Design of Minimum Active Fragments

8/12/2019 Design of Minimum Active Fragments

1/13

436 P R O T E I N S A N D P E P T I D E S : P R I N C I P L E S A N D M E T H O D S [20]c o n f o r m a t i o n s i n s o l u t i o n a r e a m o n g t h e m o s t i m p o r t a n t p r o p e r t i e s o fp e p t i d e s t h a t d e t e r m i n e a c t i v i t y a n d , u l t im a t e l y , p o t e n c y . 7,8 A n u n d e r -s t a n d i n g o f t h e s e p r o p e r t i e s a t a f u n d a m e n t a l m o l e c u l a r l e v e l w i l l u l t i -m a t e l y e n h a n c e o u r f u t u r e a b il it y to d e s i g n v a c c i n e s a n d n e w d r u g s r a ti o -na l l y f r om f i rs t p r i nc i p l e s . 7A c k n o w l e d g m e n t s

T h e a u t h o r s t h a n k t h e N a t i o n a l I n s t it u t e s o f H e a l t h a n d R o b e r t A . W e l c h F o u n d a t i o n f o rp a r t i a l s u p p o r t . W e a r e i n d e b t e d t o s e v e r a l c o l l e a g u e s f o r l o n g a n d f r u i t fu l c o l l a b o r a t i o n s ,p a r t i c u l a r l y P r o f . V . J . H r u b y a n d D r . L i e m D a n g . B . M . P . i s a n A l f r e d P . S l o a n F e l l o w ,1 9 8 9 - 1 9 9 1 .

[ 2 0 ] D e s i g n o f M i n i m u m A c t i v e F r a g m e n t so f B i o l o g i c a l l y A c t i v e P e p t i d e s

B y W I L L I A M M . B R Y A N

I n t r o d u c t i o nA t t e m p t s t o d e s i g n b i o l o g ic a l ly p o t e n t a n d r e c e p t o r - s e l e c t i v e p e p t i d e s

n e c e s s i t a t e a n u n d e r s t a n d i n g o f h o w t h e i n d iv i du a l a m i n o a c i d s o f th ep e p t i d e c o n t r i b u t e t o i ts o v e r a l l c o n f o r m a t i o n a t t h e b i o lo g i ca l r e c e p t o r .T h i s r e s u l ti n g b i o a c t i v e c o n f o r m a t i o n d e t e r m i n e s w h i c h i n d i v id u a l a m i n oa c i d s o f t h e p e p t i d e w i ll i n t e r a c t w i th s it e s o n t h e r e c e p t o r ; t h e r e m a i n i n ga m i n o a c i d s s e r v e p r i m a r i l y a s t r u c t u r a l ro l e to f a v o r t h o s e c o n f o r m a t i o n si n w h i ch t he c r i t i c a l r e s i du es a r e s pa t ia l l y s it ua t ed f o r op t ima l i n t e r ac t i onw i t h th e r e c e p t o r . O f t e n t h e a m i n o a c i d s w h i c h s e r v e as s t ru c t u r a l e l e m e n t sc a n b e d e l e t e d w i t h t h e r e s u l ti n g p e p t i d e f r a g m e n t r e t a in i n g fu ll o r p a rt ia lb i o l o g ic a l a c t i v i t y a l t h o u g h u s u a l l y o f r e d u c e d p o t e n c y .A l t h o u g h w e a r e u n a b l e t o p r e d i c t w i th c e r t a i n t y th e t h r e e - d i m e n s i o n a l3 D ) s t r u c t u r e o f p e p t i d e s f r o m t h e i r a m i n o a c i d s e q u e n c e , i t is p o s si b let o d e s i g n b i o l o g ic a l ly a c t i v e p e p t i d e s i n a r a t io n a l m a n n e r b a s e d o n t h e o r e t -i ca l s e c o n d a r y s t r u c t u r e p r e d i c t i o n , ~ s p e c t r o s c o p i c a n a l y s i s , s u c h a s n u -1 F o r a r e c e n t r e v i e w , s e e N . C . C o h e n , J . M . B l a n e y , C . H u m b l e t , P . G u n d , a n d D . C .

B a r r y , J Med Chem 33 , 883 1990) .C o p y r i g h t 1 9 9 1 b y A c a d e m i c P r e s s I n c .M E T H O D S I N E N Z Y M O L O G Y V O L . 2 02 A ll r i g ht s o f r e p ro d u c ti o n i n a n y f o r m r e s e r v e d .


2/13

[ 2 0 ] D E S IG N O F M I N I M U M A C T IV E P E P T ID E F RA G M EN T S 4 3 7c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e N M R ) , 2 a n d m o l e c u l a r m o d e l in g . 3 D e s p i te a d -v a n c e s in t h e a n a l y s is o f p e p t i d e c o n f o r m a t i o n t h r o u g h t h e s e t e c h n i q u e s ,t h e e f f o r t p u t f o r t h i n t h e i r a p p l i c a t i o n i s o f te n i n d i r e c t p r o p o r t i o n t o t h es iz e o f t h e p e p t i d e u n d e r s t u d y . T h i s is d u e t o t h e c o n s i d e r a b l e c o n f o r m a -t i o n a l f l e x i b i l i t y s h o w n b y l i n e a r p e p t i d e h o r m o n e s . E v e n c o n s t r a i n e d ,c y c l i c d i s u l f id e - c o n t a i n i n g p e p t i d e h o r m o n e s m a y p o s s e s s c o n s i d e r a b l ec o n f o r m a t i o n a l f r e e d o m . 4 O f t e n t h e f ir st s t e p i n r e d u c i n g t h is c o m p l e x i t yis t h e i d e n t if i c a ti o n o f th o s e r e s i d u e s o f th e p e p t i d e t h a t a r e c r i t ic a l fo rb i o l o g i c a l a c t i v i t y t h r o u g h t h e p r e p a r a t i o n o f a n a l o g s o f v a r y i n g l e n g t hf r o m t h e C a n d / o r N t e r m i n u s o f t h e p a r e n t p e p t i d e . S u c h s t u d ie s o f t e nr e v e a l t h a t t h e e n t i r e p e p t i d e c h a i n i s n o t n e c e s s a r y f o r f ul l b i o lo g i ca lac t i v i t y .

I f a s m a l l e r , b i o lo g i c a ll y a c ti v e f r a g m e n t o f t h e p a r e n t p e p t i d e c a n b ef o u n d , t h e p r e p a r a t i o n o f t h e m a n y a n a l o g s r e q u ir e d fo r s t r u c t u r e - a c t i v i t ys t u d i e s c a n b e g r e a t l y f a c il i ta t e d in t e r m s o f t im e a n d e f f o r t . M a n y o f th et o o ls , m e n t i o n e d a b o v e , u s e d t o s t u d y th e t h r e e -d i m e n s i o n a l s h a p e o fp e p t i d e s b e c o m e e a s i e r t o a p p l y . W i t h a s h o r t e n e d f r a g m e n t , i t m a y b ep o s s i b le t o p e r f o r m a s y s t e m a t i c g ri d s e a r c h o f it s c o n f o r m a t i o n a l s p a c eb y s e q u e n t i a l ly v a r y i n g a ll th e t o r s io n a l a n g l e s o f t h e p e p t i d e b y a f ix e di n c r e m e n t . 5 W h i l e th i s a p p r o a c h c a n g e n e r a t e a ll p o ss ib l e c o n f o r m a t i o n s o ft h e p e p t i d e , i t i s c o m p u t a t i o n a l l y i m p r a c t i c a l t o p e r f o r m o n l a r g e p e p t id e scon t a i n i ng g r e a t e r t han 5 o r 6 d i hed r a l ang l e s w i t hou t r e s o r t i ng to f i lt e ri nga l g o r i th m s t o r e s t r i c t r e g i o n s o f c o n f o r m a t i o n a l s p a c e . 6 A m o l e c u l a r d y -n a m i c s s im u l a t io n , 7 a t e c h n i q u e b a s e d o n N e w t o n i a n m e c h a n i c s w h i c hs i m u l a t e s t h e i n t r a m o l e c u l a r r o t a t i o n a n d v i b r a t io n o f a m o l e c u l e a t a g iv e nt e m p e r a t u r e o v e r t i m e , c a n b e p e r f o r m e d f o r l o n g e r t i m e t r a j e c t o r i e s ,a l lo w i n g t h e s a m p l i n g o f l a r g e r re g i o n s o f c o n f o r m a t i o n a l s p a c e f o r as m a l l e r p e p t i d e . A l s o , t h e p o s s ib i li ty o f s e v e r e r e s o n a n c e o v e r l a p i n t h eN M R s p e c t r u m o f a s h o r t e n e d p e p t i d e is l e s s e n e d , a l lo w i n g f o r e a s i e rs i gna l a s s i gnmen t .2 F o r a r e v i e w , s e e G . E . S c h u l z a n d R . H . S c h i r m e r , in P r i n c i p l e s o f P r o te i n S t r u c t u r e

( C . R . C a n t o r , e d . ) , p . 1 0 8 . S p r i n g e r - V e r l a g , N e w Y o r k a n d B e r l i n , 19 7 9.3 F o r a r e v i e w , s e e H . K e s s l e r , W . B e r m e l , A . M u l l er , a n d K , - H . P o o k , in T h e P e p t i d e s :

A n a l y s i s , S y n t h e s i s , B i o l o g y ( S . U d e n f r i e n d a n d J. M e i e n h o f e r , e d s . ) , p . 4 3 7 . A c a d e m i cP r e s s , O r l a n d o , F l o r i d a , 1 9 8 5 .

4 A . T . H a g l e r , D . J . O s g u t h o r p e , P . D a u b e r - O s g u t h o r p e , a n d J . C . H e m p l e , Science 2 2 7 ,1309 (1985) .

5 F . A . G o r i n a n d G . R . M a r s h a l l , Proc Natl Acad Sci U S A 74 , 5179 (1977) ; G. R .M a r s h a l l, F . A . G o r i n , a n d M . L . M o o r e , Annu Rep Med Chem 13, 227 (1978).

6 A , E . H o w a r d a n d P . A . K o l l m a n , J Med Chem 31, 1669 (1989) .7 F o r a n i n t r o d u c t o r y r e v i e w o f te c h n i q u e s a n d a p p l ic a t io n s , s e e J . A . M c C a m m o n a n d

S . C . H a r v e y , D y n a m i c s o f P r o t e i n s a n d N u c l e i c A c i d s . C a m b r i d g e U n i v . P r e s s , N e wY o r k , 1 9 8 7 .


3/13

4 3 8 P R O T EI N S A N D P E P T I D E S ; P R IN C I PL E S A N D M E T H O D S [ 2 0 ]T h e m i n i m u m a c t i v e fr a g m e n t f o u n d t h r o u g h s y s t e m a t i c d e le t io n s f r o m

t h e C a n d / o r N t e r m i n u s o f t h e p a r e n t p e p t i d e w i ll o f t e n , h o w e v e r , p o s s e s so n l y a f ra c t i o n o f t h e p o t e n c y o f th e i n t a c t p e p t id e . A t t e m p t s t o e n h a n c ep o t e n c y v i a c o n s t ra i n t s t h a t l im i t th e c o n f o r m a t i o n a l f r e e d o m o f t h e p e p -t i d e c a n t h e n b e i n t r o d u c e d . T h e p r e p a r a t i o n o f a n a l o g s in c o r p o r a t i n g as t r u c t u r a l c o n s t r a i n t t h a t r e s t r ic t s t h e c o n f o r m a t i o n a l s p a c e a v a i l a b l e t o ar e s id u e o r g r o u p o f r e s i d u e s r e p r e s e n t s a p o w e r f u l m e t h o d o f se a r ch i n gf o r th e b i o l o g i c a l ly a c t i v e c o n f o r m a t i o n . T h e b i o lo g i c a l a c t i v i ty o f su c h ac o n s t r a i n e d a n a l o g c a n p r o v i d e a n s w e r s a s t o w h i c h o f t h e m a n y c o n f o r m a -t i o n s a v a i l a b l e t o t h e p a r e n t p e p t i d e m a y b e r e s p o n s i b l e f o r b i n d i n g a n da c t i v a t i o n a t t h e r e c e p t o r .

F i n d in g M i n i m u m c t iv e F r a g m e n t sT h e t w o e x a m p l e s a t th e c o n c l u s i o n o f th is c h a p t e r d e m o n s t r a t e h o w ,

t h r o u g h s y s t e m a t i c d e l e t i o n s f r o m t h e C a n d N t e rm i n u s , a m i n i m u m a c t i v ef r a g m e n t o f a l a r g e r p e p t i d e i s f o u n d . A l t h o u g h t h i s is o f t e n t h e f i rs ta p p r o a c h t a k e n , i t i s a l s o s o m e t i m e s p o s s i b l e t o d e l e t e c e n tr a l p o r t i o n s o fa p e p t i d e , i f t h e s e r e g i o n s s e r v e o n l y a s a t e m p l a t e o r s c a f f o ld f o r th o s ea r e a s t h a t a r e c r it i ca l f o r i n t e r a c t i o n w i t h t h e r e c e p t o r . F o r e x a m p l e , i t w a sf o u n d t h a t n e u r o p e p t i d e Y 1 6 - 3 6 ) w a s t h e s m a l l e s t c o n t i g u o u s f r a g m e n to f t h e 3 6 -a m i n o a c id p e p t i d e , n e u r o p e p t i d e Y N P Y ) , w h i c h d i s p l a y e dh y p e r t e n s i v e a c t iv i t y . 8 H o w e v e r , it w a s l a te r s h o w n t h at r e s i d u e s 7 - 1 7c o u l d b e r e p l a c e d w i t h t h e s p a c e r , 8 - a m i n o o c t a n o i c a c i d . T h e a n a l o gc o n t a i n i n g t h i s s p a c e r a n d i n c o r p o r a t i n g a d i s u l f i d e b e t w e e n p o s i t i o n s 7a n d 21 w a s e q u i p o t e n t t o N P Y . 9 T h e d i su l fi d e b ri d g e w a s i n t r o d u c e d t or e p l a c e s o m e o f t h e c o n f o r m a t i o n a l s t a b il i za t io n l o s t th r o u g h t h e d e l e t i o no f t h e c e n t r a l r e s i d u e s .

A f t e r a s m a l l b i o l o g i c a l l y a c t i v e f r a g m e n t i s f o u n d , m a n y m e t h o d s a r ea v a i l a b l e f o r i n c o r p o r a t i n g c o n f o r m a t i o n a l c o n s t r a i n t s i n a n a t t e m p t t oe n h a n c e p o t e n c y . I n t hi s c h a p t e r , I d e s c r i b e b r ie fl y s o m e o f t h e m o r ec o m m o n a p p r o a c h e s t o w a r d e n h a n c in g p o t e n c y t hr o ug h c o n f o r m a t io n a lc o n s t r a i n t a n d c o n c l u d e w i t h t w o e x a m p l e s w h i c h i l l u s t r a t e t h e i r a p p l i -c a t i o n .

8 j . H . B o u b l i k , N . S c o t t , J . T a u l a n e , M . G o o d m a n , M . B r o w n , a n d J . R i v i e r , Int J PeptProtein Res 33 , I 1 (1989 ) .

9 j . L . K r s t e n a n s k y , T . J . O w e n , S . H . B u c k , K . A . H a g a m a n , a n d L . R . M c L e a n , inP e p t i d e s : C h e m i s t r y , S t r u c t u r e a n d B i o l o g y ( J. R i v i e r a n d G . R . M a r s h a l l , e d s . ) , p . 3 19 .E S C O M S c i e n c e P u b l i s h e r s, L e i d e n , T h e N e t h e r l a n d s , 1 99 0.


4/13

[2 0] DESIGN OF MINIMUM ACTIVE PEPTIDE FRAGMENTS 439MethodsD Amino Acids

Protected D-amino acids, which are commercially available, are fre-quently used to prepare analogs containing the opposite absolute stereo-chemistry at one or more residues. Because most enzymes are enantio-specific, such an analog, if active, may display resistance to enzymaticattack and thereby prolong its biological half-life. For example, the rapidenzymatic degradation of enkephalins (e.g., Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu)through cleavage of the Tyr-Gly bond by an aminopeptidase could beovercome by replacement of the Gly with a D-alanine.10

The replacement of Gly with a D-amino acid has other implications aswell. Because Gly is not asymmetric, it can adopt conformations availableto either an L- or D-amino acid. If in the biologically active conformationof the peptide Gly behaves like a D-amino acid, then its substitution by aD-amino acid may have the effect of locking the peptide in this conforma-tion and enhancing the biological potency o f the peptide.

The chirality of the residues in the second and third (i + 1 and i + 2)positions of a/3 turn (a turn containing four residues with a hydrogen bondbetween the i and i + 3 amino acid and classified according to the signand magnitude of the dihedral angles, ~b, of the middle residues) affectsthe conformat ion of the turn. If both are o f the L-configuration, a type Iturn is preferred, whereas a type II or II turn can result from either anLD or DL pair. 11 Glycine, which lacks an asymmetric center, can occupyeither position. As shown in Fig. 1 the side chains of the i + 1 and i + 2amino acids of a type I (L-L) and type II (D-L)/3 turn are oriented similarlyin space. Therefore, it is sometimes possible to substitute a D-amino acidfor the second residue of a type I turn with retention or even enhancementof activity. Support for a proposed bioactive conformat ion of somatostatincontaining a/3 turn at Phe-Trp-Lys-Thr came from the observation of theenhanced activity shown by the D TIpanalog. 12 Fur ther support for a typeII /3 turn came from NMR studies ~3 of this and other analogs with aD-amino acid replacing TIp.

10 C. B. Pert and A. Pert, S c i e n c e 194, 330 1976).1I G. D. Rose, L. M. Gierasch, and J. A. Smith, A d v . P r o t e i n C h e m . 37, 1 1985).12 B. H. Arison, R. Hi rschman, and D. F. Veber, B i o o r g . C h e m . 7, 447 1978).13 D. F. Veber, R. M. Freidinger, D. S. Perlow, W. J. Palveda, Jr., F. W. Holly, R. G.

Strachan, R. F. Nutt, B. H. Arison, C. Hommick, W. C. Randall, M. S. Glitzer, R.Saperstein, and R. Hirschman, N a t u r e L o n d o n ) 292, 55 1981).


5/13

44 PROTEINS AND PEPTIDES; PRINCIPLES AND METHODS [20]

Type I Turn L-L)

Type Ir Turn D-L) Type II Turn L-DIFIG. 1. Depiction of the side-chain (methyl) orientations of the i + 1 and i + 2 residuesof type I (LL), type II (LD), and type I I (DL) flturns. Note the similar conformations of thetype I (LL) and type II (DL) flturns.

Conformat ional ly Res tr ic ted mino c idsP r o l in e f r e q u e n t l y o c c u r s i n /3 t u r n s , w h e r e it h a s a p r e f e r e n c e f o r t h e

s e c o n d p o s i t i o n o w i n g t o t h e r e s t r i c t e d c o n f o r m a t i o n a l s p a c e a v a i la b l e tothe py r ro l id in e r ing (~ = - 6 0 _+ 20o). 14 Fo r th is rea son i t is f requ en t lyu s e d a s a c o n f o r m a t i o n a l p r o b e i n p e p t i d e r e g i o n s s u s p e c t e d o f c o n t a in i n ga tu r n . P r o l i n e a n d o t h e r N - s u b s t i t u t e d a - a m i n o a c id s a l so h a v e t h e e f f e c to f r e s t r i c t i n g t h e r e s i d u e p r e c e d i n g i t i n t h e p e p t i d e c h a i n t o c o n fo rm a t i o n so t h e r t h a n ot h e l i c a l a n d p r o v i d e a c c e s s i b i l i ty t o a c i s o r i e n t a t i o n o f t h ea m i d e b o n d . R e p l a c e m e n t o f t h e a h y d r o g e n o f a n a m i n o a c id w i th am e t h y l g r o u p a l s o r e s tr i c t s t h e a d j a c e n t b a c k b o n e a n g l es . T h u s , a - m e t h y la mi n o a c i d s s h o w a t e n d e n c y t o a d o p t p r e d o m i n a n t l y 310 a n d a h e l i c e s ,a l t h o u g h t y p e I a n d I I I t u rn s a r e a l so c o n f o r m a t i o n a l l y a c c e s s ib l e . B o t hs u b s t i t u t i o n s a r e f r e q u e n t l y u s e d i n c o n c e r t t o d i s c e r n t h e c o n f o r m a t i o ni n a p a r t i c u l a r p o r t i o n o f a p e p t i d e . F o r e x a mp l e , i n a f r a g m e n t o f t h e 8 4-r e s i d u e p e p t i d e p a r a t h y r o i d h o r m o n e ( P T H ) , T y r 3 4 p T H ( I - 3 4 ) N H 2 , t h el o w r e c e p t o r a f f in i ty o f t h e a n a l o g w i t h P ro s u b s t i t u t e d fo r G l y 12 a n d t h eh i g h a ff i n it y o f th e a n a l o g w i t h A i b ( a mi n o i s o b u t y r i c a c i d o r a -me t h y l a l a -14 G. E. Schulz and R. H. Schi rmer, n Princi ples of Protein Structure (C. R. Cantor, ed.),

p. 21. Springer-Verlag, New York and Berlin, 1979.


6/13

[ 2 0 ] D E S I G N O F M I N I M U M A CT IV E P E P T I D E F RA G M E N TS 4 4 1n i n e ) s u b s t i t u t e d f o r G l y 12 a r g u e d a g a i n s t a t u r n a n d s u g g e s t e d a n a -h e l i c a l o r 310 h e l i c a l c o n f o r m a t i o n i n t h i s r e g i o n o f t h e a g o n i s t . 15 S u c hc o n f o r m a t i o n a l c o n s t r a i n t s c a n h a v e d r a m a t i c e f f e c t s o n b io l o g ic a l a c t i v -i ty . S u b s t i t u t i o n o f N - M e N l e f o r M e t 28 a n d M e t 31 o f C C K 2 6 - 3 3 ) f r a g m e n to f c h o l e c y s t o k i n i n ) r e s u l t e d i n a h ig h l y p o t e n t a n d r e c e p t o r - s e l e c t i v e p e p -t i d e , 16 a n d s u b s t i t u t i o n o f o - a - M e ) P h e 8 in [ S a r l , o - P h e 8 ] A I I a n a lo g o fa n g i o t e n s i n I I ) r e s u l t e d i n a h ig h l y p o t e n t a n t a g o n i s t . 17

B e c a u s e m o s t e n z y m e s d o n o t r e c o g n i z e N - s u b s t i t u t e d a m i n o a c i d s ,P r o a n d N - M e - a m i n o a c i d s c a n a l s o i m p a rt a d e g re e o f e n z y m a t i c s ta b il it yo n t h e a m i d e b o n d t h e y f o r m w i t h t h e f o l l o w i n g r e s i d u e . A n g i o t e n s i n I I ,t h e p r o d u c t o f t h e a c t io n o f a n g i o te n s in I - co n v e r ti n g e n z y m e A C E ) o na n g i o t e n s i n I , i s c o m p l e t e l y s t a b l e to s u b s e q u e n t d e g r a d a t i o n b y t h is c a r-b o x y d i p e p t i d a s e b e c a u s e o f a p ro l in e r e s i d u e .yclization

P e r h a p s t h e m o s t w i d e l y a p p li e d m e t h o d o f r e st ri c ti n g t h e c o n f o r m a -t i o n a l s p a c e o f a p e p t i d e i s t h r o u g h c y c l i z a t i o n . I t i s u s u a l l y a p p l i e d a tr e s i d u e s o r i n a r e a s o f t h e p e p t i d e c h a in w h i c h h a v e b e e n d e t e r m i n e d n o tt o b e v i ta l t o b i o lo g i c a l a c t i v i t y . W h e n a n a c t i v e f r a g m e n t i s f o u n d , t h ep h y s i c a l p r o p e r t i e s o f t h e i n d i v id u a l r e s i d u e s w i t h i n t h e f r a g m e n t c a n b em o d i f i e d e . g ., b y s y s t e m a t i c r e p l a c e m e n t w i t h a l a n in e ) in a n a t t e m p tt o fi nd t h o s e a m i n o a c i d s o r a r e a s o f t h e p e p t i d e w h e r e c o n f o r m a t i o n a lc o n s t r a i n t c a n b e i n t r o d u c e d b y c y c l i z a t i o n , i n o r d e r t o p r e s e n t t h e f r a g -m e n t i n t h e c o r r e c t o r b i o a c t i v e c o n f o r m a t i o n . F o r e x a m p l e , b e c a u s e ar e v e r s e t u rn a t H i s - P h e - A r g - T r p i n a - m e l a n o c y t e - s ti m u l a t i n g h o r m o n ea - M S H : A c - S e r - T y r - S e r - M e t - G l u - H i s - P h e - A r g - T r p - G l y - L y s - P r o - V a l -

N H z ) w a s s u s p e c t e d , t h e f r a g m e n t [ C y s4 ,C y s 1 ] -o ~ - M S H 4 - 1 3) N H 2 w a sp r e p a r e d a n d f o u n d t o h a v e a b o u t 1 0,0 00 t i m e s t h e p o t e n c y o f a - M S H , j8D i s u l fi d e f o r m a t i o n f r o m t h e C t o N t e r m i n u s o f a p e p t i d e f r a g m e n t c a na l s o i m p r o v e p o t e n c y . T h e c y c l i c d i s u l f i d e s d e r i v e d f r o m A c - A r g - G l y -A s p - S e r - N H 2 h a v e r e c e n t l y b e e n s h o w n t o h a v e d r a m a t ic a l ly h ig h e r an ti -

~5 L . H . C a p o r a l e , M . C h o r e v , J . L . L e v y , M . E . G o l d m a n , P . A . D e H a v e n , C . T . G a y ,J . E . Re a g e n , M . Ro s e n b l a t t , a n d R . F . N u t t , in P e p t i d e s : C h e m i s t ry a n d B i o l o g y ( G .R . M a r s h a l l , e d . ) , p . 4 49 . E S C O M S c i e n c e P u b l is h e r s , L e id e n , T h e N e th e r l a n d s , 1 98 8.J6 V . J . H r u b y , S . F a n g , R . K n a p p , W . K a z m ie r s k i , G . K . L u i , a n d H . I . Y a m a m u r a , in

P e p t i d e s : C h e m i s t r y a nd B i o l o g y ( J . E . R i v i e r a n d G . R . M a r s h al l, e d s .) , p . 53 . E S C O MS c ie n c e P u b l i s h e r s , L e id e n , T h e N e th e r l a n d s , 1 99 0.J7 j . S a m a n e n , D . N a r in d r a r y , W . A d a m s , T . Ca s h , T . Y e l l i n , a n d D . Re g o l i , J M e d C h e m31, 510 (1988).18 T . K . S a w y e r , V . J . H r u b y , P . S . D a r m a n , a n d M . C . H a d l e y , P r o c N a t l A c a d S c i

U S A 79, 1751 (1982).


7/13

4 4 2 P R O T E I N S A N D P E P T I D E S : P RI NC IP L ES A N D M E T HO D S [ 2 0 ]agg r ega t o r y ac t i v i t y t han t he pa r en t pep t i de . 19 C yc l i za t i on v i a an ami deb o n d r e p r e s e n t s a n a l t e r n a t i v e t o d i su l fi d e b o n d f o r m a t i o n . I n t h e h i g h l ya c t i v e s o m a t o s t a t i n a n a l o g c y c l o P r o - P h e - D - T r p - L y s - T h r - P h e ) , 9 o f t h e 14a m i n o a c i d s o f s o m a t o s t a t i n w e r e r e p l a c e d w i t h a si n gl e P r o r e s i d u e w i t he n h a n c e m e n t o f a c t iv i ty . 2T h r o u g h s y n t h e s i s a n d s u b s e q u e n t b io l o g ic a l t e s ti n g t h e a b o v e m e t h o d sa r e u s e d t o c o n f i rm e l e m e n t s o f s e c o n d a r y s t r u c t u re n e c e s s a r y f o r b io lo g i-c a l a c ti v i ty . T h e s e m e t h o d s o f l o c a l ly s ta b il iz in g s e c o n d a r y s t r u c t u r e a r et y p i c a l l y a p p l i e d i n re g i o n s o f t h e p e p t i d e w h e r e c o n f o r m a t i o n a l e l e m e n t sa r e s u s p e c t e d . E v i d e n c e f o r t h e e x i s t e n c e o f s t ru c t u ra l c o m p o n e n t s th a td e t e r m i n e p e p t i d e c o n f o r m a t i o n c a n c o m e f r o m d a t a o b t a i n e d t h r o u g hp h y s i c a l e x p e r i m e n t , n a m e l y , N M R , o r m o l e c u l a r m o d e l in g , H o w e v e r ,s e v e r a l e m p i ri c a l m e t h o d s e x i st w h i c h a t t e m p t t o p r e d i c t s e c o n d a r y s t ru c -t u r e fr o m a m i n o a c i d s e q u e n c e a l o n e.

mpirical MethodsT h e C h o u - F a s m a n m e t h o d zl h a s b e c o m e t h e m o s t p o p u l a r o f t h e s e c -o n d a r y s t r u c t u r e p r e d i c t i o n t e c h n i q u e s 22 p r i m a r i l y b e c a u s e i t is e a s y t o

u s e . A f u l l r e v i e w o f s u c h m e t h o d s i s b e y o n d t h e s c o p e o f t h is c h a p t e r .B o t h e x a m p l e s a t t h e e n d o f t hi s c h a p t e r a ll u d e t o th e u s e o f C h o u - F a s m a np r e d i c t i o n s t o c o n f i r m e l e m e n t s o f s e c o n d a r y s t r u c t u r e . A l t h o u g h t h et e c h n i q u e h a s b e e n s u c c e s s f u l l y a p p l i e d t o a n u m b e r o f s m a l l p e p t i d e s ,u s ua l l y hav i ng a t l e a s t l 0 r e s i dues , i t s hou l d be no t ed t ha t t he r u l e s ,b a s e d o n s t a ti s ti c a l a n a l y s i s in l a rg e g l o b u l a r p r o t e i n s, m a y n o t b e d i r e c t l ya p p l i c a b le t o s m a l l p e p t i d e f r a g m e n t s .

I n t h e a r e a o f s y n t h e t i c v a c c i n e s , a p e p t i d e f r a g m e n t o f t h e n a t i v ea n t i g e n i s e m p l o y e d in t h e h o p e t h a t i t, i n s t e a d o f t h e e n t i r e p r o t e i n , w i llb e s u i ta b l e f o r a c t i v e i m m u n i z a t i o n . A n e m p i r i c a l m e t h o d f o r fi n di n g s u c ha n t ig e n i c fr a g m e n t s , b a s e d o n m a x i m u m l oc a l h y d ro p h i l ic i ty ,z3 rep res en t sa n a l t e r n a t i v e t o t h e a p p r o a c h o f s y n t h e s i z i n g o v e r l a p p i n g p e p t id e s s p a n -n i ng t h e e n t i r e p r o t e i n c h a i n . 24 T h i s a p p r o a c h w a s u s e d , f o r e x a m p l e , t o19 F . E . A l i , R . C a l v o , T . R o m o f f , J . S a m a n e n , A . N i c h o l s , a n d B . S t o r e , in P e p t i d e s :

C h e m i s t r y a n d B i o l o g y ( J . E . R i v i e r a n d G . R . M a r s h a l l , e d s . ) , p . 9 4 . E S C O M S c i e n c eP u b l i s h e r s , L e i d e n , T h e N e t h e r l a n d s , 1 9 9 0 .

20 D . F . V e b e r in P e p t i d e s : S y n t h e s i s - S t r u c t u r e - F u n c t i o n ( D. H . R ic h a n d E . G r o s s ,e d s . ) , p . 6 8 5 . P i e r c e C h e m i c a l C o m p a n y , R o c k f o r d , I l l i n o is , 1 98 1.

2i p . y . C h o u a n d G . D . F a s m a n , Biochemistry 13, 222 (1974) .22 S e e a l s o M . L e v i t t , J Mol Biol 1 0 4 , 5 9 ( 1 9 7 6 ); F . R . M a x f i e l d a n d H . A . S c h e r a g a ,

Biochemistry 1 5 , 5 1 3 8 ( 1 9 7 6 ) ; G . D . R o s e a n d S . R o y , Proc Natl Acad Sci U S A 77 ,4643 (1980) .

23 T . P . H o p p a n d K . R . W o o d s , Proc Nat l Acad Sci U S A 78, 3824 (1981).24 A . L . K a z i m a n d M . Z . A t a s s i , Biochem J 191, 261 (1980).


8/13

[ 2 0 ] D E S IG N O F M I N I M U M A C T IV E P E P T ID E F RA G M EN T S 4 4 39 9 1 0 5 1 1 0H - S e r - L e u - A r g - A r g - S e r - S e r- C y s - P h e - G l y - G l y - A r g - X - A s p - A r g - I l e 1

C y s - G l y - l . e u 4 3 1 y - S e r - G l n - A l a - G l y

X = I l e ( r at , r a b b i t a n d m o u s e )X = M e t ( h u m a n , b o v i n e , p o r c i n e a n d c a n i n e )

F I G . 2 . A t r i a l n a t r i u r e t i c f a c t o r .

i d e n t i fy a n o n a p e p t i d e s e q u e n c e a s r e p r e s e n t i n g a ll o r p a r t o f t h e e s s e n t ia la d e t e r m i n a n t o f t h e 2 2 6 - a m i n o a c i d h e p a t i t is B s u r f a c e a n t i g e n . 25

xamp l e sT h e f o l l o w i n g e x a m p l e s f r o m t h e l it e r a tu r e i l l u st r at e t h e p r o c e s s o f

d e t e rm i n i n g a m i n im u m a c t i v e f r a g m e n t t h r o u g h s y s t e m a t i c d e l e ti o n s f r o mt h e C a n d N t e r m i n u s o f t w o b io l o g i c a l ly a c t i v e p e p t i d e s . B o t h e x a m p l e sa l s o d e m o n s t r a t e h o w , t h r o u g h c o n f o r m a t i o n a l r es t ri c ti o n e m p l o y i n g s o m eo f t h e m e t h o d s d i s c u s s e d a b o v e , th e s e f r ag m e n t s a r e m a d e m o r e p o te n t .

trial Natriuretic FactorA t r i a l n a t r i u r e t i c f a c t o r A N F ) F i g . 2 ) i s a 2 8 - a m i n o a c i d p e p t i d e

h o r m o n e w h i c h i s d e r i v e d f r o m a 1 2 6 - a m in o a c i d p r o h o r m o n e . I t i s s y n t h e -s i z e d i n a n d r e l e a s e d f r o m a t r i a l c a r d i o c y t e s a n d d i s p l a y s p o t e n t n a t r i -u r e t i c , d i u r e t i c , a n d v a s o r e l a x a n t a c t i v i t i e s .T h e e f f e c t s o f s y s t e m a t i c d e l e ti o n s o f am i n o a c i ds f ro m t h e a m i n o a n dc a r b o x y l e n d s o f A N F o n i t s a b i li ty t o re l ax r a b b i t s m o o t h m u s c l e a o rt icr in g s a r e s h o w n i n T a b l e 1. 26 D e l e t i o n o f S e r 99 a n d L e u 1 h a s n o t e f f e c t o nb i o l o g i c a l a c t i v i t y , a n d a c t i v i t y f a l l o f f o n l y s l i g h tl y w i t h f u r t h e r d e l e t i o n sf r o m t h e N t e r m i n u s . I n c o n t r a s t , w h e r e a s T y r ~26 i s n o t c r u c i a l f o r a c t i v i t y ,f u r t h e r d e l e t i o n s a t t h e C t e r m i n u s g r e a t l y r e d u c e a c t i v i ty . T h e a n a l o g w i t hb o t h t h e C - a n d N - t e r m i n a l t ai ls r e m o v e d h a s b e e n p r e p a r e d a n d f o u n d t o25 p . K . B h a t n a g a r , E . P a p a s , H . E . B l u m , D . R . M i li c h , D . N i t e c k i , M . J . K a r e l s , a n d

G . N . V y a s , Proc Natl Acad Sci U S A 79, 4400 (1982) .26 K . F . F o k , F . S . T j o e n g , J . A . H o u b i o n , K . L . S p e a r , S . T . N u g e n t , S . R . E u b a n k s ,M . E . Z u p e c , G . M . O l i n s , D . J . B l e h m , a n d S . P . A d a m s , in P e p t i d e s : S t r u c t u r e a n d

F u n c t i o n ( C . M . D e b e r , V . J . H r u b y , a n d K . D . K o p p l e , e d s . ), p . 9 5 3 . P i e r c e C h e m i c a lC o . , R o c k f o r d , I l l i n o i s , 1 9 8 5 .


9/13

444 P R O T E I N S A N D P E P T I D E S : P R I N C I P L E S A N D M E T H O D S [2 ]T A B L E I

RELATIVE POTENCIES OF TRUNCATED A T~ A L NAT~URETIC FACTOR ANALOGSA n a l o g

C T e r m i n u s N T e r m i n u s R e l a ti v e p o t e n c yH - S e r - L e u - A r g - A r g - S e r - S e r A s n - S e r - P h e - A r g - T y r - O H 1 .0

H - A r g - A r g - S e r - S e r A s n - S e r - P h e - A r g - T y r -' O H 1 .0H - A r g - S e r - S e r A s n - S e r - P h e - A r g - T y r - O H 0 .5

H - S e r - S e r A s n - S e r - P h e - A r g - T y r - O H 0 .2H - S e r - S e r A s n - S e r - P h e - A r g - O H 0 .4H - S e r - S e r A s n - S e r - P h e - O H 0 .0 8H - S e r - S e r A s n - S e r - O H 0 .0 0 3

a R a b b i t a o r t a .

b e a f u ll a g o n i s t in vitro a n d in vivo a lt h ou g h o f r e d u c e d p o t e n c y c o m p a r e dt o t h e i n t a c t h o r m o n e . 27A s t r u c t u r e - a c t i v i t y s t u d y o f t h e c o r e s e q u e n c e 1 0 5 -1 2 1 ) h a s b e e np e r f o r m e d . 28 C h o u - F a s m a n a n a l y s is o f th e c o r e s e q u e n c e 1 0 5- 12 1 s ug -

g e s t e d t h e p r e s e n c e o f t w o tu r n s a t 1 0 5 - 1 0 8 a n d 1 1 6 - 1 1 9 . S u b s t i t u t i o n o fo - A l a f o r G l y 17 o r P r o f o r G l y 18 r e s u l t e d i n a c t i v e a n a l o g s , p r o v i d i n gf u r t h e r e v i d e n c e t h a t r e s i d u e s 1 0 5 - 1 0 8 m a y b e i n v o l v e d i n a t u rn . D e l e t i o no f G l y 17 o r G l y Ia g a v e a n a l o g s w i t h r e d u c e d a c t i v i t y , w h e r e a s d e l e t i o n o fg l y c i n e s o u t s i d e t h i s p u t a t i v e t u r n w e r e b e t t e r t o l e r a t e d . S u b s t i t u t i o n o fD - S e t , D - A l a , o r P r o f o r S e r N7 r e s u l t e d i n a c t i v e a n a l o g s , s u p p o r t i n g t h ep o s s i b i l i t y o f a t u r n i n t h i s r e g i o n , b u t s in g l e a m i n o a c i d s u b s t i t u t i o n ss u g g e s t e d t h a t n o r e s i d u e s c r i ti c a l f o r a c t i v i t y w e r e f o u n d i n t h e s e q u e n c e1 1 6 - 1 1 9 . D e l e t i o n o f t h e 1 1 6 - 1 1 9 t u r n a n d t h e g l y c i n e s a t 1 14 a n d 1 20y i e l d e d t h e d e c a p e p t i d e I . T h i s p e p t i d e r e l a x e d r a b b i t a o r ti c r in g s s l ig h tl yl e ss th a n A N F 1 0 5 - 1 2 1 ) . H o w e v e r , i t w a s f o u n d t ha t I e x h i b it e d p r e s s o ra c t i v i t y i n a n e s t h e s i z e d r a t s a n d t h a t a m i n o a c i d s f r o m t h e C t e r m i n u sP h e - A r g ) a n d N t e r m i n u s S e r - S e r ), p e p t i d e I f , w e r e r e q u i r e d f o r in vivoa c t i v i t y . 29 T h r o u g h s y s t e m a t i c r e p l a c e m e n t o f e a c h a m i n o a c i d w i t h i ts D27 G . P . B u d z i k , S . L . F i r e s t o n e , E . N . B u s h , P . J. C o n n o l l y , T . W . R o c k w a y , V . S a r i n , a n d

W . H . H o l l e m a n , B i o c h e m B i o p h ys R e s C o m m u n 144, 422 (1987) .28 T . W . R o c k w a y , P . J . C o n n o l l y , E . M . D e v i n e , J r . , G . P . B u d z i k , A . M . T h o m a s , Y . K i s o ,

a n d W . H . H o l l e m a n , in P e p t i d e s : C h e m i s t r y , S t r u c t u r e a n d B i o l o g y ( J. E . R i v ie r a n dG . R . M a r s h a l l , e d s . ) , p . 24 4 . E S C O M S c i e n c e P u b l i s h e r s , L e i d e n , T h e N e t h e r l a n d s , 1 9 90 .

z9 T . W . R o c k w a y , G . P . B u d z i k , E . N . B u s h , P . J . C o n n o l l y , S . K . D a v i d s e n , E . D . D e v i n e ,S . D . L u c a s , T . W . v o n G e l d e r n , a n d W . H . H o l l e m a n , in P e p t i d e s : C h e m i s tr y , S t r u c t u rea n d B i o l o g y ( J . E . R i v i e r a n d G . R . M a r s h a l l , e d s . ) , p . 2 5 2 . E S C O M S c i e n c e P u b l i s h e r s ,L e i d e n , T h e N e t h e r l a n d s , 1 9 9 0 .


10/13

[ 2 0 ] D E S IG N O F M I N I M U M A C T IV E P E P T ID E F RA G M EN T S 4 4 5i s o m e r , i t w a s f o u n d t h a t D - A r g 19 a n d D Arg 112 r e s u l t e d i n i m p r o v e da c t i v i t y .

1 0 5 1 1 0 1 1 4X - C y s - P h e - G l y - G l y - A r g - I l e - A s p - A r g - I l e - C y s - Y

(I ) X = H , Y - - O H( I I) X = H - S e r -S e r , Y = P h e - A r g - O H

T h e i m p o r t a n c e o f t h e i n d i v id u a l a m i n o a c i d s i d e c h a i n s w a s a l s oi n v e s t i g a t e d b y s y s t e m a t i c a l l y s u b s t i t u t i n g A l a a l o n g t h e A N F p e p t i d ec h a i n . 3 I t w a s f o u n d t h a t t h e s i d e c h a i n s o f A r g ~9 a n d G i n ~ 6 w e r e n o tn e c e s s a r y f o r v a s o r e l a x a n t p o t e n c y . O t h e r s u b s t i t u t i o n s w i t h i n t h e r i n g o fA N F d e c r e a s e d a c t iv i ty e x c e p t t h o s e a t G l y TM G ly H8, and G ly ~2, w hi chi n c r e a s e d a c t i v i t y 1 t o 2 - f o ld .

F i n a l l y , b i c y c l i c a n a l o g s w e r e p r e p a r e d i n a n a t t e m p t t o r e s t r i c t t h ec o n f o r m a t i o n a l f r e e d o m a n d i n c r e a s e t h e p o t e n c y o f t h e a n a l o g s . 3~ O n es u c h a n a l o g , II I , b o u n d t o r a b b i t a d r e n a l r e c e p t o r s 3 5 0 n M ) a n d p r o d u c e da 1 0 - fo l d i n c r e a s e i n n a t r i u r e s i s a t a n i n f u s i o n o f 1 5 0 / z g / k g /m i n .

|H S e r S e r C y s P h e G l y G l y I l e C y s D A r g C y s l l e C y s P h e A r g O H( I I I )

Growth Hormone Releasing FactorG r o w t h h o r m o n e - r e l e a s in g f a c t o r s G R F s ) a r e h y p o t h a l a m i c p e p t i d e s

w h i c h r e g u la t e th e s y n t h e s i s a n d re l e a s e o f g r o w t h h o r m o n e G H ) . H u m a nG R F F i g . 3) i s a 4 4 - a m i n o a c i d p e p t i d e t h a t h a s b e e n s h o w n t o st i m u l a t et h e s e c r e ti o n o f G H in vitro a n d in vivo i n h u m a n s a s w e l l a s o t h e rv e r t e b r a t e s .

T h e a b i l i ty o f G R F f r a g m e n t s , s y s t e m a t i c a l l y s h o r t e n e d a t t h e C te r m i -30 R . F . N u t t , T . M . C i c c a r o n e , S . F . B r a d y , C . D . C o l t o n , W . J. P a l e v e d a , T . A . L y l e ,

T . M . W i l li a m s , D . F . V e b e r , A . W a l l a c e , a n d R . J. W i n q u i s t , n P e p t i d e s : C h e m i s t r y ,S t r u c t u r e a n d B i o l o g y ( J . E . R i v i e r a n d G . R . M a r s h a l l , e d s . ) , p . 4 4 4 . E S C O M S c i e n c eP u b l i s h e r s , L e i d e n , T h e N e t h e r l a n d s , 1 9 9 0 .

31 T . W . R o c k w a y , E . T . O l e j n i c z a k , E . M . D e v i n e , J r . , G . P . B u d z i k , T . J . O p g e n o r t h , a n dW . H . H o l l e m a n , n P e p t i d e s : C h e m i s t ry , S t r u c t u re a n d B i o l o g y ( J. E . R i v ie r a n dG . R . M a r s h a l l , e d s . ) , p . 2 4 9 . E S C O M S c i e n c e P u b l i s h e r s , L e i d e n , T h e N e t h e r l a n d s , 1 99 0.


11/13

44 6 PROTEINS AND PEPTIDE S: PRINCIPLES AND METHODS [2 0]1 5 10 15H T y r A l a A s p A l a U e P h e T h r A s n S e r T y r A r g L y s V a l L e u G l y G l n

2 0 2 5 30Leu-Ser -Ala -Arg-Lys -Leu-Leu-Gln-Asp- I l e -Met -Ser -Arg-Gln-Gln-Gly-35 4O 44Glu-Ser -Asn-Gl r t -Glu-Arg-Gly-Ala -Arg-Ala -Arg-Leu-NH

FIG. 3. Grow th h ormone-releasing factor.

n u s , t o r e l e a s e G H i n r a t a n t e r i o r p i t u i t a r y c e l ls is s h o w n in T a b l e I I . 3zA c t i v i t y d e c r e a s e d g r a d u a l l y to th e G R F 1 - 3 l ) a n a l o g . T h i s a n a l o g a n d t h en e x t t w o d e l e t i o n s , G R F 1 - 3 0 ) a n d G R F I - 2 9 ) , w e r e a lm o s t e q u i p o te n t .H o w e v e r , w i t h f u r t h e r d e l e t i o n s f r o m t h e C t e r m i n u s t h e a c t i v it y f e l ls h a r p l y . T h e s e d a t a a n d o t h e r s 33 s u g g e s t e d t h a t o n l y t h e N - t e r m i n a l 2 9r e s id u e s o f G R F w e r e r e q u i re d f o r f ul l i n v i t r o a c t i v i t y .

F r o m s u b s t i t u t io n s o f D - a m i n o a ci d s a t t h e N t e r m i n u s i t w a s f o u n dt h a t t h e o - T y r ~, o - A l a 2, a n d D - A s p 3 a n a l o g s w e r e a p p r o x i m a t e l y 5 0, 10,a n d 7 t i m e s m o r e a c t i v e t h a n G R F 1 - 2 9 ) N H 2 .34 T h e 1 - 2 9 s e q u e n c e w a ss u b j e c t e d to C h o u - F a s m a n a n a l y s i s , w h i c h p r e d i c t e d a r e v e r s e tu r n f r o mr e s i d u e s 6 to 1 0 a n d a n o ~ -h e li ca l s t r u c t u r e f r o m 1 6 t o 2 6 . 35 T h e p o s s i b i l i t yo f a f l b e n d f r o m 6 to l 0 w a s s u p p o r t e d b y t h e a c t i v i t y o f t h e o - A s n 8a n a lo g , w h i c h d i s p l a y e d o v e r t w i c e t h e p o t e n c y o f G R F 1 - 2 9 ) N H 2. Inc o n t r a s t , t h e o - P h e 6 a n d o - T h r 7 a n a l o g s w e r e v i r tu a l ly i n a c t i v e . T h e s o lu -t io n s t r u c t u r e o f N l e E 7 G R F 1 - 2 9 ) N H 2 w a s i n v e s t i g a te d b y c i r c u l a r d i c h r o -i s m a n d 2 D N M R . 36 A n a l y s i s o f th e C D s p e c t r a i n d i c a te d t h a t a b o u t 2 3 t o2 5 r e s i d u e s w e r e i n a h el ic a l s t a te , a n d 2 D N M R e x p e r i m e n t s s u g g e s t e dr e g i o n s o f et h e l i x b e t w e e n r e s i d u e s 6 t o 13 a n d 16 t o 29 . A n a l o g s o fG R F 1 - 2 9 ) N H 2 w e r e s y n t h e s i z e d w i th v a r i o u s h y d r o p h o b i c r e s i d u e s r e-p l a c i n g G l y ~s i n a n e f f o r t t o e x t e n d t h e 16 t o 2 9 h e l i ca l s e g m e n t a n dm a x i m i z e t h e a m p h i p h i l i c c h a r a c t e r o f t h is r e g i o n . R e p l a c e m e n t o f G l y 15w i t h th e h y d r o p h o b i c , h e l i x - f o r m i n g a m i n o a c id s A l a , L e u , V a l , o r A i br e s u l t e d in i n c r e a s e d p o t e n c y , w h e r e a s s u b s t i t u t io n w i t h S a t , a h e l i x -

32 N. Ling, A. Baird, W . B. W ehrenberg, N. Ueno, T. M unegum i, and P. Brazeau, B i o c h e m .B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 123 , 854 1984).33 j. Rivier, J. S piess, M . Thorner, and W . Vale, N a t u r e L o n d o n ) 3110, 276 1982).34 V. A . L anc e, W . A. M urphy, J . Sueiras-Diaz, and D. H . Co y, B i o c h e m . B i o p h y s . R e s .C o m m u n . 119, 265 1984).35 D. H . Co y, W. A . Murph y, J. Sueiras-Diaz, E. J. Coy, and V. A. L ance, J . M e d . C h e m .28, 181 1985).36 C. M . Ciore, S. R. M artin, and A. M . Grone nbo rn, J . M o l . B i o l . 191, 553 1986).


12/13

[ 2 0 ] D E S I G N O F M I N I M U M A C TIV E P E P T ID E F R AG M E N TS 4 4 7T A B L E I I

RELATIVE POTENCIES OF TRUNCA TEDGROWTHHORMONE-RELEASING FACTOR ANALOGS

A n a l o g R e l a t i v e p o t e n c y ~GRF ( 1 - 4 4 ) 1 .0GRF ( 1 - 4 0 ) 0 .9 1G R F ( 1 - 3 7 ) 0 . 5 0GRF ( 1 - 3 4 ) 0 .2 3GRF ( 1 - 3 1 ) 0 .6 8G R F ( I - 3 0 ) 0 . 5 1G R F ( I - 2 9 ) 0 . 5 1GRF ( 1 - 2 7 ) 0 .1 2GRF ( I - 2 3 ) 0 .0 0 2 4GRF ( I - 2 2 ) 0 .0 0 0 0 1Ra t a n t e r i o r p i t u i ta r y c e l l s .

b r e a k i n g r e s i d u e , r e s u l t e d i n a lo s s o f p o t e n c y . 37 A n a l y s i s o f t h e c o n f o r m a -t i o n o f [ A l a l S ] G R F ( 1 - 2 9 ) N H 2 b y 2 D N M R a n d m o l e c u l a r d y n a m i c s c o n -f i r m e d t h e e n h a n c e d s e c o n d a r y s t r u c t u r e . 38

A d i a m i n o p e p t i d a s e w h i c h r e c o g n i z e s t h e N - t e r m i n a l T y r - A l a - s e -q u e n c e i s t h o u g h t t o b e r e s p o n s i b l e f o r th e r e la t i v e ly s h o r t n v vo hal f -l if e o f G R F . A n a l o g I V , [ d e s - T y r 1 ,D - A l a 2 , A I a I S ]G R F ( 1 - 2 9 )N H 2 , h a d as u b s t a n t i a l l y l o n g e r s e r u m h a l f - l i f e a n d w a s a p p r o x i m a t e l y 5 t i m e s m o r ep o t e n t n v tr o t h a n G R F ( 1 - 4 4 ) N H 2 . 3 9 A s e r i e s o f c y c l i c a n a l o g s b a s e do n I V w a s p r e p a r e d . 4 O f t h e s e c o m p o u n d s c yc lo 2~ ,2 5- [d e s- T yr ~,D -A la2 ,A IaIS ]G R F (1-2 9)N H 2 V an d cyc loS n;21 2L[des-Tyrl,D-Ala2 ,Ala 15]G R F ( 1 - 2 9 ) N H 2 V I d i s p l a y e d , r e s p e c t i v e l y , 1 .3 3 a n d 3 .9 1 r e la t iv e p o t e n c -ie s to G R F ( 1 - 4 4 ) N H 2 .37 A . M . F e l i x , E . P . He im e r , T . F . M o wle s , H . E i s e n b e i s , P . L e u n g , T . L a m b r o s , M .A h m a d , a n d C . - T . W a n g , n P r in c ip l e s 1 9 8 6 , P r o c e e d in g s o f t h e 1 9th E u r o p e a n P e p t i d e

S y m p o s iu m ( D . T h e o d o r o p o lo u s , e d .) , p . 4 81 . d e Gr u y t e r , Be r l in , 1 98 6.38 V . M a d i s o n , Z . B e r k o v i t c h - Y e l l i n , D . F r y , D . Gr e e ly , a n d V . T o o m e , n S y n t h e t i c

P e p t id e s : A p p r o a c h e s t o B i o l o g ic a l P r o b le m s . U C L A S y m p o s i a o n M o l e c u l a r a n d C e l l u la rB i o lo g y ( J . T a m a n d E . T . K a i s e r , e d s . ) , Vo l . 86 , p . 1 0 9 . A la n R . L i s s , N e w Yo r k , 1 98 9.39 E . P . He im e r , M . Ah m a d , T . L a m b r o s , T . M c G a r ty , C . - T . W a n g , T . F . M o wle s , S . M a in e s ,a n d A . M . F e l i x , n S y n t h e t i c P e p t i de s : A p p r o a c h e s t o B i o l o gi c a l P r o b le m s . U C L AS y m p o s i a o n M o le c u l a r a n d Ce l l u l a r B io lo g y ( J . P . T a m a n d E . T . Ka i s e r , e d s .) , Vo l . 86 ,p . 309 . Alan R. L iss , New York , 1989 .

40 A . M . F e l i x , C . - T . W a n g , E . P . He im e r , R . M . Ca m p b e l l , V . S . M a d i s o n , D . F r y , V . T o o m e ,T . R . D o w n s , a n d L . A . F r o h m a n , n P e p t i d e s : C h e m i s t ry , S t ru c t u r e a n d B i o l o g y ( J.E . R iv i e r a n d G . R . M a r s h a l l, e d s . ) , p . 22 6. E S C O M S c i e n c e P u b l i s h e r s, L e id e n , T h eNether lands , 1990 .


13/13

4 4 8 P ROTE INS AN D P E P T I DE S : P RINCI PL E S AND M E T HODS [ 2 0 ]2 5 10 15H - D - A l a - A s p - A l a - I l e - P h e - T h r - A s n - S e r - T y r - A r g - L y s - V a l - L e u - A l a - G l n -

2 0 2 5 2 9L e u - S e r - A l a - A r g - L y s - L e u - L e u - G l n - A s p - I l e - M e t - S e r - A r g - N H 2I V )

H D A l a A s p A l a I l e P h e T h r A s n S e r T y r A r g L y s V a l L e u A l a G l nI IL e u - S e r - A l a - A r g - L y s - L e u - L e u - G l n - A s p - I l e - M e t - S e r - A r g - N H 2

v)I IH D A l a A s p A l a I l e P h e T h r A s p S e r T y r A r g L y s V a l L e u A l a G l n

I IL e u - S e r - A l a - A r g - L y s - L e u - L e u - G l n - A s p - I l e - M e t - S e r - A r g - N H 2vI)

C onc l us i onD e f in i n g t h e m i n i m u m a c t i v e f r a g m e n t o f a b i o lo g i c a ll y a c t iv e p e p t i d e

a n d t h e n a t t e m p t i n g t o d i s c o v e r i t s b i o l o g i c a l l y a c t i v e c o n f o r m a t i o nt h r o u g h t h e s y n t h e s i s o f c o n f o r m a t i o n a l ly re s t ri c t e d a n a lo g s , c o m b i n e dw i t h t h e a p p l i c a t io n o f e x p e r i m e n t a l a n d t h e o r e t i c a l m e t h o d s t o th e i ra n a l y s i s , r e p r e s e n t a p o w e r f u l a p p r o a c h t o d r u g d i s c o v e r y . S u c h s t u d i e sc a n r e s u l t i n s m a l l, h i g h l y p o t e n t p e p t i d e s o f e q u a l o r e v e n g r e a t e r p o t e n c yt h a n t h e o r i g in a l p e p t i d e . H o w e v e r , i t s h o u l d b e c a u t i o n e d t h a t d e l e ti o n so f a m i n o a c i d s f r o m a b i o lo g i c a ll y a c t i v e p e p t i d e c a n h a v e d r a m a t i c e f f e c t so n b i o lo g i c a l a c t i v i t y . F o r e x a m p l e , i t w a s d i s c o v e r e d t h a t P T H f r a g m e n t sw i t h C - t e r m i n a l d e l e t i o n s , n a m e l y , [ T y r 3 4 ]P T H 1 - 3 4 )N H 2 , w e r e a g o n i st sw h e r e a s f r a g m e n t s c o n t a i n i n g N - t e r m i n a l d e l e t i o n s , n a m e l y [ T y r34]P T H 7 - 3 4 ) N H 2 , d i s p la y e d a n t a g o n i sm . A l so , it sh o u ld b e m e n t i o n e d th a tn o t a ll n a t u r a l ly o c c u r r i n g p e p t i d e s , f o r e x a m p l e , b r a d y k i n i n , c a n b e e a s i lys h o r t e n e d f r o m t h e C o r N t e r m i n u s w i t h o u t d r a s t ic a l l y r e d u c i n g a c t iv i t y .R e s e a r c h i n t h i s a r e a h o l d s t h e p r o m i s e t h a t o n e d a y w e w i l l b e a b l e t od e s i g n p e p t i d e s o f d e f i n e d s tr u c t u r e w i t h u n p r e c e d e n t e d b i o lo g i c al a c-t ivi ty .

Documents

Design of Minimum Active Fragments