estudos
realizados nos Estados Unidos, bezerros imunizados com oocistos inativados de
Cryptosporidium parvum apresentaram, após desafio experimental, redução na
diarréia e na eliminação de oocistos, em comparação a animais não vacinados
(HARP & GOFF, 1995). Entretanto, em condições naturais de desafio, os mesmos
autores relataram a ineficácia desta vacina (HARP & GOFF, 1998).
Uma forma interessante e promissora de imunização é a administração de
proteínas recombinantes da superfície de oocistos de C. parvum a fêmeas prenhes,
poucas semanas antes do parto, tornando o colostro produzido por estas fêmeas
uma solução hiperimune de anticorpos anti-C. parvum. Estudos mostraram que
bezerros alimentados com esse colostro foram capazes de responder ao desafio oral
com oocistos viáveis de C. parvum, apresentando proteção contra diarréia e redução
na eliminação de oocistos, trazendo efeito benéfico no controle da enfermidade por
meio da redução da contaminação no ambiente (PERRYMAN et al., 1999; JENKINS,
2004; BURTON et al., 2011).
A verificação de eficácia para vacinas formuladas a partir de subunidades
do protozoário têm mostrado resultados favoráveis em camundongos Balb/C
experimentalmente desafiados sendo, portanto, promissoras para uso a campo. YU
et al. (2010) avaliaram a capacidade indutora de imunidade de proteínas de
superfície dos esporozoítos de C. parvum (Cp12 e Cp21), identificadas como
antígenos imunodominantes envolvidos na resposta imune à infecção pelo parasito.
As sequências de DNA que codificam tais proteínas foram amplificadas e clonadas
em plasmídio (vetor PVAX1), sendo estimulada posteriormente a expressão da
proteína recombinante. Após a administração desta proteína aos animais, estes
foram desafiados com oocistos de C. parvum. Foi observado que houve redução de
77,5% nos níveis de eliminação de oocistos, sugerindo o desenvolvimento de
imunidade efetiva. Além disso, foi verificada diferença significativa quando se
14 associou as duas proteínas, em comparação à sua ação separadamente, mostrando
que o uso desses antígenos em formulações de imunobiológicos deverá priorizar
esta associação.
Buscando verificar a capacidade de indução de imunidade efetiva cruzada
entre espécies de Cryptosporidium, um estudo realizado na China utilizou a proteína
AB de C. andersoni na imunização de camundongos Balb/C, com posterior desafio
destes com oocistos de C. parvum. Foi observado que o uso da proteína AB
recombinante (em plasmídio) foi capaz de induzir resposta humoral e celular, com
taxa de redução de 48,6% na excreção de oocistos. Apesar do resultado pouco
expressivo, os autores ressaltam a ocorrência de imunidade cruzada e o potencial
deste resultado no desenvolvimento de uma formulação eficaz para este protozoário
(ZHENG et al., 2011).
2.3.5 Babesia
A pesquisa por antígenos imunodominantes é também uma realidade para
este protozoário. Embora se tenha alguns já identificados, sua aplicação na proteção
dos animais contra um desafio não obteve sucesso (BROWN et al., 2006).
O desenvolvimento de vacinas de subunidade para Babesia foi baseado
primeiramente na identificação de proteínas que apresentassem características
como: estar na superfície do protozoário, ser altamente conservadas entre as cepas,
ter importância funcional na virulência do agente e ter alta capacidade imunogênica.
Buscando tais características, proteínas associadas a estruturas como micronemas,
roptrias, e antígenos de superfície são pesquisados, ainda com níveis insatisfatórios
de êxito (SUAREZ & NOH, 2011).
Ainda com o mesmo objetivo, estudos nos campos da genômica e
proteômica são cada vez mais evidenciados como ferramentas importantes, visto
que um melhor entendimento sobre a biologia e virulência de Babesia contribuirá
15 para o desenvolvimento de uma formulação que associe a segurança da vacina de
subunidade a uma eficácia satisfatória (SUAREZ & NOH, 2011).
Atualmente não existem vacinas formuladas a partir do protozoário
inativado ou mesmo de subunidades antigênicas, disponíveis para aplicação (WAAL
& COMBRINK, 2006; SUAREZ & NOH, 2011).
2.3.6 Tritrichomonas foetus
Um trabalho realizado nos Estados Unidos buscou verificar a capacidade
de proteção de duas diferentes formulações de vacina contra Tritrichomonas foetus,
comparando-as a um grupo sem imunização (controle). As formulações foram vacina
com antígeno solúvel e vacina com parasito inteiro inativado. Foi observado que
todos os animais imunizados desenvolveram altos títulos de anticorpos (a partir de
1:1000). Diante do desafio oferecido a todos os animais, os indivíduos vacinados
apresentaram um período de infecção significativamente mais curto, além da
verificação de 27% das novilhas vacinadas prenhes, contra nenhuma prenhez
verificada no grupo que não recebeu imunização. Concluiu-se que ambas as
formulações foram capazes de conferir certa proteção às novilhas contra perdas
fetais decorrentes de Tricomonose (KVASNICKA et al., 1989).
COBO et al. (2002), em estudo conduzido na Argentina, verificaram a
eficácia de composições de vacinas diferentes e a resposta ao desafio com touros
contaminados com T. foetus. As formulações utilizadas foram protozoários inteiros
inativados pela formalina e membranas celulares obtidas da sonicação com posterior
purificação dos parasitos, ambas em adjuvante oleoso. A aplicação contemplou a via
subcutânea, com reforço de uma dose aplicada via intravaginal. Após a imunização,
as fêmeas foram cobertas por touro infectado (desafio). Foi observada que a taxa de
mortalidade fetal foi significativamente maior nas fêmeas não vacinadas. Ainda que
houve incremento nos níveis séricos de anticorpos e nos níveis de IgA na mucosa
genital nos animais imunizados, o que reduziu a persistência da infecção genital.
16
Este mesmo grupo de pesquisa verificou a eficácia da imunização em
associação a Campylobacter fetus na Argentina. Grupos distintos de fêmeas foram
imunizados com vacina comercial polivalente com formulação contendo
Tritrichomonas, Campylobacter e Leptospira (Trichguard V5L®, Fort Dodge, EUA) e
aplicação subcutânea, e com vacina produzida e inativada em laboratório contendo
Tritrichomonas e Campylobacter, de aplicação subcutânea e intravaginal. Foi
observado que novilhas vacinadas foram resistentes à infecção ou mesmo a
debelaram rapidamente para ambos os patógenos, tinham uma maior taxa de
prenhez e uma maior resposta imunológica sistêmica durante e após o período de
reprodução. Em uma avaliação geral, a vacina experimental foi superior à vacina
comercial (COBO et al., 2004). Este fato pode ser explicado pela adoção da via
intravaginal desta vacina, que propicia a produção de IgA no local onde ocorre a
infecção (CHEN & CERUTTI, 2010; ALVES et al., 2011).
Embora com resultados promissores, o uso de vacinas no controle da
Tricomonose ainda não é considerado muito satisfatório, pois a imunização conferida
não é duradoura (SPÓSITO-FILHA & OLIVEIRA, 2009). Trichguard®, Trichguard
Plus®, Trichguard V5L® (Fort Dodge Animal Health) são exemplos de vacinas contra
T. foetus existentes no mercado, embora ainda não disponíveis no Brasil (ALVES et
al., 2011).
2.3.7 Sarcocystis
As pesquisas na busca de um produto imunobiológico contra o gênero
Sarcocystis têm se concentrado na espécie S. neurona, um dos agentes da
Mieloencefalite Protozoária Equina. Dentre as espécies que afetam ruminantes,
ABDEL-BAKI et al. (2009) desenvolveram um estudo com Sarcocystis ovicanis (S.
tenella), onde esporocistos do parasito foram inativados por radiação ultra-violeta e
inoculados em ovinos, submetidos a posterior desafio com esporocistos viáveis. Os
animais que receberam imunização apresentaram alta resistência à infecção, com
17 sinais clínicos ausentes ou atenuados. Foi verificado que os cistos formados nos
tecidos do hospedeiro se apresentaram com tamanho reduzido e não aderidos às
fibras musculares. Além disso, detectaram-se altos níveis de interferon gama, o que
pode ser interpretado como uma melhor indução de resposta do tipo Th1 e efeito
protetor contra a infecção (ABDEL-BAKI et al., 2009).
2.3.8 Eimeria
Embora se tenha tentado imunizar bovinos contra eimeriose, o
desenvolvimento de vacinas comerciais é difícil diante dos resultados insatisfatórios
obtidos e a vacinação não está disponível como uma alternativa para o tratamento
(DAUGSCHIES & NAJDROWSKI, 2005).
A imunização através da administração de oocistos vivos de E.
alabamensis foi relatada, seguida de desafio em pastagem naturalmente infectada.
No entanto, apenas uma proteção parcial foi obtida e a doença clínica foi verificada
após a imunização (SVENSSON et al., 1996). O uso de vacina a partir de oocistos
inativados por radiação induz apenas imunidade parcial e não eficaz. O animal
permanece exposto à infecção por toda a vida e pode apresentar pequena excreção
de oocistos, mesmo em animais adultos, o que evidencia a pequena possibilidade de
sucesso em uma estratégia de imunização (DAUGSCHIES & NAJDROWSKI, 2005).
2.4 Aspectos econômicos no desenvolvimento de vacinas
O desenvolvimento de uma vacina comercial compreende várias fases
distintas. Embora novos estudos na área sejam motivados pelo resultado promissor
ou não de um estudo prévio, o início de um projeto de pesquisa na busca de uma
18 nova vacina é fortemente influenciado por demandas do mercado (SCHETTERS,
1995).
A viabilidade de um novo produto é avaliada, a partir do atendimento a
requisitos comerciais e técnicos. Assim, inicia-se a pesquisa visando chegar à
formulação ideal do novo imunobiológico, que atenda as características de eficácia e
segurança exigidas de uma boa vacina. Diante dos resultados obtidos, é traçado o
perfil do produto e este está sujeito à avaliação da aplicabilidade em situação prática.
Como exemplo, este novo produto deve preferencialmente se encaixar em esquemas
de vacinação já existentes, o que facilitaria o manejo dos animais.
Aspectos técnicos afetam igualmente o perfil do produto visando sua
viabilidade a campo (por exemplo, se o produto liofilizado é de fácil reconstituição ou
se é muito exigente em termos de conservação). Após uma análise positiva do custo-
benefício do produto, a fase de desenvolvimento é direcionada para os experimentos
necessários para obter o registro junto ao órgão regulamentador competente. Depois
que o produto obtém este registro, está pronto para produção em larga escala e
comercialização (SCHETTERS, 1995).
19 3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O desenvolvimento de vacinas eficazes a partir de parasitos inativados é
de grande dificuldade, em se tratando de agentes tão complexos quanto
protozoários, que apresentam muita heterogeneidade nos mecanismos de resposta
imune em infecção natural. Entretanto, vacina inativada é mais segura por garantir
que não hajam efeitos deletérios decorrentes de uma possível instalação de doença
provocada por antígeno vacinal. Assim, a busca por vacinas inativadas capazes de
induzir uma imunidade protetora adequada e que estimulem os mecanismos
humorais e celulares deve ser incentivada.
A gama de informações nos campos da genômica, proteômica e
imunologia é cada vez maior. Tal fato subsidia novos métodos e tecnologias de
produção e distribuição de imunobiológicos, sugerindo que novas vacinas devem
chegar ao mercado em um futuro próximo.
O uso de vacinas no controle dos principais protozoários parasitos de
ruminantes domésticos já é uma realidade em situação prática em casos como
Theileria, Toxoplasma, Babesia e Tritrichomonas. Por outro lado, protozoários como
Neospora, Cryptosporidium, Sarcocystis e Eimeria em ruminantes permanecem sem
a disponibilidade de formulações indutoras de imunidade satisfatória e uso em larga
escala, embora a maioria das pesquisas com estes parasitos tenham resultados
promissores. O desenvolvimento de técnicas utilizando antígenos recombinantes
tanto abre possibilidades de criação de um produto efetivo para os protozoários onde
ainda não existem tais opções, quanto possibilitam reformulações para produtos já
existentes comercialmente, otimizando sua eficácia e utilização.
Embora vacinas desenvolvidas e testadas experimentalmente apresentem
potencial considerável para imunização, nem todas são possíveis candidatas para o
desenvolvimento de vacinas comerciais. Além de problemas de controle de
qualidade e biossegurança, questões de viabilidade de mercado devem ser
consideradas. Em áreas de criação onde o poder aquisitivo é reduzido e as despesas
com saúde animal são baixas, vacinas muito onerosas e/ou de difícil administração
têm pouca chance de serem comercializadas.
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