DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE PROTEÍNA EN LA LECHE DE VACA Y EXTRACCIÓN DE CASEÍNA

DETERMINATION OF PROTEIN IN MILK COW AND EXTRACTION OF CASEINBOHÓRQUEZ, Dianny; GARCÍA, Edwin; OVIEDO, Sebastián; ZÚÑIGA, Laura.1

UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA NACIONALCalle 72 N° 11-86 Bogotá D.C, Colombia-Sur América

RESUMEN

PALABRAS CLAVE

Proteína, caseína

ABSTRACT

KEYWORDS

INTRODUCCIÓN

La leche contiene diversas proteínas (Figura 1), de las cuales las caseínas son las más abundantes, ya que representan el 80% de las proteínas totales. Las caseínas de la leche tienen pesos moleculares que oscilan entre 25.000 y 40.000; las más importantes son la α, la β y la κ, que representan, respectivamente, el 50, 30 y 15% del total de las caseínas. En la leche, estas proteínas se asocian entre si para formar micelas, que se encuentran estabilizadas y solublilizadas gracias a la presencia de la caseína κ, y del calcio (Prácticasde Bioquímica y Biotecnología de Alimentos ).

La preparación pura de una proteína es esencial antes de determinar sus propiedades, estructura y composición, por lo que es necesario aislarla y purificarla. Los métodos de separación de proteínas aprovechan propiedades tales como la carga, tamaño y solubilidad, que varía entre una y otra proteína (Nelson y Cox, 2000).

Cada proteína tiene una composición de aminoácidos específica que las hace diferentes unas de otras y, por lo tanto, su comportamiento en disoluciones también es diferente. Por lo general las proteínas fibrosas son insolubles en agua y resisten a la degradación enzimática, sin embargo, con soluciones de cierta fuerza iónica se pueden solubilizar. Las proteínas globulares son relativamente más solubles en agua y en soluciones de baja fuerza iónica, aunque algunas coagulan cuando se calientan. Por otro lado, la

1Profesores en formación inicial, PCLQ. Universidad Pedagógica Nacional. diannyb19@hotmail.com; lau.engel0112@hotmail.com.

composición de aminoácidos es también responsable del comportamiento de las proteínas en diferentes condiciones de pH. Así, al acidificar o alcalinizar una proteína determinada, ésta puede llegar a su punto isoeléctrico, alcanzar una carga neta de cero y, por lo tanto, precipitar (Gonzales et al, 2009).

Figura1. (Izquierda) Micelas de caseína en la leche. (Derecha) composición protéica de las leches de vaca y humana.

La caseína es una proteína conjugada del tipo fosfoproteína que en su fase

soluble se encuentra asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que se

denomina caseinógeno. Por lo cual es necesario llevar a cabo toda una serie de

pasos para aislarla de la leche, y eliminar las grasas e hidratos de carbono que

ésta contiene. La caseína se separa de la leche la cual tiene un pH

aproximadamente de 7 por acidificación llevando a la caseína a su punto

isoeléctrico (de 4.6) donde se precipita (Segal y Ortega, 2005).

Las proteínas forman un sistema coloidal de gran estabilidad solo sensible a la disminución notable de pH y a determinadas enzimas que la precipitan y coagulan. En la leche hay tres grandes grupos proteicos: caseínas, albúmina y globulina, estas últimas forman las llamadas proteínas del suero.Otro grupo de proteínas esta constituido de un gran número de enzimas ejemplo fosfatasas que nos indican si la leche ha sido pasteurizada, peroxidasas que indican si la leche fue pasteurizada y no hervida, catalasas indica gran cantidad de elementos celulares producto de procesos inflamatorios en las mamas, reductasa cuando aumenta hace prever la existencia de bacterias en la leche. La digestibilidad real de las proteínas es de 0.97 en adultos y en niños 0.90 a 0.93.Su valor biológico aproximado es de 80, es rica en Lisina además de proporcionar unas 4 Kcal/g (Acosta, 2004).

Materiales y Metodos

Tubo de ensayo 1 Tubo de ensayo 3Tubo de ensayo 2 Tubo de ensayo 4

Patrón BSA Leche diluida Reactivo de BradfordAgua

Agitar suavemente

Esperar 15 min que se desarrolle el color

Medir Absorbancia de cada tubo a 595 nm

4 tubos de ensayo1 gradilla1 vaso de precipitado de 600ml1 vaso de precipitado de 100ml1 agitador magnético1 caja petriPapel de secado

ReactivosAcido acéticoReactivo de BradfordPatron de calibrado: seroalbúmina bovina ( BSA) 0,02mg/mL

Muestra biológica250ml de leche entera

EquiposEspectrofotómetro UV-VIS Hitachi 150 - 20Centrífugaestufa

Determinación colorimétrica del contenido de caseína

en el diagrama no 1 se muestra el procedimiento realizado en la determinación colorimétrica del contenido de caseina presente en una muestra de leche entera midiendo la absorbancia en el equipo de Espectrofotómetria Ultravioleta-Visible Hitachi 150 - 20 .

Aislamiento de la caseína en la leche de vaca

200 mL leche

2,0 mL de CH3COOH

Vaso de precipitado 600 ml

Calentar a 30ºC

Llevar a agitación con agitador magnético hasta la formación de una masa.

Tubo de ensayo 1 Tubo de ensayo 2

40 mL de la suspensión 40 mL de la suspensión

Centrifugar a 3000 rpm durante 3 min.

Separar el suero lácteo de la caseína en vaso precipitado de 100 mL

Verter la suspensión en una caja petri con papel de secado. Determinar el peso.

Dejar en la estufa a 35ºC durante 24 Horas

Tubo de ensayo 1

5,0 mL de suero para retirar la caseína

Agitar

En el diagrama No 2 se muestra el procedimiento realizado en el aislamiento de la caseína en la leche de vaca.Luego de obtener la suspensión se pesó la caja petri con el papel de secado y el contenido de caseína. Posteriormente, fue dejada la muestra en la estufa por 24 horas y se volvió a pesar la caja de petri para realizar los cálculos correspondientes y así determinar el contenido en gramos de caseína.

Pesar la caja de petri y determinar los gramos de caseína de la leche

 RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Después de realizar el respectivo procedimiento, se observa los resultados obtenidos en la siguiente tabla.

Concentración A1 A2 A3 Absorbancia Promedio1 0,096 0,096 0,096 0,09602 0,099 0,1 0,1 0,09973 0,095 0,095 0,095 0,09504 0,104 0,105 0,105 0,10475 0,109 0,109 0,109 0,1090

Muestra 1 0,116 0,117 0,117 0,1167Muestra 2 0,127 0,127 0,128 0,1273Muestra 3 0,144 0,145 0,146 0,1450blanco 0 0 0 0,0000

A continuación, se procede a realizar la gráfica de absorbancia vs concentración con el fin de determinar la concentración de caseína presente en las tres muestras presentadas en la tabla anterior.

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.50.085

0.09

0.095

0.1

0.105

0.11

0.115

f(x) = 0.0031 x + 0.0913R² = 0.700437317784255

A vs C

A vs CLinear (A vs C)

Continuo a esto, se reemplaza el valor de Y en la ecuación de la recta con los datos de las absorbancias de las muestras y se determina la concentración del analíto con sus respectivas disoluciones.

y=0,0031x+0,0913

Para la primeramuestra :

0,1167=0,0031 x+0.0913

Despejando X :

0,1167−0.09130,0031

=x

x=8,193 ppm

Posteriormente se determina la concentración de caseína en la muestra:

8,193mgL

∗100mL

10mL∗100mL

5mL∗¿

Una propiedad característica de la caseína es su capacidad de precipitar. Debido a la naturaleza compleja de las moléculas de la caseína, y de las micelas formadas con ellas, la precipitación `puede ser originada por diferentes agentes, entre ellos la precipitación por ácido donde el pH bajará si se añade un acido a la leche o si se deja que se multipliquen en la misma bacterias acidificantes. Esto cambia en entorno de las micelas de caseína, reflejándose en el aumento de tamaño las mismas por agregación y que termina con la formación de un coagulo mas o menos denso. Dependiendo del valor final del pH, este coagulo contiene caseína en forma de sales de caseína o caseína en su estado isoeléctrico, o ambas a la vez.los puntos isoeléctricos de los componentes de la caseína dependen de los iones de otras clases presentes en la solución.

Conclusiones

Es posible la purificación parcial y el aislamiento de la caseína de la leche, utilizando la poca solubilidad que esta proteína tiene cuando se le lleva hasta su punto isoeléctrico y la rapidez de sedimentación de la misma al utilizar la centrifuga. No obstante, el rendimiento puede ser variado si se considera que los métodos de purificación son también variados.

De igual manera, cada proteína tiene una composición de aminoácidos específica que las hace diferentes unas de otras y, por lo tanto, su comportamiento en disoluciones también es diferente. Por lo general las proteínas fibrosas son insolubles en agua y resisten a la degradación enzimática, sin embargo, con soluciones de cierta fuerza iónica se pueden solubilizar. Las proteínas globulares son relativamente más solubles en agua y en soluciones de baja fuerza iónica, aunque algunas coagulan cuando se calientan. Por otro lado, la composición de aminoácidos es también responsable del comportamiento de las proteínas en diferentes condiciones de pH. Así, al acidificar o alcalinizar una proteína determinada, ésta puede llegar a su punto isoeléctrico, alcanzar una carga neta de cero y, por lo tanto, precipitar.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

González-Soto, E.; L. Bucio-Ortiz; P. Damián-Matzumura; F. Díaz de León-

Sánchez; E. Cortés-Barberena; L.J. Pérez-Flores. (2009) Manual de

bioquímica 1. 3ª ed. México.

Nelson, D.L. y M.M. Cox (2000) Lehninger Principios de Bioquímica. 4 ed. Ed. Worth. EUA.

Segal, C.A. K. y Gustabo Jesus Ortega L. G.J. ed. (2005) Manual de

prácticas. Biología molecular de la celula I. UNAM. Publidisa, México.