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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS
Determinación de niveles de tetraciclina y oxitetraciclina en leche cruda en
la asociación copla (corporación productora de leche de Alóag) de la
parroquia Alóag del cantón Mejía
Autor: MARIO RODRIGO TORRES TOAPANTA
e-mail: [email protected]
Tesis para optar por el Título profesional de
QUÍMICO DE ALIMENTOS
Tutor: Ing. Milene Fernanda Díaz Basantes
e-mail: [email protected]
Quito, junio del 2015
ii
Torres Toapanta Mario Rodrigo (2015) Determinación
de niveles de tetraciclina y oxitetraciclina
en leche cruda en la asociación copla
(corporación productora de leche de Alóag)
de la Parroquia Alóag del Cantón Mejía.
Trabajo de investigación para optar por el
grado de Químico de Alimentos. Carrera de
Química de Alimentos. Quito: UCE. 88p.
iii
DEDICATORIA
A mis padres sobre todo a mi mamá que nos supo inculcar el estudio por apoyarme a
cada minuto de mi vida, que con esfuerzo y entrega me ha educado para llegar a las
metas me propuesto como persona y como profesional.
A todos mis hermanos y en especial a mi hermana Norma y mi hermano Miguel que se
han sacrificado día a día por el bienestar de toda mi familia y el mío que nunca me han
dejado sin el apoyo y en quienes tengo un ejemplo a SEGUIR PARA TODA MI VIDA
como excelentes profesionales que son y unos estupendos seres humanos que dan todo sin
recibir nada a cambio.
Este triunfo en mi vida va para todos mis familiares, amigos y a quienes me rodean y me
brindan su amistad los llevare siempre en mi corazón donde sea que se encuentren.
Gracias Totales
iv
AGRADECIMIENTOS
A la PODEROSA Y GLORIOSA UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, a la
facultad de Ciencias Químicas por ser la institución que me formo para ser un excelente
profesional.
A la Ing. Milene Díaz por brindarme todos sus conocimientos en el desarrollo, la guía y
el tiempo prestado en la presente tesis.
A la Dra. Liliana Naranjo por sus consejos, su enseñanza y el apoyo bridado en el
desarrollo de la presente tesis.
Al Dr. Wilson Parra por ser mi maestro, brindarme su amistad y por su contribución a la
realización de este estudio.
AGROCALIDAD por brindarme la oportunidad de realizar la investigación de mi tesis y
a todos sus técnicos que desempeñan y contribuyen al desarrollo de la investigación para
nuestro país Ecuador.
A todos mis hermanos por brindarme el apoyo en cada momento de mi vida y mis padres
por darme la vida para forjarme un futuro y ser un hombre de bien.
A la persona que formo parte de mi vida, donde este le agradezco de todo corazón
siempre te amare Liliana Cordovilla.
v
vi
vii
viii
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN
El presente tema de “DETERMINACIÓN DE NIVELES DE TETRACICLINA Y
OXITETRACICLINA, EN LECHE CRUDA EN LA ASOCIACIÓN COPLA
(CORPORACIÓN PRODUCTORA DE LECHE DE ALÓAG) DE LA PARROQUIA
ALÓAG DEL CANTÓN MEJÍA”, se realizó en la parroquia de Alóag del Cantón Mejía
de la provincia de Pichincha como sitio de toma de muestras, los análisis se realizaron en
la parroquia de Tumbaco, perteneciente a la provincia de Pichincha, en el
LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD DE LECHE perteneciente a
AGROCALIDAD.
ix
CONTENIDO
CAPÍTULO I ..................................................................................................................................... 1
1 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 1
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................................................... 1
1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA O HIPÓTESIS DE TRABAJO. ................................................ 2
1.3 OBJETIVOS. .......................................................................................................................... 2
1.3.1 Objetivo General. ............................................................................................................ 2
1.3.2 Objetivos Específicos. ..................................................................................................... 2
1.4 IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN. .................................................... 3
CAPÍTULO II ................................................................................................................................... 4
2 MARCO TEÓRICO ..................................................................................................................... 4
2.1 ANTECEDENTES. .................................................................................................................. 4
2.2 FUNDAMENTO TEÓRICO. ..................................................................................................... 5
2.2.1 Tetraciclinas. .................................................................................................................. 5
2.2.1.1 Historia, mecanismo de acción y usos. .................................................................................. 5
2.2.1.2 Características físico-químicas de las tetraciclinas. ......................................................... 6
Por: Farmacología Veterinaria 3ra
Edición ........................................................................................ 7
2.2.2 TETRACICLINA (AEROMICINA). .......................................................................................... 8
Por: Farmacología Veterinaria 3ra
Edición ........................................................................................ 8
2.2.2.1 Farmacocinética. ............................................................................................................ 8
2.2.2.2 Efectos adversos. ............................................................................................................. 9
2.2.3 OXITETRACICLINA (TERRAMICINA). ................................................................................... 9
Por: Farmacología Veterinaria 3ra
Edición ........................................................................................ 9
2.2.3.1 Farmacocinética. ............................................................................................................... 10
2.2.3.2 Efectos adversos. ................................................................................................................. 10
2.2.3.3 Toxicidad. ...................................................................................................................... 11
2.2.3.4 Tiempo de retiro. ........................................................................................................... 11
2.2.4 ENFERMEDADES DEL GANADO BOVINO. ........................................................................... 11
2.2.5 LA LECHE. ............................................................................................................................ 12
2.2.5.1 Características. .................................................................................................................. 12
2.2.5.2 Composición química de la leche. ...................................................................................... 12
2.2.6 CROMATOGRAFÍA. ................................................................................................................ 13
Por: Abel, Stone. Comprehensive Organometallic Chemistry .......................................................... 14
x
2.2.6.1 Tipos de cromatografía. ................................................................................................ 14
2.2.7 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA O RENDIMIENTO (HPLC). ......................... 15
Por: Dionex - Medical Science Applications .................................................................................... 16
2.2.8 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ULTRA EFICIENCIA (UPLC). ................................................. 16
2.2.8.1 Características UPLC H-CLASS. ................................................................................. 17
Por: Laboratorio de leche (AGROCALIDAD) ................................................................................. 18
2.2.9 DETECTOR ACQUITY UPLC H-CLASS............................................................................ 18
2.2.9.1 ACQUITY PDA e λ detector. ......................................................................................... 18
2.2.9.2 Detector Arreglo de Diodos. ......................................................................................... 19
2.2.10 COLUMNAS ACQUITY® UPLC CON TECNOLOGÍA BEH. .................................................. 19
2.2.10.1 COLUMNAS ACQUITY UPLC™ BEH C18. ..................................................................... 19
2.3 FUNDAMENTO LEGAL. ............................................................................................................. 20
CAPÍTULO III ................................................................................................................................ 21
3 METODOLOGÍA ....................................................................................................................... 21
3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN. ............................................................................................................ 21
3.1.1 VARIABLES DE LA INVESTIGACIÓN.......................................................................................... 21
3.1.1.1 Variable independiente. ....................................................................................................... 21
3.1.1.2 Variable dependiente. ......................................................................................................... 21
3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA. ........................................................................................................... 21
3.2.1 Población. .............................................................................................................................. 21
3.2.2 Muestra. .................................................................................................................................. 21
3.2.3 Diseño metodológico............................................................................................................ 22
3.3 DISEÑO EXPERIMENTAL. ................................................................................................... 23
3.4 MATERIALES Y MÉTODOS. ................................................................................................ 23
3.4.1 Selección de las haciendas productoras de leche para el muestreo y estudio
experimental. ..................................................................................................................................... 23
3.4.2 Tipo de muestreo aplicado para la recolección de muestras. ...................................... 24
3.4.3 TRATAMIENTO DE MUESTRAS. ............................................................................................... 24
3.4.4 MÉTODOS Y TÉCNICAS DE INSTRUMENTACIÓN ANALÍTICAS UPLC. ............................... 24
3.4.4.1 Método de extracción de la muestra. ............................................................................ 24
3.4.4.2 Método cromatográfico para la determinación de tetraciclinas en leche
cruda…………………. ....................................................................................................................... 25
3.4.4.3 Parámetros De Desempeño Analítico del método cromatografico. ............................. 26
3.4.4.3.1 Estimación de los parámetros de la regresión. ............................................................. 27
3.4.4.3.2 Predicción en muestras incógnita. ................................................................................ 27
3.4.4.3.3 Sensibilidad de calibración. .......................................................................................... 28
xi
3.4.4.3.4 Sensibilidad analítica. ................................................................................................... 28
3.4.4.3.5 Límite de detección. ...................................................................................................... 29
3.4.4.3.6 Límite de cuantificación. ............................................................................................... 29
3.4.4.3.7 Rango lineal. ................................................................................................................. 29
3.4.5 MATERIALES Y REACTIVOS. .............................................................................................. 30
3.4.6 PREPARACIÓN DE REACTIVOS. .......................................................................................... 31
3.4.6.1 Metodología: ...................................................................................................................... 31
3.4.6.2 Buffer Mcllvaine. ........................................................................................................... 31
3.4.6.3 Buffer de EDTA-NaCl. .................................................................................................. 31
3.4.6.4 Solución Stock o Estándar 100 μg/ml de Tetraciclinas (TC) analíticas
certificadas. 32
3.4.6.5 Estándar de trabajo 1μg/ml de Tetraciclina y Oxitetraciclina. .................................... 32
3.4.6.6 Fases móviles. ............................................................................................................... 32
Solvente A: Acetonitrilo. ................................................................................................................... 32
3.4.6.7 Solución Hexano-Diclorometano. ................................................................................. 32
3.4.6.8 Ácido tricloroacético. .................................................................................................... 32
3.4.6.9 Concentración de la muestra por método de extracción en fase sólida. ...................... 32
3.4.6.10 Solución Hexano-Diclorometano. ................................................................................. 33
3.4.6.11 Diagrama De Flujo De Purificación De La Muestra, Aplicando Oasis Hlb Cartridge .................. 34
CAPÍTULO IV ................................................................................................................................ 35
4 ANALISIS Y DISCUCIONES DE RESULTADOS ................................................................. 35
4.1 ANÁLISIS Y DISCUSIONES DE RESULTADOS. ........................................................................... 35
4.1.1 Recolección de muestras. .............................................................................................. 35
4.1.2 Muestreo compuesto. .................................................................................................... 35
4.1.3 Método cromatográfico. ................................................................................................ 35
CAPÍTULO V.................................................................................................................................. 44
5 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ......................................................................... 44
5.1 CONCLUSIONES........................................................................................................................... 44
5.2 RECOMENDACIONES. ................................................................................................................... 46
REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA. ................................................................................................. 47
GLOSSÁRIO DE TÉRMINOS ................................................................................................................. 50
xii
LISTA DE TABLAS
Tabla 2.1: Composición química de la leche .................................................................................... 13
Tabla 2.2: Propiedades físicas y físico-químicas de la leche ........................................................... 13
Tabla 3.1: Resultados cromatograficos. ........................................................................................... 23
Tabla 3.2: Resultados de las concentraciones. ................................................................................. 23
Tabla 3.3: Gradiente utilizado para la separación de las dos tetraciclinas..................................... 26
Tabla 3.4: Gradiente de elución isocrática para las corridas cromatograficas de
tetraciclinas....................................................................................................................................... 26
Tabla 4.1: Resultados de los cromatogramas del estándar de Oxitetraciclina. ............................... 36
Tabla 4.2: Resultados de los cromatogramas del estándar de Tetraciclina. .................................... 37
TABLA 4.3A OXITETRACICLINA .............................................................................................. 39
Tabla 4.4 A Y 4.4 B: Resultados de la evaluación de la recuperación de muestras de
leche fortificadas empleando los coeficientes de student de dos colas para un 95% de
confianza y (m–2) grados de libertad. .............................................................................................. 40
TABLA 4.4 A OXITETRACICLINA .............................................................................................. 40
Tabla 4.5: Resultados de los cromatogramas de las muestras analizadas de leche cruda. ............. 41
Tabla 4.6: Resultados de las concentraciones de las muestras analizadas de leche cruda
de la Asociación COPLA. ................................................................................................................. 42
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1: Derivados de tetraciclina ............................................................................................... 7
Figura 2.2: Estructura de la tetraciclina ............................................................................................ 8
Figura 2.3: Estructura de la Oxitetraciclina. ..................................................................................... 9
Figura 2.4: Diagrama de separación de fases ................................................................................. 14
Figura 2.5 Equipo HPLC ................................................................................................................ 16
Figura 2.6: Imagen de UPLC H-Class frontal y posterior del equipo ............................................. 18
Figura 2.7: Tipo de ligando. ............................................................................................................. 20
Figura 3.1: Etapas que conforman el proceso de Extracción en Fase solida (EFS)....................... 33
Figura 4.1: Curva de calibración del estándar de Oxitetraciclina. .............................................. 36
Figura 4.2: Curva de calibración del estándar de Tetraciclina. ................................................... 37
Figura 4.3: Porcentaje de muestras de leche que poseen determinada concentración de
Oxitetraciclina. ................................................................................................................................. 43
xiv
LISTA DE ANEXOS
ANEXOS .......................................................................................................................................... 53
Anexo 1: Tabla de residuos máximos permitidos y tiempos de retiro de las tetraciclinas. .............. 53
Anexo 2: Tabla militar estándar. ...................................................................................................... 54
Anexos 3: LMR pertinentes para la acuicultura en la Zona Económica Europea. .......................... 57
CUADRO 12 Actuales LMR pertinentes para la acuicultura en la Zona Económica
Europea 57
Anexos 4: Límites máximos de residuos para Clortetraciclina/Oxitetraciclina/
Tetraciclina. ...................................................................................................................................... 59
Límites máximos de residuos para Clortetraciclina/Oxitetraciclina/Tetraciclina ........................... 59
Anexos 5: Norma Codex Alimentarius. ............................................................................................. 60
Anexo 6: Criterios de aceptación para el parámetro de precisión en función de la
concentración del analito de la AOAC. ............................................................................................ 62
Anexo 7: Criterio de aceptación del parámetro de exactitud, relacionando el porcentaje
de recuperación en función de la concentración del analito de la AOAC. ....................................... 63
Anexo 8: Cromatograma de Tetraciclina de concentración de 100 μg/l. ......................................... 64
Anexo 9: Cromatograma de Oxitetraciclina de concentración de 100 μg/l. .................................... 65
Anexo 10: Curvas de calibración y coeficientes de correlación de cada una las tres
repeticiones del estándar de Oxitetraciclina. ................................................................................... 66
Anexo 11: Curvas de calibración y coeficientes de correlación de cada una las tres
repeticiones del estándar de Tetraciclina. ........................................................................................ 67
Anexo 12: Cálculos y desarrollo estadístico del método cromatográfico para
Oxitetraciclina. ................................................................................................................................. 69
Anexo 13: Equipos utilizados para la determinación de Oxitetraciclina y Tetraciclina. ................. 77
CENTRIFUGA COM TEMPERATURA CONTROLADA EPPENDORF. ......................................................................... 77
Anexo 14:Figura de toma de muestras compuestas de leche. .......................................................... 80
xv
TEMA: Determinación de niveles de tetraciclina y oxitetraciclina en leche cruda en
la asociación copla (corporación productora de leche de Alóag) de la Parroquia
Alóag del Cantón Mejía
RESUMEN DOCUMENTAL
Las haciendas grandes o pequeñas productoras de leche no cuentan con asistencia
veterinaria permanente para el ganado bovino por lo que se administra frecuentemente
antibióticos para las enfermedades que sufra el animal, ya sea para prevenir, o curarlas.
Sin embargo, los antibióticos administrados no son eliminados en su totalidad, quedando
residuos de estos medicamentos veterinarios ( Tetraciclinas), en la leche para consumo
humano; estos residuos podrían causar daños a la salud de los consumidores.
AGROCALIDAD como entidad de control requiere actualmente implementar un método
cuantitativo para determinar la concentración de Tetraciclinas, y comparar con la norma
del Códex Alimentarius para Residuos de Medicamentos Veterinarios en los alimentos.
La leche que se recolectó de la Asociación COPLA (Corporación Productora de leche de
Alóag) de la Parroquia Alóag del Cantón Mejía, se sometió a un análisis, y se determinó
si la leche, cumplen con la norma Códex Alimentarius con los límites máximos
permitidos de Tetraciclina, Oxitetraciclina.
Se optimizó el método cromatografico (UPLC), utilizando un gradiente isocrático para
obtener una separación y una mejor resolución de los dos analitos analizados, se realizó
curvas de calibración para la validación método y determinación de concentraciones de
las muestras que posean una contaminación de residuos de medicamentos veterinarios
con Tetraciclina u Oxitetraciclina, los resultados obtenidos de las curvas calibración
fueron tratados estadísticamente con resultados satisfactorios que permitieron determinar
concentraciones de antibiótico presentes en las muestras de leche recolectada de las
haciendas de la Asociación COPLA , se comparó los resultados con la norma Códex
Alimentarius, donde 1 de las 8 muestras analizadas esta fuera de los límites permitidos.
PALABRAS CLAVES
Cromatografía liquida de ultra eficacia, concentración, Tetraciclina, Oxitetraciclina,
norma Códex Alimentarius, estándares de tetraciclinas, antibióticos veterinarios, leche.
xvi
Topic: Determination of tetracycline and oxytetracycline levels in raw milk from
the copla association (milk producing corporation from Aloag) In The Parish Of
Alóag of the Mejia Region
ABSTRACT
Big or small milk producing farms don’t rely on permanent veterinary assistance for their
cattle therefore frequently providing antibiotics to treat any disease presented by the
animals, whether it is a preventive or healing treatment. Nevertheless, the administered
antibiotics are not completely eliminated, leaving trace of these veterinary medication
(Tetracycline), in the milk used for human consumption; these remains may be harmful to
the health of consumers. AGROCALIDAD (Agro-Quality) as the controlling body
currently requires the implementation of a quantitative method in order to determine
Tetracycline concentration, which should be compared to the Códex Alimentarius
standards regarding Veterinary Medication Remains in food.
The milk collected at COPLA (Milk Producing Corporation from Aloag) of the Parish of
Aloag in the Mejia Region, was analyzed thus determining whether or not the milk
complies with the Códex Alimentarius standards and its set limits regarding Tetracycline
and Oxytetracycline.
The chromatographic method was optimized (UPLC), using an isocratic method to obtain
a reparation and a better resolution of the analyzed analytes, calibration curves were
created to validate the method and determinate concentrations in the samples which
presented contamination with veterinary medication containing Tetracycline or
Oxytetracycline, the obtained results from the calibration curves were statistically treated
and presented satisfactory results which allowed the determination of the antibiotic
concentration in the milk samples collected from the farms of the COPLA Association,
the results were compared to the Códex Alimentarius standard, where 1 of the 8 analyzed
samples was out of the allowed limits.
xvii
KEYWORDS
Ultra efficient liquid chromatography, concentration, Tetracycline, Oxytetracycline,
Códex Alimentarius standard, tetracycline standards, veterinary antibiotics,
I CERTIFY that the above and foregoing is a true and correct translation of the original document in Spanish. Silvia Donoso Acosta Certified Translator ID.: 0601890544
1
CAPÍTULO I
1 INTRODUCCIÓN
1.1 Planteamiento del problema
La leche más consumida a nivel mundial es la que proviene del ganado bovino, por su
contenido de grasa, minerales, vitaminas y del alto valor biológico, específicamente de
proteína. La leche es uno de los alimentos de mayor consumo en la población del
Ecuador, por lo que es importante que se encuentre libre de agentes químicos ajenos a su
composición como por ejemplo las Tetraciclina y Oxitetraciclina, antibióticos que son
comúnmente utilizados en la medicina veterinaria, y que pueden ocasionar toxicidad a
quienes consumen la leche.
La mayor producción de leche en el Ecuador se encuentra en las provincias de Pichincha,
Azuay y Chimborazo, sin embargo, en el Cantón Mejía, los dueños de haciendas y
quienes producen leche ya sea grandes, medianos o pequeños productores están sujetos a
mantener a sus animales en buen estado, libres de enfermedades infecciosas, y en
ocasiones suministran antibióticos o fármacos veterinarios para controlar infecciones
sistemáticas como mastitis, metritis etc.
El uso incorrecto de medicamentos en el tratamiento de enfermedades para vacas lecheras
puede dar como resultado la contaminación con niveles peligrosos de residuos
farmacológicos. Los antibióticos comúnmente utilizados en el medio son las
Tetraciclinas y los medicamentos que pertenecen a este grupo de antibióticos como la
Oxitetraciclina, Clortetraciclina, Doxiciclina y Tetraciclina, por ser fáciles de adquirir,
económicos, amplio espectro de acción y ampliamente conocidos por los ganaderos.
La Tetraciclina y la Oxitetraciclina, objeto de estudio fueron elegidas por ser los
antibióticos más usados, por su amplio espectro para las infecciones que sufre el ganado
bovino donde el control para detectar su presencia en la leche cruda son los kits
cualitativos de rápida respuesta.
Una acción típica del ganadero es el inadecuado manejo de las vacas tratadas con
antibióticos, generalmente no retiran el ganado del hato, se ordeña sin prever la
contaminación por los residuos farmacológicos que se transfieren a la leche. El agricultor
no toma precauciones importantes cómo el período de retiro de la leche hasta que los
residuos del medicamento en la leche disminuyan hasta alcanzar un nivel inocuo inferior
al Límite Máximo de Residuos (L.M.R.)
2
El irrespeto al tiempo de retiro responde a varias razones, como el desconocimiento de su
existencia, los efectos que pueden ocasionar, la pérdida económica que representa para el
productor al desechar la leche contaminada, entre otras. A esto se suma una ineficiente
acción de control ya que solo se hace pruebas cualitativas para determinar si hay
presencia o no de antibióticos, en cuyo caso se debería cuantificar los residuos de
antibióticos presentes en la leche cruda para al menos asegurar que el contenido sea
menor al aceptado como niveles seguros.
1.2 Formulación del Problema o Hipótesis de trabajo.
El consumo de leche en el Ecuador y en el Cantón Mejía de la provincia de Pichincha es
masivo, ya que es un alimento barato y de fácil acceso en todo lugar de expendio de
alimentos ya sea como leche cruda o procesada.
Al momento, no existen un control y una cuantificación real de los niveles residuales de
antibiótico presentes en la leche cruda que causan toxicidad en la salud del consumidor.
Este estudio se plantea la siguiente interrogante: Se puede cuantificar los niveles de
tetraciclinas en leche cruda y determinar si los resultados obtenidos cumplen con lo
establecido con la norma INEN 9:2012 quinta revisión y el Codex Alimentario?
1.3 Objetivos.
1.3.1 Objetivo General.
Determinar los niveles residuales de Tetraciclina y Oxitetraciclina en leche cruda,
producida por la Asociación COPLA (Corporación Productora de leche de
Alóag) de la Parroquia Alóag del Cantón Mejía.
1.3.2 Objetivos Específicos.
Realizar la selección de las haciendas mediante la tabla militar estándar del MSP.
Realizar la toma de muestras de la leche de las haciendas seleccionadas mediante
la técnica del muestreo compuesto.
Cuantificar por el método UPLC1 los niveles residuales de Tetraciclinas y
Oxitetraciclina presentes en la leche.
Comparar los resultados obtenidos en el análisis de las tetraciclinas en leche
cruda con los valores establecidos por las normas INEN.
1UPLC: Cromatografía Líquida de Ultra Eficiencia
3
1.4 Importancia y justificación de la investigación.
El uso de antibióticos en medicina veterinaria, sin lugar a dudas ha sido una de las
principales herramientas en el control y erradicación de enfermedades infecciosas que
sufre el hato ganadero lechero; ya que una vaca sana ofrece una buena producción de
leche. El Cantón Mejía es uno de los mayores productores de leche, sin embargo, no
existe un manejo específico y controlado de antibióticos.
Uno de los antibióticos más utilizados es la Tetraciclina, ya que tienen un amplio
espectro de acción, es barata, y puede ser administrada bajo prescripción veterinaria o no,
debido a que no existe un control adecuado de estos antibióticos, los animales que son
tratados con este antibiótico, deben cumplir con un tiempo de retiro, ya que el antibiótico
permanece de 6 a 26 horas en el organismo de la vaca; al no cumplir con el retiro del
animal, los residuos de antibiótico son excretados al momento del ordeño causando daños
en la salud de los consumidores, molestias digestivas como: dolor de estómago, náuseas,
diarrea y reacciones de hipersensibilidad y alergia; por otro lado, si la excreción de
residuos es permanente y es eliminado por las heces u orina del animal, esto puede
provocar efectos ecológicos alterantes.
La presencia de residuos de antibióticos en la leche es considerada ilegal causando
efectos en la reducción de acidez y aroma durante la manufactura de subproductos de la
leche, como la mantequilla y el yogurt, así mismo, dificulta la maduración de los quesos
originando textura blanda y sabor amargo. Las bacterias empleadas en la fabricación de
yogurt resultan ser muy sensibles a los antibióticos, presentan cambios morfológicos, y en
ocasiones los cultivos iniciadores son reemplazados por microorganismos indeseables,
provocando la inutilización del producto y convirtiéndose en un peligro para el consumo
humano. (UNMSM, 2009).
4
CAPÍTULO II
2 MARCO TEÓRICO
2.1 Antecedentes.
Según datos de la FAO (2012) la producción total de leche a nivel mundial,
correspondiente al año 2011 fue de 730.1 millones de toneladas métricas, lo que
representó un crecimiento del 2.31 % con respecto al año precedente. La misma fuente
estima para el año 2012 un crecimiento del 2.7 %, por lo que la producción mundial
llegaría a los 750.1 millones de toneladas de leche.
Según el III Censo Agropecuario Nacional en el Ecuador del año 2000, la producción
diaria de leche a nivel nacional se sitúa en 3’525.037 litros. En la Sierra se produce el
73% de la producción nacional, 19% en la Costa y en el Oriente 8%. La producción en la
provincia de Pichincha es la más importante con 720 mil litros de leche, es decir con el
20,44 % de la producción total, seguida por Manabí con el 9,41%, Azuay con el 8%,
Cotopaxi y Chimborazo en el 7%, constituyendo estas 4 provincias el 53,22% de la
producción nacional (S I P A E2007).
La producción de leche en el Cantón Mejía es de 240.000 litros por día, distribuidos en
las parroquias de Alóag, Tambillo, Aloasí, Cutuglahua, Uyumbicho, Cornejo Astorga,
El Chaupi y la cabecera cantonal Machachi. De acuerdo con estos registros, existe una
gran producción en el Cantón Mejía, por lo que los ganaderos de la zona están sujetos a
mantener sus animales libres de enfermedades para no bajar la producción diaria de leche.
La Asociación COPLA está situada en la parroquia de Alóag del Cantón Mejia de la
Provincia de Pichincha tiene una producción muy importante dentro de la zona, de 78.184
litros de leche quincenal.
La ausencia de control cuantitativo del antibiótico en la leche afecta directamente la
composición de la leche cruda. Al momento no existen métodos cuantitativos en el
Ecuador para controlar el uso correcto de estos antibióticos, AGROCALIDAD,
organismo de control en alimentos, para salvaguardar la inocuidad alimentaria del
consumidor, requiere evaluar un método analítico cuantitativo instrumental en UPLC para
investigar y cuantificar los niveles de tetraciclinas en leche cruda, método que será
utilizado como herramienta en el presente proyecto.
Existen estudios cuantitativos realizados en México, Guatemala donde se encontraron
residuos de antibióticos en leche cruda, y después del proceso de pasteurización dando
como positivo la presencia de tetraciclinas; en Ecuador se ha realizado estudios de
5
antibióticos por la PRUEBA COPAN MILK TEST, que ha demostrado la presencia de
antibiótico en leche procesada, éste estudio fue realizado en la Escuela Superior
Politécnica de Chimborazo en el 2008.
2.2 Fundamento teórico.
La leche y sus derivados pertenecen al grupo de alimentos de mayor riesgo en salud
pública no solo por tratarse de un alimento básico y de amplio consumo, sino por su
susceptibilidad para transmitir enfermedades, debido a la presencia de microorganismos,
y por contaminación de antibióticos veterinarios; los medicamentos veterinarios se
utilizan en los animales, para favorecer su crecimiento. Después de administrar un
medicamento a un animal, tiene lugar un proceso metabólico que favorece su
eliminación; en términos generales, la mayor parte del producto y de sus metabolitos, se
excretan por la orina y las heces; sin embargo, también se pueden encontrar residuos en la
leche o en la carne después de sacrificar el animal; por lo tanto, se recomienda que
cuando los animales estén sometidos a un tratamiento, la leche ordeñada de estos
animales se separe de la leche de los animales no tratados, respetar el tiempo o período
de retiro o supresión, hasta que se establezca con certeza que se puede consumir sin que
existan restos de antibioticos.(Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y
la Alimentación [FAO], 2006), Neiva, 2003.
2.2.1 Tetraciclinas.
Las tetraciclinas constituyen un conjunto de antibióticos naturales (Clortetraciclina,
Oxitetraciclina, Tetraciclina) o semisintéticos (Doxiciclina), derivados de diferentes
especies de Streptomyces. Se caracterizan por compartir el mismo núcleo tetracíclico
naftaleno, espectro antimicrobiano, mecanismo de acción y toxicidad. Las principales
diferencias radican en su perfil farmacocinético.
Son agentes bacteriostáticos con actividad sobre una gran variedad de microorganismos,
por lo que se han convertido en antibióticos de uso habitual en los seres humanos,
animales y en algunas áreas de la agricultura (Pérez-Trallero e Iglesias, 2003; Cuéy
Morejón, 1999; Franfe y Neu, 1987); Klein y Cunha, 1995; Rodríguez y col., 1998).
2.2.1.1 Historia, mecanismo de acción y usos.
El descubrimiento de las TCs2 (Aeromicina) fue producto de la búsqueda sistemática de
microorganismos productores de antibióticos en muestras de tierra de diversas partes del
mundo con el objetivo de encontrar alguna sustancia más segura que la estreptomicina
2*TC: Tetraciclina
6
que venía utilizándose en el tratamiento de la tuberculosis. Este trabajo fue llevado a cabo
por el Dr. Duggar de la Universidad de Wisconsin en colaboración con los Laboratorios
Lederle de Pearl River. Las primeras TCs en aislarse fueron, en 1945 la CLTC3
Aureomicina producida por Streptomyces aureofaciens y en 1950 la OXTC4 Terramicina
a partir del Streptomyces rimosus. Por otro lado la TC fue el primer producto
semisintético obtenido en 1953 a partir de CLTC por eliminación del átomo de cloro.
Poco más tarde se aisló otra TCs natural, la DEMC 5
producida por una cepa mutante de
Streptomyces aureofaciens. El resto de las TCs presentadas en la figura 1 son derivados
semisintéticos de los compuestos naturales obtenidos por sustitución de grupos
funcionales en la década de 1960 (Goodman Gilman 1996). Las TCs se clasifican como
antibióticos de amplio espectro, ya que actúan tanto sobre microorganismos Gram
positivos como Gram negativos, y también sobre Rickettsia, Mycoplasma y Chlamydia.
En términos generales, son agentes bacteriostáticos que actúan inhibiendo la síntesis de
proteínas bacterianas al ligarse al ribosoma 30S, evitando así la unión del tRNA a su sitio
de anclaje (Goodman Gilman 1996). (María Mercedes De Zan -2011).
Desde su descubrimiento, estos antibióticos han sido usados ampliamente en medicina
veterinaria y humana para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas.
Actualmente, aunque se continúan utilizando como fármacos terapéuticos veterinarios, se
los aplica como aditivos alimentarios para promover el crecimiento de animales
destinados al consumo humano (Riviere y Spoo1995).
Se administran tanto al ganado vacuno, como a cerdos, ovejas, aves de corral y peces
(Debuf 1988). Otro uso masivo importante de TCs, junto con las sulfonamidas, es en la
prevención de enfermedades causadas por el Paenibacillus larvae y el Melissococcus
plutonque. (Huq y col 2006). (María Mercedes De Zan -2011).
2.2.1.2 Características físico-químicas de las tetraciclinas.
Las tetraciclinas (TCs) son un grupo de sustancias cristalinas de color amarillo, sin olor y
de sabor ligeramente amargo, con conocida actividad antimicrobiana; tal como lo indica
su nombre genérico, todas ellas tienen una estructura tetracíclica básica denominada
naftacenocarboxamida (Corcia y Nazzari 2002, Stolker y Brinkman 2005), en en la figura
N°- 1 se presenta la estructura común a las tetraciclinas y los sustituyentes que dan lugar
a las distintas clases.
3* CLTC: Clortetraciclina
4*OXTC: Oxitetraciclina
5* DEMC: Dimetilclortetraciclina
7
Los sustituyentes representados en la parte inferior de esta estructura son grupos
funcionales de oxígeno, indispensables para asegurar las propiedades antimicrobianas del
compuesto, ya que se ha demostrado que las modificaciones en esta región de la molécula
conllevan a una pérdida de actividad biológica (Nelson 1998). Sin embargo, las
modificaciones sintéticas en la región superior de la estructura representada, dan lugar a
moléculas que al tener diferentes tamaños, solubilidad, carga electrostática y polaridad,
poseen distinta actividad y farmacocinética, ampliando el abanico de aplicación de estos
compuestos. En general las TCs poseen un comportamiento anfótero, ya que forman sales
tanto con las bases como con los ácidos. Sus sales sódicas son solubles en agua,
disminuyendo esta solubilidad al disminuir el pH. Son considerablemente estables en
estado sólido, pero no tanto en solución, siendo particularmente inestables a pH
superiores a 10.0 o inferiores a 2.0 (El Korchi 2006). (María Mercedes De Zan -2011).
En la figura N°- 2.1 se muestra los diferentes derivados de tetraciclinas.
Figura 2.1: Derivados de tetraciclina
Fuente: Farmacología Veterinaria 3ra
Edición
8
2.2.2 Tetraciclina (Aeromicina).
Figura 2.2: Estructura de la tetraciclina
Fuente: Farmacología Veterinaria 3ra
Edición
La Tetraciclina propiamente dicha o Aeromicina (Figura 2.2) es un antimicrobiano que
apareció en el ámbito clínico en 1952. Su nombre químico es [4S-
(4.α.,4a.α.,5a.α.,6.β.,12a.α.)]4-(dimetilamino)-1,4,4a,5,5a,6-11,12a-octahidro-
3,6,10,12,12a-pentahidroxi-6-metil-1,11-dioxo-2-aftacenocarboxamida. Tiene un peso
molecular de 444.44 Da6 y su fórmula condensada es C22H24N2O8. Es estable en
soluciones neutras o alcalinas. Existen en las formas de sal clorhidrato, fosfato y lauril-
sulfato.
Es una Tetraciclina semisintética de corta duración que se obtiene de Streptomyces sp, en
proliferación libre. En solución acuosa la tetraciclina pierde la mayor parte de su
actividad, aproximadamente en 3 semanas. La utilidad clínica de la Tetraciclina depende
de su concentración en los tejidos afectados. Por ejemplo en el tratamiento de la
conjuntivitis se utiliza una pomada oftálmica de Tetraciclina al 0.1%.(Varinia Paredes V.
MSc), (Farmacología Veterinaria 3ra. Edición).
2.2.2.1 Farmacocinética.
La tetraciclina por vía IM se absorbe muy bien y se detecta en plasma a los 15 minutos,
para alcanzar su Cpmax en 1h. Mantiene cifras terapéuticas por un tiempo de 6h y entre
12h aproximadamente. El Clorhidrato de tetraciclina tiene biodisponibilidad de 23-25%
y un Vd7 alto (hasta 4 L/Kg). Tiene biodisponibilidad mayor que la Clortetraciclina. La
6*Da: La unidad de masa atómica unificada (símbolo u)1 o Dalton (símbolo Da).
7*Vd: Volumen de distribución en el estado de equilibrio estacionario.
9
depuración es de 0.185 l/Kg/h, con vida media de 16 horas. (Farmacología Veterinaria
3ra. Edición).
2.2.2.2 Efectos adversos.
La tetraciclina se administra a veces por vía IV; por las vías IM o SC8es muy irritante y
puede causar edema e inflamación en el lugar de la inyección. Ha provocado choque
anafiláctico en algunos perros. Cuando se administra por vía IV en bovinos puede
provocar colapso vascular, que se previene administrándolo previamente borogluconato
de calcio.
2.2.3 Oxitetraciclina (Terramicina).
Figura 2.3: Estructura de la Oxitetraciclina.
Fuente: Farmacología Veterinaria 3ra
Edición
La Oxitetraciclina, también denominada Terramicina (Figura 2.3), se obtiene a partir de
Streptomyces rimosus. Es una de las tetraciclinas más utilizadas en la terapéutica
veterinaria. Su nombre químico es: [4S-(4α,4a,α,5α,5a,α,6β,12a,α)]-4-(dimetilamino)-
1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahidro-3,5,6,10,12,12a-hexahidroxi-6-metil-1,11-dioxo-2-
naftacenocarboxamida. Su peso molecular es de 460.44 Da y su fórmula condensada es
C22H24N2O9. Existen las formas de sal dihidratada, clorhidrato y sal disódicadihidratada.
Se encuentra en dos presentaciones:
a) De larga acción: con la que se obtiene valores sanguíneos terapéuticos durante 120 h
cuando está al 20%.
8*SC: subcutánea
10
b) De acción intermedia: que produce valores terapéuticos por alrededor de 78 h en
dilución al 10%.
En solución acuosa neta, la Oxitetraciclina pierde la mayor parte de su actividad en tres o
cuatro días. (María Mercedes De Zan -2011), (Farmacología Veterinario 3ra. Edición).
2.2.3.1 Farmacocinética.
La Oxitetraciclina tienen mayor biodisponibilidad que la Clortetraciclina, pero menor que
la Doxiciclina.
Es importante señalar que existen diferentes vehículos y formulaciones de las
oxitetraciclinas en el mercado, esto da como resultado comportamientos farmacológicos
distintos que varían de modo considerable en las bioequivalencias.
Después de absorberse las oxitetraciclinas llegan a la sangre y tejidos, cualquiera que sea
su forma de preparación o vía de administración, por lo que la eficacia clínica de sus
diferentes formas es aproximadamente la misma. (Farmacología Veterinaria 3ra,
Edición).
Por vía IM9, la Oxitetraciclina se absorbe bastante bien y se detecta en plasma a los
quince minutos, para alcanzar su Cpmax10
en una hora.
Mantiene cifras terapéuticas por el tiempo de 6h y entre 12 h, aproximadamente. Cuando
se aplica la Oxitetraciclina por vía IV11
lenta en vacas, se ha logrado concentraciones
tisulares más homogéneas y altas en el tracto urogenital. Cuando se administra a razón de
10 mg/Kg/IV en caballos, se alcanza concentraciones plasmáticas elevadas a los 30
minutos.
2.2.3.2 Efectos adversos.
Con dosis de 130 mg/IV en perros se puede inducir nefrotoxicosis aguda, a menudo
irreversible.
También se ha informado de choque anafiláctico por la aplicación IV de preparaciones de
Oxitetraciclinas en vacas, así como la hipotensión y alteraciones del ritmo cardíaco.
Se sabe que la administración de Tetraciclinas por vía IM produce irritación y en la
experiencia de algunos autores la inyección IM de Oxitetraciclina de larga acción ha
9*IM: Intra Muscular
10*Cpmax::concentración plasmática máxima
11*IV: Intra Venosa
11
producido abscesos estériles que a menudo afectan el nervio, lo cual genera cojeras y
parálisis flácida permanente.
2.2.3.3 Toxicidad.
Todas las tetraciclinas provocan efectos colaterales intestinales como dolor epigástrico,
náusea, vómitos y anorexia. Las tetraciclinas pueden acumularse en hueso y dientes
provocando una coloración amarilla-gris. Esta pigmentación está relacionada con la dosis,
tiempo de dosificación y repetición del medicamento. Las tetraciclinas pueden producir
hiperpigmentación, hipersensibilidad cutánea, vértigo y seudo tumor cerebral. Raramente
las tetraciclinas pueden producir nefrotoxicidad o hepatotoxicidad. (PAC INFECTO-1
C3).
2.2.3.4 Tiempo de retiro.
En cuanto a las oxitetraciclinas de larga acción, es necesario establecer la presencia en la
leche para cada preparado, debido a que no son bioequivalentes. Es posible que de tres a
seis días sea el intervalo de retiro de la ordeña dependiendo de la técnica analítica para
cuantificar los residuos. (Farmacología Veterinaria 3ra Edición).
2.2.4 Enfermedades del ganado bovino.
El estado de salud de los animales depende principalmente de las condiciones del animal,
de las condiciones del medio en que se encuentra y de la presencia de agentes que
producen enfermedades. Todo productor debe desarrollar un plan sanitario preventivo en
su finca que incluye vacunaciones, control de parásitos externos e internos y algunas
técnicas de manejo como descorné, corte de pezuñas, etc. Una vez que el animal a
contraído una enfermedad, el productor debe estar en capacidad de distinguirla y tratarla
de la manera adecuada (Domingo Díaz Peñate 2008).
Las enfermedades que afectan al ganado bovino son:
1. Afecciones generalizadas.
2. Sistema digestivo.
3. Sistema osteomuscular.
4. Trastornos metabólicos.
5. Aparato reproductor.
6. Sistema respiratorio.
12
2.2.5 La leche.
La definición de leche está dada por su origen y hace referencia al producto de la
secreción normal de la glándula mamaria de animales bovinos sanos, obtenida por uno o
varios ordeños diarios, higiénicos, completos e ininterrumpidos. Es un producto que
aporta nutrientes básicos para la alimentación humana. La composición de la leche no es
estable a lo largo de la lactancia y puede verse afectada por factores internos y externos
del animal, afectando en gran medida la calidad del producto. (VIRTUALPRO, 2013)
La leche es el único alimento cuya finalidad natural y exclusiva es servir como alimento
de los mamíferos recién nacidos, su composición en nutrientes es muy equilibrada, tanto
en azúcares, grasas y proteínas, micronutrientes, minerales vitamínicos y aminoácidos
esenciales.
La leche es un producto inestable, perecedero, que se altera rápidamente, sobre todo por
la contaminación microbiana; debe refrigerarse lo antes posible y procesarse sin demora.
Es un alimento complejo, en el que hay tres fases: una acuosa que tiene sales, azúcares,
proteínas, vitaminas y aminoácidos disueltos; otra sólida , en estado coloidal formado por
proteínas complejas principalmente caseína, fosfatos y otras sales insolubles de calcio;
finalmente, otra lipídica emulsionada, formada por grasas esteroles principalmente
colesterol y vitaminas liposolubles principalmente A y D .( Eduardo PrimeroYúfera
1998).
2.2.5.1 Características.
La leche es un líquido opaco, dos veces más viscoso que el agua, de sabor ligeramente
azucarado y de olor poco acentuado. Está constituido por sustancias cristaloides que se
hallan en disolución (lactosa, sales minerales y orgánicas); substancias coloidales
(proteínas) y substancias sólidas en suspensión que se encuentran emulsionadas (grasas,
parte de la caseína etc.)
La vaca produce leche aproximadamente durante 300 días después del nacimiento de las
crías. La leche producida durante los primeros cuatro (4) días es inadecuada para la
elaboración de productos lácteos debido a su diferente composición, esta clase de leche se
llama calostro. (Granja integral autosuficiente. J.Cadavid 2002).
2.2.5.2 Composición química de la leche.
La composición de la leche se presenta en la Tabla 2.1. Esta composición puede ser
afectada por los siguientes factores:
Raza y edad de la vaca lechera
Etapa de lactancia
13
Método de ordeño
Estado de salud
Alimentación
Clima
Tabla 2.1: Composición química de la leche
Componentes Porcentajes %
Agua 87.6
Grasa 3.7
Proteína 3.2
Lactosa 4.8
Sales minerales 0.7
Fuente: Granja integral autosuficiente (J. Cadavid 2002).
Las propiedades físicas y físico-químicas de la leche se muestran en la Tabla 2.2.
Tabla 2.2: Propiedades físicas y físico-químicas de la leche
Propiedades Físicas y Físico-químicas de la leche Valores
Densidad a 15 °C 1.030 – 1.034g/cc
Calor específico 0.93 cal/g.°C
Punto de congelación -0.55 °C
pH 6.5 – 6.6
Acidez expresada en grados Dornic, es decir en décimas de Acido
Lac/H. 16 – 18
Índice de refracción 1.35
Fuente: Granja integral autosuficiente (J. Cadavid 2002)
2.2.6 Cromatografía.
La cromatografía es una técnica que permite la separación de los componentes de una
mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos como son:
a) Retención. Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase
estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado a un soporte sólido.
b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase
móvil, que puede ser un líquido o un gas.
14
El fenómeno de migración de los componentes de una mezcla a lo largo de la fase
estacionaria, impulsados por la fase móvil, recibe el nombre de elución. La mezcla a
separar se deposita sobre la fase estacionaría (Figura 2.4), mientras que la móvil atraviesa
el sistema desplazando a los componentes de la mezcla a distinta velocidad, dependiendo
de la magnitud de sus interacciones relativas con ambas fases. Las dos fases se eligen de
forma que los componentes de la muestra se distribuyan de modo distinto entre la fase
móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la
fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario los
componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como
consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en
bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.
Figura 2.4: Diagrama de separación de fases
Fuente: Abel, Stone. Comprehensive Organometallic Chemistry
2.2.6.1 Tipos de cromatografía.
Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil se pueden
distinguir distintos tipos de cromatografía.
a) Cromatografía sólido-líquido. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un líquido.
15
b) Cromatografía líquido-líquido. La fase estacionaria es un líquido anclado a un
soporte sólido y la fase móvil es un líquido también.
c) Cromatografía líquido-gas. La fase estacionaria es un líquido no volátil impregnado
en un sólido y la fase móvil es un gas.
d) Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un gas.
Según el tipo de interacción que se establece entre los componentes de la mezcla y la fase
móvil y estacionaria podemos distinguir entre.
1. Cromatografía de adsorción. La fase estacionaria es un sólido polar capaz de
adsorber a los componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo polar.
2. Cromatografía de partición. La separación se basa en las diferencias de
solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases estacionaria y móvil, que son
ambas líquidas.
3. Cromatografía de intercambio iónico. La fase estacionaria es un sólido que
lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por
aquellos iones presentes en la fase móvil.
(http://www.areaciencias.com/quimica/cromatografia.html).
2.2.7 Cromatografía líquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC).
La cromatografía de alta precisión o HPLC, utiliza columnas de diámetro muy reducido,
rellenas de materiales muy especiales pulverulentos, cuyas partículas tienen un diámetro
de 30-40 μm y en ocasiones, hasta de 20-40 μm. Este tipo de columna es muy eficaz y
tiene una resistencia al flujo de la fase móvil, o sea a una gran caída de presión. Por esto
se utiliza sistemas de bombeo de alta presión para hacer fluir la fase móvil a velocidad
razonable a través de la columna. La cantidad de la fase estacionaria es pequeña por lo
que se necesita que la muestra sea de igual manera entre 1-10 mg. La técnica HPLC es
versátil y puede ser utilizada para determinar casi todo tipo de analito no gaseoso,
siempre y cuando sea soluble en solventes orgánicos e inorgánicos. Esto ha hecho que el
HPLC sea una de las técnicas más importantes para el analista y es la razón de su rápido
crecimiento desde la década de los 70.
16
Figura 2.5 Equipo HPLC
Fuente: Dionex - Medical Science Applications
2.2.8 Cromatografía líquida de ultra eficiencia (UPLC).
El lanzamiento de la UPLC H-Class, Ultra Performance Liquid Chromatography, ha sido
uno de los avances más significativos en la ciencia de las separaciones de diversos
compuestos químicos en la última década.
La UPLC H-Class es el resultado de una innovación que llevó al diseño holístico
simultáneo de una nueva tecnología de partícula para LC12
, un nuevo diseño de columna,
inyectores, bombas y detectores. La combinación de la mejora en prestaciones de las
columnas rellenas de material híbrido con tamaño de partícula inferior a 2 μm y la
capacidad única del sistema ACQUITY UPLC H-Class de suministrar la fase móvil a alta
presión y con una mínima dispersión, que permite aprovechar al máximo los beneficios
de ese nuevo material, produce como resultado picos más estrechos y más concentrados.
Los Sistemas ACQUITY UPLC H-Class aumentan el rendimiento y reducen el consumo
de eluyente sin comprometer los resultados analíticos. (© 2013 Waters).
La tecnología UPLC H-Class, adoptada con resultados satisfactorios por laboratorios de
todo el mundo para llevar a cabo las separaciones más exigentes, sin perder la robustez,
fiabilidad, confiabilidad y reproducibilidad. Lo que diferencia al diseño holístico de este
sistema es la química de partículas híbridas de menos de 2 µm, que ofrece ventajas
12
*LC: cromatografía liquida
17
importantes sobre los sistemas de HPLC, que utilizan una química estándar con partículas
de 5 µm. (ACQUITY UPLC).
2.2.8.1 Características UPLC H-CLASS.
Mezcla multi-eluyente: El QSM mezcla cuatro eluyentes con cualquier
combinación y en cualquier proporción. Puede expandir su capacidad hasta
nueve eluyentes con la válvula de selección de selección de eluyentes interna
opcional para una mayor flexibilidad en los métodos.
Muestreo con inyección directa: La aguja incorporada a la línea de flujo del SM-
FTN proporciona una elevada precisión en la inyección con una excelente
recuperación de muestras, mediante una tecnología especializada que permite
cerrar la aguja de forma eficaz a altas presiones.
Comportamientos para columnas de última generación: Los nuevos
compartimentos para las columnas se han estandarizado con sistemas de pre-
calentamiento activos de bajo volumen, fáciles de manejar, lo que facilita una
eficacia comparable sistema a sistema. El precalentamiento garantiza un
comportamiento térmico preciso y fiable; los comportamientos para columnas
ofrecen flexibilidad multi-zona y rangos de temperatura que van de 4 a 90 °C, y
son apilables.
Gestión del volumen muerto: La tecnología, gestiona de forma automática el
tiempo de inicio del gradiente y las etapas pre-inyección en paralelo.
Superponiendo en los procesos, habitualmente ejecutados en serie, se minimiza el
ciclo de inyección.(Waters-THE SCIENCE OF WHAT’S POSSIBLE)
18
Figura 2.6: Imagen de UPLC H-Class frontal y posterior del equipo
Fuente: Laboratorio de leche (AGROCALIDAD)
2.2.9 Detector ACQUITY UPLC H-Class.
Un detector de absorbancia ultravioleta/luz visible de doble longitud de onda, optimizado
para Ultra Performance LC (UPLC). Ofrece linealidad, resolución y sensibilidad óptimas
para las separaciones de UPLC/UV. (Copyright ©2013 - CienVar Laboratorios).
2.2.9.1 ACQUITY PDA e λ detector.
Detector PDA diseñado específicamente para el sistema ACQUITY UPLC. Innovado en
su celda de detección para flujo, disminución de ruido electrónico en su celda de
detección para el flujo bajo, disminución de ruido electrónico tan bajo como 10 μAU,
soporte de adquisición de datos a 80 puntos por segundo (80Hz). Al ser controlado por el
software provee flexibilidad para operación simultánea en 2D y 3D.
Capacidad:
Intervalo de longitud de onda: 190 a 800 nm.
Exactitud de la longitud de onda: +/- 1nm.
Intervalo de linealidad : < 5% de 2 UA, con un rango dinámico extendido a 2.o
AU.
19
Operación de la lámpara garantizada por 2000 horas.
2.2.9.2 Detector Arreglo de Diodos.
Obtención de cromatogramas tridimensionales, contorno espectral e índice de espectros.
Construcción de bibliotecas espectrales y análisis de pureza de picos (Homogeneidad de
Elución) a través del algoritmo “Contraste Espectral”. Calculo a múltiples longitudes de
onda de manera simultánea, obtención de “Max Plot” para identificación de co-eluciones
o picos cromatograficos ocultos.
2.2.10 Columnas ACQUITY® UPLC con tecnología BEH.
En 1999, Waters lanzó al mercado la familia de columnas XTerra con un relleno de
primera generación de partícula híbrida (HPT). Las columnas Waters XTerra se han
convertido en las columnas de mayor éxito en la historia de Waters. En un relleno de
partícula híbrida (HPT) las mejores propiedades de los rellenos inorgánico (sílice) y
orgánico (polimérico) se combinan para producir un relleno que tiene una fuerza
mecánica, eficiencia, estabilidad a pH alto y forma de pico para bases superior.
Esta primera generación de columnas con partícula híbrida de XTerra no posee la fuerza
mecánica suficiente para soportar las condiciones de velocidad, sensitividad y resolución
de la nueva tecnología UPLC; por esta razón fue necesario crear una nueva partícula
tolerante a la presión ejercida en el UPLC™. Se desarrolló una segunda generación de
relleno utilizando una estructura híbrida BEH formada por puentes etilsiloxanol/sílice;
comparado con la primera generación de partículas metil-híbridas de las columnas
XTerra, la partícula BEH de las columnas ACQUITY UPLC™ BEH es la clave que
soporta la velocidad, sensibilidad y resolución de las separaciones UPLC.
Las químicas de las columnas de la familia ACQUITY UPLC BEH han sido
cuidadosamente elegidas para producir una combinación ideal de eficiencias de alta
resolución, amplio rango de pH y selectividades complementarias. Cuando esto se
combina con la eficiencia mejorada de la tecnología UPLC, las columnas ACQUITY
UPLC BEH con químicas C18, C8, Shield RP18 y Phenyl permiten el desarrollo
rápido de separaciones más rápidas y robustas.(Copyright © Waters Corporation 2010).
2.2.10.1 Columnas ACQUITY UPLC™ BEH C18.
La amplia mayoría de las separaciones por cromatografía en fase reversa tienen lugar en
columnas que contienen fases estacionarias C18 y C8 debido a su estabilidad, retención y
reproducibilidad. Además estos ligandos hidrofóbicos proporcionan, en la mayoría de los
casos, las separaciones deseadas. Las columnas ACQUITY UPLC BEH C18 y C8 han
20
sido diseñadas para ser columnas universales, elegidas para la mayoría de separaciones
UPLC proporcionando el más amplio rango de pH.
Las columnas ACQUITY UPLC BEH C18 y C8 incorporan una química de enlace con
un ligando trifuncional que produce una estabilidad a pH bajo superior (Figura 2.7). Esta
alta estabilidad a pH bajo se combina con la estabilidad a pH alto de las partículas BEH
de 1,7mm para resultar en columnas con las que se puede trabajar en un amplio rango de
pH. Además, esta nueva química utiliza un proceso de endcapping que proporciona una
forma de pico excepcional para bases. Estas innovaciones químicas de enlace y síntesis
de partícula producen los picos más afilados, las más altas eficiencias y las sensibilidades
máximas en MS. (Copyright © Waters Corporation 2010).
Figura 2.7: Tipo de ligando.
Fuente: (Copyright © Waters Corporation 2010).
2.3 Fundamento Legal.
En algunos países se ha establecido una tolerancia nula para las tetraciclinas, a las
que no se les había fijado ningún límite máximo de residuo (LMR), solamente
existe una norma internacional en la que se establecía el LMR para la
oxitetraciclina. El Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Aditivos
Alimentarios (JECFA) y el Codex Committeeon Residues of Veterinary Drugs In
Foods (CCRVDF) establecieron que las tetraciclinas (Tetraciclina, Oxitetraciclina
y Clortetraciclina) deberían tener un LMR común. (FAO/OMS)
Norma Técnica Ecuatoriana INEN 9:2012 quinta revisión para Leche Cruda.
Base de datos en línea del Codex sobre los residuos de medicamentos
veterinarios en los alimentos (Límites máximos de residuos para
Oxitetraciclina/Tetraciclina), ver anexo 5.
21
CAPÍTULO III
3 METODOLOGÍA
3.1 Tipo de Investigación.
La presente investigación científica es de tipo bibliográfico y experimental aplicada, ya
que se realizó la toma de las muestras en el campo de ordeño de las vacas, y fueron
analizadas para cuantificar la existencia de Tetraciclina y Oxitetraciclina, se determinó la
concentración.
Con los datos obtenidos experimentales se comparó la concentración con la Norma
INEN9:2012 quinta revisión para Leche Cruda y la tabla del anexo N°- 5, para comparar
si cumplen con los límites permitidos.
3.1.1 Variables de la investigación.
3.1.1.1 Variable independiente.
Para este caso las variable independiente es la leche proveniente de las haciendas
ubicadas en la Parroquia Alóag del Cantón Mejía Provincia de Pichincha.
3.1.1.2 Variable dependiente.
Las variables evaluadas:
Concentración de Tetraciclinas
Concentración de Oxitetraciclina
3.2 Población y Muestra.
3.2.1 Población.
La población está definida por 28 haciendas productoras de leche que conforman la
Asociación COPLA de la Parroquia de Alóag del Cantón Mejía.
3.2.2 Muestra.
Las muestras de leche fresca de vaca se obtuvieron de cada hacienda de la Asociación
COPLA y el muestreo se realizó de acuerdo a la tabla Militar Estándar. Se tomó muestras
compuestas, para asegurar la homogeneidad de las mismas.
22
3.2.3 Diseño metodológico.
DETERMINACIÓN DE ANTIBIÓTICOS EN LECHE CRUDA
TRANSPORTE DE MUESTRAS
YALMACENAMIENTO
RECOLECCIÓN DE MUESTRAS (LECHE CRUDA),
POR MUESTREO COMPUESTO.
PREPARACIÓN Y ACONDICIONAMIENTO DE
MUESTRAS PARA EL ANÁLISIS
Centrifugación y
extracción ácida
OBTENCIÓN DE MUESTRA PARA
ANALIZAR POR UPLC
TOMA DE DATOS DE LAS MUESTRAS ANALIZADAS
Coolers con hielo
4 - 5°C
COMPARACIÓN DE RESULTADOS CON LA
NORMA INEN 9:2012 QUINTA REVISIÓN PARA
LECHE CRUDA
TRATAMIENTO ESTADÍSTICO
ANALISIS POR UPLC
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
23
3.3 Diseño experimental.
Para la investigación se utilizó el Método Científico (Inductivo – Deductivo, Sintético –
Analítico).
Es deductivo, debido a que las teorías desarrolladas, se aplicaron a procesos específicos
dentro del campo investigativo.
Es analítico, porque se revisó y analizó todos los datos obtenidos donde se obtenga
residuos de Tetraciclinas en leche, los cuales luego serán evaluados y comparados.
Para el tratamiento estadístico de los resultados cromatograficos de las muestras que se
recolectó de las haciendas, se realizó el análisis por triplicado, como consta en la tabla
3.1 y 3.2.
Tabla 3.1: Resultados cromatograficos.
Tabla 3.2: Resultados de las concentraciones.
Ʃ Ā Ā Conc. Muestra Media conc. Muestra
---------- Ā1 --------
Hacienda n. ---------- Ā2 -------- ---------
----------- Ā3 ----------
3.4 Materiales y Métodos.
3.4.1 Selección de las haciendas productoras de leche para el muestreo y estudio
experimental.
El método de muestreo es probabilístico, ya que se basa en el principio de un proceso al
azar. La selección para el muestro de las haciendas de la Asociación COPLA se llevó a
cabo de acuerdo con la Tabla militar estándar del anexo N°.- 2, escogiendo un nivel
general de inspección para el muestreo, el cual dependerá del tamaño de la población
(lote), y aplicando la Tabla militar estándar se le asignó, la letra del código de tamaño de
la muestra escogida, donde el tamaño de la muestra será la que se utilice para recolectar
las muestras de leche.
MATRIZ DE DATOS CROMATOGRAFICOS
Hacienda 1 Hacienda 2 Hacienda 3 Hacienda 4 Hacienda 5 Hacienda n...
R1 R2 R3 RI R2 R3 RI R2 R3 RI R2 R3 RI R2 R3 RI R2 R3
--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---
24
3.4.2 Tipo de muestreo aplicado para la recolección de muestras.
Se realizó la toma de muestras utilizando el muestreo compuesto, que consiste en una
mezcla de varias muestras puntuales de una misma fuente, tomadas a intervalos o por
períodos determinados utilizando un agitador de disco, según el tamaño del recipiente,
esto asegura una mezcla completa del producto. Los volúmenes tienen que ser iguales o
ser proporcionales al caudal durante el período de muestreo, para este presente estudio se
recolectó 200 ml de leche cruda de cada hacienda seleccionada.
Las muestras se tomaron al azar, en los distintos recolectores de cada hacienda
pertenecientes a la Asociación COPLA y se almacenaron en frascos herméticos, con
datos de identificación que llevaban una etiqueta que tenga la siguiente información:
Número de muestra
Hora del muestreo (mañana o tarde)
Nombre de la hacienda productora
Volumen (ml)
3.4.3 Tratamiento de muestras.
Se transportaron las muestras en coolers con gel refrigerante Vecol para mantener fresca
la leche hasta el laboratorio en un ambiente de refrigeración de (4- 5°C), para su
respectivo análisis.
3.4.4 Métodos y Técnicas de Instrumentación Analíticas UPLC.
De la tesis de Ana Mary Rodríguez M. de “Implementación y validación de un método de
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) con Detector Ultra Violeta, para dos
Tetraciclinas en Leche fresca de Vaca”, se utilizó para el tratamiento de la muestra el
método 2 con varias modificaciones para poder acoplarle a las condiciones del
“Laboratorio de Control de Calidad de Leche perteneciente a AGROCALIDAD y se
procedió a realizar las determinaciones para la cuantificación de Tetraciclina y
Oxitetraciclina en leche cruda.
3.4.4.1 Método de extracción de la muestra.
Transferir 2.0 ± 0.1ml de la leche a analizar en un tubo de centrífuga, adicionar 20 ml de
Buffer EDTA-Mcllvaine a 4°C y 3ml de mezcla Hexano: Diclorometano. Mezclar y
centrifugar 30 min a 3000 rpm a 4°C para separar la crema. Es de importancia utilizar una
centrífuga de temperatura controlada ya que ayuda a la precipitación y a la separación de
25
las fases acuosa, grasa y la orgánica. Es importante que los frascos tengan un peso
equivalente para que no suceda la des calibración de la centrífuga.
Transferir la parte de la leche descremada a un tubo limpio y agregar al precipitado 10 ml
de Buffer de Mcllvaine (4°C) para terminar de desgrasar la leche, tapar el tubo y mezclar
el contenido invirtiendo el tubo varias veces, y centrifugar 30 min a 3000 rpm a 4°C. Es
muy importante mantener la muestra a temperaturas inferiores de 4°C para una mejor
recuperación de las TC.
Recolectar el sobrenadante y mezclar con el anterior. Medir el volumen total que debe ser
aproximadamente de 30 ml.
Agregar la solución de ácido tricloroacético al 24 %, en un volumen igual al 10% del
volumen total de lo recolectado. Mezclar la muestra por un minuto. Colocar la muestra en
una cama de hielo o en refrigeración por 15 min.
Proceder a filtrar la muestra recolectada con filtro de papel cualitativo para eliminar las
impurezas más grandes y finalmente filtrar la muestra a través de un equipo de vacío con
una membrana de poro de 0.45 o 0.22 μm, guardar la muestra a 4 °C y en oscuridad hasta
purificarla y concentrarla a través del cartucho de fase solida u oasis HLB. (Tesis-Ana
Mary Rodríguez M.).
Nota: es muy importante mantener la muestra a temperaturas inferiores a 4°C debido a
que puedan precipitar los reactivos, y ocasionar que se obstruyan los cartuchos de
extracción en fase sólida y se pierde parte de la muestra.
3.4.4.2 Método cromatográfico para la determinación de tetraciclinas en leche
cruda.
Se utilizó el método cromatográfico para UPLC-MS FOOD TESTING-Waters (The
sciencie of what’s possible), de esta manera se tomó las condiciones cromatografícas se
acopló para el UPLC-UV con una variación en su gradiente a un gradiente isocrático.
El método se optimizó a partir de la inyección de la mezcla de los dos estándares de
tetraciclinas (solución mix Tetraciclina-Oxitetraciclina), de concentración 5 μg/ml,
1μg/ml, observando una separación de los dos analitos, se utilizó una columna
ACQUITY UPLC BEH C18, 1.7 μm, 2.1 x 50 mm, a un flujo de 0,4 ml/min, a una
longitud de onda de 355 nm, y a una temperatura de la columna de 35 °C, con un
volumen de inyección de 0,7 μl con fase móvil D de una solución de 0.1 % de ácido
fórmico en agua y fase A de acetonitrilo con una gradiente que se detalla en la tabla 3.3.
26
Tabla 3.3: Gradiente utilizado para la separación de las dos tetraciclinas.
Tiempo (min) % Acetonitrilo
A 0.1% Ac. Fórmico en agua. D Flujo (ml/min)
0.0 15 85 0.4
2 50 50 0.4
3.50 30 70 0.4
3.60 15 85 0.4
4.00 15 85 0.4
Con una excelente separación de los picos de las dos tetraciclinas inyectadas, se procedió
a disminuir el tiempo de la corrida cromatográfica, como también se aumentó el volumen
de inyección a 10 μl para concentraciones que estén por debajo de los 0.200 μg/ml y
obtener picos más estables y simétricos para los compuestos de interés, se puso a punto
una separación por gradiente de elución isocrática. Como se muestra en la tabla 3.4.
Tabla 3.4: Gradiente de elución isocrática para las corridas cromatograficas de
tetraciclinas.
Tiempo (min) % Acetonitrilo
A 0.1% Ac. Fórmico en agua. D Flujo (ml/min)
0.0 15 85 0.4
2.00 15 85 0.4
Optimizado el método cromatografico para la técnica UPLC H-Class con detector UV se
preparó soluciones cromatograficas de trabajo donde se partió de la solución madre de
100 μg/ml, donde se diluyó a una solución de estándar de 1 μg/ml.
Para realizar las curvas de calibración de cada tetraciclina, se utilizó la última solución
donde se preparó las soluciones estándar de trabajo cuyas concentraciones fueron de
0.05, 0.075, 0.100, 0.125 y 0.150, 0.175, 0.200 ug/ml, y se aforó con buffer de Mcllvaine-
EDTA-NaCl en balones ámbar aforados de 10 ml.
Nota: Las soluciones estándar de trabajo de tetraciclinas aforadas con Mcllvaine-
EDTA-NaCl no son estables deben ser preparadas el día de análisis.
3.4.4.3 Parámetros De Desempeño Analítico del método cromatografico.
Para el tratamiento de los resultados se utilizó la guía Alejandro C. Olivieri, de Curso de
Quimiometría en Calibraciones univariada y multivariada de primer orden.
27
3.4.4.3.1 Estimación de los parámetros de la regresión.
El análisis de los datos de calibrado mediante regresión lineal implica el cálculo de la
pendiente (A) y ordenada al origen (B) de la recta ajustada a la ecuación y = A x + B. Los
valores estimados de A y B se calculan mediante las siguientes ecuaciones:
Donde xi es la concentración de cada uno de los m patrones de calibrado, x es el
promedio de las concentraciones de calibrado, yi es la respuesta en cada punto e Ȳ es el
promedio de las respuestas de los patrones de calibrado. Los desvíos estándar en los
parámetros A y B se calculan con las siguientes ecuaciones:
En las ecuaciones precedentes, el parámetro sy/x es el desvío estándar de los residuos de
la regresión y está dado por:
Donde yi es la respuesta experimental de cada patrón de calibrado e ŷi representa la
respuesta estimada en cada punto, esto es, ŷi = A xi + B. En la ecuación (5) se emplean m
– 2 grados de libertad, ya que hay m datos disponibles, y 2 parámetros estimados en la
regresión (A y B).
3.4.4.3.2 Predicción en muestras incógnita.
Los valores de A y B se requieren para realizar predicciones en muestras incógnitas, a
través de la ecuación yinc = A xinc + B, de donde puede obtenerse la concentración
estimada del analito en la muestra:
Donde yinc es, en general, un promedio de las respuestas obtenidas para un determinado
número de réplicas de la incógnita (habitualmente tres).
Para calcular el error estándar en la concentración predicha s(xinc), lo cual se lleva a cabo
mediante la siguiente expresión:
28
Donde sy/x es el desvío estándar de los residuos de la regresión dado por la ecuación (5),
A es la pendiente de la recta de regresión, n es el número de réplicas de la muestra
incógnita, m es el número total de patrones de calibrado, yinc es el promedio de las
respuestas de las réplicas de la incógnita, y es el promedio de las respuestas de los
patrones de calibrado, y Qxx fue definido en la ecuación (1).
Debe notarse finalmente que el intervalo de confianza para la concentración predicha
puede calcularse multiplicando el valor del desvío estándar dado por la ecuación (7) por
el correspondiente coeficiente de student para un dado nivel de confianza (usualmente
95%) y un número de grados de libertad igual a (m – 2).
3.4.4.3.3 Sensibilidad de calibración.
La sensibilidad de calibración es igual a la pendiente de la recta de calibrado:
Indica la variación de respuesta producida por una unidad de variación de concentración
del analito, y sus unidades son de señal * concentración–1.
3.4.4.3.4 Sensibilidad analítica.
La sensibilidad de calibración no es adecuada para comparar dos métodos analíticos
cuando estos están basados en respuestas de diferente naturaleza (por ejemplo,
absorbancia y fluorescencia, o absorbancia y medidas electroquímicas, etc.). Para ello es
preferible utilizar la llamada sensibilidad analítica γ, definida por la relación entre la
sensibilidad y el ruido instrumental:
Donde sy es una medida conveniente del nivel de ruido en la respuesta. Para estimar el
nivel de ruido pueden usarse dos procedimientos, que en teoría deberían coincidir. En el
primero, se estima el ruido instrumental (sy) a través de los desvíos de las réplicas de las
mediciones de calibrado respecto de sus promedios:
Donde p es el número de niveles de concentración estudiados en la recta, r es el número
de réplicas de cada punto, yij es el valor de la respuesta correspondiente a cada nivel y
29
réplica, e ŷi es el promedio de las respuestas de las réplicas para cada nivel de
concentración. En la ecuación (10), el número de grados de libertad es m – p, ya que de
los m datos disponibles, p grados de libertad se reservan para el cálculo de las p medias
yi.
3.4.4.3.5 Límite de detección.
Es la mínima concentración detectable de manera confiable por la técnica. En la
definición moderna, el límite de detección (LOD) se calcula en función del desvío
estándar de la concentración predicha para una muestra blanco (S0). Para estimar S0 se
recurre a la ecuación (7), escrita del modo siguiente:
Si suponemos que se analiza una muestra por triplicado (lo más usual es n = 3) en la que
el analito no está presente (Sxinc = 0), la ecuación (11) se reduce a:
Aunque S0 será diferente si se emplea un número diferente de réplicas. En todo caso, es
importante informar qué valor de n se considera en el cálculo de S0 y por lo tanto del
LOD.
De este modo, el LOD está dado por:
3.4.4.3.6 Límite de cuantificación.
Es la mínima concentración cuantificable en forma confiable. Este parámetro (LOQ) se
toma como la concentración correspondiente a 10 veces el desvío estándar (en unidades
de concentración) del blanco, con lo cual:
De este modo, el desvío estándar relativo (DSR) para una concentración igual al LOQ es
del 10%, nivel que se toma convencionalmente como el máximo DSR aceptable para
cuantificar el analito en una muestra.
3.4.4.3.7 Rango lineal.
Se considera que el rango lineal comprende desde la menor concentración que puede
medirse (el LOQ) hasta la pérdida de la linealidad. Una manera conveniente de medir el
cumplimiento de la linealidad es a través de la relación que existe entre la varianza de la
30
regresión, medida por (sy/x)2[ecuación (5)], y la del ruido instrumental, medida por (sy)
2
[ecuación (10)]. Si la primera es significativamente mayor que la segunda, se supone que
hay causas de desvío de la ley lineal que son estadísticamente superiores al ruido en la
respuesta.
La prueba estadística que se utiliza para determinar si los datos se ajustan a la ley lineal es
la F: en primer lugar se calcula un valor "experimental" de F, dado por:
Luego se compara este valor con el crítico que se encuentra en tablas de F (de una cola)
para m – 2 y m – p grados de libertad, y un determinado nivel de confianza, por ejemplo
95%. Si Fexp < F, se acepta que los datos se comportan linealmente.
3.4.5 Materiales y reactivos.
Materiales
Balones de 1000, 500, 100, 50, 25 y 5 ml
Balones aforados ámbar (o forrados con papel aluminio) de 10 mI
Erlenmeyer de 250 ml y 125 ml
Pipetas volumétricas de 2.0, 5.0 y 10 mI
Dispositivo de Filtración al vacío
Membranas para filtración al vacío PVDF 0.45 o 0.22 μm
Frascos plásticos estériles 40 ml
Filtros PTFE o PVDF 0.45 o 0.22 μm
Oasis HLB cartridge 3cc x 60 mg
Jeringas de 5 o 10 ml
Tubos de centrífuga con rosca de 50 ml.
Pipetas pasteur
Pera de succión
Reactivos
Agua destilada tipo I
Metanol para HPLC
Acetonitrilo para HPLC
Acido fórmico
Soluciones estándar de Oxitetraciclina y Tetraciclina
Ácido cítrico monohidratado
31
Fosfato monoácido de Sódio (Na2HPO4)
Etilendiamino de sódiodihidratado triplex III (Na2EDTA.2H2O)
Cloruro de Sodio (NaCl)
Hidróxido de sodio 0.1 N (NaOH)
Hexano para HPLC
Dicloro metano para HPLC
Ácidotricloroacetico
Etanol (96 %v/v)3
Equipos
Instrumento UPLC H-Class
Centrífuga con temperatura controlada
Balanza analítica electrónica
Refrigeradora
Pipetas automáticas ajustables de 1000 µl y 0.5-5.00 ml
Potenciómetro (medir de pH)
Equipo de agitación magnética
Equipo Ultrasonido
Equipo de evaporación con nitrógeno
Gradillas para tubos de ensayo y tubos de centrifuga
Bomba de vacío
3.4.6 Preparación de reactivos.
3.4.6.1 Metodología:
Utilizar agua destilada tipo I, desionizada y filtrada al vacío con poro de membrana de
0.45 o 0.22 μm.
3.4.6.2 Buffer Mcllvaine.
Pesar 12.9 g de ácido cítrico monohidratado y 10.9 g de NaH2PO4 en un balón aforado de
1000 ml, disolver y aforar con agua (H2O) tipo I, guardar este buffer en refrigeración
durante un mes.
3.4.6.3 Buffer de EDTA-NaCl.
Pesar 37.2 g de Na2EDTA.2H2 y 29.2 g de NaCI en un balón aforado de 1000 ml,
disolver y aforar con buffer de Mcllvaine. Controlar el pH a 4:00.
32
Para ayudar a disolver utilizar agitación magnética durante 30 minutos, continuar
disolviendo con la ayuda de ultrasonido para las partículas que queden finalmente filtrar
la solución a través de un filtro 0.45 o 0.22 µm, guardar en refrigeración no más de un
mes.
Pesar 37.2 g de Na2EDTA.2H2 y 29.2 g de NaCI en un balón aforado de 1000 ml,
disolver y aforar con buffer de Mcllvaine. Controlar el pH a 4:00.
3.4.6.4 Solución Stock o Estándar 100 μg/ml de Tetraciclinas (TC) analíticas
certificadas.
Pesar l0 mg o 0.01 g de cada una de las TC en 2 diferentes balones aforados de 100 ml
ámbar (o forrados con papel aluminio). Aforar con metanol grado HPLC. Mezclar bien y
conservar en refrigeración. Las soluciones patrón son estables a 10°C por 6 meses.
3.4.6.5 Estándar de trabajo 1μg/ml de Tetraciclina y Oxitetraciclina.
Tomar 0.25 ml (250 μl) de la solución stock 100 μg/ml aforar con metanol grado HPLC,
en un balón ámbar (o forrado con papel aluminio), de 25 ml para cada una de las
tetraciclinas conservar la solución ≤ 5 días a 10°C.
3.4.6.6 Fases móviles.
Solvente D: Preparar una solución de 0.1 % Acido Fórmico, tomar 1 ml del acido y llevar
a um balón de 1000 ml y aforar com agua tipo I.
Solvente A: Acetonitrilo.
Se recomienda filtrar todas las fases móviles a través de un filtro 0.45µm, con una bomba
al vacío.
3.4.6.7 Solución Hexano-Diclorometano.
Preparar una solución 1:3 v/v y guardarlo en refrigeración preparar el dia de la
utilización para la extracción de la muestra.
3.4.6.8 Ácido tricloroacético.
Pesar 24 g de ácido tricloroacético y aforar en un balón de 100 ml con agua tipo I.
Prepararlo en el momento de utilizarlo.
3.4.6.9 Concentración de la muestra por método de extracción en fase sólida.
Se utilizó el método de extracción de fase sólida de Waters-OASIS SAMPLE
EXTRACTION PRODUCTS con modificaciones en su esquema y metodología para
adaptarlos a las condiciones del Laboratorio de Control de Calidad de Leche
33
perteneciente a AGROCALIDAD, se lo puede observar en el diagrama de flujo del
apartado 3.4.6.11.
3.4.6.10 Solución Hexano-Diclorometano.
Preparar una solución 1:3 v/v y guardarlo en refrigeración preparar el día de la
utilización para la extracción de la muestra.
Para optimizar las condiciones de las etapas del proceso de la extracción en fase sólida
con los cartuchos Oasis HLB se realizaron un par de ensayos ya que el material utilizado
tiene un costo muy alto para realizar más ensayos para no tener pérdidas de la muestra al
momento de empezar la extracción y concentración.
Figura 3.1: Etapas que conforman el proceso de Extracción en Fase solida (EFS).
Fuente: Aplicación de la micro extracción en fase sólida al análisis
medioambiental
34
3.4.6.11 Diagrama de flujo de purificación de la muestra, aplicando Oasis HLB
Cartridge
Activación: 3 mL metanol
Lavado: 2 ml H2O
Adición: 15 ml muestra 5 ml/min
Lavado: 1.5 ml al 5 % metanol en H2O
Elución: 2 ml metanol
Evaporación: con 0.2 ml
Preparación cromatografía: Con 1.0 ml con 0.1 % Ac. Fórmico (Fase móvil)
35
CAPÍTULO IV
4 ANALISIS Y DISCUSIONES DE RESULTADOS
4.1 Análisis y discusiones de Resultados.
4.1.1 Recolección de muestras.
De acuerdo con la Tabla militar estándar del anexo N°.- 2, se escogió la forma general
para el muestreo en los niveles generales de inspección, donde el tamaño de la población
(lote), es de 28 haciendas y la letra del código de niveles de inspección corresponde a la
D, y el tamaño de la muestra es de 8 haciendas, donde Ac (Cantidad máxima de defectos
con la que puede aceptarse el lote), es de 2 y Re (Cantidad de defectos a partir de la cual
se rechaza el lote), es de 1 muestra de leche respectivamente.
Se escogió este nivel general de muestreo debido a que es un método muy utilizado en la
mayoría de procesos de recolección de muestras, donde el tamaño de la población y de la
muestra, no tiene un número significativo de rechazos y de aceptación de muestras.
4.1.2 Muestreo compuesto.
El muestreo consistió en mezclar completamente el producto, agitándolo adecuadamente
con un agitador de disco, se sumergió un número suficiente de veces para asegurar una
mezcla completa y homogénea de la leche. El agitador debe moverse cuidadosamente
para evitar la formación de espuma por el efecto del batido. Se procedió a tomar una o
varias muestras del tanque de enfriamiento o recolectores (Acero inoxidable o aluminio),
donde se almacena la leche después del ordeño y mezclarlas para obtener una muestra
compuesta de 200 ml, de la cual se determina la concentración de las sustancias
contaminantes.
4.1.3 Método cromatográfico.
La optimización del método fue determinada mediante la preparación de estándares de las
Tetraciclinas certificadas para este tipo de estudio, en un intervalo de concentraciones de
0.050– 0.200 μg/mL (ppm). Para cada nivel, se prepararon y analizaron tres réplicas
independientes. Para todos los estándares de Oxitetraciclina y Tetraciclina que fueron
preparados según el procedimiento optimizado (especificado en la parte experimental,
sección 3.4.4.2), para su separación, detección y cuantificación.
36
Los resultados de los cromatogramas correspondientes a los estándares, de
Oxitetraciclina y Tetraciclina se incluyen en la tabla 4.1 y 4.2, consta también las áreas y
la concentración de los 8 estándares con los que se trabajó por triplicado. Las que servirán
para la determinación y cuantificación las dos tetraciclinas analizadas en leche cruda
obtenida de la Asociación COPLA.
Los tiempos de retención para la Oxitetaciclina es de 0.80 minutos, para la Tetraciclina
1.06 minutos.
Tabla 4.1: Resultados de los cromatogramas del estándar de Oxitetraciclina.
Con las áreas obtenidas de las concentraciones del estándar de Oxitetraciclina, se elaboró
la curva de calibración, que se puede observar en la figura 4.1, donde se muestra la
relación entre el área detectada por el UPLC H-Class y la concentración que fue
inyectada en el equipo.
Figura 4.1: Curva de calibración del estándar de Oxitetraciclina.
Estandar Oxitetraciclina AREAS
Concentracion (ppm) A1 A2 A3
0,000 0 0 0
0,050 2125 2068 2009
0,075 3065 3007 3106
0,100 4406 4268 4356
0,125 5717 5419 5205
0,150 6874 6763 6709
0,175 7907 8280 7862
0,200 8666 9141 9111
R² = 0,9971
-2000
0
2000
4000
6000
8000
10000
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250
Are
a μ
AU
Concentracion μg/ml
Curva de Calibracion de Oxitetraciclina
Series1
Series2
Series3
Lineal (Series3)
37
Con las concentraciones y rangos determinados, se obtuvo la siguiente ecuación de la
recta por regresión lineal:
y = 45913,718x – 185,813
Dónde:
y = área (μAU13
)
x = concentración (ug/ml)
Coeficiente correlación es de 0.9971
Tabla 4.2: Resultados de los cromatogramas del estándar de Tetraciclina.
Las áreas obtenidas de las concentraciones del estándar de Tetraciclina, se elaboró la
curva de calibración, que se puede observar en la figura 4.2, en donde se muestra la
relación entre el área detectada por el UPLC H-Class y la concentración que fue
inyectada en el equipo.
Figura 4.2: Curva de calibración del estándar de Tetraciclina.
13
*μAU: Micro unidades absorbancia
Estandar Tetraciclina AREAS
Concentracion (ppm) A1 A2 A3
0,000 0 0 0
0,050 1386 1259 1189
0,075 2170 2027 1853
0,100 3015 2699 2465
0,125 3769 3241 3005
0,150 4460 3890 3735
0,175 5010 4459 4343
0,200 5914 5041 5186
y = 25545x - 71,947
R² = 0,9978
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250
Are
a μ
AU
Concentracion μg/ml
Curva de Calibracion de la Tetraciclina
Series1
Series2
Series3
Lineal (Series3)
38
Con las concentraciones y rangos determinados, obtuvo la siguiente ecuación de la recta
por regresión lineal:
y = 26779,883x - 7,550
Dónde:
y = área (μAU)
x = concentración (ug/ml)
Coeficiente correlación es de 0.9978
La respuesta del detector está relacionada con la concentración de analito mediante
regresión por mínimos cuadrados. Al determinar la media los coeficientes de correlación
de las dos tetraciclinas analizadas da un resultado de, r2 = 0.9965 para la Oxitetraciclina y
r2 = 0,9982 para la Tetraciclina, observamos en las curvas de calibración que se trata de
una regresión lineal, el coeficiente mínimo aceptable para establecer la linealidad es de
0,95. Se deduce que la respuesta del detector es lineal en el intervalo estudiado.
Con los tiempos de retención y una separación eficiente de los dos analitos analizados se
comprobó que el método aplicado es eficaz para realizar la cuantificación verificando el
funcionamiento correcto del equipo UPLC H-Class con detector UV.
Como se puede observar el rango de las curvas de calibración de las concentraciones es
de 0.050 – 0.200 (μg/ml) ppm (multiplicado por 1000), se trasforma a las unidades que se
requiere para comparar con lo establecido en el Codex Alimentario que es ppb (μg/l),
donde los límites máximos de residuos permitidos es de 100 (μg/l) ppb en leche cruda,
está en medio del rango lineal de la curva de calibración lo que permitirá realizar el
control de muestras que estén por debajo de los niveles permitidos así como las que
sobrepasen los mismos.
Se determinó el límite de detección y cuantificación del equipo UPLC H-Class para la
cuantificación de las tetraciclinas; para la Oxitetraciclina el límite de detección y
cuantificación es de 0,01 y 0,03 μg/ml respectivamente, para la Tetraciclina el límite de
detección y cuantificación es de 0,03 y 0,07 μg/ml respectivamente.
Se debe trasformar las unidades obtenidas de μg/ml que son ppm a μg/l que son ppb con
los que se puede comparar los resultados obtenidos con los resultados establecidos por la
norma internacional “Codex Alimentario Residuos de Medicamentos Veterinarios en los
Alimentos”.
Dónde: 1ppm = 1000 ppb aplicando: (
)
= (
)
De esta manera se obtiene los resultados en las unidades que se requiere para la
comparación.
39
Para verificar si el método es el adecuado para la cuantificación de muestras se realizó
una fortificación a muestras de leche cruda con el objetivo de que se obtengan resultados
confiables, se realizó la fortificación de muestras de leche con concentraciones de 0.060,
0.090, 0.120 y 0.150 μg/ml, de Oxitetraciclina y Tetraciclina, en la tabla 4.3A y 4.3B , se
presentan los resultados obtenidos de las muestras fortificadas, ahí constan el área
promedio, concentración predicha, % recuperación, desviación estándar y la desviación
estándar relativa o coeficiente de variación.
Tabla 4.3 A Y 4.3B: Validación de método de recuperación de muestras de leche
fortificadas.
Tabla 4.3A Oxitetraciclina
Muestra
Respuesta
promedio
(yinc)
Concentración
predicha (xinc) % Recuperabilidad
Desvío
estándar
s(xinc)
Desvío
estándar
relativo, DSR
(%)
0,060 2346,000 0,055 91,90 0,003 4,75
0,090 3521,000 0,081 89,70 0,003 3,17
0,120 4650,000 0,105 87,77 0,003 2,40
0,150 5536,333 0,125 83,09 0,003 2,04
Tabla 4.3B Tetraciclina
Muestra
Respuesta
promedio
(yinc)
Concentración
predicha (xinc) % Recuperabilidad
Desvío
estándar
s(xinc)
Desvío
estándar
relativo, DSR
(%)
0,060 1536,333 0,058 96,08 0,006 10,89
0,090 2036,667 0,076 84,82 0,006 8,08
0,120 2856,000 0,107 89,11 0,006 5,68
0,150 3370,333 0,126 84,09 0,006 4,83
Estos datos obtenidos representan la extracción de las muestras de leche fortificadas para
la Tetraciclina y Oxitetraciclina, con resultados satisfactorios donde se evaluó el método
aplicado y las condiciones cromatografías realizadas, se comparó la concentración
cuantificada a través del método desarrollado, con las muestras preparadas para la
fortificación en leche cruda; se puede decir que el equipo detectó las concentraciones de
(0.060, 0.090, 0.120 y 0.150 μg/ml), así como las muestras de tetraciclinas residuales
analizadas en leche cruda.
40
Tabla 4.4 A Y 4.4 B: Resultados de la evaluación de la recuperación de muestras de
leche fortificadas empleando los coeficientes de student de dos colas para un 95% de
confianza y (m–2) grados de libertad.
Tabla 4.4 A Oxitetraciclina
Muestra Concentración predicha (xinc) ± t(p=0,05; 16GL) * s(xinc)
0,060 0,004 ± 0,0054
0,090 0,004 ± 0,0053
0,120 0,004 ± 0,0053
0,150 0,004 ± 0,0053
Tabla 4.4 B Tetraciclina
Muestra Concentración predicha (xinc) ± t(p=0,05; 16GL) * s(xinc)
0,060 0,0003 ± 0,0130
0,090 0,0003 ± 0,0128
0,120 0,0003 ± 0,0126
0,150 0,0003 ± 0,0126
Se evaluó el método de extracción para la Oxitetraciclina y Tetraciclina con la finalidad
de verificar si el método desarrollado arroja buenos resultados y confiables, se aplicó el
análisis del coeficiente de t student de dos colas para un 95 % de confianza y (m – 2)
grados de libertad.
Con la prueba de t de student se comparó los resultados donde el texperimental < ttablas el valor
t experimental es menor que el tabla, por lo que se acepta la hipótesis nula y no existe
diferencia significativa con el 100% de recuperación. Con respecto a la desviación
estándar y el coeficiente de variación son adecuados y corroboran t de student. En el
anexo 6 y 7 se encuentra la tabla A.O.A.C. de criterio de aceptación del parámetro que es
aprobado con un valor de porcentaje de recuperación que se encuentra entre 60 y 115 % y
15 % DSR14
o C.V15
.
14
*DSR: Desviación estándar relativa. 15
*C.V: Coeficiente de variación.
41
Tabla 4.5: Resultados de los cromatogramas de las muestras analizadas de leche
cruda.
En la tabla 4.5 se presentan los resultados de las áreas y concentraciones de las muestras
analizadas por triplicado las que fueron recolectados de los diferentes puntos de la
Parroquia de Alóag del Cantón Mejía las mismas que fueron sometidas al análisis y
cuantificación por el método cromatográfico UPLC- UV los resultados los comparamos
con la norma Codex Alimentario de Residuos de Medicamentos Veterinarios en los
alimentos
En la tabla 4.5, los datos que presentan un resultado negativo fueron sometidos al análisis
cromatografico donde no se detectó ningún pico de interés en los tiempos de retención
que corresponde a la Oxitetracilcina y Tetraciclina, el resultado corresponde que no
presenta ninguna clase de contaminante o antibiótico veterinario estudiado, además se
tomó en cuenta que al realizar las curvas de calibración los estándares de menor
concentración son de 50 ug/l, por ello, las muestras que no poseen señal se las reporta
como inferiores a 50 ug/l o negativas.
1.- Hacienda 1 2.- Hacienda 2 3.- Hacienda 3 4.- Haciendo 4
JC1 JC2 JC3 AC1 AC2 AC3 LP1 LP2 LP3 CP1 CP2 CP3
0 0 0 0 0 0 3612 3521 3530 0 0 0
0 0 0 0 0 0 3514 3622 3566 0 0 0
0 0 0 0 0 0 3506 3592 3522 0 0 0
5.- Hacienda 5 6.- Hacienda 6 7.- Hacienda 7 8.- Hacienda 8
AE1 AE2 AE3 LP2 1 LP2 2 LP2 3 LN1 LN2 LN3 MB1 MB2 MB3
2846 2957 2804 0 0 0 0 0 0 6715 6615 6717
2823 2914 2816 0 0 0 0 0 0 6707 6655 6725
2874 2920 2846 0 0 0 0 0 0 6739 6622 6712
42
Tabla 4.6: Resultados de las concentraciones de las muestras analizadas de leche
cruda de la Asociación COPLA.
En la tabla 4.6, constan las medias de los resultados de las muestras analizadas de leche
cruda así como las que poseen un resultado negativo, y con estos datos se realizó los
análisis comparativos entre los resultados obtenidos con la norma Codex Alimentario.
Con los datos obtenidos de la tabla 4.6, se puede analizar la cantidad de muestras que
presentan Oxitetraciclina, Tetraciclina.
Ʃ Ā Ā Conc. Muestra Media conc. Muestra
0 0 0
JC 0 0 0 0
0 0 0
0 0 0
AC 0 0 0 0
0 0 0
10632 3544,000 81,235
PL1 10735 3578,333 81,983 81,451
10618 3539,333 81,134
0 0 0
CP 0 0 0 0
0 0 0
8543 2847,667 66,069
AE 8791 2930,333 67,870 66,483
8466 2822,000 65,510
0 0 0
LP2 0 0 0
0 0 0
0 0 0
LN 0 0 0
0 0 0
20161 6720,333 150,416
MB 19892 6630,667 148,463 149,748
20154 6718,000 150,365
43
Figura 4.3: Porcentaje de muestras de leche que poseen determinada
concentración de Oxitetraciclina.
En la figura 4.3 se presenta las distintas concentraciones de Oxitetraciclina presentes en
las muestras de leche.
Se observa que una de las 8 muestras analizadas presenta una concentración de
Oxitetraciclina mayor a 100 ug/l, que es el límite máximo permitido de Codex
Alimentario de Residuos de Medicamentos Veterinarios en los alimentos.
Según las tablas 4.5, 4.6 y la figura 4.3, ninguna de las 8 muestran analizadas presenta
una concentracion de Tetraciclina.
De las 8 muestras analizadas, se determinó que 3 muestras (37.5 %) poseen una
contaminación con antibiótico, para el otro tipo de antibiótico analizado no se encontró
contaminación o presencia dentro de las 8 muestras analizadas por lo que existe 0 % de
presencia de Tetraciclina en la muestras de leche cruda.
1 2 3 4 5 6 7 8
negativo negativo
81,45μg/l
negativo
66,48μg/l
negativo negativo
149,74μg/l
Concentracion (μg/l) de Oxitetraciclina de
muestras de leche de la Asosacion COPLA
Oxitetraciclina
44
CAPÍTULO V
5 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 Conclusiones.
La selección de las haciendas se realizó utilizando la tabla militar estándar se
escogió 8 haciendas de la Asociación COPLA de una población de 28.
Para el número de haciendas escogidas se utilizó un nivel general de inspección,
donde la letra de código de tamaño de muestra es D, con un tamaño de lote o
población de 28 haciendas. Las muestras recolectadas en las diferentes
haciendas fueron almacenadas y transportadas cuidadosamente por lo que no se
rechazó ninguna de ellas.
Se realizó la toma de muestras utilizando el muestreo compuesto donde la
homogeneidad de las muestras es un factor primordial para obtener resultados
con una estimación válida.
Para mantener la homogeneidad de la muestra se la debe agitar varias veces
dependiendo de las dimensiones del tanque y evitando se forme espuma.
Se trabajó con dos tipos de columna para el equipo UPLC H-Class, la BEH C18 de
1.7 um, 2.5x50 mm y la Shield RP18 1.7 um, 2.5x50mm; los mejores resultados
de separación y tiempos de retención se obtuvieron con la columna BEH C18 con
la que se realizó los análisis de tetraciclinas y la curva de calibración obtenida.
El tiempo de retención para la Oxitetaciclina fue de 0.80 minutos, para la
Tetraciclina 1.06 minutos con resultados eficaces de separación de los dos
analitos en una sola corrida y obteniendo los picos de interés para la
identificación y cuantificación de las Tetraciclinas.
Para la Oxitetraciclina el límite de detección y cuantificación es de 10 y 30 μg/l
respectivamente, para la Tetraciclina el límite de detección y cuantificación es de
30 y 70 μg/l respectivamente. Esto permite comparar los resultados con los
límites máximos que exige el Codex Alimentarius que es de 100 ug/l para
Tetraciclinas en leche cruda.
Para la identificación y cuantificación de las Tetraciclinas se realizó varios
análisis mediante UPLC; al comparar los tiempos de retención con los estándares
de referencia, los resultados obtenidos experimentales indican la presencia de
Oxitetraciclina, , en las muestras de leche recolectas de la Asociación ACOPLA.
45
Se determinó la media de los coeficientes de correlación de las curvas de
calibración de las dos tetraciclinas con un resultado de, r2 = 0.9970 para la
Oxitetraciclina y r2 = 0,9982 para la Tetraciclina. El coeficiente mínimo
aceptable para establecer la linealidad es de 0,95 esto quiere decir que las
concentraciones para la construcción de las curvas de calibración son buenas y
tienen una linealidad aceptable (se puede observar las curvas de calibración y
coeficientes de correlación en el anexo 10, y 11).
Se probó el método aplicado una fortificación a las muestras de leche cruda con
concentraciones de 60, 90, 120 y 150 μg/l, los resultados de % de recuperación
para la Oxitetraciclina fluctúa de 83 a 91 %, y para la Tetraciclina de 84 a 96 %
según la tabla de anexo 7, está dentro de los parámetros de aceptación.
Para la recuperación de las muestras fortificadas en leche cruda la desviación
estándar relativa los coeficientes de variación para la Oxitetraciclina varían de
2.4 a 4.75 %, y para la Tetraciclina 4.83 a 10.89 % valores que cumplen con lo
establecido (ver valores en la tabla anexo 6).
Los datos obtenidos de la recuperación de la leche fortificada fue corroborada con
la prueba de t de Student el valor texperimental es menor que el de la tabla, por lo
que se acepta que no existe diferencia significativa al 5 %, y se acepta los
porcentajes de recuperación del 83 a 96 %.
Las 8 muestras de leche analizadas no presentan resultados positivos para la
presencia de Tetraciclina, pero 3 muestras presentan contaminación con
Oxitetraciclina (Tabla 4,5 y 4,6).
Las muestras 3, 5, y 8 poseen una concentración de Oxitetraciclina de, 81.45,
66.48 y 149.74 μg/l (ppb).
La muestra 8 con una concentración de 149.74 μg/l (ppb) Oxitetraciclina,
sobrepasa los límites máximos permitidos de la norma Codex Alimentarius, que
es de 100 μg/l (ppb).
Las dos muestras contaminadas 3 y 5 con concentraciones de Oxitetraciclina de
81.45 y 66.48 μg/l (ppb), no exceden los límites máximos permitidos de la
norma Codex Alimentarius, que es de 100 μg/l (ppb).
46
5.2 Recomendaciones.
Se debe tomar precaución al momento de utilizar el equipo para la detección de
las tetraciclinas, sobre todo si se utiliza otro tipo de matrices que posean
concentraciones muy altas ya que pueden llegar a saturar el equipo ocasionando
que no se detecte bajas concentraciones a niveles de trazas.
Para el desarrollo de técnicas con los límites máximos permitidos de residuos
inferiores a 50 ppb o a nivel de trazas, se recomienda utilizar un equipo UPLC H-
Class acoplado a espectro de masas, ya que esta nueva técnica instrumental está
en pleno desarrollo ahorrando solventes, tiempo, además tiene una eficacia y
exactitud en la separación, identificación, cuantificación de analitos.
Se debe tener cuidado con las soluciones utilizadas en la técnica debido que las
buffer utilizadas son sales, las cuales a una temperatura ambiente tienden a
precipitar, y ocasionar que los componentes del equipo como el detector, celdas,
aguja de inyección, y la columna se obstruyan. Se recomienda que las soluciones
sean almacenadas en refrigeración.
Se recomienda revisar los métodos de extracción en fase sólida SPE o HLB por
tener un punto crítico en la recuperación de la muestra al momento de utilizar los
Oasis HLB ya que este tipo de material son muy caros y no son reutilizables. Los
Oasis son productos de extracción, separan y purifican de muestras.
Se debe filtrar todas las soluciones preparadas en el laboratorio con un filtro
cualitativo si las partículas suspendidas son muy grandes, de lo contrario por
medio de filtración al vacío con una membrana 0.45 o 0.22 μm, si existen micro
partículas.
Todos los estándares y muestras previamente tratadas deben ser filtrados antes de
ser inyectados al equipo utilizando filtros PTFE o PVDF 0.45 o 0.22 μm.
47
Referencias Bibliográficas.
(2001).Comisión del Codex Alimentarius. Recuperado de
http://www.codexalimentarius.net/vetdrugs/data/MRL2_s_2011.pdf
FAO y OMS (2012). Recuperado de
http://www.codexalimentarius.net/vetdrugs/data/vetdrugs/details.html;jsessionid=58
D9C86BD694B28EC25E4BC58CE7BEA2?d-16497-o=2&lang=es&id=12&d-
16497-s=3&print=true
Agrovet market s.a. (2006). Antibióticos y Antimicrobianos. Recuperado de
www.agrovetmarket.com/technicalarticlesui.aspx?.language=1...129
Athie Athie A, Díaz Peñate D. (2013). Enfermedades Del Ganado Bovino.
Recuperado de http://www.mundo-
pecuario.com/buscador/ganado_bovinos.html////http://www.mundo-pecuario.com/
Avendaño C. Química Farmacéutica, capitulo 13-Tetraciclinas.
Biología Celular. (2003). Recuperado de
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cro
matografia.htm
Br. Erick Mauricio Ortez Pérez Y Br. Ana Miriam Barrera Méndez (2012). Tesis.
Brassel F. Hidalgoh F. (2007). Libre comercio y lácteos: la producción de leche en
el Ecuador entre el mercado nacional y la globalización. Recuperado de
ttp://www.flacsoandes.org/biblio/shared/biblio_view.php?bibid=110959&tab=opac
Cadavid G. J. I. Granja Integral Autosuficiente. Fondo editorial Grania, pág. (8,
11,12).
Cromatografía (2011). Recuperado de ocw.uv.es/ocw-formacio-permanent/2011-1-
35 Manual.pdf
De Zan M. M. (2011). Tetraciclinas en aguas residuales. (5). Recuperado de
bibliotecavirtual.unl.edu.ar:8180/tesis/bitstream/1/299/2/tesis2.pdf
Dr. Scope. (2005). Tetraciclinas. Recuperado de
http://www.drscope.com/pac/infecto-1/c3/in1c3_p27.htm
file:///H:/CODEX%20%20Clortetraciclina_Oxitetraciclina_Tetraciclina.html
Hectors Sumano Lopg y Ocampo Luis C. Farmacología Veterinaria,. (3ra Ed), pág.
(236-246)
http://www.areaciencias.com/quimica/cromatografia.html
48
Méndez A. (2011). Filtración y Separación. Recuperado de
http://quimica.laguia2000.com/general/cromatografia#ixzz2skhXfEaO
Milthon Esprel Gallegos Valdivia – Chile 2012 Validación de una metodología
analítica por HPLC y Espectrofotometría para la identificación y cuantificación de
antibióticos en propóleos. (Primera parte).
MINISTERIO DE SALUD DE COSTA RICA GUIA-01 GUIA DE VALIDACIÓN
DE METODOS ANALITICOS
http://www.netsalud.sa.cr/ms/drc/pciudadano/guia_01.doc.
Paredes Varinia. V. MSc. (2009). FARMACOLOGÍA VETERINARIA II.
Recuperado de cenida.una.edu.ni/relectronicos/RENL70P227fa.pdf
Pérez-Trallero E. y Iglesias L. (2003). Tetraciclinas, sulfamidas y metronidazol.
Recuperado de
http://external.elsevier.es/espacioformacion/eimc/eimc_docs/28v21n10a13052338pdf
001.pdf
Primo Yúfera E. (1998). Química de Alimentos. España: Síntesis, S.A
Publicado por la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la
Agricultura (FAO) y la Federación Panamericana de Lechería (FEPALE). ( 2011).
SITUACIÓN DE LA LECHERÍA EN AMÉRICA LATINA Y EL CARIBE EN
2011. Recuperado de
http://www.fao.org/fileadmin/templates/est/COMM_MARKETS_MONITORING/D
airy/Documents/Paper_Lecher%C3%ADa_AmLatina_2011.pdf
Rodríguez Monda A. M. (2003), IMPLEMENTACIÓN Y VALIDACIÓN DE UN
MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN CON
DETECTORES ULTRAVIOLETA, PARA LA DETERMINACIÓN DE DOS
TETRACICLINAS EN LECHE FRESCA DE VACA. Recuperado de
www.academia.edu/5410788/Determinacion de tetraciclinas en leche
Rojas S. (2009). MASTITIS EN GANADO BOVINO. Recuperado de
buendato.ning.com/profiles/blogs/mastitis-en-ganado-bovino
Sánchez Mario. (2010). Sanidad Animal. Recuperado de
carbonsintomatico.blogspot.com/
(SOFIA) (2002). El estado mundial de la pesca y la acuicultura. Recuperado de
http://www.fao.org/docrep/005/y7300s/y7300s06a.htm
49
UNAD. Recuperado
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/358002/Abastecimiento_Contenido_en_linea/l
eccin_27_tcnicas_de_muestreo.html
Waters Quality Parts (2006). Chromatography Columns And Supplies Catalog.
Recuperado de http://www.cienytech.com/ES/pys-dis-col-ana-Acquity.htm
Waters. THE SCIENCE OF WHAT’S POSSIBLE (2013). Recuperado de
http://www.waters.com/waters/es_MX/ACQUITYUPLC/nav.htm
Waters-THE SCIENCE OF WHAT’S POSSIBLE.
Wittwer F. M. (2011). Hemoglobinuria posparto en vacas de tres rebaños lecheros
de la región del Bío-Bío, Chile. Recuperado de
Screvistas.unicordoba.edu.co/revistamvz/mvz-163/V16N3A15.pdf
Dionex.
http://www.prometa.kuleuven.be/common/images/instruments/dionex_ultimate3000_
mdlc_real.jpg
50
Glossário de términos
Conceptos y Definiciones de la Guía de Validación de Métodos Analíticos.
ESPECIFICIDAD: Habilidad de evaluar inequívocamente el analito en presencia de
componentes que se puede esperar que estén presentes. Típicamente éstos pueden incluir
impurezas, productos de degradación, la matriz, etc.
EXACTITUD: (VERACIDAD): Expresa la cercanía entre el valor que es aceptado, sea
como un valor convencional verdadero (material de referencia interno de la firma), sea como
un valor de referencia aceptado (material de referencia certificado o estándar de una
farmacopea) y el valor encontrado (valor promedio) obtenido al aplicar el procedimiento de
análisis un cierto número de veces.
INTERVALO DE LINEALIDAD: Ámbito entre la menor y la mayor concentración de
analito en la muestra (incluyendo éstas concentraciones) para las cuales se ha demostrado que
el procedimiento analítico tiene el nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad.
LIMITE DE CUANTIFICACION: Cantidad más pequeña del analito en una muestra que
puede ser cuantitativamente determinada con exactitud aceptable. Es un parámetro del
análisis cuantitativo para niveles bajos de compuestos en matrices de muestra y se usa
particularmente para impurezas y productos de degradación. Se expresa como concentración
del analito.
LIMITE DE DETECCION: Cantidad más pequeña de analito en una muestra que puede ser
detectada por una única medición, con un nivel de confianza determinado, pero no
necesariamente cuantificada con un valor exacto.
Es comúnmente expresado como concentración del analito.
LINEALIDAD: Habilidad (dentro de un ámbito dado) del procedimiento analítico de
obtener resultados de prueba que sean directamente proporcionales a la concentración de
analito en la muestra.
MATERIAL DE REFERENCIA (PATRÓN TERCIARIO): Material o sustancia, en el
cual una o más de sus propiedades están suficientemente bien establecidas para que sea usado
en la calibración de un aparato, la estimación de un método de medición o para asignar
valores a los materiales.
MATERIAL DE REFERENCIA CERTIFICADO (PATRÓN SECUNDARIO): Material
en el que los valores de una o más de sus propiedades están certificados por un
procedimiento técnicamente validado, bien sea que este acompañado de, o pueda obtenerse,
un certificado u otra documentación emitida por un ente certificador.
51
MATERIAL ESTANDAR DE REFERENCIA (PATRÓN PRIMARIO): Material
emitido por la Oficina Nacional de Normas de Estados Unidos (U.S National Bureau of
Standars) cuyo nombre fue cambiado recientemente a Instituto Nacional para Normas y
Tecnología (National Institute for Standards and Technology, NIST.)
METODO ANALITICO: Adaptación específica de una técnica analítica para un propósito
de medición seleccionado.
PARAMETROS DE DESEMPEÑO ANALITICO: Características de validación que
necesitan ser evaluadas y que típicamente corresponden a la siguiente lista: exactitud,
precisión, especificidad, límite de detección, límite de Cuantificación, linealidad, intervalo de
linealidad y robustez.
PRECISION: expresa la cercanía de coincidencia (grado de dispersión) entre una serie de
mediciones obtenidas de múltiples muestreos de una misma muestra homogénea bajo
condiciones establecidas. Puede considerarse a tres niveles: repetibilidad, precisión
intermedia y reproducibilidad.
Debe determinarse utilizando muestras originales y homogéneas. Sin embargo, si no es
posible obtener una muestra homogénea puede ser determinada usando muestras preparadas o
una disolución de la muestra.
PROCEDIMIENTO ANALITICO: Forma en que se realiza el análisis. Debe describir en
detalle los pasos necesarios para realizar cada prueba analítica. Puede incluir, pero no
necesariamente los siguientes conocimientos: características de la muestra, preparación de los
estándares de referencia y reactivos, uso de los aparatos o instrumentos, generación de la
curva de calibración, uso de fórmulas para los cálculos.
PROCEDIMIENTO ANALITICO OFICIAL: Procedimiento analítico estandarizado
contenido en una farmacopea oficial o libros oficiales. Se les supone validados y los
laboratorios que los utilizan no están obligados a validar la exactitud de los mismos,
solamente demostrar su aptitud para aplicarlos, validando la linealidad y precisión del
sistema.
REPETIBILIDAD (REPETITIVIDAD): Precisión obtenida bajo las mismas condiciones
de operación en un intervalo corto de tiempo (mismo día), por un mismo analista, en la
misma muestra homogénea y en el mismo equipo.
REPRODUCIBILIDAD: Expresa la precisión entre laboratorios como resultado de estudios
interlaboratoriales diseñados para estandarizar la metodología.
ROBUSTEZ: Medida de la capacidad de un procedimiento analítico de permanecer
inafectado por pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y provee
una indicación de su fiabilidad en condiciones de uso normales.
52
SELECTIVIDAD: Describe la habilidad de un procedimiento analítico para diferenciar
entre varias sustancias en la muestra y es aplicable a métodos en los que dos o más
componentes son separados y cuantificados en una matriz compleja.
SESGO: Se usa en el sentido de exactitud de un promedio a largo plazo (valor esperado) de
una serie de promedios. Es la diferencia en el valor esperado (teóricamente igual al promedio
de un número infinito de valores individuales independientes) del valor verdadero, correcto o
asumido.
SISTEMA ANALITICO: Está compuesto por: equipos, reactivos, materiales, documentos,
patrones, materiales de referencia, analistas y variables operativas, que se utilizan en un
método de análisis.
TECNICA ANALITICA: Principio científico que se ha encontrado útil para proveer
información sobre la composición de un determinado producto o material
VALIDACIÓN: Confirmación que se da por la recopilación y análisis de la evidencia
objetiva de que se cumplen los requisitos particulares para el uso específico propuesto.
VALIDACIÓN DE UN PROCEDIMIENTO ANALITICO: Procedimiento para establecer
por medio de estudios laboratoriales una base de datos que demuestren científicamente que
un método analítico tiene las características de desempeño que son adecuadas para cumplir
los requerimientos de las aplicaciones analíticas pretendidas.
Implica la demostración de la determinación de las fuentes de variabilidad y del error
sistemático y al azar de un procedimiento, no solo dentro de la calibración sino en el análisis
de muestras reales.
Exactitud: Existen diferentes maneras de determinar la exactitud, los siguientes son los más
frecuentes en la literatura, y pueden ser utilizados en todos los tipos de análisis.
Comparación con un método oficial, validado o estandarizado:
Verificación
La muestra debe ser analizada, utilizando el método a validar y un segundo método bien
caracterizado, el cual debe tener una exactitud bien definida y establecida. Se analizan 6
muestras por replicado a la concentración normal de trabajo por ambos métodos.
53
ANEXOS
Anexo 1: Tabla de residuos máximos permitidos y tiempos de retiro de las
tetraciclinas.
Tomado de: Farmacología Veterinaria 3ra
Edición
54
Anexo 2: Tabla militar estándar.
Letra código de tamaño de muestra
Tamaño del Lote
Niveles generales de inspección
BAJO GENERAL ESTRICTO
I II III
2 a 9 A A B
9 a 15 A B C
16 a 25 B C D
26 a 50 C D E
51 a 90 C E F
91ª 150 D F G
151 a 280 E G H
281 a 500 F H J
501 a 1200 G J K
1201 a 3200 H K L
3201 a 10000 J L M
1001 a 35000 K M N
35001 a 150000 L N P
150000 a 500000 M P Q
500001 o mas N Q R
55
Use el primer plan de muestreo debajo de la flecha .Si el tamaño de la muestra es igual
o excede el tamaño del lote lleve a cabo inspección 100%.
Use el plan de muestreo arriba de la muestra.
Ac Cantidad máxima de defectos con la que puede aceptarse el lote.
Re Cantidad de defectos a partir de la cual se rechaza el lote.
Let
ra c
ód
igo
de
tam
año
de
mu
estr
a
Tam
año
de
mu
estr
a
0.65 65 15
Ac Re Ac Re Ac Re
A
B
C
2
3
5
O 1
1 2
2 3
D
E
F
8
13
20
0 1
1 2
2 3
3 4
3 4
5 6
7 8
G
H
J
32
50
80
2
5 6
7 8
10 11
10 11
14 15
21 22
K
L
M
125
200
315
2 3
3 4
5 6
11 15
21 22
N
P
Q
500
800
1250
7 8
10 11
14 15
R 2000 21 22
56
DEFECTO
CRITICO
Consulte la columna roja, si el efecto que encontró en la inspección, critico.
DFECTO
MAYOR
Consulte la columna amarilla, si el defecto que encontró en la inspección es mayor.
DEFECTO
MENOR
Consulte la columna gris, si el defecto que encontró en la inspección es menor.
57
Anexos 3: LMR pertinentes para la acuicultura en la Zona Económica Europea.
CUADRO 12
Actuales LMR pertinentes para la acuicultura en la Zona Económica Europea
Medicamento Anexo LMR (µg/kg
)
Especie Reglamento
del Consejo
Todas las
sulfonamidas
I 100 Todas las productoras de alimentos
508/1999/EC
Trimetoprim I 50 Peces
Amoxicillin I 50 Todas las productoras de alimentos
Ampicillin I 50 Todas las productoras de alimentos
Benzylpenicillin I 50 Todas las productoras de alimentos
Cloxacillin I 300 Todas las productoras de alimentos
Dicloxacilin I 300 Todas las productoras de alimentos
Oxacillin I 300 Todas las productoras de alimentos
Penethamate I 50 Todas las productoras de alimentos
Sarafloxacin I 30 Salmónidos
Chlortetracyclin
e
I 100 Todas las productoras de alimentos
Oxytetracycline I 100 Todas las productoras de alimentos
Tetracycline I 100 Todas las productoras de alimentos
Bronopol II Salmónidos, sólo huevas
Somatosalm II Salmón
Azametifos II 1931/1999/EC
Emamectin
benzoato
I 100 Salmónidos 1931/1999/E
C
Teflubenzuron I 500 Salmónidos 1931/1999/E
C
Tricaine
mesylato
II 1942/1999/EC
Toschloramide
Na
II Peces 2393/1999/E
C
Diflubenzuron I 1000 Salmónidos 2593/1999/E
C
Thiopental iv II n/a Todas las productoras de
alimentos
749/2001/EC
Flumeqine I 600 Salmónidos 2728/1999/E
C
Ácido
oxolínico
III expira el
1/1/03
300 Peces 807/2001/EC
Florfenicol I 1000 Peces 1322/2001/E
C
Nota: A las sustancias del Anexo I se han asignado LMR para especies o grupos animales
principales. Las sustancias del Anexo II se consideran inocuas para el consumidor y no requieren
establecimiento de LMR. Se incluyen aquí sólo las sustancias del Anexo II pertinentes para la
acuicultura; para las sustancias del Anexo III se han establecido LMR provisionales y por un
período limitado, en espera de obtener datos definitivos sobre su inocuidad.
58
CUADRO 13
Actuales tolerancias pertinentes a la acuicultura en los Estados Unidos
Medicamento Especie Tolerancia (LMR) Estado
Trifluralin Camarones o langostinos 0,001 mg/kg Temporal
Oxitetraciclina Salmónidos 0,2 mg/kg Temporal
Ácido oxolínico Salmón del Pacífico 0,01 mg/kg En el LD1 1 LD = límite de determinación.
59
Anexos 4: Límites máximos de residuos para Clortetraciclina/Oxitetraciclina/
Tetraciclina.
Límites máximos de residuos para Clortetraciclina/Oxitetraciclina/Tetraciclina
Especie Tejido LMR Año de adopción Nota
Oveja Leche 100 µg/l 2003
Vacuno/Vaca Leche 100 µg/l 2003
Oveja Riñón 1200 µg/kg 2003
Cerdo Riñón 1200 µg/kg 2003
Vacuno/Vaca Riñón 1200 µg/kg 2003
Aves Riñón 1200 µg/kg 2003
Aves Músculo 200 µg/kg 2003
Oveja Músculo 200 µg/kg 2003
Pescado Músculo 200 µg/kg 2003 Es aplicable únicamente a
oxitetraciclina.
Langostino
gigante
(Paeneus
monodon)
Músculo 200 µg/kg 2003 Es aplicable únicamente a
oxitetraciclina.
Vacuno/Vaca Músculo 200 µg/kg 2003
Cerdo Músculo 200 µg/kg 2003
Aves Huevos 400 µg/kg 2003
Oveja Hígado 600 µg/kg 2003
Vacuno/Vaca Hígado 600 µg/kg 2003
Aves Hígado 600 µg/kg 2003
Cerdo Hígado 600 µg/kg 2003
60
Anexos 5: Norma Codex Alimentarius.
Residuos de Medicamentos Veterinarios en los alimentos
Actualizado hasta la 35a Reunión de la Comisión del Codex Alimentarius (2012)
DETALLES SOBRE EL MEDICAMENTO VETERINARIO
Clortetraciclina/Oxitetraciclina/Tetraciclina
Clase funcional
o Agente antimicrobiano
Búsquedar JECFA
Pulsar en la conexión arriba para acceder a la pertinenete JECFA residuos monográficos.
Límites máximos de residuos para Clortetraciclina/Oxitetraciclina/Tetraciclina
Especie Tejido LMR Año de adopción Nota
Vacuno/Vaca Riñón 1200 µg/kg 2003
Vacuno/Vaca Hígado 600 µg/kg 2003
Vacuno/Vaca Leche 100 µg/l 2003
Vacuno/Vaca Músculo 200 µg/kg 2003
Cerdo Hígado 600 µg/kg 2003
61
Cerdo Riñón 1200 µg/kg 2003
Cerdo Músculo 200 µg/kg 2003
Oveja Riñón 1200 µg/kg 2003
Oveja Hígado 600 µg/kg 2003
Oveja Músculo 200 µg/kg 2003
Oveja Leche 100 µg/l 2003
Aves Huevos 400 µg/kg 2003
Aves Riñón 1200 µg/kg 2003
Aves Músculo 200 µg/kg 2003
Aves Hígado 600 µg/kg 2003
Pescado Músculo 200 µg/kg 2003 Es aplicable únicamente
a oxitetraciclina.
Langostino
gigante
(Paeneus
monodon)
Músculo 200 µg/kg 2003 Es aplicable únicamente
a oxitetraciclina.
CODEX sobre medicamentos veterinarios Medicamentos veterinarios
62
Anexo 6: Criterios de aceptación para el parámetro de precisión en función de la
concentración del analito de la AOAC.
63
Anexo 7: Criterio de aceptación del parámetro de exactitud, relacionando el
porcentaje de recuperación en función de la concentración del analito de la AOAC.
64
Anexo 8: Cromatograma de Tetraciclina de concentración de 100 μg/l.
65
Anexo 9: Cromatograma de Oxitetraciclina de concentración de 100 μg/l.
66
Anexo 10: Curvas de calibración y coeficientes de correlación de cada una las tres
repeticiones del estándar de Oxitetraciclina.
y = 44912x - 67,281 R² = 0,9967
-2000
0
2000
4000
6000
8000
10000
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250
Are
a μ
AU
Concentracion μg/ml
Curva de Calibracion Oxitetraciclina 1
Seri…Line…
y = 46998x - 272,21
R² = 0,9956
-2000
0
2000
4000
6000
8000
10000
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250
Are
a μ
AU
Concentracion μg/ml
Curva de Calibracion Oxitetraciclina 2
Series1
67
r média= 0,9965
Anexo 11: Curvas de calibración y coeficientes de correlación de cada una las tres
repeticiones del estándar de Tetraciclina.
y = 45830x - 217,95 R² = 0,9971
-2000
0
2000
4000
6000
8000
10000
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250
Are
a μ
AU
Concentracion μg/ml
Curva de Calibracion Oxitetraciclina 3
Series1
y = 29503x - 11,386 R² = 0,9984
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250
Are
a μ
AU
Concentracion μg/ml
Curva de Calibracion Tetraciclina 1
Series1
68
r media = 0,9982
y = 25292x + 60,684 R² = 0,9983
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250
Are
a μ
AU
Concentracion μg/ml
Curva de Calibracion Tetraciclina 2
Series1
y = 25545x - 71,947 R² = 0,9978
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250
Are
a μ
g/m
l
Concentracion μg/ml
Curva de Calibracion Tetraciclina 3
Series1
69
Anexo 12: Cálculos y desarrollo estadístico del método cromatográfico para
Oxitetraciclina.
Estimación de los parámetros de la regresión
Concentración
del patrón (xi)
Respuesta
1, 2 o 3
(yi)
(xi - x prom) (xi - x prom)2 (yi - y prom) (xi - x prom)(yi - y prom)
0 0 -0,11 0,01 -4836,00 528,938
0,050 2125 -0,06 0,00 -2711,00 160,966
0,075 3065 -0,03 0,00 -1771,00 60,878
0,100 4406 -0,01 0,00 -430,00 4,031
0,125 5717 0,02 0,00 881,00 13,766
0,150 6874 0,04 0,00 2038,00 82,794
0,175 7907 0,07 0,00 3071,00 201,534
0,200 8666 0,09 0,01 3830,00 347,094
0 0 -0,11 0,01 -4836,00 528,938
0,050 2068 -0,06 0,00 -2768,00 164,350
0,075 3007 -0,03 0,00 -1829,00 62,872
0,100 4268 -0,01 0,00 -568,00 5,325
0,125 5419 0,02 0,00 583,00 9,109
0,150 6763 0,04 0,00 1927,00 78,284
0,175 8280 0,07 0,00 3444,00 226,013
0,200 9141 0,09 0,01 4305,00 390,141
0 0 -0,11 0,01 -4836,00 528,938
0,050 2009 -0,06 0,00 -2827,00 167,853
0,075 3106 -0,03 0,00 -1730,00 59,469
0,100 4356 -0,01 0,00 -480,00 4,500
0,125 5205 0,02 0,00 369,00 5,766
0,150 6709 0,04 0,00 1873,00 76,091
0,175 7862 0,07 0,00 3026,00 198,581
0,200 9111 0,09 0,01 4275,00 387,422
2,625 116064 Qxx = 0,09 Qxy = 4293,650
x prom = 0,11
y prom = 4836,00
70
Estimación de los parámetros de la regresión
A= pendiente
B = ordenada al origen
A = 45913,718
B = -185,813
Entonces:
Y = Ax + B
yinc = 45913,72 xinc + (-185,81)
Para el gráfico de residuos:
Concentración del patrón (xi) Respuesta 1, 2 o 3 (yi) Residuos yi - Axi - B
0 0 185,813
0,050 2125 15,127
0,075 3065 -192,716
0,100 4406 0,441
0,125 5717 163,598
0,150 6874 172,755
0,175 7907 57,912
0,200 8666 -330,931
0 0 185,813
0,050 2068 -41,873
0,075 3007 -250,716
0,100 4268 -137,559
0,125 5419 -134,402
0,150 6763 61,755
0,175 8280 430,912
0,200 9141 144,069
0 0 185,813
0,050 2009 -100,873
0,075 3106 -151,716
0,100 4356 -49,559
71
0,125 5205 -348,402
0,150 6709 7,755
0,175 7862 12,912
0,200 9111 114,069
Evaluando F para el rango de los 8 estándares analizados.
Concentración
del patrón (xi)
Respuesta
1, 2 o 3
(yi)
Respuesta
estimada
yi -Resp. Est. (yi -Resp. Est.)2 (yij-y prom i)
2
0 0 -185,813 185,813 34526,421 23386896,000
0,050 2125 2109,873 15,127 228,826 7349521,000
0,075 3065 3257,716 -192,716 37139,440 3136441,000
0,100 4406 4405,559 0,441 0,195 184900,000
0,125 5717 5553,402 163,598 26764,359 776161,000
0,150 6874 6701,245 172,755 29844,367 4153444,000
0,175 7907 7849,088 57,912 3353,832 9431041,000
0,200 8666 8996,931 -330,931 109515,102 14668900,000
0 0 -185,813 185,813 34526,421 23386896,000
0,050 2068 2109,873 -41,873 1753,349 7661824,000
0,075 3007 3257,716 -250,716 62858,491 3345241,000
0,100 4268 4405,559 -137,559 18922,450 322624,000
0,125 5419 5553,402 -134,402 18063,854 339889,000
0,150 6763 6701,245 61,755 3813,707 3713329,000
-400,000
-300,000
-200,000
-100,000
0,000
100,000
200,000
300,000
400,000
500,000
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
Series1
GRAFICO DE RESIDUOS
72
0,175 8280 7849,088 430,912 185685,394 11861136,000
0,200 9141 8996,931 144,069 20755,975 18533025,000
0 0 -185,813 185,813 34526,421 23386896,000
0,050 2009 2109,873 -100,873 10175,365 7991929,000
0,075 3106 3257,716 -151,716 23017,731 2992900,000
0,100 4356 4405,559 -49,559 2456,084 230400,000
0,125 5205 5553,402 -348,402 121383,841 136161,000
0,150 6709 6701,245 7,755 60,143 3508129,000
0,175 7862 7849,088 12,912 166,727 9156676,000
0,200 9111 8996,931 114,069 13011,814 18275625,000
Ʃ= 116064 792550,309 197929984,000
y prom = 4836,000
m= 24
p= 8
m = número total de patrones de calibrado
p = número de réplicas de la muestra incógnita
i y prom i
0 0,000
0,050 2067,333
0,075 3059,333
0,100 4343,333
0,125 5447,000
0,150 6782,000
0,175 8016,333
0,200 8972,667
Predicción en muestras incógnita:
sy/x = 189,803
sy = 3517,189787
73
sy/x = desvío estándar de los residuos de la regresión
s(xinc) = error estándar en la concentración predicha
Fexp = 0,003
F para m-2 y m-p grados de libertad (95%)es menor, por tanto, el comportamiento es
lineal
Los desvíos estándar de A y B se obtienen mediante:
Sy/x = 189,803
SA = 620,669
SB = 75,794
Sensibilidad de calibración y Sensibilidad analítica
Sensibilidad de calibración = SEN = A = 45913,718 unidades son de señal *
concentración–1
Sensibilidad analítica = g = SEN/sy
p = número de niveles de concentración estudiadas en la recta
r = número de réplicas de cada punto
yij = valor de la respuesta correspondiente a cada nivel y réplica
= promedio de las respuestas de las réplicas para cada nivel de concentración S
74
El número de grados de libertad es m-p
Cálculo de sy
Calculo de Sy.
i j yij y promedio (yij-y promedio)2
0,050 1 2125 2067,33 3325,44
2 2068 0,44
3 2009 3402,78
0,075 1 3065 3059,33 32,11
2 3007 2738,78
3 3106 2177,78
0,100 1 4406 4343,33 3927,11
2 4268 5675,11
3 4356 160,44
0,125 1 5717 5447,00 72900,00
2 5419 784,00
3 5205 58564,00
1 6874 6782,00 8464,00
0,150 2 6763 361,00
3 6709 5329,00
1 7907 8016,33 11953,78
0,180 2 8280 69520,11
3 7862 23818,78
0,200 1 8666 8972,67 94044,44
2 9141 28336,11
3 9111 19136,11
414651,33
sy = 103662,833
= 0,443
Límite de detección y cuantificación.
75
S0 = 0,003
Límite de detección = LOD = 2*t0.05,m-2*s0
LOD = 0,01
Límite de cuantificación = LOQ = 10*s0
LOQ = 0,03
Nota: De acuerdo al mismo processo de calculo se aplicado para la Tetraciclina com
resultados.
Donde:
x prom = 0,11
y prom = 2921,50
Estimación de los parámetros de la regresión
A = 26779,883
B = -7,550
Gráfico de residuos:
Evaluando F para el rango de concentraciones 0-8:
Fexp = 0,016
Los desvíos estándar de A y B:
Sy/x = 265,589
-400,000
-200,000
0,000
200,000
400,000
600,000
800,000
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
Series1
GRAFICO DE RESIDUOS
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SA = 868,496
SB = 106,058
Sensibilidad de calibración y Sensibilidad analítica:
sy = 377997,833
γ = 0,121
Límite de detección y cuantificación:
LOD = 0,03
LOQ = 0,07
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Anexo 13: Equipos utilizados para la determinación de Oxitetraciclina y
Tetraciclina.
Centrifuga com temperatura controlada Eppendorf.
Centrífuga com temperatura controlada SIGMA
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Tubos 50 ml plástico donde se centrifugo la muestra de leche
Tratamento de extracción de la muestra através de los Oasis HLB
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Evaporador a base de nitrógeno
Preparación de estándares
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Anexo 14:Figura de toma de muestras compuestas de leche.
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