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Departamento

de Engenharia Química e Biológica

Determinação da capacidade antibacteriana

de extratos de plantas encapsulados em

substratos têxteis Dissertação apresentada para a obtenção do grau de Mestre em

Processos Químicos e Biológicos

Autor

Ana Sofia Pereira Relva

Orientador

Ana Cristina Araújo Veloso Instituto Superior de Engenharia de Coimbra

Orientador

Carla Joana dos Santos Marinho da Silva Centro de Nanotecnologia e Materiais Técnicos, Funcionais e

Inteligentes

Coimbra, Dezembro, 2012

Ana Sofia Pereira Relva ISEC,2012


AGRADECIMENTOS

Agradeço à minha orientadora, Professora Doutora Ana Veloso, por todo o apoio, incentivo e paciência que teve comigo durante a realização deste trabalho.

Ao Cento de Nanotecnologia e Materiais Técnicos, funcionais e inteligentes, em especial à Doutora Carla Silva pela sua hospitalidade e por toda a ajuda que me deu.

O meu agradecimento ao Instituto Superior de Engenharia de Coimbra por de uma ou outra forma me ajudar no decorrer deste trabalho.

Aos meus pais, pelo apoio e investimento ao longo de todo este tempo.

Ao Alexandre, por estar sempre presente e por todo o incentivo, ânimo e paciência que teve comigo.

Gostava de uma forma geral, agradecer a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para que todo este trabalho fosse possível.


RESUMO

DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIBACTERIANA DE EXTRATOS DE PLANTAS ENCAPSULADOS EM SUBSTRATOS TÊXTEIS

A indústria têxtil tem apostado cada vez mais em novas técnicas e novos procedimentos de modo a produzir novos materiais com características apelativas ao mercado, nomeadamente os materiais têxteis multifuncionais. Para isso, os seus investimentos têm vindo a aumentar significativamente em pesquisas para a conceção de tecidos funcionais e inteligentes de modo a alcançarem uma maior competitividade a nível industrial.

Um dos campos onde se tem verificado um maior investimento e investigação é no desenvolvimento de processos de acabamento têxtil. Os processos que permitem obter produtos funcionalizados têm suscitado grande interesse, nomeadamente os processos que permitem obter têxteis com características antimicrobianas. Dependendo da aplicação, o controlo do crescimento de microrganismos nos têxteis é essencial, pois estes são causadores de diversos problemas, como o mau odor, o aparecimento de manchas e danos nos tecidos, sendo ainda principais responsáveis por contaminações em diversos ambientes nomeadamente em ambientes hospitalares.

Por outro lado, é essencial o desenvolvimento de métodos rápidos e simples que permitam avaliar se os tecidos produzidos têm ou não atividade antimicrobiana e se esta permanece com o tempo de utilização.

Assim, neste projeto, realizado em parceria com o CeNTI, foi avaliada a atividade antimicrobiana de tecidos de algodão e poliamida, contendo extratos naturais encapsulados em ciclodextrinas, mais concretamente o extrato de castanheiro-da-índia denominado de escina e o própolis, produto proveniente da ação das abelhas. É proposto um método para avaliar a atividade antimicrobiana do têxtil funcional adaptado da norma ISO 20743:2007 (Textiles – determination of antibacterial activity of antibacterial finished products).

O poder antimicrobiano de soluções de escina e do própolis foi avaliado através dos métodos de difusão em agar e de microdiuição utilizando como microrganismos teste o Staphylococcus aureus e a Escherichia coli.

Verificou-se pelos dois métodos que a escina não apresenta atividade antimicrobiana relativamente aos microrganismos testados.

O própolis apresentou atividade antibacteriana, observando-se que a E. coli foi menos sensível que o S. aureus. Pelo método de difusão em agar e para o ensaio com S. aureus, obteve-se uma zona de inibição com um diâmetro de 11,0±1,2 mm e 17,3±1,2 mm para uma solução de própolis em DMSO e etanol, respetivamente. O método de diluição em microplacas permitiu também determinar a concentração mínima inibitória de 1500 μg/mL para o S.aureus e de 6000 μg /mL para a E. coli.


Nos ensaios com tecidos funcionalizados com ciclodextrinas verificou-se a sua solidez à lavagem, concluindo-se que o processo de ligação covalente das ciclodextrinas aos tecidos de algodão e poliamida foi eficaz, revelando solidez à lavagem doméstica até pelo menos 5 ciclos consecutivos.

Verificou-se ainda que o tecido de algodão funcionalizado com ciclodextrinas e extrato etanólico de própolis apresentou atividade antimicrobiana quer em ensaios realizados com os microrganismos teste quer em ensaios em contacto com a pele de vários utilizadores.

O método utilizado para avaliar a atividade antimicrobiana de tecidos revelou-se apropriado para uma avaliação qualitativa do crescimento dos microrganismos. Sendo simples requer ainda otimização para permitir uma quantificação do poder antimicrobiano dos têxteis.

Palavras-chave: escina, própolis, atividade antimicrobiana, têxteis.


ABSTRACT

DETERMINATION OF CAPACITY AND ANTIBACTERIAL ANTIFUNGAL PLANT EXTRACTS FROM PLANTS ENCAPSULATED IN TEXTILE SUBSTRATE

The textile industry has invested increasingly on new techniques and procedures to produce new materials with appealing features to the market, including multifunctional textile materials. For this, their investments are increasing significantly in research for the design of functional fabrics and intelligent in order to achieve greater industrial competitiveness.

One area where there has been increased investment and research is the development of textile finishing processes. The processes that allow obtaining functionalized products have aroused great interest, particularly the processes that allow obtaining textiles with antimicrobial characteristics. Depending on the application, controlling the growth of microorganisms in textiles is essential because they are causing problems such as malodor, the appearance of stains and tissue damage is also mainly responsible for contamination in various environments particularly in hospital settings.

On the other hand, it is essential to develop rapid and simple methods to assess whether or not produced fabrics have antimicrobial activity and if it remains with time of use.

So in this project, conducted in partnership with the CeNTI evaluated the antimicrobial activity of cotton and polyamide, containing natural extracts encapsulated in cyclodextrins, specifically the extract of chestnut termed aescin and propolis product from action of bees. We propose a method to evaluate the antimicrobial activity of functional textiles adapted from ISO 20743:2007 (Textiles - determination of antibacterial activity of antibacterial finished products).

The antimicrobial power solutions aescin and propolis was evaluated by agar diffusion methods and micro dilution using as test organisms Staphylococcus aureus and Escherichia coli.

It was found by the two methods that aescin has no antimicrobial activity in relation to microorganisms.

The propolis showed antibacterial activity, noting that E. coli was less sensitive than S. aureus. For the agar diffusion method and the test with S. aureus was obtained a inhibition zone with a diameter of 11.0 mm ± 1.2 and 17.3 ± 1.2 mm


for a propolis solution in DMSO and ethanol, respectively. The method of dilution on microplates also enabled to determine the minimum inhibitory concentration of 1500 mg / ml for S. aureus and 6000 mg / mL for E. coli.

In tests with fabrics functionalized with cyclodextrins verified their fastness to washing, concluding that the process of covalent linkage of cyclodextrins to cotton and polyamide was effective, revealing fastness to domestic laundering at least 5 consecutive cycles.

It was also found that cotton fabric functionalized with cyclodextrins and ethanolic extract of propolis showed antimicrobial activity in both assays performed with the microorganisms or test assays in contact with the skin of multiple users.

The method used to evaluate the antimicrobial activity of tissues proved to be suitable for a qualitative assessment of the growth of microorganisms. Being simple requires further optimization to allow a quantification of the power of antimicrobial textiles.

Keywords: Aescin; antimicrobial activity, textiles.

Determinação da capacidade antibacteriana de extratos de plantas encapsuladas em substratos têxteis Índice


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ÍNDICE

CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO

1. INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................. 2

1.1. CONTEXTO E MOTIVAÇÃO .................................................................................... 2

1.2. CENTI ................................................................................................................. 3

1.3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 4

1.4. ORGANIZAÇÃO DA TESE ....................................................................................... 5

CAPÍTULO 2 - FIBRAS TÊXTEIS E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

2. FIBRAS TÊXTEIS E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ............................................. 7

2.1. FIBRAS TÊXTEIS................................................................................................... 7

2.1.1. Algodão ....................................................................................................... 7

2.1.2. Poliamida ......................................................................................................... 8

2.2. AGENTES ANTIMICROBIANOS QUE PODEM SER INCORPORADOS EM TÊXTEIS ......... 8

2.2.1. Escina ....................................................................................................... 10

2.2.2. Própolis ..................................................................................................... 12

2.2.3. Prata ......................................................................................................... 13

2.3. PROCESSOS DE INCLUSÃO DOS AGENTES ANTIMICROBIANOS EM PRODUTOS

TÊXTEIS ........................................................................................................................ 14

2.4. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS TÊXTEIS ................................... 17

CAPÍTULO 3 - MATERIAIS E MÉTODOS

3. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 21

3.1. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS NATURAIS .................. 21

3.1.1. Padrões, reagentes e microrganismos .................................................... 21

3.1.2. Metodologia .............................................................................................. 22

3.2. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE TECIDOS FUNCIONALIZADOS COM

EXTRATOS NATURAIS .................................................................................................... 24


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3.2.1. Reagentes e Material têxtil ....................................................................... 24

3.2.2. Processos de funcionalização dos substratos utilizados ........................ 24

3.2.3. Avaliação da atividade antimicrobiana do tecido funcionalizado ............ 25

3.3. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE DISCOS DE MADEIRA TRATADOS

COM AgIONTM ................................................................................................................ 27

CAPÍTULO 4 - RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO

4. RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO ............................................... 29

4.1. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS NATURAIS .................. 29

4.1.1. Atividade antimicrobiana da escina.......................................................... 29

4.1.2. Atividade antimicrobiana do própolis ....................................................... 36

4.2. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE TECIDOS FUNCIONALIZADOS COM

EXTRATOS NATURAIS .................................................................................................... 40

4.2.1. Processo de funcionalização dos tecidos utilizados ................................ 41

4.2.2. Avaliação da atividade antimicrobiana do tecido funcionalizado ............ 42


COM AgIONTM .............................................................................................................. 52

CAPÍTULO 5 - CONCLUSÕES GERAIS E TRABALHO FUTURO

5. CONCLUSÕES GERAIS E TRABALHO FUTURO ................................................ 56

5.1. Síntese do Trabalho e Conclusões Gerais ..................................................... 56

5.2. Seguimento de Trabalhos futuros ................................................................... 58

CAPÍTULO 6 - REFERNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 61

CAPÍTULO 7 - ANEXOS

7. ANEXOS .................................................................................................................. 67

Determinação da capacidade antibacteriana de extratos de plantas encapsuladas em substratos têxteis Índice das Figuras


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ÍNDICE DAS FIGURAS

Figura 1 – Frutos (a) e sementes (b) do Castanheiro-da- Índia. Fonte: a) http://www.ppmac.org/content/castanheiro-da-índia; b) http://www.botanicalgarden.ubc.ca/potd/2006/08/xanthoceras_sorbifolia_and_aesculus_hippocastanum.php ...................................................................................................... 10 Figura 2 – Estrutura química da β-escina. Fonte: (R. Sirtori, 2001).............................. 11 Figura 3 – Esquema ilustrativo da estrutura dos diferentes tipos de ciclodextrinas α, β e λ. Adaptado de (Manakker, et al., 2009) ........................................................................ 16 Figura 4 – Representação esquemática da estrutura das ciclodextrinas (B-Cyclodextrin hydrogels as potencial drug delivery systems, 2012) .................................................... 16 Figura 5 – Exemplo do método de difusão em agar. Fonte: http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/atm_racional/modulo2/metodos5.htm ................................................................................................................. 18 Figura 6 - Representação esquemática do procedimento efetuado no método de diluição em microplacas ................................................................................................. 23 Figura 7 - Fotografia obtida com um esteriomicroscópio dos tecidos utilizados: A- algodão, B- poliamida. Ampliação total: 40x .................................................................. 24 Figura 8 – Zonas de inibição de ensaios realizados para avaliar a atividade antimicrobiana da solução comercial de escina 0,3% em etanol 65% para o S.aureus. (1- etanol 65%; 2- escina comercial 0,3%; 3- água destilada estéril) ........................... 30 Figura 9 - Zonas de inibição de ensaios realizados para avaliar a atividade antimicrobiana da solução comercial de escina 0,3% em etanol 65% para a E.coli. (1- etanol 65%; 2- escina comercial 0,3%; 3- água destilada estéril) ................................. 31 Figura 10 – Zonas de inibição de ensaios realizados para avaliar a atividade antimicrobiana da escina 6% para a S.aureus. (1- etanol 65%; 2- padrão de escina 6%; 3- escina comercial 6%; 4- água destilada estéril) ........................................................ 32 Figura 11 – Zonas de inibição de ensaios realizados para avaliar a atividade antimicrobiana da solução de escina 6% e 3% em água destilada para a S.aureus. (1- etanol 65%; 2- escina 6%; 3- escina 3%; 4- AgIONTM 2% 5- água destilada estéril) ... 33 Figura 12 – Ensaio na microplaca para avaliar a influência do pH na determinação da capacidade antibacteriana de diferentes concentrações de escina para o inóculo de S.aureus e respetiva legenda dos poços da microplaca ............................................... 35 Figura 13 – Zonas de inibição de ensaios realizados para avaliar a atividade antimicrobiana da solução de própolis 6% em DMSO para a S.aureus. (1- DMSO; 2- própolis 6%; 3- água destilada estéril) ........................................................................... 37 Figura 14 - Zonas de inibição de ensaios realizados para avaliar a atividade antimicrobiana da solução de própolis 6% em etanol 65% para a S.aureus. (1- etanol 65%; 2- própolis 6%; 3- água destilada estéril) ............................................................. 38


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Figura 15 – Ensaio na microplaca para determinar a CIM com diferentes concentrações própolis para o inóculo de S.aureus e respetiva legenda dos poços da microplaca ...................................................................................................................... 39 Figura 16 – Ensaio na microplaca para determinar a CIM com diferentes concentrações própolis para o inóculo de E.coli e respetiva legenda dos poços da microplaca ...................................................................................................................... 39 Figura 17 – Fotografia obtida com um esteriomicroscópio dos tecidos (ampliação total 40x) do têxtil de algodão (A- controlo do algodão, B- com E.coli, C- com S.aureus) ... 43 Figura 18 - Fotografia obtida com um esteriomicroscópio dos tecidos (ampliação total 40x) do têxtil de poliamida (A- controlo da poliamida, B- com E.coli, C- com S.aureus) ........................................................................................................................................ 43 Figura 19 – Fotografia obtida com um esteriomicroscópio dos tecidos funcionalizados com CD’s (ampliação total 40x): algodão (A- E.coli, B- S.aureus) e poliamida (C- E.coli, D- S.aureus) ................................................................................................................... 45 Figura 20 - Fotografia obtida com um esteriomicroscópio dos tecidos funcionalizados com a solução comercial de escina 0,3% (ampliação total 40x): algodão - (A- E.coli, B- S.aureus) e da poliamida - (C- E.coli, D- S.aureus) ...................................................... 46 Figura 21 - Visualização ao microscópio (ampliação total 100x): A- algodão funcionalizado com agar, B- algodão funcionalizado pulverizado com etanol a 65% e agar, C e D: algodão funcionalizado com o inóculo de S.aureus e agar ...................... 47 Figura 22 - Visualização ao microscópio (ampliação total 100x): A- algodão funcionalizado com agar, B- algodão funcionalizado pulverizado com etanol a 65% e agar, C e D: algodão funcionalizado com o inóculo de E.coli e agar. ........................... 48 Figura 23 - Visualização ao microscópio (ampliação total 100x) do têxtil de algodão com CD´s inoculado com S.aureus e pulverizado com própolis 1% ............................. 49 Figura 24 – Visualização ao microscópio (ampliação total 100x) do têxtil de algodão com CD´s inoculado com E.coli e pulverizado com própolis 1% e ............................... 49 Figura 25 – Visualização ao microscópio (ampliação total 100x) do algodão funcionalizado: A- sem estar em contato com a pele, B,C,D- em contato com a pele de diferentes utilizadores..................................................................................................... 51 Figura 26 - Visualização ao microscópio (ampliação total 100x) do algodão funcionalizado e pulverizado com própolis 1%: A- sem estar em contato com a pele, B,C,D- em contato com a pele. ...................................................................................... 52 Figura 27 - Resultados dos testes com as placas de madeira tratadas com AgIONTM (1 - placa com AgIONTM, 2 - Controlo) ............................................................................... 53 Figura 28 – Reta de calibração para quantificação das ciclodextrinas. ........................ 67

Determinação da capacidade antibacteriana de extratos de plantas encapsuladas em substratos têxteis Índice das Tabelas


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ÍNDICE DAS TABELAS

Tabela 1 – Valores das concentrações das β-ciclodextrinas após lavagem com água corrente (0 ciclos de lavagem) e 1 e 5 ciclos de lavagem doméstica ..............................42


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LISTA DE SÍMBOLOS

°C – Grau Celcius

g – Gramas

mg - Miligrama

μL – Microlitro

mm - Milímetro

mL – Mililitro

M – Molar

nm – Nanómetro

rpm – Rotações por minuto


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ABREVIATURAS

CeNTI - Centro de Nanotecnologia e Materiais Técnicos, Funcionais e Inteligentes

CITEVE - Centro Tecnológico das Indústrias Têxtil e do Vestuário de Portugal

CTIC - Centro Tecnológico para a Indústria do Couro

MIC – Concentração mínima do composto

CD´s - Ciclodextrinas

CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO GERAL


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CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO GERAL



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1. INTRODUÇÃO GERAL

1.1. CONTEXTO E MOTIVAÇÃO

Para aumentar a sua competitividade a indústria têxtil tem-se focado no desenvolvimento de materiais multifuncionais e inteligentes, apostando cada vez mais em novas técnicas e novos procedimentos que permitam obter materiais com características adequadas à sua aplicação em diversas áreas (Nelson, 1991; Rodrigues, et al., 2003; Saraswathi, et al., 2010). Um dos campos onde se tem verificado um maior investimento e investigação é no desenvolvimento de processos de acabamento têxtil. Os processos que permitem obter produtos funcionalizados têm suscitado grande interesse, nomeadamente os processos que permitem obter têxteis com características antimicrobianas. Dependendo da aplicação, o controlo do crescimento de microrganismos nos têxteis é essencial, pois estes são causadores de diversos problemas, como o mau odor, o aparecimento de manchas e danos nos tecidos, sendo ainda principais responsáveis por contaminações em diversos ambientes nomeadamente em ambientes hospitalares. Nem os tecidos têxteis produzidos com fibras naturais, nem os que são manufaturados com fibras sintéticas, são resistentes ao crescimento de bactérias ou fungos patogénicos (Lee, et al., 2003). Uma forma de evitar o crescimento de microrganismos e também de proteger o tecido é o seu tratamento com agentes antimicrobianos. Estão descritos vários métodos que permitem que os materiais têxteis obtenham propriedades antimicrobianas, tais como: (i) a incorporação de agentes antimicrobianos diretamente na produção das fibras, (ii) revestimento ou adsorção de substâncias antimicrobianas sobre as fibras têxteis e (iii) imobilização de substâncias antimicrobianas em fibras através de ligações iónicas ou covalentes (Ramachandran, et al., 2004). Atualmente, a maior parte dos produtos têxteis com propriedades antimicrobianas comercializados são produzidos por incorporação de metais como a prata e o zinco. Contudo, essas substâncias possuem reduzida biocompatibilidade e são nocivos para o ambiente (Pinho, et al., 2010; Kozicki, et al., 2013). Ultimamente, a utilização de extratos naturais afigura-se uma alternativa bastante promissora aos agentes antimicrobianos convencionais, podendo tornar os têxteis biofuncionalizados mais biocompatíveis e consequentemente com maior aplicação na área da saúde. Uma outra vantagem da sua aplicação é tornar os têxteis mais atrativos do ponto de vista ecológico. Por outro lado, a utilização de têxteis contendo



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extratos naturais cujos princípios ativos podem ser libertados é também uma funcionalidade muito desejada, uma vez que o têxtil está em contacto direto com a pele, podendo portanto ser um veículo de transmissão de diversos princípios ativos com benefícios para o utilizador. Esta classe de têxteis designa-se por têxteis cosméticos, existindo já produtos comerciais com reportadas propriedades anti-stress e anti celulite, por exemplo (El-thalawy, et al., 2005; Angela, et al., 2010; Gouveia, 2010; Saraswathi, et al., 2010; Alonso, et al., 2012; Hong, et al., 2012; Rajendran, et al., 2013). A escina é o principal princípio ativo proveniente das sementes do castanheiro-da-índia (Aesculus hippocastanum), encontrando-se esta planta um pouco por todo o mundo devido à sua elevada resistência às condições climatéricas. A β-escina é uma mistura de saponinas, substâncias de elevado peso molecular, formada por uma parte hidrofóbica denominada sapogenina e uma parte hidrofílica constituída por um ou mais açúcares. Este composto possui propriedades venotónicas e anti-edematosas e quando encapsulado num têxtil pode libertar-se pela ação da temperatura e humidade natural da pele do utilizador, podendo ser utilizado para fins terapêuticos (R. Sirtori, 2001; Baraldi, et al., 2007).

Um outro exemplo de um extrato natural que pode ser incorporado em têxteis é o própolis, um produto proveniente da atividade das abelhas que ao colherem resinas e enriquecendo-as com secreções salivares e enzimáticas, cera e pólens, originam uma mistura com uma composição rica em resina, até 50%, (flavonóides e outros), 30% de cera, 10% de óleos essenciais, 5% de pólen e 5% de outros compostos orgânicos. É utilizado com fins terapêuticos desde a antiguidade até aos dias de hoje, encontrando-se na composição de cosméticos, dentífricos ou em fármacos. Os estudos que comprovam as suas potencialidades farmacológicas são inúmeros encontrando-se aplicações como anti-inflamatórios, anticancerígenos, antioxidantes, fungicidas e bactericidas (Burdock, 1988; Kujumgiev, et al., 1999; Park, et al., 2002; Ozkul, et al., 2004; Funari, et al., 2006).

Deste modo, com o presente trabalho pretendeu-se incorporar extratos naturais em têxteis e avaliar as suas propriedades antimicrobianas, com o intuito de criar produtos funcionalizados, biocompatíveis e mais ecológicos. Os extratos testados foram a escina e o própolis sendo a sua atividade antimicrobiana comparada com um agente antimicrobiano convencional, a prata.

1.2. CENTI

O Centro de Nanotecnologia e Materiais Técnicos, Funcionais e Inteligentes situa-se em Vila Nova de Famalicão e pretende impulsionar o desenvolvimento de novos materiais com o propósito de contribuir para a inovação de produtos ou das etapas do



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seu desenvolvimento. O CeNTI foi idealizado em 2004 pelo Centro Tecnológico das Indústrias Têxtil e do Vestuário (CITEVE), pela Universidade do Minho, Universidade do Porto, Universidade de Aveiro e o Centro Tecnológico para a Indústria do Couro (CTIC) contudo a sua concretização só foi possível em 2006.

O êxito do desenvolvimento dos projetos no CeNTI resulta do trabalho, dedicação e investigação de uma equipa que conta com a contribuição do conhecimento de técnicos e investigadores de diversas áreas, nomeadamente, física, química, engenharia, materiais, eletrónica e biomédica. O CeNTI opera sob uma parceria de negócios com empresas relacionada com as necessidades e as oportunidades dos seus parceiros. Identidades como a Decathlon, o Grupo Amorim, o Grupo Salvador Caetano, a Sonae Indústria e Optimus trabalham em cooperação com o Centro no desenvolvimento de novos produtos para aumentarem as suas competências e vencerem num mercado cada vez mais competitivo.

1.3. OBJETIVOS

Com o presente projeto realizado em parceria com o CeNTI pretendeu-se avaliar a atividade antimicrobiana de um têxtil contendo extratos naturais encapsulados, mais concretamente o extrato de castanheiro-da-índia denominado de escina e o própolis, produto proveniente da ação das abelhas.

Inicialmente foi avaliada a atividade antimicrobiana da escina e do própolis através de métodos de difusão e métodos de diluição, comparando também a sua atividade com a de um composto comercial contendo prata.

Após comprovar o poder antimicrobiano foi determinada a concentração mínima inibitória (CMI) do extrato capaz de inibir o crescimento de bactérias gram-positivas e gram-negativas. Para isso, foram utilizados como microrganismos teste o Staphylococcus aureus e a Escherichia coli. O método utilizado foi o método de diluição em microplacas usando a resazurina para identificar a viabilidade celular dos microrganismos em causa.

Procedeu-se à funcionalização de um tecido de algodão por incorporação de ciclodextrinas e do agente antimicrobiano natural. A atividade antimicrobiana do têxtil funcional foi testada adaptando a norma ISO 20743:2007 (Textiles – determination of antibacterial activity of antibacterial finished products), antes e após utilização do têxtil.

O método utilizado para avaliar a atividade antimicrobiana por adaptação da norma ISO 20743:2007 foi ainda aplicado a placas de madeira tratadas com prata como agente antimicrobiano.



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1.4. ORGANIZAÇÃO DA TESE

Tendo em conta os objetivos estabelecidos, o presente trabalho foi dividido em cinco capítulos.

O primeiro capítulo é de contextualização do tema, apresentação do CeNTI e descrição dos principais objetivos do trabalho.

No segundo capítulo é apresentada a revisão bibliográfica onde são descritos os principais conceitos relacionados com o objeto de estudo, têxteis com propriedades antimicrobianas.

Todos os materiais e métodos necessários no trabalho experimental são apresentados no capítulo três.

O capítulo quatro diz respeito aos resultados experimentais obtidos e à discussão dos mesmos.

No capítulo cinco, são apresentadas as conclusões gerais e também propostas para trabalhos futuros.

CAPÍTULO 2 FIBRAS TÊXTEIS E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA


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CAPÍTULO 2

FIBRAS TÊXTEIS E ATIVIDADE

ANTIMICROBIANA



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2. FIBRAS TÊXTEIS E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

2.1. FIBRAS TÊXTEIS

Desde há muito tempo que as fibras são usadas como matéria-prima para a elaboração de tecidos. Estas fibras eram obtidas principalmente de animais e plantas e foram utilizadas durante longos períodos de tempo na tecelagem. Com a evolução e crescimento do sector têxtil surgiram as fibras químicas criadas em laboratório para responder à necessidade de criar novos produtos (Pezzolo, 2007).

As fibras químicas podem ser divididas em dois tipos: as fibras químicas artificiais, provenientes do tratamento de matéria-prima natural vegetal, animal ou mineral e as fibras químicas sintéticas obtidas do petróleo, do carvão mineral, entre outros (Pezzolo, 2007).

São exemplos de fibras naturais animais a lã, a seda, a crina e o angorá. De entre as fibras naturais vegetais salientam-se o linho, o algodão e a ráfia. Das fibras químicas artificiais são exemplo a viscose, a modal e a lanital. Das fibras químicas sintéticas destacam-se o acrílico, o elastano, a poliamida e o poliéster (Pezzolo, 2007).

2.1.1. Algodão

O algodão foi descoberto no Brasil no século XVI, tendo sido desenvolvidas mais de 300 qualidades de algodão. Atualmente, os maiores produtores mundiais da fibra de algodão são os Estados Unidos, a China, a União Soviética, a Índia e o México. Há também produções significativas no Egipto, na Turquia e em Moçambique (Araújo, et al., 1984).

O algodão é constituído por fibras que possuem uma estrutura unicelular as quais se diferenciam a partir das células epidémicas da semente do algodoeiro. Nos primeiros 28 dias após a abertura da flor, as referidas células crescem rapidamente em comprimento, chegando a cerca de 90% do comprimento final. Nesta primeira fase as sementes apresentam uma forma cilíndrica cuja constituição da parede interna é formada essencialmente por celulose. Esta camada de celulose vai-se tornando mais espessa à medida que ocorre a etapa de maturação, sendo determinante para as caraterísticas físicas das fibras (Araújo, et al., 1984).

As principais vantagens comparativas do algodão em relação às fibras artificiais e sintéticas decorrem principalmente do conforto referente ao toque agradável e



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frescura, absorção de água, resistência ao uso, e também dos aspetos ecológicos, por ser biodegradável. Existem algumas propriedades pelas quais as fibras de algodão são caracterizadas sendo elas: o comprimento, a finura, a relação comprimento/finura, maturação, resistência e impurezas (Araújo, et al., 1984).

2.1.2. Poliamida

A poliamida é um polímero formado por monómeros de amida unidos por ligações peptídicas sendo um dos exemplos de fibras sintéticas, que foi criada para fazer frente às fibras naturais.

As fibras de poliamida possuem propriedades importantes como a elevada tenacidade, elevada resistência à abrasão, elevada resistência aos agentes químicos sintéticos e naturais, alto grau de tingimento e a baixa absorção da humidade.

A poliamida é utilizada só ou combinada com outros tipos de fibras no vestuário em geral, bem como em para-quedas, redes de pesca, cordas ou até artigos de cirurgia. O derivado mais conhecido da poliamida é o nylon, sendo considerado o mais nobre dos fios sintéticos e foi o primeiro a ser produzido industrialmente (Pezzolo, 2007).

2.2. AGENTES ANTIMICROBIANOS QUE PODEM SER INCORPORADOS EM TÊXTEIS

Os têxteis são um ótimo meio de proliferação de microrganismos, nomeadamente bactérias e fungos, por permitirem o seu alojamento ou servirem como fontes de nutriente. O crescimento de microrganismos pode originar maus odores, descoloração, deformação e tingimento do tecido e possíveis perdas de propriedades que se traduzem numa redução do tempo de vida do têxtil, principalmente do algodão e da lã (Swarbrick, 2006; Saraswathi, et al., 2010).

Com a inerente atividade microbiana nos têxteis torna-se relevante que exista um acabamento antimicrobiano nestes materiais de forma a combater a sua proliferação e prevenir a degradação dos materiais têxteis.

Os agentes antimicrobianos que inibem o crescimento e desenvolvimento dos microrganismos são geralmente denominados como biostáticos, (bacteriostáticos e fungistáticos).Por outro lado, os produtos antimicrobianos que destroem os microrganismos, são designados como, biocidas (bactericidas e fungicidas) (Ramachandran, et al., 2004; Schindler, et al., 2004).



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Existe uma enorme variedade de agentes antimicrobianos que são utilizados nos materiais têxteis, entre ao quais se destacam os extratos vegetais, os antibióticos, o formaldeído, os metais pesados (prata, cobre, sais metálicos), os compostos organometálicos, os fenóis, o peróxido de hidrogénio e os compostos quaternários de amónio, entre outros (Kalyon, et al., 2001; Kim, et al., 2001; Dubas, et al., 2006; Gabbay, et al., 2006; Wei, et al., 2008; Gonensek, et al., 2010).

Os compostos quaternários de amónio são bastante ativos contra um largo espectro de microrganismos, tais como: bactérias Gram-positivas, Gram-negativas, fungos e alguns vírus. A atividade antimicrobiana destes compostos depende do comprimento da cadeia de alquilo, do número de grupos de amónio na molécula entre outras. A função antimicrobiana resulta da interação da atração entre o grupo de amónio catiónico dos compostos quaternários e da membrana celular do microrganismo carregada negativamente. Estas interações originam a formação de um complexo de agente tensioativo que por sua vez faz com que exista interrupção de todas as funções essenciais da membrana celular e, assim, a interrupção da atividade proteica. Os compostos quaternários de amónio também afetam o DNA bacteriano, causando uma perda de capacidade de multiplicação (Dastjerdi, et al., 2010; Foudaa, et al., 2013).

O modo como o agente antimicrobiano inibe ou destrói os microrganismos, pode ser atribuído a vários fatores, entre os quais: a degradação da parede celular ou inibição do seu metabolismo, alteração da permeabilidade da membrana citoplasmática, variação do estado físico e químico das proteínas e ácidos nucleicos, inibição da síntese dos mesmos e impedimento da ação enzimática (Casciani, 2003; Purwar, et al., 2003). Por exemplo os agentes oxidantes como os aldeídos e os compostos metálicos complexantes como a prata atuam sobre os microrganismos e seu metabolismo, nomeadamente inibindo e desnaturando enzimas (Ramachandran, et al., 2004).

Um outro exemplo de agente antimicrobiano é o quitosano. Este é um derivado da quitina, que é um polissacarídeo natural, principalmente derivados de conchas de crustáceos e outros animais do mar. Para além da sua atividade antimicrobiana, o quitosano tem algumas vantagens importantes, tais como a não-toxicidade, biocompatibilidade e biodegradabilidade. Para proporcionar um efeito antimicrobiano nos têxteis, o quitosano pode ser usado como um aditivo durante a centrifugação das fibras e também como um agente de acabamento para a modificação da superfície, principalmente na celulose, poliéster e fibras de lã. A sua função antimicrobiana resulta da sua natureza policatiónica, que é causada por protonação dos grupos amino nos átomos C-2 das unidades de glucosamina. A eficácia antimicrobiana do quitosano depende do seu peso molecular médio, o grau de desacetilação e o rácio entre grupos protonados e os grupos amino não protonado na sua estrutura. A eficiência aumenta



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também com o aumento da desacetilação, a qual pode ser superior a 90%. Uma desvantagem importante do quitosano é a sua fraca adesão às fibras de celulose, o que resulta numa lixiviação gradual a partir da superfície da fibra com a lavagem repetitiva. Para permitir que o quitosano se ligue fortemente às fibras de celulose são usados diversos agentes de reticulação sendo os principais os ácidos policarboxílicos (Dastjerdi, et al., 2010; Foudaa, et al., 2013).

2.2.1. Escina

O Castanheiro-da-Índia (Aesculus hippocastanum), é uma árvore que se encontra em diferentes partes do mundo devido à sua elevada resistência a diferentes condições climatéricas. O seu fruto é arredondado e espinhoso sendo que a sua casca se torna mais espessa com o amadurecimento, contendo no seu interior duas ou quatro sementes arredondadas e lisas (R. Sirtori, 2001).

Na Figura 1 pode-se observar os frutos e as sementes desta árvore.

Figura 1 – Frutos (a) e sementes (b) do Castanheiro-da- Índia. Fonte: a)

http://www.ppmac.org/content/castanheiro-da-índia; b) http://www.botanicalgarden.ubc.ca/potd/2006/08/xanthoceras_sorbifolia_and_aesculus_hippocastanum.php

As sementes do Castanheiro-da-índia contêm uma mistura natural de saponinas de onde provém dois produtos principais: a escina e a prosapogenina. Na sequência de vários estudos foram também isolados outros produtos das sementes da planta como bioflavonoides, antioxidantes, entre outros. Estes produtos podem ser encontrados também em outras plantas (R. Sirtori, 2001).

A escina é uma mistura de saponinas, substâncias de elevado peso molecular que são formadas por uma parte lipofílica denominada aglicona e outra parte hidrofílica constituída por um ou mais açúcares. Pode ser dividida em dois tipos: a α-escina e a β-escina que são distinguidos pelo seu ponto de fusão, solubilidade na água e índice

http://www.ppmac.org/content/castanheiro-da-índia

http://www.botanicalgarden.ubc.ca/potd/2006/08/xanthoceras_sorbifolia_and_aesculus_hippocastanum.php



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específico de rotação (Wilkinson, et al., 1999; R. Sirtori, 2001). No decorrer de vários estudos, os investigadores concluíram que várias propriedades do extrato de Castanheiro-da-índia devem-se unicamente à presença de escina, entre as quais: venotónicas, anti-edematosas e anti-inflamatórias (R. Sirtori, 2001).

A escina é naturalmente encontrada sob a forma de β-escina (Figura 2) que é praticamente insolúvel em água (R. Sirtori, 2001).

Figura 2 – Estrutura química da β-escina. Fonte: (R. Sirtori, 2001)

De acordo com a sua estrutura química é classificada como uma saponina triterpenica tendo em conta o núcleo de aglicona. Relativamente ao número de açúcares ligados à aglicona, a β-escina é classificada como monodesmosídica. A cadeia de açúcar que se encontra ligada ao C-3 apresenta-se ramificada e os monossacarídeos são duas moléculas de D-glucose e uma molécula de ácido glucurónico. Os monossacarídeos presentes na molécula estão na forma de piranose e as ligações entre os açúcares encontram-se sob a forma β (R. Sirtori, 2001).

A β-escina tem tido uma grande utilização no tratamento de várias perturbações vasculares periféricas (R. Sirtori, 2001). Atua também sobre as veias e capilares diminuindo a híper-permeabilidade vascular, melhorando assim a hemodinâmica e reduzindo o edema dos membros inferiores em pacientes com varizes ou submetidos a cirurgia. Esta substância reduz o número e diâmetro dos poros na parede dos vasos



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capilares, com o intuito de normalizar a permeabilidade capilar e por isso têm ações anti-inflamatória e anti-edematosas (Guillaume, et al., 1994; R. Sirtori, 2001).

A escina é portanto utilizada em diversas áreas pelas suas propriedades e pelo seu modo de atuação.

2.2.2. Própolis

A palavra própolis foi criada por Aristóteles e deriva do grego pro (em defesa) e polis (cidade ou comunidade) (Santos Pereira, et al., 2002).

Os gregos davam o nome de própolis às portas da cidade pela derivação da palavra. Anos mais tarde, Plínio aplicou esta palavra em latim para dar nome à resina proveniente da polpa das árvores com a qual as abelhas recobrem a entrada das suas colmeias com o propósito de as proteger contra fungos e bactérias (Marcucci, 1996; Kujumgiev, et al., 1999).

O própolis é um material resinoso acastanhado colhido pelas abelhas obreiras das folhas e fendas de cascas de numerosas plantas em particular do choupo. Após recolhido estas resinas são enriquecidas com secreções salivares e enzimáticas e utilizada para selar fendas e buracos de colmeias e embalsamar invasores das colmeias. A utilização do própolis remonta à idade média: os Egípcios usavam-no para embalsamar cadáveres dadas as propriedades anti-putrefactórias; os Árabes recorriam às potencialidades antissépticas, cicatrizantes e desinfectantes. Atualmente é recomendado pelas suas propriedades antibacterianas, antifúngicas, antiviral, hepato-protector e anti-inflamatório (Marcucci, 1996; Kujumgiev, et al., 1999).

A composição do própolis é maioritariamente de compostos fenólicos, em particular de flavonoides, mas também ácidos e ésteres fenólicos, aldeídos fenólicos e cetonas. Outros compostos presentes são as ceras (30-40%), resinas, ácidos aromáticos e grãos de pólen. A presença de pinocembrina é associada às propriedades fúngicas enquanto compostos como os ácidos diterpénicos ou p-coumárico são relacionados com as propriedades antibacterianas. Apesar da sua composição não sofrer grandes variações com a origem geográfica, o mesmo não se verifica para as proporções dos constituintes presentes (Burdock, 1988; Kujumgiev, et al., 1999; Park, et al., 2002; Ozkul, et al., 2004; Funari, et al., 2006).

Os flavonoides são um grupo de metabolitos da classe dos polifenóis, que possuem baixo peso molecular e são encontrados em diversas espécies. São compostos tricíclicos contendo dois anéis aromáticos e um anel não aromático (Cushnie, et al., 2005)



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Os flavonoides presentes no própolis são as flavonas, isoflavonas, flavonóis, flavanonas, entre outros (Cushnie, et al., 2005).

O própolis tem sido alvo de inúmeros estudos devido às suas propriedades antibacterianas, antifúngica, antiviral, anti-inflamatória, antioxidante, entre outras (Marcucci, 1996).

A atividade bacteriana do própolis é atribuída principalmente à flavonona pinocembrina, ao flavonol galagina e ao éster feniletil do ácido cafeico. Estes apresentam um mecanismo de ação baseado na possível inibição da enzima RNA-polimerase bacteriana (Uzel, et al., 2005). Outros componentes como os flavonoides, ácido benzoico, ácido cinâmico são considerados como causadores de danos funcionais e estruturais pois atuam na membrana ou parede celular do microrganismo (Scazzachio, et al., 2006).

O própolis possui atividade antibacteriana em maior escala contra bactérias Gram-positivas e limitada contra Gram-negativas (Marcucci, 2001).

2.2.3. Prata

A prata é reconhecida pela sua eficácia antimicrobiana desde o século XVIII, pois eram utilizados sais de prata pela comunidade médica, para diversos tratamentos (Klasen, 2000).

No início do século XX, a prata voltou a ser usada com um novo formato nano particulado. As soluções de prata desenvolvidas na área da nanotecnologia possuem partículas com tamanho variando entre 0,01 a 0,001 micrómetro de diâmetro, que se caraterizam por uma maior superfície de contacto e como consequência ampliando as ações antibacterianas da prata. Segundos diversos estudos, as mini partículas interagem com elementos da membrana celular das bactérias, levando a danos na sua estrutura e forçando a dissipação dos protões e por fim a morte celular.

Têm sido usadas nano estruturas de prata depositadas sobre materiais têxteis para produzir têxteis inteligentes e funcionais, que têm grande potencial de aplicação nomeadamente na produção de materiais com propriedades antibacterianas, condutoras e sensores eletrónicos (Klasen, 2000; Dubas, et al., 2006; Zhang, et al., 2008; Gonensek, et al., 2010).

Como já referido anteriormente, atualmente, a maior parte dos produtos têxteis com propriedades antimicrobianas comercializados são produzidos por incorporação de metais como a prata. Contudo, essas substâncias possuem baixa biocompatibilidade e são nocivas para o ambiente (Pinho, et al., 2010). Sendo assim, a utilização de extratos naturais poderá aumentar uma vez que poderá tornar os têxteis



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funcionalizados mais biocompatíveis e consequentemente com maior aplicação na área da saúde e alimentar.

2.3. PROCESSOS DE INCLUSÃO DOS AGENTES ANTIMICROBIANOS EM PRODUTOS

TÊXTEIS

Os compostos antimicrobianos podem ser organizados em dois grandes grupos de acordo com a possibilidade ou não de migrarem no material têxtil. O primeiro grupo atua por um mecanismo de libertação controlada, no qual, a substância é lentamente libertada na superfície da fibra ou no seu interior. Neste tipo de atuação, denominado como “leaching”, o composto antimicrobiano é eficiente, no que diz respeito, à sua atuação na superfície da fibra e no ambiente circundante da mesma. Contudo, como estes compostos migram da superfície da fibra onde foram aplicados para o exterior, existe um consumo significativo do composto, e por isso uma diminuição da eficácia e durabilidade do tratamento. Sendo assim, quando um composto antimicrobiano do tipo “leaching” é aplicado em materiais têxteis em contacto direto com o corpo, existe um risco potencial associado à possível difusão e consequentemente absorção do composto pela pele. Desta forma, afeta a flora bacteriana normal da pele, originando alergias, irritações, entre outros efeitos indesejáveis (Ramachandran, et al., 2004; Schindler, et al., 2004).

O segundo tipo de compostos antimicrobianos consiste em produtos que são quimicamente ligados às superfícies das fibras. Estes compostos promovem o controlo microbiano na superfície das fibras, sem hipótese de libertação ou migração para o ambiente envolvente. Dada a sua ligação química com as fibras não perdem a sua eficácia, fornecendo um acabamento estável que retém a sua funcionalidade durante o ciclo de vida do artigo têxtil. Este tipo de compostos antimicrobianos como não difundem para o exterior, são menos absorvidos pela pele e naturalmente potencialmente mais inócuos para o utilizador (Szostak-Kotwa, 2004).

Os agentes antimicrobianos podem ser aplicados nos têxteis através de várias técnicas, nomeadamente por impregnação, pulverização, aplicação de espumas, e até diretamente sobre as fibras. Os agentes antimicrobianos podem ser aplicados nos têxteis durante os processos de tingimento ou acabamento. Existem vários métodos para melhorar a eficácia da preparação de substratos têxteis antimicrobianos por acabamento, que incluem (Ramachandran, et al., 2004):

Insolubilização de substâncias ativas em/na fibra; Tratamento das fibras com resina ou agentes de “cross-linking” Microencapsulação dos agentes antimicrobianos na matriz de fibras;



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Utilização de polímeros de enxerto, polímeros homo e/ou copolimerização na fibra.

Estes métodos, adaptados aos vários tipos de compostos antimicrobianos e tecidos, permitem obter produtos têxteis com propriedades antimicrobianas. No entanto, devido às múltiplas lavagens a que os artigos têxteis são sujeitos durante o seu ciclo de vida, a durabilidade do acabamento antimicrobiano, é uma exigência fundamental deste tipo de materiais.

As tecnologias que atuam por libertação controlada, nas quais as substâncias ativas são libertadas para a superfície do material provocando a destruição dos microrganismos, constituem uma opção viável para as fibras sintéticas, uma vez que os compostos podem ser aplicados antes ou durante os processos de extrusão das fibras. Estas podem ser misturadas posteriormente com as fibras de forma a obter-se um material antimicrobiano.

Este método tem a vantagem de permitir obter um produto ativo usando uma quantidade mínima de fibras de elevado custo. O objetivo principal deste tipo de tratamento é prevenir a deterioração do próprio material têxtil (Schindler, et al., 2004).

Os processos de insolubilização dos agentes antimicrobianos permitem que estes se difundam para o interior da fibra. No entanto, estes métodos apresentam limitações no que diz respeito ao consumo do agente antimicrobiano e consequentemente à durabilidade da atividade antimicrobiana. A incorporação de microcápsulas com o princípio ativo antimicrobiano durante os processos de extrusão das fibras ou por revestimento na superfície das fibras é uma metodologia que permite uma duração prolongada da atividade antimicrobiana, durante o ciclo de vida do artigo têxtil, mesmo após várias lavagens (Nelson, 1991; Schindler, et al., 2004).

Os materiais têxteis antimicrobianos podem também ser obtidos por processos de impregnação que permitem que seja utilizada uma vasta gama de agentes antimicrobianos e também em vários tipos de fibras. O desempenho do processo depende em grande medida, da permanência do agente antimicrobiano, que está relacionado com a sua solubilidade. Se o agente for significativamente solúvel em água é rapidamente removido quando sujeito à lavagem. Há substâncias ligantes que são adicionadas para aumentar a durabilidade de ação antimicrobiana, mas alteram em, grande medida, as propriedades do próprio material têxtil (principalmente ao toque e aspeto). Este efeito também é observado nos processos por revestimento nas fibras sintéticas (Schindler, et al., 2004).

Um composto que permite melhorar processos de tingimento e de lavagem, para garantir auniformidade da cor são as ciclodextrinas (CD’s). Foram realizadas vários estudos no campo dos têxteis para a fixação das CD’s nas fibras, com o objectivo de



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fazer uso da sua capacidade de inclusão em vários produtos ou várias substâncias:fragrâncias, substâncias nomeadamente de antimicrobianas, inseticidas, UV-absorventes, etc.

As CD’s são oligossacarídeos cíclicos compostos por unidades de glucose unidas por ligações α-1,4, de origem natural e com bastante uso em diversos tipos de indústrias. As CD’s usadas industrialmente são a α, β e λ-CD’s (Figura 3) sendo as suas concavidades formadas por 6, 7 ou 8 unidades de D(+)-glucopiranose, respetivamente (Moutin del Valle, 2004; Andreaus, et al., 2008).

Figura 3 – Esquema ilustrativo da estrutura dos diferentes tipos de ciclodextrinas α, β e λ. Adaptado de (Manakker, et al., 2009)

As CD’s possuem uma estrutura tridimensional em forma de tronco cónico (Figura 4) com uma cavidade interna hidrofóbica que serve como hospedeira a outras moléculas, permitindo assim a formação de um complexo de inclusão (Moutin del Valle, 2004; Andreaus, et al., 2008).

Figura 4 – Representação esquemática da estrutura das ciclodextrinas (B-Cyclodextrin hydrogels as potencial drug delivery systems, 2012)

O interior da cavidade das CD’s é relativamente apolar quando comparado com a água, o que lhes proporciona uma maior facilidade em formar complexos de inclusão



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com compostos orgânicos. Por possuirem esta estrutura, as CD’s tem a facilidade de formar complexos com compostos sólidos, líquidos e gasosos, contudo, para que ocorra a formação do complexo de inclusão é necessário que o tamanho da molécula a ser encapsulada seja compatível com a cavidade da CD bem como com a sua polaridade (Singh, et al., 2002; Moutin del Valle, 2004).

Um aspeto relevante no processo de fixação das ciclodextrinas em fibras prende-se com o uso dos agentes reticulantes como é exemplo a epicloridrina, pois é fundamental que estes agentes tenham uma grande aplicabilidade e ainda a vantagem de se serem usados em todos os tipos de CD’s não havendo necessidade de investir mais recursos para obter derivados das CD’s (Renard, et al., 1997; Andreaus, et al., 2008).

A aplicação das CD’s na indústria é muito diversificada tendo aplicacões na indústria farmacêutica, têxtil, alimentar e até de cosméticos. As CD’s têm um papel significativo na indústria têxtil, pois podem ser usadas para: remover os agentes tensioactivos a partir do material têxtil lavado, nos acabamento têxtil, na ligação dos produtos químicos sobre as fibras com a finalidade de aumentar a molhabilidade, e na ação antimicrobiana. As CD’s podem ser consideradas como uma nova classe de substâncias auxiliariares na a indústria têxtil (Grigoriu, et al., 2011).

2.4. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS TÊXTEIS

A atividade antimicrobiana de um composto pode ser quantificada com base na determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI), isto é, da concentração mínima do composto capaz de inibir o crescimento de um dado microrganismo. A determinação desta concentração é realizada normalmente através do método de difusão de agar mas em algumas situações também se efetua o método das diluições sucessivas (Harvey, 2000). O valor da CMI de um dado agente antimicrobiano não é constante, sendo influenciado pela natureza do microrganismo testado, pela quantidade de inóculo, pelo tempo de incubação, pela composição do meio de cultura e pelas condições ambientais, tais como a temperatura, o pH e o arejamento. É assim importante padronizar todas estas condições para poder determinar a CMI e comparar a atividade de diferentes agentes antimicrobianos face a um certo microrganismo (Jungkind, 1995; Laskin, 2011).

O método da difusão em agar é realizado dispensando discos de papel-filtro, impregnados com o agente antimicrobianos em concentrações fixas, sobre a placa de agar antecipadamente inoculada com o inóculo bacteriano com uma concentração de 1 a 2 x 108 UFC/mL. Durante a incubação da placa de Petri a uma temperatura



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adaptada para o crescimento do microrganismo teste, o agente antimicrobiano sofre difusão do disco de papel para o meio sólido. A uma certa distância do disco, o valor da concentração mínima inibitória é atingido e é onde se forma um halo (zona transparente) de inibição há volta desse mesmo disco, não crescendo colónias do microrganismo. Na Figura 5 encontra-se um exemplo da aplicação do método de difusão em agar.

Figura 5 – Exemplo do método de difusão em agar. Fonte:

http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/atm_racional/modulo2/metodos5.htm

Após 18-24 horas de incubação é medido o diâmetro do halo de inibição formado à volta do disco. O diâmetro do halo de inibição é proporcional à quantidade de agente antimicrobiano presente no disco, à solubilidade do agente, ao coeficiente de difusão no meio de cultura sólido e à eficácia global do agente antimicrobiano. Este método é rotineiramente usado para determinar a sensibilidade a antibióticos de microrganismos patogénicos (Jungkind, 1995; Harvey, 2000; Laskin, 2011).

No método das diluições sucessivas, são preparados tubos de ensaio contendo o meio de cultura suplementado com concentrações crescentes do agente antimicrobiano. Cada um dos tubos é inoculado com o microrganismo a testar. Terminado o período de incubação, avalia-se o crescimento microbiano, visível através da turbidez da cultura (Laskin, 2011). Segundo diversos autores a técnica alternativa mais amplamente utilizada em ensaios microbiológicos para determinar a concentração mínima inibitória é a de diluição em microplacas que permite a utilização de pequenas quantidades e/ou volumes. Outra vantagem desta técnica é a possibilidade de se utilizar simultaneamente mais que uma substância-teste, bem como diferentes microrganismos (Eloff, 1998; Langfield, et al., 2004; Alves, 2006).

Para poder produzir novos produtos têxteis são necessárias metodologias que permitam estudar e testar as várias propriedades que um têxtil comercial precisa de ter. É de extrema importância que os métodos usados em laboratório tenham

http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/atm_racional/modulo2/metodos5.htm



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resultados num curto espaço de tempo para se poderem tirar as diversas conclusões (Swofford, 2010). São comumente utilizados protocolos de ensaios quantitativos para têxteis antimicrobianos como os testes de difusão em agar que incluem: AATCC 147-2004 (American Association of Textile Chemists and Colorists), AATCC 100-2004, JIS L 1902-2002 (Japanese Industrial Standard) e ISO 20743 (International Standards Organization). Estes testes são apresentados em percentagem ou log10 tendo em consideração a diminuição da contaminação de uma contagem inicial das bactérias ou então tendo em conta um controlo final. Embora os organismos utilizados nos métodos quantitativos possam ser alterados, normalmente é usada uma bactéria Gram-positiva e uma Gram-negativa (Swofford, 2010).

O teste AATCC 100-2004 utiliza um meio completo de nutrientes para diluição para obter a concentração teste exigida de bactérias para inoculação. O nível de nutrientes é muito maior do que o esperado na maioria das situações do mundo real, permitindo o crescimento de bactérias em excesso. Apenas uma única repetição do teste é normalmente executada, em virtude deste método não ser específico. Fazer o teste, em triplicado, pelo menos e, tal como especificado em JIS L 1902-2002 e ISO 20743, é recomendado devido à variabilidade inerente. O teste AATCC 100-2004 é citado em especificações militares para avaliação de vestuário. Estudos patrocinados pelo US Congress e realizados conjuntamente pela Microban International e os US Army Natick Soldier RD&E Center obtiveram resultados em relação ao método AATCC 100-2004 no que diz respeito ao controlo de odores, ao conforto do uniforme usado no campo de combate do exército e nas t-shirts (Swofford, 2010). A norma ISO 20743:2007 especifica os testes quantitativos de contagem de placas que devem ser utilizados para determinar a atividade antibacteriana de produtos têxteis com acabamentos antibacterianos, incluindo não-tecidos. A norma é aplicável a todos os produtos têxteis, incluindo tecidos, estofos, e material para decoração de roupas, casa e bens diversos, independentemente do tipo de agente antibacteriano utilizado (orgânico, inorgânico, natural ou sintético) ou o método de aplicação (Windler, et al., 2012).

Nos testes AATCC 147-2004 e também a norma ISO 20743, a parte inferior da placa de Petri é preenchida com agar onde o microrganismo teste é colocado por espalhamento e depois a amostra de tecido é colocada por cima. Para a amostra tratada, a área onde não existe crescimento é então a zona de inibição que é expressa em milímetros. O teste AATCC 147-2004 é rápido (feito durante um período de 24horas), barato e simples apresentando contudo a desvantagem de não poder ser usado para medir a eficácia relativa de um antimicrobiano contra outro, em virtude de existirem antimicrobianos que se difundem a diferentes velocidades (Swofford, 2010).

CAPÍTULO 3 MATERIAS E MÉTODOS


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CAPÍTULO 3

MATERIAIS E MÉTODOS



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3. MATERIAIS E MÉTODOS

Neste capítulo descreve-se o trabalho experimental realizado. São fornecidas informações relativas ao equipamento utilizado, aos reagentes químicos, aos microrganismos e às metodologias, entre outros.

3.1. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS NATURAIS

3.1.1. Padrões, reagentes e microrganismos

O padrão de escina utilizado foi adquirido à Sigma com uma pureza mínima de 95%. Foram ainda utilizadas uma solução de escina 0,3% em spray da Biofarma e escina a 6% da Boiron, fornecidas pelo CeNTI.

As soluções de própolis testadas foram preparadas a partir de própolis (P19) em pó fornecido pela Ingrenor (Alemanha).

O agente antimicrobiano convencional utilizado foi o AgIONTM, constituído por prata (2,1-2,8%), zeólito A (63-82,8%), zinco (10,5-14%), entre outros constituintes em menor percentagem (dados do fabricante: Agion Technologies).

Os solventes utilizados foram o etanol adquirido à Panreac, o dimetilsulfoxido (DMSO) adquirido à Sigma e água destilada obtida num destilador (modelo D4000/Euro, Bibby sterilin).

Na determinação da concentração mínima inibitória (CMI) foi utilizada a resazurina 0,01 mg/mL adquirida à Acros Organics em tampão fosfato pH 7,0.

Os meios de cultura utilizados foram o meio de soja tripticase (TSB) da Oxoid e o meio e o agar de Mueller-Hinton adquiridos à Merck.

Nos ensaios em meio sólido foram utilizados discos de papel de filtro 6 mm de diâmetro da Whatman nº 2.

Os microrganismos teste utilizados foram as estirpes de Staphylococcus aureus ATCC 29213 e de Escherichia coli ATCC 10536.



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3.1.2. Metodologia 3.1.2.1. Ensaios em meio sólido e líquido

A avaliação da atividade antimicrobiana da escina e do própolis foi realizada através do método de difusão (meio sólido) e o método de diluição (meio líquido), utilizando como inóculos suspensões noturnas de Staphylococcus aureus e Escherichia coli em meio TSB.

Nos ensaios efetuados pelo método de difusão foi utilizado o meio de cultura Mueller-Hinton agar em placas de Petri e o microrganismo teste inoculado por espalhamento com zaragatoa à superfície do meio. Após aproximadamente 5 minutos foram colocados discos de papel impregnados com as diferentes soluções dos compostos a testar. De seguida, as placas de Petri foram colocadas numa incubadora (Selecta Hotcold-M) a 37ºC, durante 24 horas. Posteriormente foi observado o crescimento do microrganismo nas placas, avaliando a atividade antimicrobiana através da medição do halo de inibição formado à volta dos discos de papel.

Foram testadas duas soluções padrão de escina de 2 e 6% em água destilada, duas soluções comerciais de escina 0,3% e 6% em etanol 65% e uma solução de própolis 6% em DMSO 20%. Como controlos positivos foram utilizados o etanol 65% e uma solução de AgIONTM 2% em água destilada. Como controlos negativos o DMSO 20%, a água destilada estéril e discos de papel sem compostos impregnados.

Os ensaios efetuados pelo método de diluição foram realizados em microplacas estéreis com tampa de 96 poços. O inóculo utilizado foi preparado a partir das culturas noturnas dos microrganismos teste, diluindo-as 100 vezes em meio Mueller-Hinton. Esta diluição foi realizada para que não fosse visível turvação inicial da suspensão de microrganismo utilizada.

Em cada poço da microplaca foram colocados 180µL de inóculo e 20µL das soluções dos compostos a testar. As microplacas foram vedadas com parafilm® para evitar a evaporação dos solventes. De seguida, as microplacas foram colocadas na incubadora, sem agitação, a 37ºC, durante 18 horas. Após o período de incubação foi avaliada a atividade antimicrobiana adicionando, a cada poço, 15µL de resazurina 0,01mg/mL em tampão fosfato pH 7,0 (pesaram-se 5mg de resazurina, 375mg de KH2PO4 e 556mg de NA2HPO4 em 100mL de água destilada). As microplacas foram colocadas novamente na incubadora à mesma temperatura durante 4 horas. A alteração da cor azul para rosa da solução de resazurina permite avaliar se existe ou não atividade celular e assim avaliar se os compostos testados inibiram o crescimento dos microrganismos. Na Figura 6 está esquematizado o método de diluição em microplacas utilizado.



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Foram testadas doze soluções padrão de escina de concentração entre 6% e 0,005% em água destilada, e sete soluções de própolis de concentração entre 6% e 0,25% em DMSO 20%. Como controlos positivos foram utilizados o etanol 70 e 96%, e oito soluções de AgIONTM de concentração entre 6 e 0.25% em água destilada. Como controlos negativos a água destilada estéril e o DMSO 20%. Foi ainda realizado um controlo positivo e negativo do meio de cultura colocando num poço 200µL do inóculo e num outro poço 180µL de meio de Mueller-Hinton e 20µL de água destilada estéril, respetivamente.

Figura 6 - Representação esquemática do procedimento efetuado no método de diluição em microplacas

3.1.2.2. Determinação da concentração mínima inibitória

A determinação da concentração mínima inibitória do extrato de própolis foi realizada através de um procedimento semelhante ao descrito anteriormente para a avaliação da atividade antimicrobiana pelo método de diluição. As concentrações das soluções de própolis usadas foram 6%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,8%, 0,6%, 0,5%, 0,25%, 0,15% e 0,1% em DMSO 20% e etanol 65%.



24

3.2. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE TECIDOS FUNCIONALIZADOS

COM EXTRATOS NATURAIS

3.2.1. Reagentes e Material têxtil

Os reagentes utilizados foram o ácido sulfúrico, o hidróxido de sódio, as β-ciclodextrinas e epicloridrina adquiridos à Merck. Foram ainda utilizados o etanol adquirido à Panreac, o dimitilsulfoxido (DMSO) adquirido à Sigma, a fenolftaleína e a água destilada obtida num destilador (modelo D4000/Euro, Bibby sterilin). Foi utilizada uma solução de escina 0,3% em spray da Biofarma. A solução de própolis testada foi preparada através de própolis (P19) em pó fornecido pela Ingrenor.

Os meios de cultura utilizados foram o meio de soja tripticase (TSB) da Oxoid e o meio agar nutritivo (NA) semissólido preparado com agar fornecido por José M. Vaz Pereira, S.A., a peptona da Himedia e extrato de carne da Cultimed.

Os microrganismos teste utilizados foram as estirpes de Staphylococcus aureus (ATCC 29213) e de Escherichia coli (ATCC 10536).

Os tecidos utilizados neste estudo foram meias constituídas por algodão/elastano e poliamida/algodão/elastano (Figura 7).

Figura 7 - Fotografia obtida com um esteriomicroscópio dos tecidos utilizados: A- algodão, B- poliamida. Ampliação total: 40x

3.2.2. Processos de funcionalização dos substratos utilizados

O processo de funcionalização foi realizado no CeNTI e permitiu a incorporação de ciclodextrinas nos tecidos de poliamida e algodão. No processo de funcionalização das meias de poliamida foi necessário proceder-se a um pré-tratamento por hidrólise ácida para que a fixação das ciclodextrinas fosse possível. Assim, as meias de poliamida foram colocadas num banho com uma solução de hidrólise de H2SO4 1M, a 30 ˚C durante 15 minutos.

Posteriormente, o processo de funcionalização foi realizado na unidade de tingimento e acabamento têxtil do CITEVE, na Mathis (Mathis Labomat BFA, W. Mathis AG) onde



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as meias de poliamida foram colocadas com as soluções de NaOH (200 g/L), de β-ciclodextrinas (100 g/L) e de epicloridrina (30 mL/L), a 40 ˚C, 25 rpm, durante 38 minutos. Procedeu-se de igual modo para as meias de algodão, omitindo o passo de pré-tratamento por hidrólise ácida.

Finalmente, as meias foram lavadas com água corrente sendo depois colocadas a secar até ao dia seguinte para proceder à quantificação do teor de ciclodextrinas ligadas ao tecido.

3.2.2.1. Caraterização das β-ciclodextrinas no tecido funcionalizado

A quantificação do teor de β-CD incorporado nos tecidos após o processo de funcionalização foi efetuada pelo método espectrofotométrico com fenolftaleína. Para tal, foram pesadas numa balança analítica da Mettler Toledo (XS 205 dual range) amostras em duplicado das meias secas e utilizadas no dia anterior com cerca de 0,1 g cada., Estas amostras foram colocadas em frascos com 5mL de fenolftaleína e 1 mL de água destilada. Após agitação, a concentração de β-CD foi medida através da descoloração da solução de fenolftaleína num espectrofotómetro UV/VIS Lambda 35, a 550nm.

3.2.2.2. Verificação da solidez à lavagem do tecido funcionalizado

A verificação da solidez à lavagem dos tecidos funcionalizados foi realizada por adaptação da norma ISO 6330:2000. Os ensaios foram realizados numa máquina de lavar roupa (INDESIT IWDC 6105) no programa 2 (60ºC, 800 rpm, durante 85 minutos), adicionando 30 g de um detergente padrão em cada ciclo de lavagem.

3.2.3. Avaliação da atividade antimicrobiana do tecido funcionalizado 3.2.3.1. Ensaios com microrganismos teste

A avaliação da atividade antimicrobiana dos têxteis funcionalizados foi realizada por adaptação da norma ISO 20743:2007. O método foi otimizado utilizando o tecido de poliamida e de algodão e a solução comercial em spray de escina 0,3% em etanol. Foi otimizada a quantidade de inóculo e de meio NA semissólido utilizada.

As amostras de poliamida e algodão com cerca de 1 g cada foram pulverizadas com a solução de escina 0,3% em etanol e deixadas secar durante a noite.

O inóculo utilizado foi preparado a partir de das suspensões noturnas de Staphylococcus aureus e Escherichia coli, diluindo-as 100 vezes em meio TSB.



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As amostras de poliamida e algodão foram colocadas em placas de Petri estéreis, inoculadas com 0,6 mL da suspensão do microrganismo teste e posteriormente cobertas com 3 mL de meio NA semissólido. Foram preparados 100 mL de meio NA semissólido pesando numa balança analítica Mettler Toledo (modelo AB204) 0,8 g de agar, 0,5 g de peptona e 0,3 g de extrato de carne, esterilizado numa autoclave Trade Raypa AV-100 a 121ºC, 1atm, durante 15 minutos.

As placas de Petri com os têxteis foram incubadas a 37ºC, durante 24 horas.

Foram efetuados ensaios controlo, nos quais se estudou a viabilidade do inóculo e a influência das ciclodextrinas na atividade antimicrobiana dos tecidos. Para isso foi utilizado o têxtil funcionalizado com ciclodextrinas (sem escina) inoculado com 0,6 mL da suspensão de microrganismo e 3 mL de meio NA semissólido. O controlo negativo consistiu no tecido funcionalizado com 3 mL de meio NA semissólido e o controlo positivo com o tecido funcionalizado com ciclodextrinas pulverizadas com etanol 65%, inoculado com 0,6 mL da suspensão de microrganismo e 3 mL de meio NA semissólido.

A avaliação da atividade antimicrobiana de tecidos funcionalizados por incorporação de ciclodextrinas e extrato de própolis foi efetuada com uma metodologia semelhante à descrita anteriormente, utilizando um tecido de algodão e uma solução de própolis a 1% em etanol 65%.

A visualização do crescimento microbiano e consequentemente a avaliação da atividade antimicrobiana do tecido funcionalizado foi realizada utilizando um esteriomicroscópio da Motic com ampliação total 40x.

3.2.3.2. Ensaios com os tecidos depois de colocados em contato com a pele

A atividade antimicrobiana do tecido de algodão funcionalizado com ciclodextrinas e contendo uma solução de própolis 1% em etanol 65% foi ainda avaliada após o tecido estar em contacto com a pele de um utilizador.

Foram preparadas amostras de tecido de algodão com cerva de 1g pulverizadas com uma solução de própolis 1% em etanol 65%, amostras pulverizadas com água destilada (controlo negativo) e amostras pulverizadas com etanol 65% (controlo positivo). Deixaram-se secar as amostras antes de serem utilizadas.

O ensaio consistiu em colocar as três amostras em contacto com a pele, mais propriamente no antebraço do utilizador, durante 6 a 8 horas. Os utilizadores usaram as amostras em duplicado (um conjunto das três amostras em cada antebraço) e foram indivíduos voluntários do sexo feminino e masculino.



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Após o período de utilização, as amostras foram colocadas em placas de Petri, com a parte em que esteve em contacto com a pele para cima. Foi adicionado 3mL de meio NA semissólido e colocadas a incubar a 37ºC durante 24 horas. Foram ainda realizados ensaios de amostras preparadas como descrito anteriormente mas sem terem sido colocadas em contacto com a pele.

Os resultados foram observados num microscópio modelo DM2000 da Leica e a aquisição de imagens realizada à escala de cor em campo claro através de uma câmara modelo DFC310 FX também da Leica, acoplada ao microscópio.


COM AgIONTM

Foram ainda realizados ensaios para avaliar a atividade antimicrobiana de discos de madeira contendo AgIONTM, de modo a verificar a aplicação da metodologia descrita anteriormente, e que resulta da adaptação da norma ISO 20743:2007, em material rígido como a madeira.

Para a realização destes ensaios foram usados discos de madeira com cerca de 2 cm de diâmetro tratados com o agente antimicrobiano convencional AgIONTM.

Numa placa de Petri foram colocados dois discos de madeira, um revestido com AgIONTM e outro não. Em cada disco foram colocados 0,2 mL de inóculo do microrganismo teste e 0,2 mL de meio NA semissólido. O inóculo foi preparado como descrito no subcapítulo 3.2.3.1. As placas foram incubadas a 37˚C durante 24 horas

CAPÍTULO 4 RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO


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CAPÍTULO 4

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

E DISCUSSÃO



29

4. RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO

Os materiais têxteis são potenciais portadores de microrganismos nomeadamente bactérias patogénicas, bactérias geradoras de odores e fungos, possibilitando também o seu crescimento. A diminuição do crescimento microbiano não é conseguida através do controlo das condições ambientais do tecido nem mesmo pelos processos de lavagem frequentes, à exceção da lavagem à fervura, sendo esta, no entanto, desaconselhável na maioria dos materiais têxteis. Assim, os tratamentos com agentes antimicrobianos adquirem cada vez mais um papel preponderante visto que, aumentam a vida útil dos tecidos protegendo o utilizador quer de maus odores quer muitas vezes de alergias e infeções. Como os consumidores têm aumentado cada vez mais as suas exigências em termos de higiene e estilo de vida, tem-se verificado um incremento na procura e expectativas de produtos têxteis com propriedades antimicrobianas.

Assim sendo, no decorrer do trabalho experimental pretendeu-se estudar as propriedades antimicrobianas de dois extratos naturais, a escina e o própolis e a sua aplicação em materiais têxteis. Em virtude de ambos os extratos naturais estudados serem insolúveis em água, utilizaram-se extratos dissolvidos em etanol e em DMSO. Estes dois solventes possuem poder antimicrobiano, embora o do DMSO seja muito inferior ao do etanol. A utilização do etanol deveu-se ao facto deste trabalho ter como objetivo a funcionalização de têxteis para posterior utilização comercial, e o DMSO não ser biocompatível com a pele humana, contrariamente ao etanol.

A avaliação da atividade antimicrobiana dos têxteis funcionalizados foi realizada por adaptação da norma ISO 20743:2007. Apesar de haver vários métodos descritos na literatura que permitem quantificar a atividade antimicrobiana em materiais têxteis, não existe ainda um consenso quanto à sua aplicação, estando associadas grandes incertezas e variabilidade (E., 2008; H.W., 2010). Tornou-se assim pertinente otimizar um método que permiti-se obter uma resposta rápida e que fosse possível aplicar também a material mais rígido como por exemplo a placas de madeira.

4.1. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS NATURAIS

4.1.1. Atividade antimicrobiana da escina

Numa primeira etapa do trabalho experimental procedeu-se à avaliação da atividade antimicrobiana da escina através do método de difusão (meio sólido), utilizando como inóculos suspensões noturnas de S.aureus e E.coli em meio TSB.



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Inicialmente foi testada a solução comercial de escina 0,3% em etanol 65%. Para isso, foram efetuadas várias placas de Petri com meio de cultura Mueller-Hinton agar, nas quais, após inoculadas com o microrganismo teste, foram colocados discos impregnados com a solução comercial de escina 0,3% em etanol 65%, água destilada estéril como controlo negativo e etanol 65% como controlo positivo por se tratar do solvente da solução de escina utilizada. Nas Figura 8 e Figura 9 pode observar-se os resultados obtidos em quatro replicados destes ensaios.

Observa-se que houve formação de zonas de inibição quer para a solução comercial de escina 0,3% quer para o etanol 65%. Estas duas soluções apresentaram atividade antimicrobiana relativamente ao S. aureus e à E. coli. Essa atividade traduziu-se em halos de inibição para o etanol 65% de 89,5±1,0 mm e 89,3±1,3 mm, para o S. aureus e a E. coli, respetivamente. Para a solução comercial de escina 0,3% obteve-se as seguintes zonas de inibição: 21,0±1,2 mm para o S. aureus e 29,0±1,2 mm para a E. coli.

Era esperado que o disco impregnado com água destilada não apresentasse uma zona de inibição, pois esta não deverá inibir o crescimento microbiano, o que não aconteceu.

Figura 8 – Zonas de inibição de ensaios realizados para avaliar a atividade antimicrobiana da solução

comercial de escina 0,3% em etanol 65% para o S.aureus. (1- etanol 65%; 2- escina comercial 0,3%; 3- água destilada estéril)



31

Figura 9 - Zonas de inibição de ensaios realizados para avaliar a atividade antimicrobiana da solução comercial de escina 0,3% em etanol 65% para a E.coli. (1- etanol 65%; 2- escina comercial 0,3%; 3- água destilada estéril)

Apesar de se ter observado que a solução comercial de escina 0,3% inibiu o crescimento de ambos os tipos de bactérias, esta apresentou uma zona de inibição inferior à do etanol 65%. Como o etanol é o solvente da solução de escina comercial, estes resultados deixaram a dúvida de que a inibição observada fosse devido a este e não à escina. O poder antimicrobiano do etanol usado como solvente em diversos extratos já é bastante conhecido e estudado, como são exemplo os trabalhos de (Michelin, et al. 2005, Kivrak, et al. 2009, Li, et al. 2012). Por outro lado, a concentração de escina poderia ser também muito reduzida e por isso as suas propriedades antimicrobianas serem mascaradas pelas do etanol.

Testou-se então de seguida uma solução comercial de escina 6% em etanol 65% para verificar se o aumento da concentração de escina influenciava o seu poder antimicrobiano, Testou-se duas soluções padrão de escina de 3% e 6% em água destilada para retirar o efeito do solvente etanol. Foi ainda utilizado como controlo negativo discos impregnados com água destilada e controlo positivo o etanol 65% e uma solução do agente antimicrobiano comercial AgIONTM de 2%. Estes ensaios realizaram-se apenas com o S. aureus. Os resultados obtidos são apresentados nas Figura 10 e Figura 11.



32

Figura 10 – Zonas de inibição de ensaios realizados para avaliar a atividade antimicrobiana da escina 6% para a

S.aureus. (1- etanol 65%; 2- padrão de escina 6%; 3- escina comercial 6%; 4- água destilada estéril)

Verificou-se que o etanol 65% apresentou uma zona de inibição de 81,0±1,5 mm, o AgIONTM 2% de 17,8±2,1 mm, a solução comercial de escina 6% de 21,0±*1,3 mm. As soluções padrão de escina 3 e 6% em água destilada não apresentam um halo de inibição, no entanto o crescimento à sua volta tem um aspeto diferente da restante placa de Petri.

Estes resultados parecem evidenciar que a atividade antimicrobiana das soluções comerciais de escina é devida ao etanol e não a esse composto. Contudo, como a escina é composta por substâncias de elevado peso molecular poderá ter dificuldades em difundir no agar e por isso não ser percetível por este método a sua atividade antimicrobiana. A coloração que se observa à volta dos discos impregnados com a solução padrão de escina 6% poderá ser devido à precipitação da escina no meio de cultura.

Observa-se ainda que para a solução comercial de escina 6% há crescimento de colónias de microrganismos resistentes na zona de inibição. Está descrito que as saponinas não inibem o crescimento microbiano de populações com elevada



33

densidade celular (S.G., et al., 2004) o que poderá justificar esse aumento de resistência.

Figura 11 – Zonas de inibição de ensaios realizados para avaliar a atividade antimicrobiana da solução de

escina 6% e 3% em água destilada para a S.aureus. (1- etanol 65%; 2- escina 6%; 3- escina 3%; 4- AgIONTM 2% 5- água destilada estéril)

Observou-se também que o etanol 65% tem um poder antimicrobiano superior ao AgIONTM. Este agente antimicrobiano comercial é constituído por prata (2,1-2,8%), zeólito A (63-82,8%), zinco (10,5-14%), As propriedades antimicrobianas da prata já são conhecidas e utilizadas em diversas áreas e para diversas finalidades (Lee, Yeo e Jeong 2003, Sondi e Salopek-Sondi 2007, Gonensek, et al. 2010). Esta solução tinha um aspeto coloidal o que poderá também ter dificultado a sua difusão no meio de agar e por isso a sua atividade.

Salienta-se o facto de os teste nas placas apenas serem feitos com o etanol a 65% pois é a quantidade permitida para utilização nos tecidos e posterior contato com a pele.

Procedeu-se então à avaliação da atividade antimicrobiana da escina através do método de diluição testando-se doze soluções padrão de escina de concentração entre 6% e 0,005% em água destilada, Como controlos positivos foram utilizados o



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etanol 70 e 96%, e oito soluções de AgIONTM de concentração entre 6 e 0.25% em água destilada. Como controlos negativos a água destilada estéril. Foi ainda realizado um controlo positivo e negativo do meio de cultura colocando num poço 200µL do inóculo e num outro poço 180µL de meio de Mueller-Hinton e 20µL de água destilada estéril.

Este método foi efetuado em microplacas estéreis de 96 poços e a atividade microbiana identificada pela reação com a resazurina.

A resazurina permite realizar uma leitura visual após a sua adição aos poços das microplacas pois trata-se de um indicador de oxidação-redução que é utilizado para avaliar a viabilidade de células microbianas. A resazurina possui uma cor azul que é oxidada na presença de células viáveis a resofurina, sendo esta substância de cor rosa e indica a inviabilidade das células (Alves, et al., 2008).

Após a realização de vários ensaios verificou-se que a solução de escina mais concentrada (6%) alterava a cor da resazurina de azul para rosa, podendo levar à conclusão que não apresentava atividade antimicrobiana enquanto, as restantes soluções não alteravam a cor da resazurina, podendo assim levar à conclusão que possuíam poder antibacteriano. Como estes resultados se apresentaram incoerentes verificou-se se a solução de escina 6%, mesmo sem inocular já alterava a cor da resazurina. Testou-se essa solução após esterilização na autoclave, por filtração e sem esterilizar. Verificou-se que a esterilização por autoclave alterava a solução de escina, provocando precipitação. Por outro lado, verificou-se que todas as soluções de escina alteravam a cor da resazurina de azul para rosa como se pode observar na Figura 12. A alteração da cor não é devida à atividade microbiana, visto que a solução esterilizada por filtração também apresentou alteração da cor. Após verificar o pH desta solução, que possuía um pH de 4 concluiu-se que provavelmente seria essa a razão da alteração da cor. Como já mencionado a resazurina muda de cor porque é oxidada na presença de células viáveis alterando a sua cor de azul (pH 6,5) para rosa (pH 3,8) (Alves, et al., 2008).



35

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A-H - 200μL

escina 6% (autoclave)

200μL escina 6% (filtrada)

200μL escina 6%

(s/esterilizar)

200μL inóculo

180μL inóculo + 20μL escina

6%

180μL inóculo + 20μL escina

2%

180μL inóculo + 20μL escina 0.25%

180μL inóculo + 20μL

água DL

180μL inóculo + 20μL etanol 70%

200μL etanol 70%

-

Figura 12 – Ensaio na microplaca para avaliar a influência do pH na determinação da capacidade antibacteriana de diferentes concentrações de escina para o inóculo de S.aureus e respetiva legenda dos poços da

microplaca

Sendo assim, preparou-se uma nova solução de resazurina em tampão fosfato para impedir a variação da cor por influência da alteração do valor de pH (Sarker, et al., 2007; Alves, et al., 2008).

Verificou-se ainda, que alguns resultados dos ensaios controlos nem sempre eram coerentes. Apesar de se verificar sempre a viabilidade do inóculo utilizado por crescimento em placa de Petri, em alguns casos, nos poços das microplacas onde se colocava apenas 200 µL de inóculo e/ou 180 µL de inóculo e 20 µL de água destilada não se verificava atividade celular. O volume reduzido pipetado pode ter levado a alguns erros, sendo assim, para ultrapassar esse problema foram ainda realizados ensaios em tubos de ensaio em que o volume final foi de 2 mL (1,9 mL de inóculo e 0,1 mL de solução de escina). Foram testadas soluções de escina com as concentrações a variar entre 6% e 0,005%. Fizeram-se ainda ensaios para controlar o inóculo (adicionando-se apenas 2,0 mL de inóculo), do meio de cultura (adicionando-se 2,0 mL de meio) e com etanol 65% (1,9 mL de inóculo e 0,1 mL de etanol 65%).

Verificou-se que todas as soluções de escina testadas (6% e 0,005%) alteraram a cor da resazurina enquanto que com o etanol não houve alteração da cor, concluindo-se assim que este composto não consegue inibir o S. aureus e a E. coli, Apesar de se esperar que a escina pela sua composição química, apresenta-se atividade antimicrobiana, estes resultados vêm ao encontro do que está descrito na literatura. No estudo de Sparg et al. (2004), estes autores referem que, de um modo geral, as saponinas triterpenicas derivadas de plantas têm fraca atividade bacteriana,



36

apresentando essencialmente atividade antifúngica e antiviral. Referem ainda que a atividade antifúngica é potenciada quando usados os extratos das misturas das saponinas relativamente aos compostos puros. Assim, será interessante avaliar a atividade antimicrobiana do extrato total das sementes do Castanheiro-da-índia, e focando essencialmente a sua atividade contra fungos filamentosos e leveduras. Uma vez que, esse extrato total será constituído também por outros compostos que possuem essencialmente atividade antifúngica, como referido por Fant et al. (1999) em que a proteína 1 (h-AMP1) isolada das sementes do Aesculus hippocastanum, possui atividade antifúngica, mas pouca ou nenhuma atividade contra bactérias.

4.1.2. Atividade antimicrobiana do própolis

A atividade antimicrobiana do própolis (P19) em pó fornecido pela Ingrenor foi avaliada usando o mesmo procedimento descrito para a escina. Uma vez que o própolis não é solúvel em água, foram usados como solvente o DMSO e o etanol 65%.

Os resultados obtidos pelo método de difusão são apresentados nas Figura 13 e Figura 14.

Verifica-se que há formação de uma zona de inibição junto ao disco de papel impregnado com a solução de própolis em DMSO e etanol, com um diâmetro de 11,0±1,2 mm e 17,3±1,2 mm, respetivamente. Verificou-se um halo de inibição também para o DMSO de 17,5±1,9 mm e para o etanol 65% de 79,0±1,0 mm.

Foram já realizados vários estudos (Fernandes, et al., 1997; Kujumgiev, et al., 1999; Hegazi, et al., 2000; Scazzachio, et al., 2006; Choudhari, et al., 2012; Silva, et al., 2012; Frozzaa, et al., 2013) com o intuito de estudar a atividade antimicrobiana do extrato de própolis, evidenciando-se por exemplo o trabalho de Stepanovic e co-autores que realizaram um estudo para avaliar as propriedades do extrato etanólico de 13 amostras de própolis provenientes de diferentes regiões da Sérvia, sobre 39 microrganismos, através dos métodos de diluição e difusão em ágar com o intuito de estudar a capacidade antimicrobiana do própolis. Com os resultados obtidos concluíram que os extratos etanólicos de própolis apresentavam atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e leveduras.

Relativamente ao DMSO, este possui diversas propriedades entre as quais a antimicrobiana e por isso é habitual o seu uso como solvente (Brayton 1986).



37

Figura 13 – Zonas de inibição de ensaios realizados para avaliar a atividade antimicrobiana da solução de

própolis 6% em DMSO para a S.aureus. (1- DMSO; 2- própolis 6%; 3- água destilada estéril)



38

Figura 14 - Zonas de inibição de ensaios realizados para avaliar a atividade antimicrobiana da solução de própolis 6% em etanol 65% para a S.aureus. (1- etanol 65%; 2- própolis 6%; 3- água destilada estéril)

Como os resultados pelo método de difusão em meio de agar não foram totalmente conclusivos recorreu-se também ao método de diluição cujos resultados são apresentados nas figuras que se seguem.

Pelo método de diluição em microplacas foram testadas oito soluções de própolis de concentração entre 6% e 0,1% em etanol 65%. Como ensaios controlo foram usados a água destilada estéril, o etanol 65% e o DMSO 20%. Foi ainda realizado um controlo positivo e negativo do meio de cultura colocando num poço 200 µL do inóculo e num outro poço 180 µL de meio de Mueller-Hinton e 20 µL de água destilada estéril, respetivamente.

Foi usado o etanol 65% como solvente das soluções de própolis pois foi este solvente o utilizado nos ensaios com os tecidos.

Estes ensaios permitiram ainda determinar a concentração mínima inibitória (CMI) para as bactérias utilizadas.



39

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A-F 200μL inóculo

180μL meio + 20μL água DL

200μL DMSO 20%

200μL etanol 65%

180μL inóculo + 20μL própolis

4%


2%


1%


0.8%


0.5%

180μL inóculo + 20μL própolis 0.25%

180μL inóculo + 20μL própolis 0.15%


0.1% Figura 15 – Ensaio na microplaca para determinar a CIM com diferentes concentrações própolis para o inóculo

de S.aureus e respetiva legenda dos poços da microplaca

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A-F 200μL inóculo

180μL meio + 20μL água DL

200μL DMSO 20%

200μL etanol 65%


6%


4%


3%


2%


1%


0.8%


0.6%


0.5%

Figura 16 – Ensaio na microplaca para determinar a CIM com diferentes concentrações própolis para o inóculo de E.coli e respetiva legenda dos poços da microplaca

Foram também realizados ensaios em tubos de ensaio, como descrito nos testes da escina, para verificar se o volume utilizado nas microplacas tinha influência nos resultados. Após os resultados deste procedimento verificou-se que todos os tubos de ensaio com as soluções de própolis, à exceção dos que continham as concentrações



40

mais baixas para cada um dos microrganismos teste, apresentaram coloração azul, estando em concordância com os resultados obtidos nas microplacas.

Com os ensaios realizados constatou-se que a solução de própolis 0,1% (1 mg/mL) possui atividade contra o S. aureus, uma vez que se observou alteração da cor da resazurina. Sendo assim, verifica-se que a CMI para esta bactéria foi de 1500 μg/mL correspondente à mínima concentração de própolis que inibiu totalmente o crescimento celular. Para a E. coli verificou-se alteração da cor da resazurina na solução de própolis 0,5% (5 mg/mL), tendo-se concluído que a CMI para esta bactéria e para os ensaios realizados é de 6000 μg /mL.

Verificou-se que a E. coli foi menos suscetível que o S. aureus ao própolis. Estes resultados estão em concordância com os obtidos por outros investigadores que verificaram uma atuação relevante do própolis sobre bactérias gram-positivas e uma atividade mais limitada contra as gram-negativas (Fernandes, et al., 1997; Marcucci, 2001; Stepanović, et al., 2003; S. Silici, et al., 2005).

Na literatura é possível encontrar valores similares aos obtidos para a CMI, nomeadamente entre 1000 e 8400 μg/ml para o S. aureus e a E. coli (Hegazi, Hady, e Allah 2000) ou bastante inferiores. Por exemplo, Lu et al. (2004) reportaram valores da CMI entre 3,75 a 60 μg/ml para o S. aureus. Por outro lado, Silici e Kutluca (2005) verificaram que diferentes extratos de própolis, de diferentes origens, inibiam de modo diferente os microrganismos testados (CMI entre 117 e 468 μg/ml para o S. aureus e entre 1875 e 7500 μg/ml para a E. coli, dependendo da origem do própolis). Este diferente poder de inibição poderá estar relacionado com diferenças na composição e concentração de vários compostos presentes nas amostras de própolis com diferentes origens.

Com os resultados obtidos, e uma vez que, foram testadas soluções etanólicas de própolis por não se conseguir dissolver o própolis em água destilada, podem ficar algumas dúvidas se a atividade antibacteriana observada é de facto devida ao própolis ou não. No entanto, como já referido existem outros trabalhos a realçar essas propriedades e referem ainda que a atividade antimicrobiana do própolis poderá estar associada à flavonana, ao flavonol e ao éster que apresentam um mecanismo de ação baseado na possível inibição da enzima RNA-polimerase bacteriana (Uzel, et al., 2005).

4.2. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE TECIDOS FUNCIONALIZADOS

COM EXTRATOS NATURAIS

Os têxteis, especialmente aqueles que são constituídos por fibras naturais proporcionam um excelente ambiente para o crescimento de microrganismos devido à



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sua capacidade de reter humidade e à sua grande superfície. Assim a modificação química e física dos tecidos com vista à introdução de propriedades antimicrobianas tem-se mostrado de grande importância.

Inicialmente procedeu-se à incorporação de ciclodextrinas nos tecidos de poliamida e algodão, de modo que a sua funcionalização com os extratos naturais fosse facilitada. Devido à sua estrutura em forma de cone truncado e interior hidrofóbico, as ciclodextrinas possuem uma elevada capacidade de retenção de compostos hidrofóbicos, sendo excelentes agentes encapsulantes de moléculas aromáticas como os extratos naturais de plantas. Deste modo, pretendeu-se no presente trabalho estudar o efeito antimicrobiano de extratos naturais encapsulados nas ciclodextrinas, presentes à superfície dos tecidos.

Descreve-se de seguida a caraterização da incorporação das ciclodextrinas em termos da sua quantificação e solidez à lavagem.

4.2.1. Processo de funcionalização dos tecidos utilizados 4.2.1.1. Caracterização das β-Ciclodextrinas no tecido funcionalizado

A quantificação das β-CD foi realizada através do método da fenolftaleína, método interno desenvolvido no CeNTI. Este método consiste em verificar o poder de formação de complexos de inclusão das ciclodextrinas com a fenolftaleína, podendo ser usado como forma de quantificação das CD’s presentes no substrato têxtil. Sucintamente, o método consiste em colocar o substrato têxtil contendo as CD’s covalentemente ligadas numa solução de fenolftaleína em tampão alcalino. Se as CD’s formarem complexos de inclusão com este indicador de pH, vão encapsula-lo, pelo que a cor da solução passa de rosa forte para rosa ténue ou incolor. Como as CD’s formam complexos de inclusão com a fenolftaleína de 1:1 (uma molécula de ciclodextrina complexa com uma molécula de fenolftaleína), então a remoção da fenolftaleína pode ser diretamente correlacionada com a quantidade de CD’s à superfície do tecido.

De seguida são apresentadas as concentrações das β-ciclodextrinas calculadas com base na curva de calibração pelo método da fenolftaleína que se encontra em anexo.

Na Tabela 1 encontram-se as concentrações das ciclodextrinas presentes nas diferentes amostras das meias de algodão e poliamida, após lavagem com água corrente (0 ciclos de lavagem) e após 1 a 5 ciclos de lavagem. Como se pode verificar através da Tabela 1 existe uma concentração significativa de β-ciclodextrinas com 0 ciclos de lavagem, o que pode levar a concluir que existem ciclodextrinas que estão apenas adsorvidas à superfície do tecido e que não foram corretamente removidas na lavagem efetuada com água corrente.



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Tabela 1 – Valores das concentrações das β-ciclodextrinas após lavagem com água corrente (0 ciclos de lavagem) e 1 e 5 ciclos de lavagem doméstica

0x 1x 5x

Amostras M tecido (g) Concentração de β-CD's (mg/g tecido)

Concentração de β-CD's (mg/g tecido)

Concentração de β-CD's (mg/g tecido)

Algodão (C1) 0,102 0,219 0,025 0,390 Algodão (C2) 0,101 7,11 0,180 0,150

Poliamida (P1) 0,102 23,42 1,34 1,03 Poliamida (P2) 0,0970 16,36 1,16 1,42 Analisando as concentrações de β-ciclodextrinas nas duas amostras das meias de algodão e de poliamida pode constatar-se que após um ciclo de lavagem, as CD’s que existiriam em excesso foram removidas, apresentando portanto uma concentração mais baixa quando comparada com a anterior, antes do primeiro ciclo de lavagem.

Após cinco ciclos de lavagem verifica-se que em cada uma das duas amostras de algodão e poliamida a concentração de CD’s mantem-se em cerca de 1 mg por grama de tecido.

Deste modo, pode concluir-se que o processo de ligação covalente das ciclodextrinas aos tecidos de algodão e poliamida foi eficaz, revelando solidez à lavagem doméstica até pelo menos 5 ciclos consecutivos. Trabalhos anteriores efetuados no CeNTI mostraram que a quantidade de CD’s se manteve inalterada durante 50 ciclos consecutivos, que é considerado o tempo de vida útil para a maioria dos artigos têxteis.

4.2.2. Avaliação da atividade antimicrobiana do tecido funcionalizado 4.2.2.1. Otimização do método de avaliação da atividade antimicrobiana no

tecido

Existem vários métodos para quantificar e avaliar a atividade antimicrobiana de têxteis, no entanto ainda não existe um consenso na sua aplicação e os seus resultados apresentam grande variabilidade e incertezas como já referido anteriormente.

O método usado no presente trabalho foi baseado na norma ISO 20743:2007. Teve-se como objetivo simplificar o método e torna-lo mais expedito. O método foi otimizado utilizando o tecido de poliamida e de algodão e a solução comercial em spray de escina 0,3% em etanol. Foi otimizada a quantidade de inóculo e de meio NA semissólido utilizada.



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Foram pulverizados os tecidos com a solução comercial de escina 0,3% e deixados a secar para posteriormente se adicionar 0,6 ml de inóculo e depois os 3 ml de meio NA semissólido. As placas com os tecidos foram encubadas a 37ºC durante 24 horas.

Realizaram-se ensaios com tecidos de algodão e poliamida sem e com inoculação de S. aureus e E.coli. Os resultados obtidos são apresentados nas Figura 17 e Figura 18 que se seguem.

Figura 17 – Fotografia obtida com um esteriomicroscópio dos tecidos (ampliação total 40x) do têxtil de algodão (A- controlo do algodão, B- com E.coli, C- com S.aureus)

Figura 18 - Fotografia obtida com um esteriomicroscópio dos tecidos (ampliação total 40x) do têxtil de poliamida (A- controlo da poliamida, B- com E.coli, C- com S.aureus)

Verificou-se que no tecido de poliamida houve crescimento microbiano mesmo sem se proceder à sua inoculação com os microrganismos teste e este tecido ser usado, o que vem realçar o fato de os tecidos serem um excelente meio para o alojamento e crescimento microbiano (Swarbrick, 2006; Saraswathi, et al., 2010).

Conseguiu-se observar em ambos os tecidos crescimento em colónias das bactérias utilizadas. Isso levou a perspetivar que o método poderia ser utilizado para quantificar



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o crescimento microbiano e assim a atividade antimicrobiana. No entanto, verificou-se que nem sempre se obtinha colónias isoladas, mesmo com diluições maiores do inóculo. Pensa-se que se poderá obter melhores resultados se se otimizar o modo de espalhamento do inóculo no tecido. Poder-se-á, por exemplo, utilizar uma outra amostra do mesmo tecido e friccionar e só depois colocar o agar semissólido.

Contudo, o método mostrou-se adequado para verificar o crescimento dos microrganismos nos tecidos. Ao contrário dos métodos descritos, em que se processa de modo semelhante ao método por difusão em agar, em que se coloca o tecido numa placa de Petri inoculada com o microrganismo teste e se verifica a formação do halo de inibição, neste método o agar é colocado por cima do tecido e verifica-se assim se este inibe o crescimento ou não. Nos métodos por difusão em agar o tecido terá que permitir que os compostos antimicrobianos se difundam para o meio para inibir o crescimento do microrganismos e isso como já referido nem sempre acontece, levando a resultados inconclusivos.

4.2.2.2. Ensaios com os microrganismos teste

O método anteriormente descrito foi utilizado para avaliar a atividade antimicrobiana dos tecidos utilizados de uma forma qualitativa e não quantitativa

Começou-se por verificar se as CD’s incorporadas no algodão e na poliamida teriam algum poder antimicrobiano, uma vez que é com esses tecidos que se iria incorporar o extrato de própolis pois as CD’s permitem que o própolis adira ao tecido e que resista às lavagens no período de vida útil do tecido. Para isso inoculou-se os tecidos com as CD’s incorporadas com ambas as bactérias teste utilizadas.

Verificou-se que as CD’s não inibiram o crescimento do S. aureus e da E. coli (Figura 19). Observou-se ainda crescimento de outras colónias de microrganismos que possivelmente já estariam nos tecidos utilizados,



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Figura 19 – Fotografia obtida com um esteriomicroscópio dos tecidos funcionalizados com CD’s (ampliação total 40x): algodão (A- E.coli, B- S.aureus) e poliamida (C- E.coli, D- S.aureus)

Como era previsto, nos ensaios em que se funcionalizou os tecidos com a solução comercial de escina 0,3% em etanol, não se verificou atividade antimicrobiana dos tecidos. Esses resultados são apresentados na Figura 20.



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Figura 20 - Fotografia obtida com um esteriomicroscópio dos tecidos funcionalizados com a solução comercial de escina 0,3% (ampliação total 40x): algodão - (A- E.coli, B- S.aureus) e da poliamida - (C- E.coli, D- S.aureus)

A avaliação da atividade antibacteriana de tecidos funcionalizados com o extrato de própolis foi realizada apenas com o algodão e com uma solução etanólica (65%) de própolis a 1%. A percentagem de etanol foi escolhida tendo em atenção a solubilidade do própolis e da realização dos ensaios posteriores em que se iria colocar o tecido em contacto com a pele de vários utilizadores. A escolha do algodão deveu-se ao facto deste ser o material mais importante usado no fabrico de fibras naturais na indústria têxtil.

O tecido de algodão com CD’s foi previamente pulverizado com a solução de própolis 1% em etanol 65% e deixado a secar na totalidade. Após o algodão ficar seco foi adicionado o inóculo (de S.aureus ou E.coli) e o meio NA semissólido. Foram ainda realizados ensaios controlo apenas com o algodão com CD’s pulverizado com água destilada, com o algodão com CD’s pulverizado com etanol 65% e com o algodão com CD’s inoculado com o microrganismo teste.

Após incubação a 37 ºC durante 24horas os tecidos foram observados no microscópio LEICA DM2000 e os resultados são apresentados de seguida. É de salientar que existiu alguma dificuldade em obter imagens com qualidade de visualização razoável uma vez que as fibras são bastante densas.



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Nestes ensaios observou-se, como seria de esperar, crescimento microbiano nos tecidos de algodão inoculados com os microrganismos teste, pois como já tinha sido referido as CD’s não apresentam atividade antimicrobiana (Figura 21 Figura 22C, Figura 21 e Figura 22D). O algodão pulverizado com água destilada apresentou um crescimento residual de microrganismos (Figura 21 e Figura 22A), o que também era esperado, já se tendo observado em outros ensaios.

No algodão pulverizado com etanol 65% verificou-se também algum crescimento microbiano. Apesar de não ser muito percetível nas figuras apresentadas, observa-se na Figura 22B esse crescimento. Apesar do etanol ter atividade antimicrobiana, após o tecido estar seco e em contacto com o ar pode novamente ser um meio de alojamento de microrganismos e por isso se observar esse crescimento residual comparável com o observado no algodão pulverizado com água destilada. Em ensaios em que o tempo se secagem foi inferior já não se verificou qualquer crescimento.

Figura 21 - Visualização ao microscópio (ampliação total 100x): A- algodão funcionalizado com agar, B-

algodão funcionalizado pulverizado com etanol a 65% e agar, C e D: algodão funcionalizado com o inóculo de S.aureus e agar



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Figura 22 - Visualização ao microscópio (ampliação total 100x): A- algodão funcionalizado com agar, B-

algodão funcionalizado pulverizado com etanol a 65% e agar, C e D: algodão funcionalizado com o inóculo de E.coli e agar.

Na Figura 23 e Figura 24 observa-se os resultados obtidos para os ensaios com o algodão funcionalizado com o extrato de própolis e inoculado com as bactérias S.aureus e E.coli, respetivamente. Com a observação do têxtil ao microscópio concluiu-se que o própolis conseguiu inibir o crescimento desses microrganismos. Não se observou crescimento nos tecidos tratados com o própolis e uma vez que nos tecidos tratados com etanol se observou crescimento, pode-se concluir que após o etanol da solução etanólica de própolis evaporar não terá qualquer efeito antimicrobiano. Sendo assim a atividade antimicrobiana observada deverá ser explicada pela ação do própolis.



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Figura 23 - Visualização ao microscópio (ampliação total 100x) do têxtil de algodão com CD´s inoculado com

S.aureus e pulverizado com própolis 1%

Figura 24 – Visualização ao microscópio (ampliação total 100x) do têxtil de algodão com CD´s inoculado com

E.coli e pulverizado com própolis 1% e

Estes resultados estão de acordo com outros investigadores e também a concentração de 1% utilizada está acima da concentração mínima inibitória determinada (Fernandes, et al., 1997; Marcucci, 2001).

4.2.2.3. Ensaios com os tecidos depois de colocados em contato com a pele

Realizaram-se ainda ensaios em que se avaliou os tecidos de algodão funcionalizados com o extrato de própolis após colocados em contacto com a pele do antebraço de vários utilizadores durante 6 a 8 horas.

Nestes ensaios foram utilizados os tecidos de algodão funcionalizados com a solução etanólica de própolis 1%, com água destilada e com etanol 65% e cada utilizador usou os tecidos em duplicado (nos dois antebraços) após algum tempo de secagem.

Após o período de utilização, as amostras foram colocadas em placas de Petri, com a parte em que esteve em contacto com a pele para cima. Foi adicionado 3 mL de meio



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NA semissólido e colocadas a incubar a 37ºC durante 24 horas. Foram ainda realizados ensaios de amostras preparadas como descrito anteriormente mas sem terem sido colocadas em contacto com a pele como controlos.

As figuras que se seguem foram captadas ao microscópio com ampliação total 100x e é de referir que existiu bastante dificuldade em conseguir uma focagem nítida de todo o campo uma vez que o tecido possui uma pluralidade de campos devido á sua textura. Em cada figura é colocado o resultado obtido com o tecido sem estar em contacto com a pele (A) e três réplicas de tecido que estiveram em contacto com a pele de três utilizadores diferentes (B,C e D).

A Figura 25 é referente ao tecido funcionalizado pulverizado com água destilada. Em todas as amostras foi observado crescimento microbiano sendo visíveis ao microscópio alguns microrganismos alojados no interior das fibras têxteis, no entanto verificou-se maior crescimento nos tecidos que estiveram em contacto com a pele dos utilizadores. Este facto pode ser explicado visto que a pele é um excelente meio de proliferação de microrganismos, principalmente de bactérias (Chiller, et al., 2001).

Em alguns dos tecidos pulverizados com etanol 65% também se observou crescimento microbiano. Nas amostras em que não se observou crescimento microbiano não se tem a certeza que os utilizadores deixaram secar bem o tecido antes de o usar. Sendo assim, se o tecido foi utilizado ainda húmido, pode o etanol ter atuado como antisséptico sobre a pele do utilizador e por isso não se ter verificado crescimento. De facto, era esperado que depois de evaporada da solução de etanol, o tecido não apresentasse atividade antimicrobiana.



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Figura 25 – Visualização ao microscópio (ampliação total 100x) do algodão funcionalizado: A- sem estar em

contato com a pele, B,C,D- em contato com a pele de diferentes utilizadores.

Na Figura 26 encontram-se os resultados obtidos com o tecido de algodão funcionalizado e pulverizado com a solução de própolis 1% em etanol 65%. Nestes ensaios não se observou qualquer crescimento microbiano, quer no algodão sem estar em contacto com a pele quer os tecidos usados pelos vários utilizadores.



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Figura 26 - Visualização ao microscópio (ampliação total 100x) do algodão funcionalizado e pulverizado com

própolis 1%: A- sem estar em contato com a pele, B,C,D- em contato com a pele.

Estes resultados vieram e assim reforçar a ideia que os extratos etanólicos de própolis apresentam atividade antimicrobiana contra vários microrganismos (Marcucci, 1996; Stepanović, et al., 2003; Bankova, 2005; Scazzachio, et al., 2006; Silva, et al., 2012).


COM AgIONTM

Foram ainda realizados ensaios para avaliar a atividade antimicrobiana de discos de madeira contendo AgIONTM, de modo a verificar a aplicação da metodologia descrita anteriormente, e que resulta da adaptação da norma ISO 20743:2007, em material rígido como a madeira.

Em cada disco de madeira foi colocado o inóculo e posteriormente revestido com meio NA semissólido. Foram testadas várias quantidades de inóculo e também de meio NA semissólido. Verificou-se que a superfície dos discos repelia quer o inóculo quer o meio NA, sendo difícil conseguir que, principalmente o meio NA semissólido permanecesse na superfície superior dos discos, superfície esta que continha o agente antimicrobiano.



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Na Figura 27 encontram-se os resultados obtidos para os ensaios onde, em cada disco de madeira, foram colocados 0,2 mL de inóculo do microrganismo teste e 0,2 mL de meio NA semissólido. As Figura 27A e Figura 27B correspondem ao ensaio cujo inóculo utilizado foi a E. coli e as Figura 27C e Figura 27D correspondem ao ensaio com S. aureus.

Figura 27 - Resultados dos testes com as placas de madeira tratadas com AgIONTM (1 - placa com AgIONTM, 2-

Controlo)

De um modo geral os resultados obtidos não foram os esperados uma vez que, nos discos de madeira tratados com AgIONTM também se observou crescimento dos microrganismos, sendo que, no entanto, o crescimento observado em alguns ensaios foi menor que nos discos de madeira sem o agente antimicrobiano. Verificou-se também que seria de todo importante não só otimizar a quantidade de maio NA utilizado, mas também o tempo de incubação, visto que ao fim de 24 horas, a 37 ºC o agar se encontrava muito ressequido, dificultando a observação do crescimento dos microrganismos.

Por outro lado, os resultados obtidos podem também dever-se ao facto das bactérias utilizadas não serem muito sensíveis ao AgIONTM, vindo ao encontro dos resultados obtidos nos ensaios realizados no método por difusão em agar.



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CAPÍTULO 5 CONCLUSÕES GERAIS E TRABALHO FUTURO


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CAPÍTULO 5

CONCLUSÕES GERAIS E

TRABALHO FUTURO



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5. CONCLUSÕES GERAIS E TRABALHO FUTURO

5.1. SÍNTESE DO TRABALHO E CONCLUSÕES GERAIS

Na indústria têxtil os processos que permitem obter produtos funcionalizados têm suscitado grande interesse, nomeadamente os processos que permitem obter têxteis com características antimicrobianas. Dependendo da aplicação, o controlo do crescimento de microrganismos nos têxteis é essencial, pois estes são causadores de diversos problemas, como o mau odor, o aparecimento de manchas e danos nos tecidos, sendo ainda os principais responsáveis por contaminações em diversos ambientes nomeadamente em ambientes hospitalares.

Atualmente, a maior parte dos produtos têxteis com propriedades antimicrobianas comercializados são produzidos por incorporação de metais como a prata e o zinco. Contudo, essas substâncias possuem reduzida biocompatibilidade e são nocivos para o ambiente. Assim, a utilização de extratos naturais afigura-se uma alternativa bastante promissora aos agentes antimicrobianos convencionais, podendo tornar os têxteis biofuncionalizados mais biocompatíveis e consequentemente com maior aplicação na área da saúde e alimentar. Uma outra vantagem da sua aplicação é tornar os têxteis mais atrativos do ponto de vista ecológico. Por outro lado, a utilização de têxteis contendo extratos naturais cujos princípios ativos podem ser libertados é também uma funcionalidade muito desejada, uma vez que o têxtil está em contacto direto com a pele, podendo portanto ser um veículo de transmissão de diversos princípios ativos com benefícios para o utilizador.

Existem vários métodos para quantificar e avaliar a atividade antimicrobiana de têxteis, no entanto ainda não existe um consenso na sua aplicação e os seus resultados apresentam grande variabilidade e incertezas como já referido anteriormente.

De tudo isto se depreende a pertinência do estudo elaborado neste projeto cujo principal objetivo foi avaliar a atividade antimicrobiana de tecidos de algodão e poliamida, contendo extratos naturais encapsulados em ciclodextrinas, mais concretamente o extrato de castanheiro-da-índia denominado de escina e o própolis, produto proveniente da ação das abelhas.

O poder antimicrobiano das soluções de escina e do própolis foi avaliado através dos métodos de difusão em agar e de microdiluição utilizando como microrganismos teste o Staphylococcus aureus e a Escherichia coli. No método de diluição em microplacas foi utilizada uma solução de resazurina que permitiu de uma forma simples observar a viabilidade celular.



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Verificou-se pelos dois métodos que a escina não apresenta atividade antimicrobiana relativamente aos microrganismos testados, vindo ao encontro com o descrito na literatura na qual se refere que as saponinas triterpenicas derivadas de plantas têm fraca atividade antibacteriana, apresentando essencialmente atividade antifúngica e antiviral e quando utilizados extratos de misturas das saponinas e não compostos puros (Sparg et al. 2004).

O própolis apresentou atividade antibacteriana, observando-se que a E. coli foi menos sensível que o S. aureus. Pelo método de difusão em agar e para o ensaio com S. aureus, obteve-se uma zona de inibição com um diâmetro de 11,0±1,2 mm e 17,3±1,2 mm para uma solução de própolis em DMSO e etanol, respetivamente. O método de diluição em microplacas permitiu também determinar a concentração mínima inibitória de 1500 μg/mL para o S.aureus e de 6000 μg /mL para a E. coli. Como esperado o própolis foi mais efetivo contra bactérias Gram-positivas do que Gram-negativas (Fernandes, et al., 1997; Marcucci, 2001; Stepanović, et al., 2003; S. Silici, et al., 2005).

Nos ensaios com tecidos funcionalizados com ciclodextrinas verificou-se a sua solidez à lavagem, concluindo-se que o processo de ligação covalente das ciclodextrinas aos tecidos de algodão e poliamida foi eficaz, revelando solidez à lavagem doméstica até pelo menos 5 ciclos consecutivos.

Verificou-se ainda que o tecido de algodão funcionalizado com ciclodextrinas e extrato etanólico de própolis apresentou atividade antimicrobiana quer em ensaios realizados com os microrganismos teste quer em ensaios em contacto com a pele de vários utilizadores. Verificou-se ainda que as ciclodextrinas não possuem poder antimicrobiano assim como os tecidos funcionalizados e pulverizados com etanol 65%. Em ambos foi observado crescimento de microrganismos. Assim, pode-se concluir que após o etanol da solução etanólica de própolis evaporar, este não terá qualquer efeito antimicrobiano e assim a atividade antimicrobiana observada deverá ser explicada pela ação do própolis.

Foi proposto um método para avaliar a atividade antimicrobiana do têxtil funcional adaptado da norma ISO 20743:2007 (Textiles – determination of antibacterial activity of antibacterial finished products). O método utilizado para avaliar a atividade antimicrobiana de tecidos revelou-se apropriado para uma avaliação qualitativa do crescimento dos microrganismos. Sendo simples requer ainda otimização para permitir uma quantificação do poder antimicrobiano dos têxteis.

Nos ensaios realizados para avaliar a atividade antimicrobiana de discos de madeira contendo AgIONTM, de modo a verificar a aplicação do método proposto, em material rígido como a madeira, de um modo geral os resultados obtidos não foram os



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esperados. Foi observado crescimento dos microrganismos nos discos de madeira tratados com AgIONTM sendo que, no entanto, o crescimento observado em alguns desses discos foi menor que nos discos de madeira sem o agente antimicrobiano. Verificou-se também que seria de todo importante não só otimizar a quantidade de meio NA utilizado, mas também o tempo de incubação, visto que ao fim de 24 horas, a 37ºC o agar se encontrava muito ressequido, dificultando a observação do crescimento dos microrganismos. Por outro lado, os resultados obtidos podem também dever-se ao facto das bactérias utilizadas não serem muito sensíveis ao AgIONTM, vindo ao encontro dos resultados obtidos nos ensaios realizados no método por difusão em agar.

5.2. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Os resultados obtidos neste trabalho deixam em aberto diretrizes para o prosseguimento dos esforços de investigação nesta área. Assim, de seguida, apresentam-se algumas sugestões de trabalho futuro que, se por um lado poderão complementar o trabalho realizado, por outro poderão ser indicações para novas linhas de investigação que possibilitem o desenvolvimento de materiais têxteis biofuncionalizados.

Apesar dos resultados obtidos na avaliação da atividade antimicrobiana da escina será interessante avaliar a atividade antimicrobiana do extrato total das sementes do Castanheiro-da-índia, e focando essencialmente a sua atividade contra fungos filamentosos e leveduras.

Por outro lado, será importante a aplicação e estudo de outros extratos naturais principalmente extratos aquosos para ultrapassar a influência do etanol na avaliação da atividade antimicrobiana. Sugere-se por exemplo o estudo de plantas medicinais e aromáticas tradicionais portuguesas como a cidreira, a salva e o comilho.

É importante também verificar não só a eficácia da incorporação dos agentes antimicrobianos nos tecidos assim como da solidez à lavagem, o que não foi realizado neste trabalho.

Apesar do método utilizado para avaliar a atividade antimicrobiana de tecidos se ter revelado apropriado para uma avaliação qualitativa do crescimento dos microrganismos requer ainda otimização para permitir uma quantificação do poder antimicrobiano dos têxteis. Sugere-se otimizar o modo de espalhamento do inóculo no tecido, utilizando uma outra mostra igual do mesmo tecido e friccionar e só depois colocar o agar semissólido. Esse tecido será posteriormente incubado à temperatura



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adequada para o crescimento do microrganismo teste entre 18 a 24 horas para se visualizar o crescimento.

CAPÍTULO 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


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CAPÍTULO 6

REFERÊNCIAS

BIBLIOGRÁFICAS



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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Alves, E.G. “Avaliacao in vitro da atividade antibacteriana de extratos brutos de Miconia rubiginosa e Miconia fallax.” Estudo comparativo de quatro tecnicas de ''screening''. França: Dissertação, Mestrado em Ciências na área de Química Biológica-Universidade de França, 2006.

Andreaus, Jungen , Mara C. Dalmolin, Iguatemy B. de Oliveira Junior, e Ivonete Barcellos. “Aplicação de ciclodextrinas em processos têxteis.” Química nova, 2008: 1-9.

Araújo, M., e E.M. de Melo Castro. Manual de engenharia têxtil - volume I e II. Fundação Calouste Gulbenkian, 1984.

Bankova, V. “Chemical diversity of propolis and problem of standardization.” Journal Ethpharmacol, 2005, 2 ed.

Brayton, C.F. “Dimethyl sulfoxide (DMSO): a review.” Cornell Veterinarian, 1986.

Burdock, C.A. “A review of the biological properties and toxicity of bee propolis.” Food Chemical Toxical, 1988.

Casciani, Robert V. “Antimicrobial finishes 101: a primer for fabric developers.” AATCC review, 2003, 11 ed.

Case, C.L., B.R. Funke, e G.J. Tortora. Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2008.

Chiller, Katarina , Bryan A Selkin, e George J Murakawa. “Skin Microflora and Bacterial Infections of the Skin.” Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings, 2001.

Cushnie, T.P., e A.J. Lamb. “Antimicrobial Activity of flavonoides.” Antimicrobial Agents, 2005.

Dubas, Stephan T., Panittamat Kumlangdudsana, e Pranut Potiyaraj. “Layer-by-layer deposition of antimicrobial silver nanoparticles on textile fibers.” Coloids and Susfaces A- Physicochemical and Engineering Aspects, 2006, 1-3 ed.

Eloff, J.N. “A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria.” Planta médica, 1998, 8 ed.

Fernandes, A. Jr., C.A.M. Lopes, J.M. Sforcin, e S.R.C. Funari. “Population analysis of susceptibility to propolis in reference strains of Staphylococcus aureus and Escherichia coli.” Journal of Venomous Animals and Toxins, 1997, 2 ed.

Funari, C.S., e V.O. Ferro. “Análise do Própolis.” Ciência Tecnologica Aimentar, 2006, 1 ed.



62

G.Nelson. “Microencapsulates in textile coloration and finishing.” Rev. Prog Coloration, 1991.

Gabbay, Jeffrey, Gadi Borkow, Joseph Mishal, Eli Magen, Richard Zatcoff, e Yonat Shemer-Auni. “Copper Oxide Impregnated Textiles with Patent Biocidal Activities.” Journal of Industrial Textiles, 2006, 4 ed.

Gonensek, Manija, Marija Gorjanc, Vili Bukosek, Janez Kovac, Peter Jovancic, e Darka Mihailovic. “Functionalization of PET Fabrics by Coona and Nano Silver.” Textile Research Journal, 2010, 3 ed.

Guillaume, M., e F. Padioleau. “Veinotonic effect, vascular protection, antiinflammatory and free radical scavenging properties of horse chestnut extract.” Arzneimittelforschung, 1994, 1 ed.

Harvey, Alan. “Strategies for Discovering Drugs from Previously Unexplored Natural Products - Review.” Drug Discovery, 2000, 7 ed.

Hegazi, A.G., F. K. A. E. Hady,, e F. A. M. A. Allah. “Chemical composition and antimicrobial activity of European propolis.” Zeitschrift Fur Naturforschung, 2000.

HJ, Klasen. “Historial review of the use of silver in the treatments of bums.” Burns, 2000, 26 ed.

Jungkind, Donald L. Antimicrobial resistance: a crisis in health care. New York: Plenum Press, 1995.

Kalyon, Bilgé D., e Ugursoy Olgun. “Antibacterial efficacy of triclosan-incorporated polymers.” American Journal of infection control, 2001, 2 ed.

Kim, Joung Hee, e Gang Sun. “Durable Antimicrobial Finishing of Nylon Fabrics with Acis Dyes and a quaternary ammonium salt.” Textile Research Journal, 2001, 4 ed.

Kivrak, İbrahim, Mehmet Emin Duru, Mehmet Öztürk, Nazime Mercan, Mansur Harmandar, e Gülaçtı Topçu. “Antioxidant, anticholinesterase and antimicrobial constituents from the essential oil and ethanol extract of Salvia potentillifolia.” Food Chemistry, 2009, 2 ed.

Kujumgiev, A., I. Tsvetkova, Su Serkedjieva, V. Bankova, R. Christov, e S. Popov. “Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis of different geographic origin.” Journal of Ethnopharmacology, 1999, 64 ed.

Langfield, R.D., F.J. Scanano, M.E. Heitzman, M Kondo, G.B. Hummond, e C.C Neto. “Use of a modified microplate bioassay method to investigate antibacterial activity in the Peruvian medicinal plant Peperomia galioides.” Journal Ethnopharmacol, 2004.

Laskin, Allen I. Advances in Applied Microbiology. USA: Academic Press, 2011.



63

Lee, H., S.Y. Yeo, e S.H. Jeong. “Antibacterial Effect of Nanosized Silver Colloidal Solution on textile Fabrics.” Journal of Materials Science, 2003.

Li, Wen-Juan, et al. “Antimicrobial properties, antioxidant activity and cytotoxicity of ethanol-soluble acidic components from Ganoderma atrum.” Food and Chemical Toxicology, 2012, 3-4 ed.

Machin, Rubén, José Ramón Isassi, e Itziar Vélaz. “B-Cyclodextrin hydrogels as potencial drug delivery systems.” Carbohydrate Polymers, 2012: 2024-2030.

Manakker, Frank van de, Tina Vermonden, Cornelus F. van Nostrum, e Wim E. Hennink. “Cyclodextrin-Based Polymeric Materials: Synthesis, Properties,vand Pharmaceutical/Biomedical Applications.” BioMacromolecules, Dezembro de 2009.

Marcucci, M.C. “Phenolic compounds from Brasilian propolis with pharmacological activities.” Journal Ethnopharmaccol, 2001, 2 ed.

—. “Propriedades biológicas e terapêuticas dos constituintes químicos da própolis.” Química Nova, 1996, 1 ed.

Menezes, H. “Própolis: Uma revisão dos recentes estudos das suas propriedades farmacológicas.” Arq. Instituto Biologia, 2005, 3 ed.

Michelin, D.C., P.E. Moreschi, A.C. Lima, G.G.F. Nascimento, M.O. Paganelli, e M.V. Chaud. “Avaliação da atividade antimicrobiana de extratos vegetais.” Brazilian Journal of Pharmacognosy, 2005, 4 ed.

Monteiro, Douglas Roberto, Luiz Fernando Gorup, Aline Satie Takamyia, Adhemar Colla Ruvollo-Filho, Emerson Rodrigues de Camargo, e Debora Barros Barbosa. “The growing importance of materials that prevent microbial adhesion: antimicrobial effect of medical devices containing silver.” Intenational Journal Antimicrobial, 2009, 2 ed.

Moutin del Valle, E.M. “Cyclodextrines and their uses: a review.” Elsevier, 2004: 1033-1046.

Nazi, Malihe, Reza Mohammad Ali Malek, e Richard Kotek. “Modification of B-cyclodextrin with itaconic acid and application of the new derivative tocotton fabrics.” Carbohydrate Polymers, 2012.

Ozkul, Y, S Silici, e E Erógly. “The anticarcinogenic effect of propolis in humam lymphocytes culture.” Phytomedicine, 2004, 10 ed.

Park, Young, Severino Alencar, Adilma Scamparini, e Claudio Aguiar. “Própolis produzida no sul do Brasil, Argentina e Uruguai: Evidências fitoquímicas da sua origem vegetal.” Ciência Rural, 2002, 6 ed.

Pezzolo, Dinah Bueno. Tecidos: História, tramas, tipos e usos. São Paulo: Senac, 2007.



64

Pinho, Eva, Mariana Henriques, Rosário Oliveira, Alberto Dias, e Graça Soares. “Devepolment of Biofunctional Textiles by the Application os Resveratrol to Cotton, Bamboo and Silk.” Fibers and Polymers, 2010, 2 271-276 ed.

Purwar, R., e M. Joshi. “Recent developments in ntimicrobial finishing of textiles - a review.” AATCC, 2003.

R. Sirtori, Cesare. “Aescin: Pharmacology, pharmacokinetics and therapeutica profile.” Pharmacological Research, 2001, 3 ed.

Ramachandran, T., K. Rajendrakumar, e R. Rajendran. “Antimicrobial Textiles - Overview.” Journal TX, 2004.

Renard, E., A. Deratani, G. Volet, e B. Sebille. “Preparation and characterization of water soluble high molecular weight B-cyclodextrin-epichlorohydrin polymers.” European Polymer Journal, 1997: 44-57.

Rodrigues, S.N., et al. “Scentfashion®: Microencapsulated perfumes for textile application.” Chemical Engineering Journal, 2003, 1-3 ed.: 463-472.

San, Yuyu, Tay-yuan Chen, S.D. Wonley, e Grang Sun. “Novel refreshale N-halamine polymeric biocides containing imidazolidin-4-one derivatives.” Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, 2001, 18 ed.

Santos Pereira, Alberto, Fernado Rodrigues Seixas, e Francisco Radler Neto. “Própolis: 100 anos de pesquisa e as suas perspectivas futuras.” Química Nova, 2002, 2 ed.

Saraswathi R., Krishnam PN., Dilip C. “Antimicrobial activity of cotton and silk fabric with herbal extract by microencapsulation.” Journal of Tropical Medicine, 2010: 128-132.

Scazzachio, F., F.D. D'Auria, D. Alessandrini, e F. Pantanella. “Multifatorial aspects of antimicrobial activity of própolis.” Microbiology, 2006, 4 ed.

Schindler, W.D., e P.J. Hourse. Chemical Finishing of textiles. USA: The Textile Institute, 2004.

Singh, Manata, Rohit Sharma, e U.C. Banerjee. “Biotechnological application of cyclodextrins.” Biotechnology Advances, 2002: 341-359.

Sondi, Ivan, e Branka Salopek-Sondi. “Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as model for gram-negative bacteria.” Jounal of Colloid and Interface Science, 2007, 275 ed.

Souza, João, Niege Furtado, Raquel Jorge, Ademilson Soares, e Jairo Bastos. “Perfis físico-químico e cromatográfico de amostras de própolis produzidas nas microrregiões de Franca (SP) e Passos (MG), Brasil.” Revista Brasileira de Farmacognosia, 2007, 1 ed.



65

Speranza, G, et al. “Role of chemical interactions in bacterial adhesion to polymer surfaces.” Biomaterials, 2004, 11 ed.

Stepanović, Srdjan , Nataša Antića, Ivana Dakića, e Milena Švabić-Vlahović. “In vitro antimicrobial activity of propolis and synergism between propolis and antimicrobial drugs.” Microbiological Research, 2003, 4 ed.

Swarbrick, James. Microencapsulation - Methods and Industrial Application. USA: CRC Press, 2006.

Swofford, H. Wayne . “An Overview of Antimicrobial Testing.” Microbian International, 2010.

Szostak-Kotwa, Jadwiga. “Biodeterioration of textiles.” International Biodeterioration & Biodegradation, 2004, 3 ed.

Uzel, A., K. Sorkun, O. Oncãq, D. Cogulu, O. Gençay, e B. Salih. “Chemical composition and antimicrobial activities of four different Anatolian propolis samples.” Microbiology, 2005, 2 ed.

Wei, Qufu, Qiuxiang Xu, Yibing Cai, e Yingying Wang. “Evaluation of the interfacial bonding between fibrous substrate and sputter coated copper.” Surface and Coating Techonology Journal, 2008, 19 ed.

Wilkinson, J.A., e A.M. Brown. “Horse chestnut- Aesculus hipposcastanum: potencisl applications in cosmetic skin-care products.” International Journal de cosmetic Science, 1999.

Zhang, Yongwen , Huashong Peng, Wei Huang, Yongfeng Zhou, e Deyue Yan. “Facile preparation and characterization of highly antimicrobial colloid Ag or Au nanoparticles.” Journal Colloid Interface Science, 2008, 325 ed.

CAPÍTULO 7 ANEXOS


66

ANEXOS

CAPÍTULO 7 ANEXOS


67

7. ANEXOS

A reta de calibração fornecida para determinar a concentração das ciclodextrinas nas meias de poliamida e algodão é apresentada na Figura

28. A linearidade do ajuste é dada por

vs.

em

que A0 e A representam a absorvância (550 nm) do controlo e da amostra com CD’s.

Figura 28 – Reta de calibração para quantificação das ciclodextrinas.

1/(A0-A) = 0,5045(1/conc.βCD) + 0,5886 R² = 0,9914

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

1/(λ

0-λ)

1/concentração CD's

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