DETERMINAZIONE PIGMENTI FOTOSINTETICI PRESENTI IN FOGLIE DI TABACCO

Estrazione e purificazione dei pigmenti fotosintetici da foglie di tabacco

• Lavare e asciugare le foglie su carta morbida• Pesare 0,8-1 g di foglie di spinacio. Pestarle in un mortaio con l’aggiunta di 3 ml di

etanolo, che è un buon solvente per i pigmenti e sodio bicarbonato, per basificare la soluzione e mantenere stabili le clorofille che rischierebbero di perdere il Mg++

presente nell’anello tetrapirrolico e trasformarle in feofitine se a contatto con il contenuto acido del vacuolo,

• Trasferire il contenuto del mortaio, attraverso una micropipetta, in due eppendorf e centrifugare per 3 min. Prelevare il surnatante e riporlo in una provetta con tappo ricoperto da stagnola, per proteggere gli estratti dalla luce che potrebbe fotodistruggerli.

ESTRAZIONE : processo chimico attraverso il quale è possibile la precipitazione proteica. Prevede l’uso di un solvente organico che attragga attorno a se le molecole d’acqua, che prima circondavano le proteine in soluzione. Queste ultime espongono così i loro gruppi carichi che ne causano la reciproca interazione e precipitazione.

P reparazione della camera di sviluppo e separazione dei pigmenti

• Versare nella camera di sviluppo il solvente cromatografico , costituito da una miscela 9:1 di etere di petrolio/acetone; chiudere la camera e lasciare equilibrare la camera.

• Su una striscia di carta Whatmann 3MM tracciare con una matita una linea orizzontale a 3cm dal bordo inferiore e 1,5 da quello laterale. Con l’aiuto di una micropipetta si versano aliquote di campione per una lunghezza di 4 cm circa, seguendo il segno a matita. Si ottiene infine una banda di spessore pari a 3mm.

• Immergere il bordo inferiore della carta cromatografia, facendo attenzione che il solvente non tocchi la linea di origine. Chiudere la camera e lasciare sviluppare il cromatogramma.

• Quando il fronte del solvente avrà quasi raggiunto l’apice della carta, si rimuove dalla vaschetta e si segna il punto di arrivo del solvente e si lascia asciugare il cromatogramma sotto cappa.

Identificazione dei pigmenti estratti

• Una volta asciugato il cromatogramma si ritagliano le bande colorate e per l’eluizione immergere ciascuna banda in una provetta distinta contenente 1,5 ml di etanolo 95%.

• Trasferire in cuvetta l’eluito e determinare lo spettro di assorbimento della miscela di pigmeni purificati tra 400 e 750 nm.

DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO PROTEICO IN UNA MISCELA COMPLESSA

A partire da una miscela alimentare complessa, come ad esempio un’aliquota di latte.si vuole determinare il contenuto di proteine solubili totali presenti mediante analisi colorimetrica (saggio di Bradford)

Preparazione della retta di calibratura

Si preparano degli standard basati sull’utilizzo dell’albumina di siero bovino (BSA) alle seguenti concentrazioni:1) 2,5 microgrammi/ml2) 5 microgrammi/ml3) 7,5 microgrammi/ml4) 10 microgrammi/ml Gli standard sono preparati in 1 ml volume finale.

Preparazione campioni

I campioni da analizzare vanno diluiti ad un volume finale di 1 ml a tre diverse diluizioni (1:100, 1:1000, 1:500).

Reazione

Agli standard e alle diluzioni si aggiunge 1 ml di reagente di Bradford; si mescolano e si misura l’Assorbanza a 595 nm.

Determinazione della concentrazione

Dalla retta di taratura costruita con gli standard si ricava il coefficente angolare della retta (m). Tale coefficente è utilizzato successivamente per il calcolo della concentrazione dei campioni.

RILEVAZIONE DELLO SPETTRO DI ASSORBIMENTO DI DUE SOLUZIONI DI DNA

In tale esperienza verra rilevato lo spettro di assorbimento del DNA ottenuto con due diversi metodi di estrazione (uno commerciale e un altro artigianale).La soluzione di DNA sarà diluita 1:80 in un volume finale di 500 micolitri.In seguito alla calibrazione dello strumento con una soluzione acquosa, si determineranno gli spettri di assorbimento delle due soluzioni in un range da 230 nm a 300 nm.

Verranno rilevati I picchi di assorbimento e si determineranno le concentrazioni delle due soluzioni, mediante la seguente formula:

C= A260 nm x Fattore di diluizione (80) x 50

Si determinerà inoltre il rapporto che indica la contaminazione proteica della soluzione A260 nm/A280 nm e di conseguenza l’affidabilità della misura.