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"Detección y cuantificación de la resistencia a los antihelmínticos"
María Martínez Valladares 1,2
Investigador post-doctoral, Ramón y Cajal
1. Instituto de Ganadería de Montaña (CSIC-Universidad de León)2. Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de León
Benzimidazol-carbamatos
Albendazol
Lactonasmacrocíclicas
Avermectinas (ivermectina)
Milbemicinas (moxidectina)
Imidazotiazoles
Levamisol
Derivados aminoacetonitrilos
Espiroindoles
Derquantel Monepantel
1960 → 1964
1981 → 1988
1970 → 1979
1991 → 1995
2009 → 2013 2010 → 2016
ResistenciaAntihelmíntica
Fármacos antihelmínticos
¿Porqué se desarrolla la resistencia antihelmíntica?
Frecuencia del tratamiento
SubdosificaciónEspecies de helmintos
Falta de alternancia de los tratamientos
Importación de las resistencias
INADECUADA UTILIZACIÓNFÁRMACOS
¿Cuáles son los niveles de resistencias a las diferentes familias de antihelmínticos en España?
FÁRMACO % REBAÑOS RESISTENTES
ABZ 23,6%IV 27,3%
2006-2011
63,6 % rebaños resistentes
27,2% resistencia múltiples
(7% 1999-2003)
2014-2016
34 %
2006-2011
In vivoEnsayo de reducción de huevos en heces (FECRT)
¿Qué técnicas in vivo e in vitro existen para detectarlos?
¿Qué técnicas in vivo e in vitro existen para detectarlos?
In vitro Ensayo de eclosión de huevos (BZ)Ensayo de la inhibición de la ingestión larvaria (LM y LEV)Ensayo de motilidad larvaria (LM y LEV)
In vivo en in vitro (Fasciola hepatica)Ensayo de reducción de huevos en heces (FECRT)Ensayo de eclosión de huevos (BZ)
¿Qué técnicas in vivo e in vitro existen para detectarlos?
Mecanismo de acción de los fármacos Benzimidazoles
Mecanismo de acción de los fármacos Benzimidazoles
Resistencia Antihelmíntica: F167Y, E198A and F200Y
Mecanismo de acción de los fármacos Benzimidazoles
¿Diseño de un test diagnóstico?
BETA TUBULINA ISOTIPO 1
Teladorsagia circumcinctaTrichostrongylus colubriformisHaemonchus contortusCyathostomin speciesHookworms
SNPs en los codones
200, 198, 167
Benzimidazoles
Phe167Tyr, Glu198Ala, Phe200Tyr
Base molecular de la resistencia a los fármacos Benzimidazoles
Técnicas moleculares, detección BZDetección molecular alelos resistentes en el gen que codifica al isotipo 1 la beta tubulina
¿Qué técnicas in vivo e in vitro existen para detectarlos?
Codón 200: Phe (TTC) Tyr (TAC)
Codón 167: Phe (TTC) Tyr (TAC)
Codón 198: Glu (GAA) Ala (GCA)
Haemonchus sppTeladorsagia spp. Trichostrongylus spp.
Frecuencia alelos resistentes después del tratamiento con albendazol
Frecuencia alelos resistentes antes del tratamiento
Técnicas molecularesDetección molecular del porcentaje de alelos resistentes en el gen que codifica al isotipo 1 de la beta tubulina(Lactonas macrocíclicas)
¿Qué técnicas in vivo e in vitro existen para detectarlos?
Codón 200: Phe (TTC) Tyr (TAC)
Codón 167: Phe (TTC) Tyr (TAC)
Codón 198: Glu (GAA) Ala (GCA)
Freeman A, Nghiem C, Li J, Ashton F, Guerrero J, Shoop W, Schad G. Amphidial structure of ivermectin resistantand susceptible laboratory and field strains of Haemonchus contortus. Vet Parasitol 2003; 110:217–226
Frecuencia alelos resistentes después del tratamiento con Ivermectina
Frecuencia alelos resistentes antes del tratamiento
Frecuencia alelos resistentes después del tratamiento con albendazol
Frecuencia alelos resistentes antes del tratamiento
¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?
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1 2 3 6 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 3 31 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
%T. circumcincta %Haemonchus %Trichostrongylus spp %C. ovina %Oesophagostomum %Cooperia
Especies de nematodos gastrointestinales, antes del tratamiento
¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?
Especies de nematodos gastrointestinales, después del tratamiento
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%T. circumcincta %Haemonchus %Trichostrongylus spp %C. ovina %Oesophagostomum %Cooperia
¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?
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1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43
T. circumcincta. Pre-treatment.
% SNP 200 % SNP 198
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728293031323334353637383940414243
T. circumcincta. Post-treatment.
% SNP 200 % SNP 198
¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?
198 199 200
Pre-tratamiento
GAA CAAGTACTA
GLUGLNVALLEU
198 199 200
Post-tratamiento
CTA LEU
¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?
Nuevo ensayo de pirosecuenciación para determinar la frecuencia del nuevo polimorfismo: Glu 198 Leu
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%C %T
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%C %T
Codon 198 GAA (GLU) CTA (LEU)
T. circumcincta. Pre-tratamiento
T. circumcincta. Post-tratamiento.
¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?
¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?
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26 27 28 29 30 32 33 34 35 36 37 38 40 41 43
%C Pre
%T Pre
%C Post
%T Post
Codon 198 GAA (GLU) CTA (LEU)
% In vivo % In vitro %SNP198 Tc% In vivo 1 -0,559** -0,567**% In vitro 1 0,765**
%SNP198 Tc 1
Flock ID %FECRT % Hatching (DD) % SNP198 (mean C and T) Flock ID %FECRT % Hatching (DD) % SNP198 (mean C and T)1 100,0 11,3 16,50 23 100,0 23,5 11,172 100,0 2,5 11,17 24 96,1 43,7 13,003 100,0 4,0 25,50 25 100,0 48,3 9,334 100,0 11,8 26 34,0 76,1 77,175 100,0 12,9 27 -110,0 44,9 58,336 100,0 6,2 18,50 28 58,5 59,3 71,677 100,0 15,1 29 100,0 43,6 32,838 100,0 1,5 14,50 30 17,0 72,3 37,509 100,0 4,0 10,83 31 60,0 71,3 73,33
10 100,0 1,7 25,33 32 87,9 34,5 46,5011 100,0 18,9 12,00 33 7,2 79,5012 91,6 57,83 34 69,4 41,0 56,0013 98,6 32,9 26,17 35 97,9 42,6 50,5014 22,4 17,67 36 42,1 54,4 61,0015 17,1 17,67 37 88,1 40,3 65,3316 100,0 24,3 16,00 38 91,3 61,6 76,3318 100,0 33,3 20,17 39 -100,0 89,6 78,3319 19,6 14,33 40 100,0 35,8 52,1720 96,8 30,9 17,83 41 100,0 40,2 49,8321 97,1 23,5 19,67 42 97,5 71,7 57,8322 12,2 18,33 43 100,0 19,7 33,83
¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?
• La única presencia de LEU en lugar de GLU en el codón 198 del gen β-tubulinisotipo 1 en Teladorsagia circumcincta está asociada con la resistencia a BZ.
• Se describieron correlaciones significativas entre las frecuencias de este polimorfismo y los resultados de los ensayos in vivo e in vitro.
• El estudio de la frecuencia de este nuevo polimorfismo debería incluirse como marcador de resistencia a los benzimidazoles.
¿Ausencia de mutaciones en Teladorsagia circumcincta?
Muchas gracias por su atenciónMaría Martínez [email protected]
