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Artrópodos y Salud Septiembre-Diciembre, 2014. Vol. I No. 2 Detección de resistencia a insecticidas en mosquitos con
énfasis en Aedes aegypti
21
Detección de resistencia a insecticidas en mosquitos con énfasis en
Aedes aegypti
Adriana E. Flores
Universidad Autónoma de Nuevo León, Facultad de Ciencias Biológicas. Av. Universidad s/n Cd.
Universitaria, San Nicolás de los Garza, N.L. 66455. México. [email protected],
Resumen
La vigilancia de la resistencia a insecticidas es un paso esencial en el manejo integrado de vectores,
para proveer datos que permitan programar y planear la selección adecuada y racional de insecticidas con
un impacto económico y ambiental bajo. De igual manera, el detectar la resistencia en etapas tempranas
permitirá también la implementación de una estrategia de manejo de la resistencia además de otras
alternativas de control. Varias técnicas se han desarrollado para la detección de la resistencia a insecticidas
en mosquitos vectores de enfermedades, aquí se presentan y contrastan las técnicas basadas en bioensayos
y se mencionan algunas otras para estudios más extensivos sobre los mecanismos responsables de la
resistencia.
Palabras clave: insecticidas, resistencia, mosquitos.
Introducción
Dengue es una de las mayores
preocupaciones en salud pública en regiones
tropicales y sub-tropicales del mundo. Es la
enfermedad viral transmitida por vectores de
más amplia distribución, con un incremento de
30 veces en su incidencia global en los últimos
50 años. La organización Mundial de la Salud
(38
) estima que al menos la mitad de la población
mundial vive en zonas donde el dengue es
endémico, ocurriendo de 50-100 millones de
infecciones cada año, con una rápida
propagación en zonas anteriormente no afectadas
(14, 26
); cada año, cientos de miles de casos
severos surgen, incluyendo 2000 defunciones
(24
). Números reales de la enfermedad son
probablemente peores, debido a que existe un
sub-registro y una clasificación errónea de casos
de dengue (48,3
).
Para el 2012, el dengue representa la
enfermedad viral más importante transmitida por
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mosquitos a nivel mundial. Los brotes superan la
carga en los sistemas de salud y la economía de
la mayoría de los países tropicales. La
emergencia y diseminación de los cuatro
serotipos de virus de dengue (DENV) de Asia a
las Américas, África y regiones mediterráneas
del este representa una amenaza de pandemia.
Aunque la carga mundial total de la enfermedad
es aún incierta, los patrones son alarmantes para
la salud humana y la economía.
La disponibilidad de una vacuna segura y
eficaz alteraría significativamente la idea de la
prevención de dengue. Sin embargo, el futuro de
la misma aún es incierto (38
).
El mosquito Aedes aegypti (L.) es el
principal vector de dengue, aunque Ae.
albopictus es un vector secundario en Asia, se
encuentra distribuido en Norte América y
Europa. Además de estas dos especies bien
establecidas Ae. polynesiensis (en la Polinesia
Francesa, Islas Cook y Wallis y Futuna) y Ae.
sctutellaris (en Nueva Guinea) han mostrado ser
vectores eficientes (42
). Ae. hensilli fue
identificado como un vector en la Micronesia (45
)
y Ae. frucifer y Ae. luteocephalus son
reconocidos como probables vectores selváticos
en el oeste de África.
El control de los vectores de dengue consta
principalmente de una reducción de fuentes de
proliferación de los mosquitos: eliminación de
los depósitos favorables para ovoposición y
desarrollo de las forma acuáticas. Algunas veces
esto va acompañado de tapar los recipientes o
matando a las formas acuáticas con el uso de
larvicidas, los cuales pueden tener una variada
persistencia y/o eficacia. Aunado a esto, la
constante vigilancia entomológica para
identificar criaderos productivos puede ser más
efectivo que tener que tratar todos los criaderos
potenciales (49
). El grado en el cual las
poblaciones inmaduras son reducidas por la
acción de estas acciones de control, impacta
significativamente en la incidencia de la
enfermedad en cualquier localidad endémica.
Por otro lado, la aplicación espacial de
insecticidas para las formas adultas es
recomendada para el control de los vectores
durante epidemias, sin embargo su eficacia en
otras situaciones no ha sido aún bien
documentada (21
). La aplicación dentro de las
casas es una labor intensiva y en muchas
regiones impráctica cuando suceden brotes de la
enfermedad. Los tratamientos residuales están
destinados a reducir la densidad de vectores y su
longevidad. Aunque la aplicación de insecticidas
dentro de las casas es con frecuencia exitosa para
el control de los vectores de malaria, su efecto en
Aedes spp con frecuencia no es comparable
porque la preferencia de posarse dentro de la
casa es incierta. Se requiere aún más
investigación acerca del efecto de insecticidas
residuales sobre cortinas, cubiertas de depósitos,
pantallas y otros materiales que tengan
aceptación por la comunidad.
El uso de insecticidas químicos, ha
constituido la herramienta más poderosa y de uso
más extendido para controlar las enfermedades
transmitidas por vectores. La aplicación
sistemática e indiscriminada de plaguicidas y el
deterioro de los programas de control se debe en
gran parte a la resistencia que los vectores han
desarrollado hacia los insecticidas.
La resistencia a insecticidas ha sido objeto
de múltiples estudios, no solo por ser ejemplo de
adaptabilidad de los insectos, sino porque es el
principal motivo que favorece la transmisión de
muchas enfermedades. Se han estandarizado
bioensayos, técnicas bioquímicas y más
recientemente pruebas de diagnóstico genético
para detectar y cuantificar la resistencia (8,9,16
).
Los bioensayos permanecen como el “estándar
de oro” para cuantificar la resistencia a
insecticidas. Los mosquitos se exponen a varias
dosis de insecticidas, ya sea grado técnico o
formulaciones de los insecticidas y/o sinergistas
y la mortalidad se monitorea a través del tiempo
o a través de varias generaciones. Este tipo de
ensayos sin embargo no identifican los
mecanismos de resistencia los cuales pueden ser
de tipo: 1) resistencia metabólica por niveles
elevados o actividad modificada de enzimas
previniendo que el insecticida alcance su sitio de
acción, o 2) resistencia en el sitio blanco la cual
involucra alteración de aminoácidos
responsables para el anclaje del insecticida en su
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sitio de acción resultando en una pobre eficacia
del insecticida(8)
. Los ensayos bioquímicos
permiten la detección de mecanismos específicos
de resistencia. Son útiles para determinar
potencialmente existencia de resistencia cruzada
y seleccionar insecticidas alternativos para una
rotación apropiada cuando se presenta resistencia
a un insecticida de uso común. En el área de
genética de la resistencia se han identificado
marcadores moleculares para detectar resistencia
al derribo (knock-down kdr) en mosquitos
vectores de enfermedades incluyendo Ae.
aegypti (4,30,31,40,41,44,43
). Kdr es un término
genérico aplicado a los insectos que fallan en
perder coordinación seguido de la exposición a
insecticidas como el DDT y piretroides, esto,
debido a una o más mutaciones en el gen para
del canal de sodio dependiente de voltaje.
A pesar de la disponibilidad del bioensayo,
pruebas bioquímicas y recientemente pruebas de
diagnóstico molecular, el monitoreo y manejo de
la resistencia a insecticidas es casi nulo o poco
desarrollado en muchos países donde los
insecticidas son usados extensivamente en
programas de control de vectores. Esto es
desafortunado, ya que en 1986 el Consejo
Nacional de Investigaciones Científicas (NRC
1986) reportó las estrategias para el manejo de
resistencia a insecticidas, considerando la
susceptibilidad a insecticidas como un “recurso
natural” en riesgo de agitarse si no se gestiona
adecuadamente. Esta línea de pensamiento ha
llevado al concepto de manejo de resistencia a
insecticidas (MRI) (8,12,16,18
).
En el presente documento se presentan los
métodos para el detección de la resistencia a
insecticidas en mosquitos con especial énfasis en
Aedes aegypti (L.), se contrastan ventajas y
limitaciones, y se detallan recomendaciones. El
monitoreo de la resistencia es necesario para
garantizar el uso de insecticidas efectivos y que
la política de cambio/rotación se haga con un
sólido fundamento científico. Esto deberá estar
coordinado a nivel local en conjunto con otros
programas de manejo de vectores además de
considerar el impacto del uso de los plaguicidas
de uso agrícola.
1. Técnicas para detección de resistencia
1.1 OMS Dosis-Respuesta
Este método se basa en el uso de
concentraciones fijas de un insecticida en un
tiempo de exposición determinado. Los
resultados se reportan en porcentaje de
mortalidad y/o efecto knockdown.
La OMS ha definido tradicionalmente sus
concentraciones discriminantes en una de dos
maneras como:
■ el doble de la concentración más baja que
dio sistemáticamente una mortalidad del 100%
después de 60 minutos exposición y un periodo
de mantenimiento de 24 horas con una cepa
susceptible o una población susceptible; o
■ dos veces el valor de CL99.9 según lo
determinado por las pruebas de susceptibilidad
de línea de base de una cepa susceptible o una
población susceptible.
Para la obtención de la concentración
discriminante o concentración diagnóstico es
necesario obtener la línea base de susceptibilidad
de referencia para cada insecticida en una
población “susceptible” de la especie
determinada (población susceptible es aquella
que no ha sido sometida a presión con
insecticida y en el que la presencia de individuos
resistentes es rara o ausente). Esto se consigue
mediante la exposición a una serie de
concentraciones de un insecticida dado (o a una
serie de tiempos a una concentración fija), y
trazando el porcentaje de mortalidad contra la
exposición en papel log-probabilidad con el fin
de estimar las dosis requerida para producir
diversos niveles de mortalidad (alternativamente,
este cálculo puede ser hecho usando un modelo
estadístico log-probit). Por este medio, es posible
derivar la concentración correspondiente a
99.9% de mortalidad (el valor de la CL99.9); a
este concentración existe una muy alta
probabilidad de obtener un 100% de mortalidad
en una población susceptible. Esta concentración
se conoce convencionalmente como la
concentración diagnóstico o discriminante
porque permite la discriminación de la respuesta
de insectos: los que morirán después de la
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exposición están etiquetados como susceptibles y
los que sobreviven como resistentes.
Una vez que se tienen las concentraciones
discriminantes establecidas para cada insecticida
bajo condiciones estandarizadas de laboratorio
utilizando cepas o poblaciones susceptibles ésta
se multiplica por un factor de 2, 3 o 4 para
determinar la dosis diagnóstico. La elección del
factor de multiplicación depende en el nivel de
discriminación deseado. Como se mencionó
anteriormente, la recomendación de la OMS es
del doble de la concentración más baja que
proporciona sistemáticamente el 100% de
mortalidad en una cepa o población susceptible
(33
).
Es importante reconocer que para las
especies de mosquitos que no son monitoreadas
rutinariamente y / o bajo situaciones nuevas en
las que no se dispone de datos de la línea base,
es necesario establecer primero la línea base de
susceptibilidad al insecticida deseado.
La Organización Mundial de la Salud ha
establecido el uso de concentraciones o dosis
diagnóstico para algunos insecticidas. En el caso
de adulticidas se hace a través de “kits” de
prueba los cuales consisten en cámaras de
exposición y papeles impregnados con el
insecticida.
El principio de este ensayo es exponer a los
mosquitos durante un tiempo dado en un tubo de
plástico especialmente diseñado forrado con un
papel de filtro tratado con una concentración
diagnóstico de insecticida. El kit puede ser
adquirido con instrucciones completas sobre su
uso (36
). Las dosis o concentraciones sugeridas
por la OMS (34
) se basan en ensayos realizados
en laboratorios de referencia.
Como tal, esta prueba está destinada a ser
utilizada como un sistema de vigilancia de
campo y herramienta de laboratorio con la
limitación de que se da poca información sobre
el mecanismo(s) responsable(s) de la resistencia
detectada. Además, para llevarla a cabo requiere
de la compra de todos los componentes de una
fuente centralizada. Este requisito elimina
algunos errores del operador y ayuda a asegurar
que los resultados pueden ser comparados entre
años y sitios. Sin embargo, también aumenta los
costos y la complejidad logística del ensayo y
limita su uso a las dosis de insecticida y
compuestos técnicos que se proporcionan de
forma centralizada. No se puede utilizar para
producir información relevante a nivel local
sobre la eficacia y la calidad de formulaciones de
insecticidas; además laboratorios locales no
puede modificar la dosis discriminante para
tratar, por ejemplo, con especies de mosquitos,
más pequeñas.
Para el caso de larvas la OMS también
establece las directrices sobre los ensayos en su
última revisión en el 2005 (37
).
La OMS (39
) en su reciente revisión sobre
“Test procedures for insecticide resistance
monitoring in malaria vector mosquitoes”
establece que las pruebas de susceptibilidad
establecidas por ese organismo deberán seguir
siendo el principal método por el cual se detecte
la resistencia. Sin embargo, se consideró
necesario, como una cuestión de cierta urgencia,
de actualizar las directrices existentes de
vigilancia de la resistencia con el fin de reflejar
las nuevas prioridades y las necesidades de
información y, en particular, para poner de
relieve la necesidad de precisión en la
identificación de las especies de mosquitos bajo
prueba. Lo anterior en virtud de que la
resistencia a los insecticidas también necesita ser
descrita en términos genéticos, por lo que se
recomienda además que el monitoreo de la
susceptibilidad rutinario sea complementado por
pruebas genéticas adicionales y pruebas
bioquímicas. Todas en conjunto son
herramientas importantes en la toma de
decisiones para el manejo de insecticidas a nivel
país.
1.1.1 Técnica de la OMS para la medición
de susceptibilidad en mosquitos adultos (OMS
2013).
Los papeles de la OMS son hojas de papel
filtro (12 X 15cm) impregnadas con la dosis
diagnóstico del adulticida, para el caso de Ae.
aegypti se presentan en la tabla 1 según la
publicación más actualizada (34
). Los papeles
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impregnados son preparados por un laboratorio
certificado en la Universidad Sains Malasia,
ubicada en Penang, Malasia. Cada una de las
hojas es insertada en forma de cilindro en cada
uno de los tubos de exposición. Se prepararán 4
tubos con papel impregnado con insecticida y 2
funcionarán como controles los cuales están
impregnados con aceite. La hojas deberá estar lo
más posible adheridas a las paredes de los tubos,
para ellos deberán colocarse sujetadores tipo clip
(incluidos en los “kits”) para asegurar la posición
del cilindro de papel dentro de cada tubo. Al
menos 20 a 25 mosquitos hembra sin
alimentación sanguínea y no más de 3 a 5 días de
edad deberán colocarse en los tubos de
exposición. El total de mosquitos para cada
insecticida será de 120 a 150. Una vez que los
mosquitos son transferidos a los tubos de
exposición estos deberán cerrarse y se expondrán
por el lapso de 1h (60 min). En caso de que haya
algún mosquito dañado al momento de ser
transferido deberá eliminarse. Pasado el tiempo,
los mosquitos serán forzados a moverse a los
tubos de observación y se les proporcionará en
algodón una solución azucarada. Los mosquitos
serán mantenidos en los tubos de recuperación
por un lapso de 24h (período de recuperación).
Durante este tiempo es importante mantener los
tubos con los mosquitos en la obscuridad y evitar
cambios extremos de temperatura, lo ideal sería
un insectario. Al término del período de
recuperación (24h) se contará y registrará el
número de mosquitos muerto. Cualquier adulto
capaz de volar se considerará vivo
independientemente del número de patas que le
queden. Cualquier mosquito derribado
independientemente si ha perdido patas o alas se
considerará moribundo y será considerado como
muerto.
Para completar cada prueba de
susceptibilidad, los mosquitos deberán ser
transferidos a tubos tipo Eppendorf (por
separado vivos y muertos) hasta que pueda ser
transferido a una instalación disponible para
verificar la especie o realizar pruebas
suplementarias en caso de que sea necesario.
1.1.1.1. Especímenes de prueba
Dentro de los factores a considerar al
momento de la selección de los especímenes de
prueba están las características de obtención de
los mismos y condiciones apropiadas para
someterlos a bioensayo. La edad, sexo, estado
fisiológico, la generación de prueba, la obtención
en campo, todos pueden ser factores que afecten
los resultados de los bioensayos. El uso de
machos no es recomendado para el monitoreo de
la resistencia ya que son más pequeños y frágiles
que las hembras, por lo que tienden a tener
mayor mortalidad en el control. Estudios
realizados con hembras adultas han demostrado
que la edad y el estado fisiológico puede influir
en la susceptibilidad a los insecticidas. Por lo
general se ha observado que a mayor edad las
hembras son menos resistentes a los insecticidas,
especialmente cuando la resistencia es conferida
por la presencia de enzimas de desintoxicación
cuya actividad tiende a declinar con la edad (11
).
Es por eso que se recomienda que las hembras
usadas en las pruebas de susceptibilidad se hagan
en hembras no alimentadas con sangre y de 3 a 5
días post-emergidas.
Para estandarizar la edad de las hembras, es
recomendable usar ya sea adultos obtenidos de
colectas de larvas (opción de preferencia) o si no
es posible usar la progenie F1 de mosquitos
hembra de campo. Si se obtienen larvas de
campo del mismo sitio de colecta en el mismo
tipo de criadero, las muestras deberán juntarse
con la finalidad de tener suficientes individuos
para las pruebas de susceptibilidad. Sin embrago,
las colecciones de larvas idealmente deberán ser
realizadas de un numero de diferentes criaderos
con la finalidad de evitar colectar individuos
provenientes de un simple lote de huevos
producto de una ovipostura. Lo anterior con la
finalidad de evitar tener en la muestra alta
proporción de individuos emparentados.
Considerando también que la variabilidad
genotípica de la progenie de una hembra adulta
está igualmente limitada, hembras silvestres
deberán ser capturadas idealmente de diferentes
sitios para garantizar una muestra representativa
de la población local. En la práctica esto
significa que al menos 30 lotes de huevos, más si
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hay una mezcla de especies, se deberán obtener
de las hembras silvestres.
Otra opción menos favorable es el uso de
hembras silvestres capturadas directamente en
campo. En este caso es necesario registrar el
estado fisiológico de los adultos antes de la
prueba (alimentación y gravidez). Si es necesario
las hembras pueden mantenerse con una solución
azucarada hasta que las pruebas se lleven a cabo.
Sin embargo, usar hembras directamente de
campo representa una desventaja en el sentido de
que los resultados en las pruebas de
susceptibilidad serán muy variables, se puede
subestimar la resistencia (28
).
1.1.1.2. Tamaño de muestra
Al menos 100 mosquitos deben ser probados
para cualquier insecticida en el a la dosis
diagnóstico, con al menos 4 repeticiones de 20-
25 mosquitos por prueba. Cuando no es posible
probar este número de mosquitos en un solo día,
las pruebas se pueden realizar en varios días. En
este caso, y para evitar múltiples
manipulaciones, los papeles impregnados pueden
permanecer en los tubos de prueba siempre que
se envuelvan en papel de aluminio y se
mantengan a 4°C entre las pruebas sucesivas.
Hay que considerar que se especifica un mínimo
de dos controles (50 mosquitos) con el fin de
mejorar la validez estadística de los resultados.
1.1.1.3. Condiciones ambientales
Múltiples investigaciones han establecido
que la temperatura ambiente puede influir en la
toxicidad de los insecticidas; del mismo modo la
humedad relativa se ha demostrado que afectan a
la supervivencia de los mosquitos durante el
periodo de mantenimiento. Por ello se
recomienda, que la temperatura y la humedad se
controlen durante los ensayos y los periodos de
mantenimiento (recuperación). Si es posible, las
pruebas deberán llevarse a cabo a 25 ° C ± 2 ° C
y 80% ± 10% HR. Durante el período de
exposición de 1h y el período de recuperación de
24h posterior, tanto la humedad relativa y la
temperatura (no deberá exceder 30°C) deberán
ser controladas y los valores máximos y mínimos
registrados al comienzo del período de
exposición y de nuevo al final del periodo de
recuperación (24h).
1.1.1.4. Frecuencia de las evaluaciones
La recomendación para el análisis de la
susceptibilidad de a las cuatro clases de
insecticidas aprobados por la OMS es de
probarse varias veces durante un año de acuerdo
con los cambios de estación y/o basado en el
calendario de los diferentes cultivos agrícolas de
la zona. Considerando el tiempo y la frecuencia
del análisis de la susceptibilidad se proponen
diversas estrategias:
A. El monitoreo de la resistencia a
insecticidas podría llevarse a cabo a través de
una red de sitios centinela, y que los sitios
seleccionados representen la variedad de zonas
ecológicas y de transmisión de enfermedades
particulares del vector.
B. Las pruebas podrían repetirse en los
mismos lugares con el fin de monitorear los
cambios en la susceptibilidad del mosquito con
el tiempo, dependiendo del tamaño de la
población de vectores.
C. Áreas en las que se utiliza el mismo
insecticida tanto para el control de vectores y
para fines agrícolas puede requerir supervisión
más intensiva debido al potencial para la
selección adicional en poblaciones del vector por
plaguicidas de uso agrícola.
1.1.1.5. Re-uso de los papeles impregnados
La eficacia de los papeles impregnados
disminuye con el número de usos y el número de
mosquitos probado, especialmente con
piretroides. La recomendación actual es que un
papel impregnado con insecticida no deberá
usarse más de 6 veces, el equivalente a exponer
aproximadamente 150 mosquitos. Para papeles
impregnados con insecticidas no-piretroides
permiten mayor re-uso (hasta 20 veces).
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1.1.1.6 Efecto de derribo (knockdown) y
mortalidad
Los piretroides y el DDT son insecticidas de
acción rápida que tienen un efecto knock-down).
Cuando se trata de la resistencia knock-down
(KDR), se ha demostrado que la tasa de derribo
(KD) es un indicador sensible para la detección
temprana de la resistencia. Las observaciones de
la cantidad de mosquitos derribados se hacen
durante la exposición en el período de 1h. Un
mosquito se considera derribado si no puede
permanecer de pie o volar en una forma
coordinada; éstos por lo general caen al fondo
del tubo de exposición. Se recomienda realizar
observaciones a intervalos regulares,
generalmente después de 10, 15, 20, 30, 40, 50 y
60 min, con la última observación justo antes de
transferir al tubo de observación. Si, después de
60 min, la tasa de derribados (KD) es inferior al
80%, se deberá hacer otro registro a los 80 min
de los mosquitos en los tubos de observación. En
poblaciones muy susceptibles, el registro de
derribo hacerse con mayor frecuencia, cada 3
min. Con estos datos se puede calcular la KD-50
o KD-95, sin embargo estas mediad no son
usadas rutinariamente para el monitoreo de la
susceptibilidad desde el punto de vista operativo.
1.1.1.7 Interpretación de resultados
Una mortalidad en el rango de 98-100%
indica susceptibilidad. Una mortalidad menor al
98% sugiere resistencia y requiere de mayor
investigación. Si la mortalidad observada
(corregir si es necesario) se encuentra en el
rango de 90-97%. La presencia de resistencia en
la población deberá ser confirmada. Esto debe
hacerse mediante bioensayos adicionales con el
mismo insecticida en la misma población o en la
progenie de los mosquitos que sobrevivieron
previamente (criados bajo condiciones de
insectario) y/o a través de ensayos moleculares
para los mecanismos de resistencia conocidos. Si
al menos dos ensayos de susceptibilidad
adicionales consistentemente muestran
mortalidad menor al 98%, la resistencia es
confirmada. Si la mortalidad es inferior al 90%,
la confirmación de la existencia de genes de
resistencia en la población de prueba con
bioensayos adicionales pueden no ser necesarios,
siempre y cuando los ensayos originales se
hayan realizado con un mínimo de 100
mosquitos. Sin embargo, la investigación
adicional de los mecanismos y distribución de
resistencia deben llevarse a cabo.
Cuando se confirma la resistencia, se deben
tomar medidas preventivas para manejar la
resistencia a insecticidas y para asegurar que la
eficacia de los insecticidas utilizados para el
control del vector se conserve.
Tabla 1. Dosis diagnóstico (concentraciones) (%) y tiempos de exposición (h) de adulticidas para
Aedes aegypti (OMS 1998).
Insecticida DD (%) Tiempo de exposición (h)
DDT 4 0.5
Dieldrin 0.4 1
Fention 0.25 1
Malatión 0.8 1
Propoxur 0.1 1
Lambda-cialotrina 0.03 1
Permetrina 0.25 1
1.1.2 Técnica de la OMS para la medición de
susceptibilidad en larvas de mosquitos (OMS
1981, 2005).
Los experimentos relacionados con el
establecimiento de dosis diagnóstico para el
monitoreo de la resistencia en larvas de
mosquitos forma parte de estudios fase I dentro
de la secuencia de la evaluación de larvicidas
(37
). El propósito de las pruebas de
susceptibilidad es el detectar la presencia de
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resistencia en una población larval tan pronto
como sea posible con la finalidad de planear
alternativas de control. Los bioensayos de tipo
dosis-respuesta son la base para determinar la
dosis discriminante de los insecticidas sobre
larvas de mosquitos.
1.1.2.1 Línea base de susceptibilidad y dosis
discriminante para larvas
Inicialmente, las larvas de mosquito son
expuestas a un rango de concentraciones
determinar el rango de actividad de los
insecticidas a prueba. Después de determinar la
mortalidad de las larvas en este rango
concentraciones, se establece un rango más
estrecho (de 4-5concentraciones, que arroje entre
10% y 95% de mortalidad en 24h-48h). Estos
resultados se utilizarán para determinar valores
de CL50 y CL90.
Lotes de 25 larvas de tercer o cuarto instar
se transfieren a recipientes, conteniendo de 100-
200 ml de agua. Las larvas dañadas deben ser
eliminadas y reemplazadas. La profundidad del
agua de los vasos debe permanecer entre 5 cm y
10 cm; niveles más profundos pueden causar una
mortalidad excesiva.
Se añade el volumen apropiado de la
solución stock en un disolvente orgánico
(alcohol) del insecticida a los 100 ml o 200 ml
de agua en cada vaso para obtener las
concentraciones deseadas. Al menos 4
repeticiones deberán establecerse por
concentración y un número igual de controles
simultáneamente. Cada ensayo deberá correrse
tres veces en tres días diferentes. Para
exposiciones largas deberá suministrarse
alimento a las larvas. Los vasos deberán
mantenerse a 25-28°C y un fotoperiodo 12:12.
Después de 24h de exposición, la mortalidad
de las larvas se registra. Para insecticidas de
acción lenta pueden ser necesarias 48h lectura.
Las larvas moribundas con consideradas
muertas, siendo éstas últimas aquellas que no
pueden moverse cuando se cuándo son
estimuladas con una aguja. Larvas moribundas
son los que son incapaces de elevarse a la
superficie o no muestran la reacción de buceo
característica cuando el agua es perturbada. Se
realizan 3 ensayos con 6 concentraciones y 4
repeticiones por concentración. En caso de que
las larvas pupen, estas se eliminan del conteo
original. Si más del 10% de las larvas del control
pupan, el bioensayo se descarta. Si se obtiene un
rango de mortalidad en el control del 5 al 20 %
se deberá corregir la mortalidad de los
tratamientos por Abbott (1).
Los resultados de todas las repeticiones
deberán agriparse para el cálculo de CL50 y CL90
con un programa apropiado.
1.1.2.2 Dosis diagnóstico
La concentración discriminante se determina
a partir las líneas de regresión dosis-respuesta de
ensayo (sección 1.2.1) en especies de mosquitos
vectores susceptibles. La concentración
diagnóstico es el doble del valor estimado de
CL99.99.
Tabla 2. Dosis diagnóstico (concentraciones) (mg/l) de insecticidas para larvas de Aedes aegypti (35
).
Insecticida DD
DDT 0.012
Dieldrin 0.025
BHC 0.012
Malation 0.125
Fenitrotion 0.02
Fention 0.025
Temefos
Clorpirifos
Bromofos
0.012
0.002
0.05
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En la tabla 2 se presentan las dosis
diagnóstico para Aedes aegypti establecidas
hasta el momento para algunos insecticidas por
la OMS (35
).
1.2.3. Interpretación de resultados
Igual que para las pruebas con adulticidas
(inciso 1.1.2).
1.2 CDC bioensayo de botella
Este método es considerado por la OMS
como complementario para la detección de
resistencia a los insecticidas en las poblaciones
de vectores y es ampliamente utilizado para el
monitoreo de poblaciones de mosquitos. En
contraste con el bioensayo de la OMS que mide
la tasa de mortalidad en los mosquitos expuestos
a una alta concentración de insecticida por un
período fijo de tiempo, el ensayo de botella del
CDC (2010) toma como medida el tiempo que se
necesita para matar a una muestra de mosquitos
adultos expuestos a una concentración conocida
de insecticida. Al igual que el bioensayo de la
OMS, la prueba puede ser estandarizada para la
determinación de las dosis diagnóstico y tiempos
de exposición para insecticidas individuales y
cada especie de vector usando cepa o población
susceptible.
La dosis diagnóstico es la dosis de
insecticida que mata el 100 % de mosquitos
susceptibles en un tiempo dado. El tiempo
esperado para que el insecticida cumpla este
objetivo (100% de mortalidad) es llamado
tiempo diagnóstico. Estos parámetros se usan
como puntos de referencia para compararlos con
los resultados del ensayo biológico. Se asume
que existe resistencia en una población si una
proporción significativa de esta sobrevive a la
dosis diagnóstica en el tiempo diagnóstico.
La dosis diagnóstico y el tiempo diagnóstico
deben ser definidos para cada insecticida, cada
región geográfica a estudiar y cada especie de
vector que se va a evaluar. Ambos parámetros
deben ser validados usando una población
susceptible. Una vez que se han determinado la
dosis diagnóstico y el tiempo diagnóstico para
una especie, estos parámetros serán utilizados
para realizar pruebas con la población de
vectores de una región en particular; sin embargo
puede partirse de dosis diagnóstico y tiempo
diagnóstico reportados por el CDC para Aedes
spp (14
) (Tabla 3).
Tabla 3. Dosis diagnóstico (concentraciones) (µg/botella) y tiempos diagnóstico de adulticidas para
Aedes spp (14
).
Insecticida DD (µg/botella) Tiempo diagnóstico (min)
Bendiocarb 12.5 30
Ciflutrina 10 30
Cipermetrina 10 30
DDT 75 45
Deltametrina 10 30
Fenitrotion 50 30
Lambdacialotrina 10 30
Malation 50 30
Permetrina 15 30
En comparación con el ensayo de la OMS,
algunos de los componentes del ensayo de
botella son más fáciles y baratos de obtener, sin
embargo se requiere del uso de insecticidas
grado técnico (puro) los cuales puede ser caros y
difícil de acceder localmente. Otras componentes
del ensayo de botella pueden ser difíciles de
obtener, como es el caso de la acetona, la cual su
venta tiene restricciones en alguna regiones de
América del Sur. En común con el ensayo de la
Artrópodos y Salud Septiembre-Diciembre, 2014. Vol. I No. 2 Detección de resistencia a insecticidas en mosquitos con
énfasis en Aedes aegypti
30
OMS, la dosis discriminante puede enmascarar
bajos niveles de resistencia en algunas especies
(35, 52
).
Algunas modificaciones a los protocolos
existentes podría ayudar a que éstos sean más
robustos y relevantes a nivel internacional. En
Perú por ejemplo, mostraron que algunas
limitaciones en los bioensayos con botella
podrían superarse simplemente mediante la
sustitución de acetona por etanol para la
preparación de las botellas y utilizando
formulaciones de los insecticidas en lugar de
grado técnico (52
). Con una evaluación final a
una hora encontraron este ensayo más manejable
que el de la OMS (que tiene una observación
final a las 24h).
Algunas de las innovaciones y adaptaciones
serán altamente específico; el laboratorio
Peruano mostró que las botellas impregnadas
con piretroides podían ser utilizado varias veces
e incluso almacenarse por largos períodos en
condiciones ambientales; sin embargo, esto sería
menos aplicable a los organofosforados por su
alta volatilidad.
Sin embargo se recomienda que todas las
adaptaciones y modificaciones locales a los
diferentes protocolos deban ser publicadas para
que a su vez estas sean criticadas o adaptadas por
otros (20
).
1.2.1. Preparación de soluciones stock
Las botellas destinadas para el ensayo
biológico deben ser recubiertas en su interior con
la dosis diagnóstico del insecticida a evaluar. Por
practicidad, se aconseja la preparación de
soluciones stock con las mismas concentraciones
de insecticida que las requeridas para recubrir las
botellas.
Para preparar las soluciones stock de
insecticidas se diluye la cantidad apropiada de
insecticida (sea producto de grado técnico [puro]
o de formulación) en acetona o etanol de grado
técnico (puro). El insecticida de grado técnico
puede ser sólido o líquido y hay que tener en
cuenta que este debe ser de buena calidad y no
caducados. Es importante etiquetar la botella de
solución stock con el nombre del insecticida, su
concentración y la fecha de preparación. La
solución stock preparada puede ser almacenada
en el refrigerador (4°C) en botellas a prueba de
luz (botellas de color ámbar o envueltas en papel
de aluminio si son transparentes) hasta el
momento de ser usadas. En el CDC, se han
usado soluciones stock de numerosos
insecticidas mantenidas refrigeradas durante 2 a
3 años sin que se haya observado degradación
de la actividad. Es recomendable que las
soluciones stock se saquen del refrigerador por
lo menos una hora antes de realizar el ensayo
biológico para que alcancen la temperatura
ambiente antes de ser usados. La solución stock
debe ser agitada suavemente antes de usarse para
homogeneizarla.
1.2.2. Manipulación de los mosquitos
Los mosquitos hembra que serán usados en
el ensayo biológico pueden ser capturados en
campo como adultos (siendo de edad y estado
fisiológico variado) o pueden ser adultos de edad
conocida obtenidos en laboratorio a partir de
larvas de campo. No se recomienda el uso de
mosquitos obtenidos de huevos obtenidos en el
insectario para este ensayo. Si se usan hembras
adultas de campo, se debe registrar en la hoja de
resultados su estado fisiológico (Ej., no
alimentada, alimentada con sangre, fecundada).
Los mosquitos hembra deben ser
alimentados sólo con solución azucarada (10%)
el día antes de la prueba. Se recomienda un
mínimo de 100 mosquitos, divididos en cuatro
botellas prueba para realizar la prueba de un
insecticida a una concentración dada. Cuando no
sea posible disponer de tal número de, mosquitos
en una misma ocasión, se pueden combinar los
resultados de múltiples ensayos biológicos de
días diferentes para lograr el tamaño de muestra
recomendada de 100 mosquitos. En cualquier
caso, cada ensayo biológico debe incluir una
botella control (sin insecticida) con 10–25
mosquitos.
1.2.3. Ensayo
Usando un aspirador, introduzca entre 10 y
25 mosquitos en la botella control. No es
necesario contar los mosquitos ya que el número
Artrópodos y Salud Septiembre-Diciembre, 2014. Vol. I No. 2 Detección de resistencia a insecticidas en mosquitos con
énfasis en Aedes aegypti
31
exacto no tiene importancia, haga lo mismo con
las botellas prueba. Es necesario examinar las
botellas en el tiempo 0 y contar el número de
mosquitos muertos y/o vivos. A partir de aquí
registre los mosquitos muertos (caídos) cada 15
min hasta que la totalidad de mosquitos haya
muerto, o hasta que se cumplan 2 horas desde el
inicio; no es necesario continuar con el ensayo
luego de 2 horas. Sin embargo la mortalidad en
el tiempo diagnóstico es la crítica ya que
representa el límite entre la susceptibilidad y
resistencia (Tabla 3). En caso de que se hubiese
obtenido mortalidad en el control entre el 3 y el
10% a las 2h de exposición la mortalidad en las
botellas tratamiento deberá corregirse por Abbott
(1). Si la mortalidad en el control supera el 10% a
las 2h el ensayo deberá ser descartado.
En una misma botella se puede evaluar más
de un grupo de mosquitos en un mismo día. Sin
embargo, el principal factor limitante para usar
repetidamente las botellas recubiertas es la
humedad que podría acumularse dentro de ellas
con las sucesivas introducciones de mosquitos,
especialmente si se trabaja en condiciones
húmedas. Si las botellas van a ser usadas
nuevamente el mismo día, es recomendable dejar
transcurrir un tiempo entre cada ensayo (2–4
horas, o más tiempo si las condiciones son muy
húmedas), para permitir que las botellas se
sequen (destapadas) antes de introducir más
mosquitos. Si las botellas serán usadas
nuevamente al día siguiente, se pueden dejar
secar las botellas destapadas durante la noche
evitando el contacto con luz directa. Si las
botellas no se van a usar inmediatamente
después de ser recubiertas con el insecticida, es
posible guardarlas para su uso posterior. Cuando
las botellas estén secas, deben guardarse
destapadas en un lugar oscuro (como una
gaveta). El tiempo que las botellas pueden
guardarse depende del insecticida usado, y puede
variar de 12 horas a 5 días.. Para saber si una
botella que fue almacenada es todavía adecuada
para hacer pruebas, se puede hacer una
evaluación de la misma con mosquitos
susceptibles. Si los mosquitos mueren en el
límite de tiempo esperado (dentro del tiempo
diagnóstico), la botella puede ser usada. Las
botellas pueden ser recubiertas con insecticida en
un solo laboratorio central y ser enviadas para su
uso en el campo.
1.2.4. Interpretación de resultados
La mortalidad registrada a la dosis
diagnóstico (DD) en el tiempo diagnóstico (TD)
para un insecticida en particular será el
parámetro más importante para esta prueba. Los
resultados se registrarán en porcentaje. Para la
interpretación de los resultados referirse al punto
1.1.2. de acuerdo con la OMS (39
).
2. Investigación adicional, detección de
mecanismos de resistencia
2.1 Ensayos bioquímicos
La resistencia metabólica es un proceso más
dinámico, que implica la regulación del sistema
de desintoxicación de mosquitos con el fin de
contrarrestar la agresión química causada por
insecticidas. La resistencia metabólica consiste
en niveles elevados o el incremento de la
actividad de las enzimas sobre el insecticida,
resultando en una proporción suficiente de
moléculas de insecticidas que está siendo
metabolizada antes de alcanzar su objetivo el
sistema nervioso de los mosquitos (11
). Tal
mecanismo originalmente derivado de la co-
evolución planta-insecto se ha asociado a la
resistencia a diversas toxinas de plantas y todo
tipo de productos químicos, incluyendo
insecticidas(19,22,27,46
). Enzimas de
desintoxicación generalmente ligadas a la
resistencia a insecticidas se compone de 3
grandes familias de genes, las monooxigenasas
dependientes de citocromo P450 (CYP) o P450s, las
carboxil esterasas/colina (CCE) y los glutatión-s-
transferasas (GSTs), pero otras familias de
enzimas también pueden estar involucrados
como UDP glucosyl - transferasas (UGT) (25 27
).
La desintoxicación al insecticida puede ser la
consecuencia de la sobre -producción o la
modificación estructural de una sola enzima,
pero diferentes enzimas de las mismas o
diferentes familias también puede actuar juntas
de forma simultánea o secuencialmente para
conferir resistencia.
Artrópodos y Salud Septiembre-Diciembre, 2014. Vol. I No. 2 Detección de resistencia a insecticidas en mosquitos con
énfasis en Aedes aegypti
32
Varios protocolos para la determinación de
enzimas involucradas en la resistencia a
insecticidas han sido publicados (10, 6, 17, 50
). O
también referirse al manual de métodos para
investigación con Anopheles, disponible en
http://www.mr4.org/Publications/MethodsinAno
phelesResearch.aspx.
2.2. Pruebas moleculares
El segundo mecanismo de resistencia más
común encontrado en los insectos es resistencia
en el sitio blanco. Los insecticidas generalmente
actúan en un sitio específico dentro del insecto,
típicamente dentro del sistema nervioso. El sitio
de acción puede ser modificado en las cepas
resistentes de los insectos de tal manera que el
insecticida ya no se une de manera efectiva.
Las aplicaciones de adulticidas son
comúnmente hechas a través de aplicaciones
espaciales de tipo ULV (ultra bajo volumen),
neblina térmica o aplicaciones aéreas durante
epidemias y los piretroides representan el grupo
de insecticidas preferido para este tipo de
aplicaciones. Estos insecticidas alteran la
función de los canales de sodio dependientes de
voltaje en la membrana de los axones de
neuronas (29
). La resistencia a piretroides es
conferida por dos mecanismos, insensibilidad en
el sitio blanco y/o incremento en desintoxicación
metabólica. La resistencia por insensibilidad en
el sitio blanco involucra cambios estructurales en
los canales de sodio dependientes de voltaje en
las neuronas ocasionando un anclaje reducido
del piretroide. Dependiendo de la dosis del
insecticida el insecto no exhibirá el efecto de
derribe (knockdown) que es usualmente referido
a la resistencia de tipo kdr.
La resistencia kdr (knockdown resistance)
se debe a la presencia de mutaciones puntuales
en el gen que codifica para el canal de sodio
(VGSC, por sus siglas en ingles), donde el
aminoácido resultante ocasiona una reducción en
la unión al insecticida sin pérdida de la función
primaria del sitio blanco. Se han identificado
algunas de estas mutaciones en Ae. aegypti:
G923V, L982T, I1011M, I1011V, V1016I,
V1016G, D1794Y, F1534C, S989P (4,44,15,51,47
).
Las pruebas moleculares para detección de
resistencia en el sitio blanco de acción de los
insecticidas se puede llevar a cabo post-ensayo.
Para ello, los mosquitos deberán ser
almacenados adecuadamente colocados
individualmente en tubos de plástico tipo
Eppendorf® conteniendo etanol absoluto o
soluciones específicas, por ejemplo RNA-Later®
a -20°C o en seco a -80°C. Además deberá
identificarse cada tubo con las características del
material almacenado, es decir, si proviene de
bioensayos, con que insecticida, a que dosis, el
tiempo de exposición al insecticida y si resultó
vivo o muerto.
Al igual que para las pruebas bioquímicas
deberá referirse a los protocolos reportados
según la mutación kdr específica o mecanismo
bajo sospecha.
Discusiones
Actualmente la vigilancia de la resistencia
en mosquitos vectores de enfermedades depende
de los resultados obtenidos a través de
bioensayos, ya sea, utilizando concentraciones y
tiempos de exposición fijos. La exposición de los
mosquitos se hace ya sea sobre papeles
impregnados (39
) o botellas de vidrio estándares
cubiertas internamente con insecticida (14
), sin
embargo en estudios donde se contrastan ambas
técnicas se evidencian algunos aspectos que nos
conducen a concluir que ambas técnicas no son
intercambiables.
Aizoun et al. (2) en un estudio en donde
contrastan las técnicas de la OMS y del CDC
para establecer la susceptibilidad a la
deltametrina en Anopheles gambiae en Africa
encontraron discrepancia entre ambos técnicas.
Ellos encontraron una disminución en la
mortalidad con la técnica del CDC en
comparación con la de la OMS; siendo entonces
que los mosquitos resultaron susceptibles con la
técnica de OMS y para la técnica del CDC el
porcentaje de mortalidad resultó en el rango
confirmatorio para resistencia. Los autores
discuten que, el tiempo en el que los mosquitos
son expuestos al insecticida (tiempo diagnóstico)
son bastante cortos en el caso de la técnica del
CDC por lo que ésta característica puede
Artrópodos y Salud Septiembre-Diciembre, 2014. Vol. I No. 2 Detección de resistencia a insecticidas en mosquitos con
énfasis en Aedes aegypti
33
ocasionar que se sobre-estime la resistencia.
Ellos se apoyan en evidencia previamente
reportada por Fonseca et al. (23
) quienes
concluyeron que poblaciones de Anopheles
nuneztovari de Colombia resultaron susceptibles
al fenitrotion usando los papeles impregnados de
la OMS y resultaron resistentes en pruebas con
botella, obteniendo un 20% de supervivencia en
ésta última; aduciendo la diferencia a los tiempos
de exposición (2 h en papeles impregnados y 30
min en botellas).
Estudios previos también han demostrado la
robustez de la técnica del CDC con respecto a la
de la OMS, sobre todo en países
latinoamericanos en donde la disponibilidad de
los insumos y la capacidad del personal técnico
es clave en un esquema de monitoreo de la
resistencia a nivel local. Sin embargo concluyen
que las redes nacionales de coordinación para el
manejo de insecticidas deberán retener los
ensayos de la OMS como una herramienta de
control de calidad para garantizar la
confiabilidad de los ensayos en botella (52
).
Ambas técnicas (OMS y CDC) nos
proporcionan información limitada con respecto
a la resistencia, mecanismos e incluso intensidad
de la misma. Métodos bioquímicos y ensayos
moleculares están disponibles y detectan
mecanismos específicos de resistencia; sin
embargo, estos deben realizarse como
complemento y no un sustituto los bioensayos.
Además, deberán realizarse por laboratorios y
personal calificado ya que requiere equipamiento
y capacidad especializada, con el que las
universidades y centros de investigación
cuentan. Devine y Ogusuku (20
) establecen que
los métodos de bioensayos deberán evolucionar
y adaptarse, siendo ésta última la clave para el
monitoreo de la resistencia.
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